法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-08-25
授权
授权
2013-12-18
著录事项变更 IPC(主分类):C12N1/04 变更前: 变更后: 申请日:20100813
著录事项变更
2012-07-11
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/04 申请日:20100813
实质审查的生效
2012-05-30
公开
公开
技术领域
本发明涉及具有增强的稳定性和生存力的包被的脱水微生 物。
背景技术
冻干方法经常被用于保存微生物。事实上，冻干方法的低操 作温度会导致微生物有小的损伤。而且，本领域内已知低储存温 度可能是维持这种冻干细胞的生存力和稳定性的关键因素。本领 域内还已知，在保护剂存在情况下冻干的细胞比不添加所述保护 剂情况下冻干的细胞更适于保持其生存力和稳定性。例如，US 6,919,172(Wisconsin Alumni研究基金)涉及在生物介质进行至少 一种保存处理(例如冷冻、冻干、真空干燥或喷雾干燥)前，将保 护混合物(即蔗糖和磷酸钾)与生物材料混合以形成保存介质的用 途。在进行保存处理后，当在室温干燥条件下储存时，该生物材 料能保持稳定。然而，在密封容器中运输及储存过程中保存以提 供增强稳定性的US 6,919,172的益生微生物通常不能耐受同时的 高温和/或高湿条件，这些条件通常在饲料产品、食物产品(例如 谷物、营养棒、调制奶酪、婴儿配方食品)、消费者保健产品(包 括膳食补充剂、保健营养品、非处方产品)以及农产品所使用的 长期储存和二次处理中遇到。事实上，有活力的微生物经常被热 和/或湿汽和/或其它处理条件或储存条件灭活，从而在储存和/或 消费过程中随时间降低其在最终产品中的生存力，使得包含微生 物的最终产品的预期效果最终丧失。
为了克服这个问题，已经开发了许多用于微生物的包被方法 以保护其对抗如高温和高湿水平的不利因素。这些包被方法通常 基于如脂肪或低渗透性聚合物的包被材料，比如虫胶和羟丙基甲 基纤维素(HPMC)。例如，US 7,157,258(Lallemand)涉及用熔点 高于60℃的疏水性屏障(如脂肪和蜡)来包被脱水的微生物，而 EP 1753440B1(Merck)、US 6,365,148(Il Yang Pharm Co.Ltd.) 和EP 0778778B1(University New South Wales)则使用如HPMC 或淀粉的聚合物屏障。这些防潮屏障旨在通过防止或延迟水进入 包被层而提供对脱水微生物的保护，从而避免湿汽扩散进入下层 的脱水微生物。如果包被层允许湿汽通过，那么脱水微生物可能 吸收水分，因此改变其生存力。
然而，申请人制备了以常用的化合物如脂肪、虫胶或HPMC 包被的脱水微生物，并注意到含有这种微生物的产品的生存力并 没有充分地得到保持。事实上，正如在本专利申请的结果部分 (特别是实施例4，表5和实施例7，表8)中可以看到的，与未包 被脱水微生物相比，现有技术中用于包被微生物的材料既没有增 加微生物的热稳定性，在中等或高湿度环境中也没有提供较长时 间内的增强的生存力。
因此，尽管有上述教导，本领域仍然存在对包被脱水微生物 的需求，藉此微生物能够在制备期间及制备后保持其大部分活 性，并且能够抵御例如在用于饲料/食物产品、消费者保健产品或 农产品制备的二级处理或这些产品长期储存期间所遇到的损伤条 件(其中所述处理/长期储存通常涉及高温和/或高湿的组合)，因此 符合了对于具有改进稳定性的脱水微生物的普遍追求但当前仍未 满足的需求。
发明简述
申请人惊异地发现加入至少一个包裹脱水微生物的吸湿盐层 能提高这些脱水微生物的存活率(即生存力)，尤其在高湿和/或高 温条件下。事实上，鉴于本领域技术人员通常使用疏水性(例如 脂肪)、低渗透性化合物(例如虫胶或HPMC)或非吸湿盐作为包被 层以防止吸湿，申请人惊异地发现包含吸湿盐的至少一个包被层 能使得在高湿和/或高温条件下处理和储存脱水微生物而不改变微 生物生存力。
因此本发明特别涉及一种包被的脱水微生物，其包含被至少 一个包被层包裹的脱水微生物，所述包被层包含按干重计为至少 25％的下文定义的吸湿盐或其混合物，且其中包被层的pH与包 被脱水微生物的生存力相容。因此本发明的“至少一个包被层”是 “至少一个吸湿盐包被层”。
包被层也可以包含按干重计为0至60％的至少一种非吸湿 盐。
可选择地，包被层可包含其它成分，比如多羟基化合物、抗 粘剂、具有保健和/或营养益处的化合物(抗氧化剂、维生素、矿 物质、益生元、多肽、蛋白质、...)、水胶体(hydrocolloids)、填 充剂、润滑剂、粘合剂、酸、碱、疏水物质、聚合物及其混合 物。这些其他任选成分的量优选按干重计为0至70％。
因此本发明特别涉及包被的脱水微生物，其包含被至少一个 包被层包裹的脱水微生物，所述包被层包含按干重计为：
-至少25％的吸湿盐或其混合物，
-0至60％的非吸湿盐或其混合物，
-0至70％的其它任选成分，
并且其中包被层的pH与包被脱水微生物的生存力相容。
本发明的一层或多层的吸湿盐包被层(分别命名为“第一吸湿 盐包被层”、“第二吸湿盐包被层”...)可以相同或不同的组成用于 包被脱水微生物。因此本发明特别地涉及包被的脱水微生物，其 包含由本发明定义的至少一个、或至少两个、或至少三个、或至 少四个包被层包裹的脱水微生物。也可以增加包裹吸湿盐包被层 的一个或多个外包被层(分别命名为“第一外包被层”、“第二外包 被层”...)。这些任选的外包被层可以包含常规化合物如脂肪；脂 肪酸(例如硬脂酸)；乳化剂(如单和双甘油酯)；油；蜡；树脂； 低渗透性聚合物(例如虫胶、sepiflm、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二 醇)；水胶体(例如角叉菜胶、藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶或瓜 尔胶)；可作为来源于土豆、玉米、乳清、稻、马铃薯、木薯的 天然或改性淀粉使用的淀粉；环糊精；多元醇(例如甘露醇)；纤 维素和纤维素衍生物(HPMC、纤维素酯、纤维素醚)及其混合 物。
外包被层可用于为脱水微生物提供进一步的抗性，尤其是保 护以使其免受胃和/或氧化环境和/或具有不利的pH条件的灭活。 这些层也可以为包被脱水微生物提供增强的机械抗性、增强的对 蒸汽处理的抗性或增强的操作性能(例如改良的固体流动性)。
已经显示，本发明的包被层提供了对用于食品、饲料、消费 者保健产品或农产品的制备的二次处理期间灭活的增强的抗性， 和/或提供了食品、饲料、消费者保健产品和农产品所需的长期储 存稳定性。
因此，本发明的包被脱水微生物可用于功能性食品、饲料产 品、消费者保健产品和农产品中。预期这种新技术增加关键脱水 微生物，尤其是关键益生微生物和直接饲喂微生物的销售，因为 它符合了使得在如食品、饲料、消费者保健产品和农产品的新的 应用(其中目前商业化的冻干微生物缺乏长期和加工稳定性)中能 够使用脱水微生物的所追求的市场需求。
所有引用的参考文献以引用方式并入。
定义
本发明所用的术语“包被层”是指在液体包被组合物施加并干 燥后包裹脱水微生物的任何层(或包被的层)。
包被层的组分量以百分比表示，其是干重百分比(干重 wt％)，而且是相对于包被层本身(不是相对于包被的脱水微生 物)。所述百分比包括任何结合的结晶水。
在本发明中，术语“盐”也包括水合盐。因此吸湿盐包括吸湿 盐水合物，且非吸湿盐包括非吸湿盐水合物。
“至少25％的一种或多种吸湿盐”的表述与“至少25％的吸湿 盐及其混合物”的表述同义。这也意味着：
-至少25％的单一吸湿盐；或
-至少25％的数种吸湿盐的混合物(例如至少20％的第一种吸 湿盐+至少5％的另一种吸湿盐)。
本申请中后面提及的其它优选的百分比作同样的解释。
“吸湿性是物质从空气中吸收水分的倾向”。吸湿解读为“(物 质)倾向于从空气中吸收水分”(《牛津英语词典》)。
吸湿性可由这两个参数来表征：(a)保水能力(MHC)以及(b) 吸湿速率(MUR)。
吸湿性可以定义为材料可以吸收的水的相对量。因此，保水 能力(MHC)是当暴露于给定的相对湿度时材料可以吸收的水的平 衡量。“空气相对湿度(RH)是水蒸气分压与该温度下其蒸汽压的 比值”(Atkins，Physical Chemistry，OUP，1978，p199)。在本申请 中，保水能力(MHC)是指当暴露于受控相对湿度的环境时，基于 重量分析的包被层或包被脱水微生物所吸收水分的平衡量。它可 以通过记录包被层或包被脱水微生物的重量增加(直到观察不到 进一步的重量增加)而测定。
MHC可以基于暴露于水分前的初始材料，以体积(单位为 mg/cm3)或重量(重量百分比(％w/w))来表示。重要的是，要注意 MHC可能取决于材料的暴露表面积的量和厚度。MHC可以根据 Sharma和Patel所述的公式进一步分析″study and evaluation of hygroscopic behaviour of phosphatic fertilizers″IFA Technical Conference，1-4 October 2000，New Orleans，Louisiana，USA：
MHC＝MA/MP，其中：
MA＝水分吸收量(mg/cm2)，多少水分被吸收进材料的给定 表面积中的量度(mg/cm2)；以及
MP＝水分渗透量(cm)，水分渗透深度的量度。
(b)吸湿速率(MUR)：
盐的吸湿性可以用MUR测定(″Additive to biological substances.III.The moisture content and moisture uptake of commonly used carrier agents undergoing processing conditions similar to those used in the preparation of international biological standards″，E Tarelli等，Journal of Biological Standardization，1987， 15，331-340)。吸湿性也有动力学因素(kinetic dimension)。吸湿速 率(MUR)是每单位时间的MHC，对于特定％RH，在特定温度下 和对于特定时间长度测量，在数小时或数天内测定。在本发明 中，在25℃、75％RH下7天后的MUR最少为20％w/w的盐将 被视为吸湿盐，而在25℃、75％RH下7天后的MUR小于20％ w/w的盐将被视为非吸湿盐。实施例9给出了MUR测定的详细 方案。可以理解的是盐的MUR以及因此其吸湿或非吸湿的性质 取决于其进行测量的大气条件(尤其是温度或％RH)。本申请中提 供的吸湿或非吸湿盐的定义限制为如下特定条件：盐在25℃、 75％RH下储存7天后。例如在文献中，取决于环境湿度和温 度，硫酸钠有时被称为吸湿盐，而在其它时候称为非吸湿盐。在 本发明中，它被归类为非吸湿盐，因为在25℃、75％RH下7天 后测定其MUR为小于20％w/w。在其他文献或专利中，它可能 被视为吸湿盐，例如当MUR在更高％RH下测定时。.
因此，如本发明所使用的，吸湿盐必须被理解为在25℃、 75％RH下7天后的MUR为至少20％w/w的无机或有机盐(包括 水合盐)。吸湿盐之间的吸湿度差异很大(也就是说某些盐与其它 盐相比吸湿性很高)。
优选本发明的吸湿盐在25℃、75％RH下7天后的MUR为 至少30％w/w，更优选在25℃、75％RH下7天后的MUR为至 少40％w/w，更优选在25℃、75％RH下7天后的MUR为至少 50％w/w，甚至更优选在25℃、75％RH下7天后的MUR为至 少60％w/w。
本发明的吸湿盐的一些实例为磷酸氢二钾(K2HPO4)、无水磷 酸氢二钠(Na2HPO4)、六偏磷酸钠(NaPO3)6、无水醋酸钠 (CH3COONa)、硝酸镁(Mg(NO3)2)、溴化钙(CaBr)、溴化锂 (LiBr)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)、氯化锂(LiCl)、五氧化 二磷(P4O10)、二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-2H2O)、七水合磷酸 氢二钠(Na2HPO4-7H2O)、醋酸铵(CH3COONH3)、醋酸钙 (CH3COO)2Ca、醋酸钾(CH3COOK)、碳酸钾(K2CO3)、碳酸钠 (Na2CO3)、甲酸钠(NaCHO2)、一水合柠檬酸钾(K3C6H5O7·H2O)、 五水合柠檬酸钠(C6H5Na3O7·5H2O)及其混合物。
例如：
K2HPO4在25℃、75％RH下7天后的MUR为45.6％w/w，
K2CO3在25℃、75％RH下7天后的MUR为50.7％，
MgCl2在25℃、75％RH下7天后的MUR为53.7％。
另外，“吸湿盐或其混合物”的表述包括以下两个方面：
(a)一种或多种盐起初是吸湿的(本身)，也就是说在施加到 脱水的包被微生物上之前是吸湿的，因此，该一种盐/多种盐在 25℃、75％RH下7天后的MUR为至少20％w/w；和/或
(b)一种或多种盐起初是非吸湿的，但是在施加到脱水微生物 上时(即，在处理时)它/它们变得吸湿。换句话说，在施加到脱水 微生物上之前，该一种盐/多种盐在25℃、75％RH下7天后不具 有为至少20％w/w的MUR，但是在包被层施加到微生物时，该 一种盐/多种盐在25℃、75％RH下7天后的MUR为至少20％ w/w。例如，在样品28中令人惊讶地显示出，将一定量的NaOH 加入如KH2PO4的非吸湿盐而由KH2PO4和NaOH的反应提供了 包含吸湿盐的合适的包被层(这种盐的非吸湿性质的改变，产生 了吸湿的盐)。
因此，所述吸湿盐本身是吸湿的盐和/或在施加到脱水微生物 上后变为吸湿盐。
另外，材料本身、施加包被层时的温度、湿度和干燥条件将 影响包被层的“水化度”，从而影响包被层中盐的吸湿性。
如此处所使用，本发明的非吸湿盐是在25℃、75％RH下7 天后的MUR低于20％w/w的有机或无机盐(包括水合盐)。本发 明的非吸湿盐优选在25℃、75％RH下7天后的MUR低于10％ w/w，更优选低于5％w/w。
本发明的非吸湿盐的实例为磷酸二氢钾(KH2PO4)、三水合醋 酸钠(CH3COONa·3H2O)、二水合硫酸钙(CaSO3·2H2O)、硫酸钠 (Na2SO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸钾(K2SO4)、氯化钠(NaCl)、氯 化钾(KCl)、碳酸钙(CaCO3)、乳酸钙((CH3CHOHCOO)2Ca)、四 水合柠檬酸钙((Ca3C6H5O7)2·4H2O)、二水合柠檬酸钠 (HOC(COONa)(CH2COONa)2·2H2O)及其混合物。
在本申请中，包被层的pH“与包被的脱水微生物的生存力相 容”是指以不改变微生物生存力的方式选择pH。它随菌株而变 化，但它通常为5.5到7.9，优选6到7.5。在本发明的含义中， 该pH是指在本发明的包被的脱水微生物以10wt％的量悬浮于水 中后测定的pH。
在本申请中，“最终产物”是指引入本发明的包被脱水微生物 的食物产品、饲料产品、消费者保健产品或农产品。
发明详述
发明人惊异地发现包被层中足量的特定盐，即吸湿盐的存在 导致包被的脱水微生物生存力的增加。不希望被理论束缚，发明 人推测该包被层获得的微生物稳定效应取决于包被层吸湿的能 力，这与易吸收水分的吸湿盐的存在直接相关。另外，当进行处 理以包被脱水微生物时，包含这种吸湿盐的吸湿盐层可以采用无 定形或部分无定形(半晶体)状态的形式，这允许水分增强扩散 和/或更大量水分吸收进入包被层体相中。发明人已经表明当包被 层在处理(即施加到脱水微生物上)时为无定形或非完全晶体 时，其吸湿能力和/或其吸湿速率显著更高，并且令人惊讶的是生 存力相比于显示低吸湿性的包被层增强。
因此本发明特别涉及包被的脱水微生物，其包含被至少一个 包被层包裹的脱水微生物，所述包被层包含按干重计为至少25％ 的吸湿盐或其混合物，其中包被层的pH与包被脱水微生物的生 存力相容。
本发明也涉及包被的脱水微生物，其由被至少一个包被层包 裹的脱水微生物组成，所述包被层包含按干重计为至少25％的吸 湿盐或其混合物，其中包被层的pH与包被脱水微生物的生存力 相容。
优选地，包被层包含按干重计为至少28％的吸湿盐或吸湿盐 的混合物，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少 50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％的吸 湿盐或吸湿盐的混合物。
在特定实施方式中，包被层由按干重计为100％的吸湿盐或 吸湿盐的混合物组成。
在一个实施方式中，本发明包被层的吸湿盐选自于包括磷酸 氢二钾(K2HPO4)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、六偏磷酸钠 (NaPO3)6、无水醋酸钠(CH3COONa)、硝酸镁(Mg(NO3)2)、溴化 钙(CaBr)、溴化锂(LiBr)、氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)、氯化 锂(LiCl)、五氧化二磷(P4O10)、二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4- 2H2O)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)、醋酸铵 (CH3COONH3)、醋酸钙(CH3COO)2Ca、醋酸钾(CH3COOK)、碳 酸钾(K2CO3)、碳酸钠(Na2CO3)、甲酸钠(NaCHO2)、一水合柠檬 酸钾(K3C6H5O7·H2O)、五水合柠檬酸钠(C6H5Na3O7·5H2O)及其混 合物或由其组成的组。
氯化镁(MgCl2)和磷酸氢二钾(K2HPO4)是优选的吸湿盐， 磷酸氢二钾(K2HPO4)是最优选的吸湿盐。因此，在一个特定实 施方式中，脱水微生物被至少一个包被层所包裹，所述包被层包 含K2HPO4作为吸湿盐或包含包括K2HPO4的吸湿盐的混合物。
在特定实施方式中，脱水微生物被包含MgCl2的至少一个包 被层所包裹。在特定实施方式中，脱水微生物被由MgCl2组成的 至少一个包被层所包裹(表1的样品25)。
在特定实施方式中，包被层包含至少两种吸湿盐的混合物。
重要的是，包被层的pH与包被脱水微生物的生存力相容。 用于包被本发明脱水微生物的合适pH可以通过几种方法获得。 取决于选择用于制备本发明包被层的化合物的性质，包被层的 pH可以很容易地与微生物的生存力相容。例如，制备由中性吸 湿盐组成的包被层可以得到适合的pH。在那种情况下，不需要 调节包被层的pH。
由于一些材料比其它材料的酸性更强，可以通过合适地组合 包被层的化合物而获得相容的pH。
或者，可以通过将标准碱(例如NaOH、KOH)或酸(例如 乳酸)加入包被层溶液中来调节pH。例如，欲制备含K2HPO4作 为吸湿盐的包被层的人可以加入如乳酸的酸以降低所得包被层的 pH，因为K2HPO4是弱碱性盐。他也可以通过加入一定比例量的 KH2PO4和K2HPO4而制备混合物以降低所得包被层的pH(因为 KH2PO4的酸性)。
因此在特定实施方式中，脱水微生物被包含至少K2HPO4和 至少一种酸的至少一个包被层所包裹。在另一个特定实施方式 中，包被层包含至少K2HPO4和KH2PO4。
与包被的脱水微生物生存力相容的pH根据菌株不同而变 化，但它通常应为5.5到7.9，优选6到7.5。根据其组成，在包 被层施加到脱水微生物上的过程中、包被的脱水微生物在干燥条 件下储存的过程中、将包被脱水微生物加入最终产物和储存期间 以及在微生物复水之后，本发明的包被层具有适于增强微生物生 存力的pH值。通常，当以10wt％的量再溶解/重悬于水中时，本 发明的包被的脱水微生物提供了pH为5.5至7.9的溶液/悬浮 液。
包被层也可以包含按干重计为0至60％的非吸湿盐或其混合 物。在特定实施方式中，包被层包含5％至60％，优选10％至 60％，优选15％至50％，更优选20至35％的非吸湿盐或其混合 物。在特定实施方式中，包被层包含小于50％，或小于40％，或 小于30％，或小于20％，或小于10％或小于5％的非吸湿盐或其 混合物。
在一个实施方式中，本发明包被层的非吸湿盐选自于包括磷 酸二氢钾(KH2PO4)、三水合醋酸钠(CH3COONa·3H2O)、二水合硫 酸钙(CaSO3·2H2O)、硫酸钠(Na2SO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸钾 (K2SO4)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、碳酸钙(CaCO3)、乳酸钙 ((CH3CHOHCOO)2Ca)、四水合柠檬酸钙((Ca3C6H5O7)2·4H2O)、 二水合柠檬酸钠(HOC(COONa)(CH2COONa)2·2H2O)及其混合物 或由其组成的组，磷酸二氢钾(KH2PO4)是最优选的非吸湿盐。
在一个实施方式中，包被层包含磷酸二氢钾(KH2PO4)。
在特定实施方式中，本发明包被层包含至少一种吸湿盐和至 少一种非吸湿盐的混合物。在特定实施方式中，脱水微生物被至 少一个包含磷酸氢二钾(K2HPO4)和磷酸二氢钾(KH2PO4)的包被层 所包裹。在特定实施方式中，脱水微生物被至少一个由磷酸氢二 钾(K2HPO4)和磷酸二氢钾(KH2PO4)组成的包被层所包裹。在特定 实施方式中，包被层包含磷酸氢二钾(K2HPO4)和三水合醋酸钠 (CH3COONa·3H2O)。它们的比例可以是1∶99至99∶1。它们可以 等摩尔比例存在。
任选地，包被层可包含其它成分，比如多羟基化合物、抗粘 剂、具有保健和/或营养益处的化合物(抗氧化剂、维生素、矿物 质、益生元、多肽、蛋白质...)、水胶体、填充剂、润滑剂、粘 合剂、酸、碱、疏水物质、聚合物及其混合物。这些其他任选成 分的量优选为按干重计0至70％，更优选10％至60％，甚至更优 选17至40％。
这些任选组分可以用于改善包被层的可加工性(即施加到脱 水微生物上)。例如滑石和淀粉(乳清淀粉、大米淀粉)是可用 作包被层的抗粘剂的惰性成分。这些任选成分也可以用于为最终 产物带来另外的益处/效果(例如补充维生素)。它们也可以用于 将包被层的pH调节至“与包被的脱水微生物的生存力相容”的 值。
“多羟基化合物”通常选自于糖类、碳水化合物、聚醇(或多 元醇)、其衍生物和其混合物。甘露醇可以作为多元醇的一个实 例。糖可以是天然和合成的单糖和多糖。多糖是指含两个或更多 个单糖单元的糖。淀粉和改性淀粉可以作为多糖的实例。
单个多羟基化合物可以单独使用或与其它类型的多羟基化合 物组合使用。在种类广泛的可用的多羟基化合物中，优选使用单 糖和多糖或如糊精的淀粉水解产物及其混合物。在本发明中，优 选使用如麦芽糖、乳糖和蔗糖的双糖，最优选蔗糖。
依照本发明可使用的“抗粘剂”(也被称为“抗粘结剂”或“抗结 块剂”)包括滑石、二氧化硅(沉淀或煅制二氧化硅)、淀粉 (包括来源于土豆、玉米、乳清、大米、马铃薯的天然淀粉)。 滑石和大米淀粉是最优选的试剂之一。
本发明的包被层可以包含具有保健和/或营养益处的化合物， 如抗氧化剂、维生素、矿物质、益生元、多肽、蛋白质...
通常，本发明的包被层可以包含的“抗氧化剂”可以选自于谷 氨酸一钠、抗坏血酸(维生素C)、乳糖酸、叔丁基氢醌、谷胱 甘肽、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯、α-生育酚(维生素 E)、多酚、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、EDTA。
“益生元”被定义为通过选择性地刺激一种或有限数目的有益 细菌的生长和/或活性而对宿主产生有益影响的非消化性食物成 分。益生元通常为在上消化道不被降解或吸收的非消化性碳水化 合物(寡糖或多糖)或糖醇。市售产品中使用的并根据本发明有 用的已知益生元包括菊粉(果寡糖或FOS)和反式半乳寡糖 (GOS或TOS)。其它适宜的益生元包括帕拉金糖寡糖 (palatinoseoligosaccharides)、大豆寡糖、龙胆寡糖、木糖寡聚体 (xylooligomer)、非可降解淀粉、乳蔗糖(lactosaccharose)、乳果 糖、乳糖醇、麦芽糖醇、葡聚糖(即)等等。
通常，“肽”是一般含有少于50个氨基酸的化合物。肽可以是 寡肽(10个氨基酸或更少)或多肽(多于10个氨基酸)。
“蛋白质”是一般包含多于100个氨基酸的化合物。作为蛋白 质的实例，我们可以提到成膜蛋白，如乳清蛋白、酪蛋白酸盐、 酪蛋白和球蛋白。在特定实施方式中，蛋白质是非酶性蛋白。
通常，本发明的包被层中可以包含的“填充剂”选自于滑石和 二氧化硅(沉淀或煅制二氧化硅)。
通常，可以特别地加入“酸”和“碱”以获得与本发明的包被脱 水微生物的生存力相容的pH。在可以使用的种类广泛的酸和碱 中，优选乳酸、氢氧化钠和氢氧化铵。
通常，本发明的包被层中可以包含的“润滑剂”选自于硬脂酸 镁和丙二醇。
通常，本发明的包被层中可以包含的“水胶体”是角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶、瓜尔胶。
通常，本发明的包被层中可以包含的“粘合剂”可以是例如麦 芽糊精。
通常，本发明的包被层中可以包含的“疏水物质”选自于脂 肪、脂肪酸、如单和双甘油酯的乳化剂、油、蜡...
通常，本发明的包被层中可以包含的“聚合物”的部分实例是 来源于土豆、玉米、乳清、大米、马铃薯、木薯的天然或改性淀 粉；环糊精；纤维素和纤维素衍生物(纤维素酯、纤维素醚)；低 渗透性聚合物(例如虫胶、HPMC、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二 醇)。
因此在特定实施方式中，本发明特别地涉及包被的脱水微生 物，其包含被至少一个包被层包裹的脱水微生物，所述包被层包 括按干重计为：
-至少25％的吸湿盐或其混合物，
-15％至50％的非吸湿盐或其混合物和/或10至60％的任选成 分，
并且其中包被层的pH与包被的脱水微生物的生存力相容。
根据典型的实施方式，包被层由K2HPO4(吸湿盐)和 KH2PO4(非吸湿盐)组成。在特定实施方式中，包被层由 K2HPO4(50-85％)和KH2PO4(15-50％)组成。在特定实施方 式中，K2HPO4和KH2PO4为等摩尔的量(50％)。
根据典型实施方式，包被层包含或由K2HPO4(吸湿盐)或 含K2HPO4的盐混合物以及任选成分(滑石、大米淀粉和/或蔗 糖...)组成。优选包被层为K2HPO4(60-90wt％干重)和滑石 (10-40wt％干重)。本发明的尤其优选的包被层为K2HPO4(83wt ％干重)和滑石(17wt％干重)(见表1的样品27)。
本发明的另一种尤其优选的包被层可以通过混合KH2PO4(非吸湿盐)和NaOH(任选成分)而获得。加入NaOH使得可以 将包被层的pH调节至pH 6.5，且它也可以与KH2PO4反应而令 人惊讶地提供适宜的吸湿性包被层。非束缚于任何理论，发明人 相信NaOH的加入改变了溶液中盐的平衡，并且在施加到脱水微 生物上时，KH2PO4的非吸湿特性发生改变。例如特定的包被层 为K2HPO4(83wt％干重)和滑石(17wt％干重)(见表1的样品 28)。
磷酸的三个pKa值为2.16、7.21和12.32。因此，对于低于 2.16的pH，磷酸盐将主要以H3PO4的形式存在于水性溶液中。 对于2.16和7.21之间的pH，磷酸盐将主要以H2PO4-的形式存在 于水性溶液中。对于7.21和12.32之间的pH，磷酸盐将主要以 HPO4--的形式存在于水性溶液中。pH高于12.32时，磷酸盐将 主要以PO4---的形式存在于水性溶液中。
至于样品28(KH2PO4)，磷酸盐将主要以H2PO4-的形式存 在于溶液中。在用碱调节pH之前，这一盐溶液的pH为5(见样 品16的pH值，表20)。当碱加入K2HPO4中时，平衡从H2PO4-的形式向形成HPO4-的形式转变。*因此，通过加入碱(或酸) 改变盐的pH可以显著改变溶液中的磷酸盐形式。因此，通过加 入碱(或酸)改变盐的pH也可以因为溶液中磷酸盐形式的改变 而在处理时显著改变盐的吸湿性。事实上，我们知道K2HPO4(在溶液中主要为HPO4-的形式)在干燥状态下是吸湿盐，而 KH2PO4(在溶液中主要为H2PO4-的形式)在干燥状态下是非吸 湿盐。事实上，样品28进行的pH调节导致HPO4-形式的增加， 然后在处理后这产生吸湿盐的包被层。通过调节盐溶液的pH， 处理后可以在包被层中获得吸湿盐，即使在液体包被组合物中所 用的盐初始为非吸湿性的。
根据典型的实施方式，包被层包含或由K2HPO4(吸湿盐) 和非吸湿盐(三水合醋酸钠、KH2PO4...)和至少一种任选成分 (滑石、淀粉、蔗糖...)组成。本发明的尤其优选的包被层为 K2HPO4(30wt％干重)、三水合醋酸钠(30wt％干重)、蔗糖(17wt ％干重)和滑石(14wt％干重)(见表1的样品26)。
另一种优选包被层为K2HPO4(25-65wt％干重)、KH2PO4(15-50wt％干重)和滑石(10-30wt％干重)。本发明的特别优选的 包被层为K2HPO4(48wt％干重)、KH2PO4(35wt％干重)和滑石 (17wt％干重)(见表1的样品10)。另一种尤其优选的包被层由 K2HPO4(63wt％干重)、KH2PO4(20wt％干重)和滑石(17wt％ 干重)组成(见表1的样品22)。
另一种特别的包被层由等摩尔量的K2HPO4和KH2PO4与滑 石组成。
根据另一个典型实施方式，包被的脱水微生物包含被含有或 由K2HPO4(吸湿盐)和KH2PO4(非吸湿盐)及几种任选成分 (例如蔗糖及滑石或淀粉)组成的至少一个包被层包裹的脱水微 生物。优选的包被层为K2HPO4(25-50wt％干重)、KH2PO4(20- 40wt％干重)、蔗糖(10-30wt％干重)和滑石(10-30wt％干重)，更 优选包被层为K2HPO4(30-45wt％干重)、KH2PO4(25-35wt％干 重)、蔗糖(15-25wt％干重)和滑石(10-20wt％干重)。本发明的尤 其优选的包被层为K2HPO4(40wt％干重)、KH2PO4(29wt％干 重)、蔗糖(17wt％干重)和滑石(14wt％干重)(见表1的样品 11)。
发明人推测包被层的高MHC或高MUR是包被层中所含的 吸湿盐的物理特性和包被层的结构所导致的结果。事实上，吸湿 盐能够在不改变微生物生存力的情况下吸收或保留包被的层中的 水分，这是令人惊讶的。当发明人制备包含被含有吸湿盐的至少 一个包被层包裹的脱水微生物的包被脱水微生物时，他们发现含 这种吸湿盐的这一包被层产生无定形或部分无定形(半晶体)的 状态，尤其当使用导致包被层快速脱水的技术(喷雾干燥或流化 床涂覆)时。吸湿将取决于吸湿盐的量和性质以及最终包被层的 结构。不希望被理论束缚，发明人假设这种无定形或部分无定形 状态可以部分地解释增强的微生物生存力。事实上发明人已经证 明当包被层在被处理以获得干燥包被层时(“在被处理时”是指在 施加到脱水微生物上时)不完全是晶体时，其吸湿能力显著较 高，并且生存力相比于非吸湿性的包被层令人惊讶地增强。干燥 状态的包被层赋予的益处与固体包被层可吸收的水分的量有关， 对于无定形(非晶体)或对于部分无定形(半晶体)包被层来 说，该量较大。无定形或部分无定形(半晶体)状态允许更多的 水分吸收进入包被层体相中。包被层中无定形结构的存在导致更 高的MUR以及吸湿百分比的持续增加。相对低百分比的无定形 材料可以将相当大量的水分吸收入其结构中(Encyclopedia of Pharma tech，卷6)。MUR和MHC将取决于吸湿盐的量和性质 以及最终包被层的结构。
发明人已经表明当包被层在处理时(即施加到脱水微生物上 时)为无定形或非完全晶体时，其吸收水分的能力显著更大，并 且生存力相比于非吸湿性的包被层令人惊讶地增强：干燥状态的 包被层所赋予的益处与固体包被层可以吸收的水分量有关，且对 于无定形(非晶体)或部分无定形(半晶体)包被层来说，该量 较大。
根据本发明，“晶体状态”是指该状态的特征为具有长范围原 子序列的完全有序的晶格，而“非晶体”(或“无定形”)状态的特 征为不存在原子位置的长范围序列的无序晶格。这代表两种极端 晶格序列，且中间状态是可能的。原则上，假定在足够高的干燥 状态下，任何液体组合物都可以制成无定形固体。干燥降低了分 子移动性。如果干燥速率比分子可组织成热力学更有利的晶体状 态的速率更快，那么将会形成无定形固体。相反，如果分子具有 足够时间组织成具有二维或三维序列的结构，那么将会形成晶体 (或半晶体)固体。也可以通过干扰初始组分的结晶能力的添加 剂来产生无定形材料。
当一种吸湿盐/多种吸湿盐以单独/共同或以与至少一种非吸 湿盐和/或至少一种其它任选成分的混合物形式使用使得能够快速 脱水的技术如流化床涂覆处理时，会产生低结晶度的无序固体。 这种“低结晶度”状态在干燥状态中具有有益的效果。事实上，干 燥状态所赋予的益处与固体可以吸收的水分量有关，对于表现无 定形结构的包被层，该量较大。
为了制备本发明的脱水包被微生物，因此优选使用能获得产 生部分或完全无定形包被层的干燥固体的工艺。例如，流化床涂 覆是制备包被脱水微生物的最优选技术之一，因为它导致快速脱 水并且能产生无定形结构。
在一个实施方式中，在包被层被处理(即包被层被施加到脱 水微生物上)时，所述存在于包被层中的盐(吸湿盐和非吸湿 盐)具有最高达60％，优选最高达50％，更优选最高达40％，甚 至更优选最高达30％的盐结晶度(晶体形式盐的克数除以包被层 的克数)。
包被层中存在的盐的结晶度在处理时的包被层上测定，也就 是说在液体包被组合物施加到脱水微生物上并干燥之后。根据本 发明，“结晶度”的表述是指包被层中盐的分数量，表示为通常以 结晶状态存在的质量百分比，包被层中剩余的盐以无定形状态存 在。
结晶度可以用本领域技术人员已知的各种技术测定，比如i) X-射线衍射(见Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology， 2002)或ii)等温差示扫描量热法(等温DSC)(Kedward， MacNaughtanm Blanchard and Mitchell，1998)。
当使用X-射线衍射(XRD)时，化合物的每种晶体形式的X- 射线衍射图是独特的，该技术广泛应用于固相的鉴定和表征。该 技术也可以揭示化合物结晶性的差异。无定形(非晶体)化合物 的XRD图将由一个或多个宽扩散晕组成(Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology，2002，第3005页)。
根据本发明的结晶度也可以用DSC(差示扫描量热法)测定。 例如，配备内容冷却器的Netzch DSC 204(Netzsch，德国)用于 所有测定，根据测试A，以N2为冲洗剂。测试A由下列实验方 案构成：称取10mg包被层样品，立即气密封闭入铝制DSC盘 中。通过首先冷却并将中样品在初始温度-50℃下保持2分钟来进 行扫描。然后将样品以12℃min-1从-50℃加热至330℃，并在 330℃保持3分钟。在实施例11中使用该测试以表征通过流化床 干燥获得的包被层的无定形状态。如实施例11所述，对与用于 包被脱水微生物的同样条件下制备的包被层本身进行测试。因 此，图10-12中所示的温谱图即为本发明包被层结构的特征。包 被层的盐的结晶度与下层脱水微生物的存在无关，因为其各自由 独立的层构成。
也可以用其它合适的技术测定结晶度，比如测量包被层对温 度变化的响应的TMA(热机械分析)技术，并可以测定无定形 结构的玻璃转化温度特征。该技术采用置于包被层内的探针。
根据特定实施方式，包被层在25℃和75％相对湿度(RH) 下7天后的吸湿速率(MUR)为至少15％，优选至少20％，优选至 少30％。
根据特定实施方式，包被的脱水微生物在25℃，75％相对湿 度(RH)下7天后的吸湿速率为至少8％。
完成吸湿等温线来表征包被的脱水微生物的吸湿性。包被的 脱水微生物(或本发明的包被层)表现出含水量随相对湿度变化 的强烈变化，从而表明了很高的吸湿特性。另外，该图显示了含 水量的持续增加，这是无定形或部分无定形结构的特征。
而且，正如已提及的，用确保快速干燥速率(例如用流化床 涂覆)的方式来加工包被层是有益的，因为这防止了有序结构的 产生，从而导致了固溶体的形成。因此，低晶体结构是处理过程 中相变的结果，且不反映各单个盐的初始固体状态。包含至少 25％吸湿盐或其混合物的部分结晶包被层具有明显更大的吸湿能 力。令人惊讶的是，如果pH与包被的脱水微生物的生存力相 容，脱水微生物的生存力因这种增强的吸湿能力而提高。不希望 被理论所束缚，发明人认为这种现象可能与在处理(尤其当采用 快速干燥技术时)时包被层不是完全晶体的事实部分相关。
在特定实施方式中，本发明的包被脱水微生物在制备后，在 干燥条件下储存期间和最终使用前，在密封条件下15℃至40℃ 储存长达2年时间的稳定性为最低40％存活，优选至少50％存 活，优选至少60％存活，优选至少70％存活，优选至少80％存活 以及优选90％存活。
包含本发明的包被脱水微生物的最终产品(例如在食物产 品、饲料产品、消费者保健产品或农产品中)在储存数个月后 (例如储存1个月后，甚至2个月后，甚至3个月后，甚至5个 月后，甚至9个月后，甚至12个月后，甚至2年后，甚至更 长...)在预期应用中获得高的有活力细菌的存活率，尤其当储存 于环境温度时(例如，从15℃至40℃，尤其20至35℃，例如在 23℃或30℃时)，且尤其当最终产物的水活性(aw)高于0.10 时。因此，本发明的包被层是脱水微生物的稳定包被层。
在特定实施方式中，在aw高于0.10的饲料产品、食物产 品、消费者保健产品或农产品在15℃至40℃的温度下储存12个 月后，本发明的包被脱水微生物能够具有＜1.5LOG，最优选＜ 1.0LOG，最优选＜0.5LOG，最优选＜0.2LOG以及最优选＜0.1 LOG的生存力损失。
生存力损失是在任何暴露之前和之后用cfu(集落形成单 位)测定的活细胞数的减少。其通常用LOG表示。根据本发 明，术语LOG或E或E是指十进制对数，即十的倍乘因子。
在另一种特定实施方式中，在aw高于0.10的饲料产品、食 物产品、消费者保健产品或农产品于15℃至40℃的温度下储存2 年后，本发明的包被脱水微生物能够具有＜3LOG，最优选＜1.5 LOG，最优选＜1.0LOG，最优选＜0.5LOG以及最优选＜0.2 LOG的生存力损失。
本发明的包被层是包裹并保护脱水微生物对抗湿汽和/或热的 稳定包被层。本技术可用于敏感的脱水微生物。“敏感”是指当暴 露于高湿和/或高热时具有低生存力。这些包被的脱水活微生物在 压迫性条件和延长的储存期限(例如至少1个月，或至少2个 月，或至少5个月或至少12个月或至少2年或甚至更长，尤其 当储存于环境温度时，例如，从15℃至40℃，尤其20-35℃，例 如在23℃或30℃，尤其当最终产物的aw高于0.10时)下具有 增加的存活率。另外，如果添加常规外包被层(比如脂肪；脂肪 酸(例如硬脂酸)；乳化剂(如单和双甘油酯)；油；蜡；树脂；低 渗透性聚合物(例如虫胶、sepifilm、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二 醇)；水胶体(例如角叉菜胶、藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶或瓜 尔胶)；可以来源于土豆、玉米、乳清、大米、马铃薯、木薯的 天然或改性淀粉使用的淀粉；环糊精；多元醇(例如甘露醇)；纤 维素和纤维素衍生物(HPMC、纤维素酯、纤维素醚)及其混合 物)，则包被的脱水微生物，尤其是包被的敏感脱水微生物，将 对胃肠道中对增强的生存力不利的pH和/或氧化环境和/或对包括 蒸汽处理的工艺更加耐受，且它将保持其大部分活性。
本发明提供的另一个优势是，尽管使用吸湿盐，获得的包被 脱水微生物不会在环境条件粘在一起。因此获得了具有增强生存 力的脱水微生物的自由流动微粒。
本发明的脱水微生物通常选自于酵母、霉菌、真菌、细菌或 其任意混合物。可以包被一种或数种微生物。
适用的酵母的实例为：克鲁维酵母菌属的种(Kluyveromyces spp)、德巴利氏酵母属的种(Debaryomyces spp)、耶罗威亚酵 母属的种(Yarrowia spp)、拟威尔酵母属的种(Williopsis spp)、 毕赤酵母属的种(Pichia spp)、酵母属的种(Saccharomyces spp)。
适用的真菌/霉菌的实例为：青霉菌属的种(Penicillium spp)、地丝菌属的种(Geotrichum spp)、轮枝菌属的种 (Lecanicillium spp)、单端孢霉属的种(Trichothecium spp)。
适用的细菌的实例为：例如土壤细菌属的种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属的种(Corynebacterium spp)、短杆菌属的种 (Brevibacterium spp)的棒状杆菌细菌或乳酸细菌。
脱水微生物优选是乳酸细菌。根据本发明，术语“乳酸细菌” 包括能产生作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的乳酸或至少 一种其衍生物(包括但不限于丙酸)的任何细菌。因此该术语包 括能产生作为碳水化合物发酵产物的丙酸的丙酸细菌(PAB)。
用于本发明中的细菌优选为通常被认为对动物或人类消费安 全的(即GRAS批准的)乳酸细菌。
合适的乳酸细菌可选自于乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、双歧杆菌属 (Bifidobacterium)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属 (Enterococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、小球菌属 (Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)及其混合物。
通常，微生物是益生微生物或DFM(直接饲喂微生物)。根据 本发明，“益生微生物”或“DFM”是指足量施用时能赋予宿主健康 利益的活的微生物，就益生微生物而言，宿主是人；就DFM而 言，宿主则是动物。最常用的益生微生物或DFM主要是下列属 的细菌和酵母：乳杆菌属的种、链球菌属的种、肠球菌属的种、 双歧杆菌属的种和酵母属的种。
在一个典型实施方式中，本发明的包被的脱水微生物选自于 乳杆菌属。通常，所用的微生物为嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)或植 物乳杆菌(L.plantarum)，更优选申请人所使用的名为嗜酸乳杆菌 的商用嗜酸乳杆菌NCFM或植物乳杆菌Lp115(其根据布 达佩斯条约在2009年2月9日以Danisco Deutschland GmbH， Busch-Johannsen-Str.1 25899，Niebull，Germany的名义保藏在位 于Inhoffenstr.7B，D-38124 Braunscheiwg，Germany的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，保藏号 DSM22266)。
包被的脱水微生物中，以包被脱水微生物的重量计，可包含 104至1014cfu/g，优选107至1011cfu/g。
通常，脱水微生物可以通过如“冷冻干燥”的常规使用的方法 或通过“将微生物喷涂于惰性核心上”而获得。
脱水微生物的制备可以，但不限于冷冻干燥和将微生物喷涂 于惰性核心上。其它可能的方法为1)将微生物或油悬浮的微生 物吸附于多孔惰性载体上，2)微生物的喷雾干燥，随后任选地进 行微生物的团聚、喷雾制粒或高剪切制粒，以及3)本领域技术 人员已知并能提供适于进一步包被的形式的脱水微生物的任何其 它方法。
根据典型的实施方式，将液体包被组合物喷涂于脱水微生物 上以获得本发明的包被的脱水微生物。
因此本发明的优选实施方式是经液体组合物喷涂的脱水微生 物以获得包含被至少一个包被层包裹的脱水微生物的包被脱水微 生物，所述包被层包含按干重计为至少25％的吸湿盐或其混合 物，且其中包被层的pH与包被的脱水微生物的生存力相容。
通常，可使用允许液体包被组合物快速干燥的任何方法将包 被层喷涂于微生物上，以形成非晶体或部分晶体的包被层。包被 优选在流化床类型的包被装置中进行。
在典型实施方式中，已经被至少一层本发明的包被层(也被 称为第一包被层)包被的包被脱水微生物随后可以被至少一个其 他包被层(也被称为外包被层)包被，例如其包含任何常规包被 成分，比如脂肪；脂肪酸(例如硬脂酸)；乳化剂(如单和双甘油 酯)；油；蜡；树脂；低渗透性聚合物(例如虫胶、sepifilm、聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙二醇)；水胶体(例如角叉菜胶、藻酸盐或阿拉 伯树胶或黄原胶或瓜尔胶)；可作为来源于土豆、玉米、乳清、 大米、马铃薯、木薯的天然或改性淀粉使用的淀粉；环糊精；多 元醇(例如甘露醇)；纤维素和纤维素衍生物(HPMC、纤维素酯、 纤维素醚)及其混合物。
除了本发明的包被层(第一包被层)提供的对高温和/或高湿 水平的增强的抗性外，外包被层还允许获得脱水微生物对胃和/或 氧化环境和/或具有不利pH的条件(尤其当包被的脱水微生物特 别敏感时)的增强抗性。它在帮助这些脱水微生物耐受使用蒸汽 处理的工艺(在制备例如饲料产品或调制奶酪的大多数过程中正 是如此)时也是有利的。
通常，本发明的包被层的量为包被的脱水微生物重量的至少 10％，优选为包被的脱水微生物重量的至少20％，更优选至少 30％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少 80％，甚至更优选至少90％。在特定实施方式中，包含脱水微生 物的包被脱水微生物被数层可包含不同组成的本发明的包被层包 裹。然后可以添加包含例如任何常规包被组分的外包被层。
本发明的另一个目的是包含重量至少为包被层组合物中包含 的干燥固体的25％的吸湿盐或其混合物的液体包被组合物。作为 液体包被组合物，必须理解该液体混合物在施加到脱水微生物上 并进行干燥之前制备。所有前面描述的优选实施方式，例如涉及 组分类型和pH范围，也适用于液体包被组合物。
本发明另一个目的是包被脱水微生物的方法，所述方法包括 如下步骤：
(a)制备液体包被组合物，
(b)用步骤(a)后获得的液体包被组合物包被脱水微生 物，优选通过喷涂法获得包被的脱水微生物。
在特定实施方式中，液体包被组合物包含吸湿盐或其混合 物。
该工艺使得能够获得本发明的包被脱水微生物，即包含被至 少一个包被层包裹的脱水微生物，所述包被层包含按干重计为至 少25％的吸湿盐或其混合物，且其中包被层的pH与包被的脱水 微生物的生存力相容。
吸湿盐优选溶解于水性介质中。按干重计为0至60％的非吸 湿盐或其混合物，和/或按干重计为0至70％的其它任选成分也 可以是液体包被组合物的组分。它们可以溶解或悬浮加入液体包 被组合物中。
所有前面描述的优选实施方式，比如例如涉及包被层中所含 组分类型、包被层性质(例如结晶度、MUR...)和/或微生物， 也适用于包被脱水微生物的方法。
根据优选的实施方式，步骤(b)必须在适于确保快速干燥的温 度下进行，从而在保持包被微生物生存力的同时防止包裹脱水微 生物的包被层的盐的结晶。选择处理的温度和持续时间以确保处 理过程中由相变所导致的本发明包被层的无定形或部分结晶性 质。
步骤(a)和(b)可重复数次以提供被数层包被的包被脱水微生 物。这些不同层的组成可以是相同或不同的。
包被脱水微生物的方法可以进一步包括步骤(c)：
(c)用至少一个外包被层包被步骤(b)后获得的包被的脱水微 生物。这种至少的外包被层优选使用常规化合物制成，比如脂 肪；脂肪酸(例如硬脂酸)；乳化剂(如单和双甘油酯)；油；蜡； 树脂；低渗透性聚合物(例如虫胶、sepifilm、聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇)；水胶体(例如角叉菜胶、藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原 胶或瓜尔胶)；可作为来源于土豆、玉米、乳清、大米、马铃 薯、木薯的天然或改性淀粉使用的淀粉；环糊精；多元醇(例如 甘露醇)；纤维素和纤维素衍生物(HPMC、纤维素酯、纤维素醚) 及其混合物。
本发明的液体包被组合物将施加到脱水微生物上，即在单独 的包被层中。
包被的脱水微生物可以用在稳定性上比商购冻干微生物粉末 显示出显著改进的两种优选方法来制备：
1)液体途径(即包括通过流化床干燥将微生物的液体培养物 施加到惰性核心上，见图1A)，或者
2)固体途径(即包括干燥培养物的制备，见图1B)。
“液体途径”方法的概述
制备在压迫性条件和延长的储存期限下具有增加的存活率的 本发明高度稳定脱水微生物的一种方法是“液体途径”方法。该方 法涉及通过用微生物的液体制剂喷涂惰性载体颗粒(即，惰性核 心)而制备初级颗粒。因此初级颗粒由被至少一薄层脱水的活微 生物包被的惰性核心所组成。然后进一步用本发明的包被层包被 初级颗粒。在这种情况下，当微生物的液体培养物喷射到惰性核 心上的情况下，有必要控制含微生物层的配方和处理条件，以使 微生物存活最大化。就含微生物层而言，配方的构成和配方的 pH都需要优化。
制备初级颗粒和包被颗粒的优选方法是通过流化床涂覆。在 这种方法中，通过将惰性核心材料在空气流中流化并将微生物的 液体培养物喷射于核心材料上来制备初级颗粒。选择处理条件以 确保：i)物理产量(即在处理结束时回收的材料与处理过程中加 入材料的比值)最大化，ii)微生物生存力的保持，iii)含微生物 层中的水分残留最小化。
然后进一步用本发明的液体包被组合物喷涂初级颗粒。通过 确保需要量的期望组分和任选组分完全溶解于水性介质(例如蒸 馏水)中或悬浮于液体包被组合物中来制备液体包被组合物。然 后将该液体包被组合物喷涂于以空气流流化的初级颗粒上。选择 处理条件以确保：i)产生部分晶体状态的包被层，ii)物理产量 (即在处理结束时回收的材料与处理过程中加入材料的比值)最 大化，iii)干燥的含活微生物层的再润湿最小化，iv)颗粒表面上 包被溶液的快速干燥，v)在初级颗粒表面上形成均匀分布的多层 包被层结构(见实施例1)。
“固体途径”方法的概述
制备在压迫性条件和延长的储存期限下具有增加的存活率的 本发明的含有活的脱水微生物的高度稳定干燥组合物的另一种方 法是“固体途径”方法。在该方法中，本发明的液体包被组合物在 流化床工艺中直接喷涂于干燥的脱水微生物上。干燥的脱水微生 物可以是冻干粉末。其它用于获得干燥的脱水微生物的可能方法 为α)将微生物或油悬浮的微生物吸附于多孔惰性载体上，β)微 生物的喷雾干燥，随后任选地进行微生物的团聚、喷雾制粒或高 剪切制粒以及δ)本领域技术人员已知的任何其它合适方法。在 优选实施方式中，干燥粉末是冻干粉末。干燥的脱水微生物粉末 可以通过如WO03/018778的现有技术中描述的方法获得。
本发明的另一个目的是一种保护脱水微生物的方法，所述方 法包括通过用包含按干重计为至少25％的吸湿盐或吸湿盐混合物 的至少一个包被层包裹脱水微生物来制备包被的脱水微生物，其 中包被层的pH与包被的脱水微生物的生存力相容。本发明的另 一个目的是包含按干重计为至少25％的吸湿盐或其混合物的至少 一个包被层用于保护脱水微生物的用途，其中包被层的pH与包 被的脱水微生物的生存力相容。
在特定实施方式中，脱水微生物被数层所包被。这些不同层 的组成可以是相同或不同的。
在另一个特定实施方式中，存在至少一个外包被层，其优选 使用常规化合物制成，比如脂肪；脂肪酸(例如硬脂酸)；乳化剂 (如单和双甘油酯)；油；蜡；树脂；低渗透性聚合物(例如虫胶、 sepifilm、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇)；水胶体(例如角叉菜胶、 藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原胶或瓜尔胶)；可作为来源于土豆、 玉米、乳清、大米、马铃薯、木薯的天然或改性淀粉使用的淀 粉；环糊精；多元醇(例如甘露醇)；纤维素和纤维素衍生物 (HPMC、纤维素酯、纤维素醚)及其混合物。
正如已提及的，本发明的包被脱水微生物在制备后，在干燥 条件下储存期间和最终使用前，在密封条件(例如在密封囊中) 15℃至40℃(尤其从20℃至35℃，例如在23℃或30℃时)下 储存高达2年时间的稳定性为最低40％存活，优选至少50％存 活，优选至少60％存活，优选至少70％存活，优选至少80％存活 以及更优选90％存活。
在特定实施方式中，在饲料产品、食物产品、消费者保健产 品或农产品中，尤其aw高于0.10的情况下，于15℃至40℃的 温度(尤其从20℃至35℃，例如在23℃或30℃)下储存12个 月后，本发明的包被脱水微生物的生存力损失＜1.5LOG，最优 选＜1.0LOG，最优选＜0.5LOG，最优选＜0.2LOG以及最优选＜ 0.1LOG。
在特定实施方式中，在饲料产品、食物产品、消费者保健产 品或农产品中，尤其aw高于0.10的情况下，于15℃至40℃的 温度(尤其从20℃至35℃，例如在23℃或30℃)下储存2年 后，本发明的包被脱水微生物的生存力损失＜3LOG，最优选＜ 1.5LOG，最优选＜1.0LOG，最优选＜0.5LOG以及最优选＜0.2 LOG。
因此，本发明的包被层是脱水微生物的稳定包被层。
所有前面描述的优选实施方式，例如涉及包被层中所含组分 的类型、包被层性质(例如结晶度、MUR...)和/或微生物，也 适用于保护脱水微生物的方法(或用途)。
本发明的另一个目的是制备食物产品、饲料产品、消费者保 健产品或农产品的方法，其中将本发明定义的或根据本发明的制 备方法获得的包被脱水微生物加入食物产品、饲料产品、消费者 保健产品或农产品中。
根据本发明，“食物”是指适于人类食用的产品。它们是包含 或由人体必需营养物(比如碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素 或矿物质)组成的材料，并被有机体消化和吸收以产生能量、刺 激生长和维持生命，以用于实际消费的固体、液体或糊状形式存 在。这些材料经常在高温下组合并混合，而且湿度较高。本发明 的包被脱水微生物适合用于食物产品中。它们可以与随后可能烘 焙、蒸汽处理、压制、制粒和/或模制的食品材料(营养棒、奶酪 串、早餐谷物食品等...)相混合。对于蒸汽处理，优选包被的脱 水微生物含有至少一个用常规化合物制成的外包被层，尤其是对 于敏感性微生物。
本发明的包被脱水微生物可用作用于制备如下食品的成分： 营养棒、早餐谷物食品、婴儿配方食品、饼干糕点、糕点混合配 料、零食、均衡食物和饮料、水果馅、蛋糕外皮(cake glaze)、巧 克力面包馅、干酪饼风味馅、水果味蛋糕馅、蛋糕和甜甜圈酥 衣、即食冰激凌面包馅、饼干馅、即用型面包馅、低热馅、甜 点、糖果产品(例如橡皮糖、糖果、巧克力和巧克力块、果仁 糖、口香糖、棒棒糖)、饮料如饮料粉末、软饮料、果汁、含乳 清蛋白的饮料、保健茶、可可饮料、奶基饮料、钙强化的豆浆和 巧克力奶、钙强化的咖啡饮料、基于乳酸菌的饮料、成人营养饮 料、酸化大豆/果汁饮料、无菌/灭菌巧克力饮料、酸奶、饮用酸 奶、奶酪、奶酪串、调制奶酪、冰激凌、冰冻果子露。在食物产 品中，尤其优选营养棒、早餐谷物食品、婴儿配方食品和饮料粉 末。
根据本发明，“饲料”是指适合动物食用的产品，且可以选自 于“宠物食品”(宠物的蛋糕、饼干、咀嚼食物、零食...)，青储 饲料产品和粒状饲料。术语“动物”必须广义理解。它可以是指 “多胃草食动物”，包括但不限于，牛科、鹿科、叉角羚科和骆驼 科。它可以指例如“多胃反刍动物”包括但不限于，牛、绵羊、母 羊、山羊、鹿、骆驼、长颈鹿。它也可以是指如马和猪的“单胃 食草动物”以及驯养动物或宠物(狗、猫、兔、鸟、大鼠、小 鼠、豚鼠、鱼、爬行动物...)。它也可以是指家禽、鸡、小鸡， 还可以是指如虾等来自水产养殖领域的任何类型的动物。
本发明的包被脱水微生物可以加入非粒化的饲料混合物中， 其可随后用蒸汽处理和/或蒸汽制粒或干燥。非粒化混合物是指预 混合料和糊浆。″预混合料″通常包含维生素和矿物质。如谷粒和 粘土的其他成分也可以加入预混合料中。″糊浆″通常包含完全的 动物食料。″粒″是通常通过压缩可以包含本发明的包被脱水微生 物的原始饲料混合物所产生的球形或圆柱形的颗粒。在压缩前， 饲料混合物在调理器中60℃至95℃的温度下用注入蒸汽进行蒸 汽处理30秒至5分钟。正如上文所述的，因为蒸汽处理，优选 包被的脱水微生物含有至少一个用常规化合物制成的外包被层， 尤其是对于敏感性微生物。然后将蒸汽处理的饲料混合物转移至 制粒机或挤出机并最终转移至粒料冷却器。
本发明的包被脱水微生物可以包括在凝胶或其它油递送系统 中以直接补充给动物。它也可以是用于例如表面处理饲料(top dreesing feed)的粉末或其它干燥制剂。
根据本发明，“消费者保健产品”包括膳食补充剂、营养品和 非处方产品。消费者可以是人和/或动物。
根据本发明，“膳食补充剂”(也被称为食品补充剂或营养补 充剂)是指意图提供在个人的膳食中缺失或没有足量消耗的营养 物(如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸或氨基酸)的制剂。膳食补 充剂可以用于人和/或动物消费。
根据本发明，术语“营养品”是指不仅能提供营养效果和/或口 味满意度而且能为消费者产生治疗(或其他有益)效果的功能性 食品。
根据本发明，“非处方产品”是指能防止某种疾病或减少与肠 道健康或免疫健康相关的症状，从而促进肠道健康或改善免疫功 能的非处方药品。例如，这些产品使得可以预防和治疗过敏，预 防和治疗呼吸道感染以及益生微生物和直接饲喂微生物(DFM) 的其它新兴应用。
根据本发明，“农产品”的表述包括生物杀虫剂、生物肥料、 植物护理产品、堆肥和副产品以及生物能产品(生物乙醇，生物 酯)。
这些产品(食品、饲料、消费者保健产品和农产品)可以以 任何形式制备，比如液体、悬浮液、半固体、片剂、胶囊、颗 粒、丸剂、粉末、凝胶或其它递送体系等等。在典型的实施方式 中，本发明的包被脱水微生物可以引入微穿孔吸管或任何其它微 穿孔包装技术或设备中。
所有前面描述的优选实施方式，例如涉及包被层中所含组分 的类型、包被层性质(例如结晶度、MUR...)和/或微生物，也 适用于制备食物产品、饲料产品、消费者保健产品或农产品的方 法。
本发明的另一个目的是包含本发明定义或获得的包被脱水微 生物的食物产品、饲料产品、消费者保健产品或农产品。包含本 发明的包被脱水微生物的最终产品在储存数个月后获得了高细菌 存活率(例如储存1个月后，甚至2个月后，甚至3个月后，甚 至5个月后，甚至9个月后，甚至12个月后，甚至2年后，甚 至更长...)，尤其当储存于环境温度下时(例如，从15℃至 40℃，尤其20℃至35℃，例如23℃或30℃)，且尤其当最终产 品的aw高于0.10时。
所有前面描述的优选实施方式，例如涉及包被层中所含组分 的类型、包被层性质(例如结晶度、MUR...)和/或微生物，也 适用于包含所述包被的脱水微生物的食物产品、饲料产品、消费 者保健产品和农产品。
本发明另一个目的是可通过本发明的制备方法获得的包被的 脱水微生物。
本发明另一个目的是通过本发明的制备方法直接获得的包被 的脱水微生物。
所有前面描述的优选实施方式，例如涉及包被层中所含组分 的类型、包被层性质(例如结晶度、MUR...)和/或微生物，也 适用于用本发明的制备方法可获得的/获得的包被脱水微生物。
本发明另一个目的是本发明的包被脱水微生物在生产调制奶 酪中的用途，通过下列步骤生产所述调制奶酪：
i)研磨凝乳，
ii)加入水胶体(无熔化盐)以获得最终产物的适当质地，
iii)加热至60℃，以及
iv)在60℃搅拌，同时加入包被的脱水微生物。
所有前面描述的优选实施方式，例如涉及包被层中所含组分 的类型、包被层性质(例如结晶度、MUR...)和/或微生物，也 适用于包被脱水微生物在生产调制奶酪中的应用。然而，由于在 调制奶酪生产中通常使用蒸汽处理，优选本发明的包被脱水微生 物包含至少一个外包被层，其优选用常规化合物制成，比如脂 肪；脂肪酸(例如硬脂酸)；乳化剂(如单和双甘油酯)；油；蜡； 树脂；低渗透性聚合物(例如虫胶、sepifilm、聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙二醇)；水胶体(例如角叉菜胶、藻酸盐或阿拉伯树胶或黄原 胶或瓜尔胶)；可作为来源于土豆、玉米、乳清、大米、马铃 薯、木薯的天然或改性淀粉使用的淀粉；环糊精；多元醇(例如 甘露醇)；纤维素和纤维素衍生物(HPMC、纤维素酯、纤维素醚) 及其混合物。
本发明的其它特征和优势将在阅读下列非限制性实施例时显 现出来。
附图说明
图1A)是经由液体途径的包被脱水微生物的示意图，其中起 始生物材料是液体微生物浓缩液。
图1B)是经由固体途径的包被脱水微生物的示意图，其中起 始生物材料是冻干微生物粉末。
图2A是储存在23℃的巧克力棒中的包被(样品11)的嗜酸 乳杆菌NCFM的生存曲线图。样品11的组成为：K2HPO4(40％ 干重)、KH2PO4(29％干重)、蔗糖(17％干重)、滑石(14％干重)。
图2B是储存在30℃的巧克力棒中的包被(样品11)和未包 被的(样品2)嗜酸乳杆菌NCFM的生存曲线图。*样品11的包 被层为：K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、蔗糖(17％干 重)、滑石(14％干重)。
图3是75％RH、37℃时包被的嗜酸乳杆菌NCFM的吸湿曲 线图。全部都是通过液体途径制备并且被下列包被层包裹的脱水 嗜酸乳杆菌NCFM：样品10：K2HPO4(48％干重)、KH2PO4(35％干重)、蔗糖(0％干重)、滑石(17％干重)。样品11：K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、蔗糖(17％干重)、滑石(14％干 重)。样品12：K2HPO4(14％干重)、KH2PO4(11％干重)、蔗糖 (54％干重)、滑石(22％干重)。样品13：Na2SO4。样品14： MgSO4。
图4是通过液体途径获得的包被脱水微生物的X-射线衍射 图，其中包被层是以喷涂共处理的K2HPO4(48％干重)、KH2PO4(35％干重)、滑石(17％干重)和0％蔗糖的混合物(样品10)。
图5是通过液体途径获得的包被脱水微生物的X-射线衍射 图，其中包被层是以喷涂共处理的K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、滑石(14％干重)和蔗糖(17％干重)的混合物(样品 11)。
图6是通过液体途径获得的包被脱水微生物的X-射线衍射 图，其中包被层是以喷涂共处理的K2HPO4(14％干重)、KH2PO4(11％干重)、滑石(22％干重)和蔗糖(54％干重)的混合物(样品 12)。
图7是通过液体途径获得的包被脱水微生物的X-射线衍射 图，其中包被层是以喷涂处理的一种非吸湿盐(KH2PO4)和滑石 (样品16)。
图8是通过固体途径获得的包被脱水微生物的X-射线衍射 图，其中包被混合物是以喷涂共处理的K2HPO4(40％干重)、 KH2PO4(29％干重)、滑石(14％干重)和蔗糖(17％干重)(样品 20)。
图9是通过固体途径获得的包被脱水微生物的X-射线衍射 图，其中包被混合物是以喷涂共处理的Na2SO4(样品21)。
图10是样品A(KH2PO4)的DSC温谱图。
图11是样品B(K2HPO4)的DSC温谱图。
图12是样品C(KH2PO4/K2HPO4/蔗糖)的DSC温谱图。
图13是被包含不同组成的包被层包裹的脱水微生物在25℃ 下暴露于0-75％RH 28天时的25℃的水蒸气吸附等温线。全部 都是被如下包被层包裹的流化床干燥的NCFM：样品10： K2HPO4(48％干重)、KH2PO4(35％干重)、蔗糖(0％干重)、滑石 (17％干重)。样品11：K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、 蔗糖(17％干重)、滑石(14％干重)。样品12：K2HPO4(14％干 重)、KH2PO4(11％干重)、蔗糖(54％干重)、滑石(22％干重)。样 品13：Na2SO4。样品14：MgSO4。样品15：K2HPO4(83％干 重)、滑石(17％干重)。样品16：KH2PO4(83％干重)、滑石(17％ 干重)。样品23：K2HPO4(23％干重)、KH2PO4(60％干重)、滑石 (17％干重)。样品24：K2HPO4(19％干重)、KH2PO4(15％干重)、 蔗糖(52％干重)、滑石(14％干重)。
图14是未包被颗粒(核心；核心+脱水微生物)和具有对应 于样品11的盐组成的包被颗粒(核心+盐包被层；包被的脱水微 生物)在25℃下暴露于0-75％RH 28天时的水蒸气吸附等温 线。样品11的包被层：K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干 重)、蔗糖(17％干重)、滑石(14％干重)。
图15是未包被颗粒(核心；核心+脱水微生物)和具有对应 于样品10的盐组成的包被颗粒(核心+盐包被层；包被的脱水微 生物)在25℃下暴露于0-75％RH 28天时的水蒸气吸附等温 线。样品10的包被层：K2HPO4(48％干重)、KH2PO4(35％干 重)、蔗糖(0％干重)、滑石(17％干重)。
图16是未包被颗粒(核心；核心+脱水微生物)和具有对应 于样品15的盐组成的包被颗粒(核心+盐包被层；包被的脱水微 生物)在25℃下暴露于0-75％RH 28天时的水蒸气吸附等温 线。样品15的包被层：K2HPO4(83％干重)、滑石(17％干重)。
图17是未包被颗粒(核心；核心+脱水微生物)和具有对应 于样品13的盐组成的包被颗粒(核心+盐包被层；包被的脱水微 生物)在25℃下暴露于0-75％RH 28天时的水蒸气吸附等温 线。样品13的包被层：Na2SO4。
图18是未包被颗粒(核心；核心+脱水微生物)和具有对应 于样品12的盐组成的包被颗粒(核心+盐包被层；包被的脱水微 生物)在25℃下暴露于0-75％RH 28天时的水蒸气吸附等温 线。样品12的包被层：K2HPO4(14％干重)、KH2PO4(11％干 重)、蔗糖(54％干重)、滑石(22％干重)。
图19是未包被颗粒(核心；核心+脱水微生物)和具有对应 于样品16的盐组成的包被颗粒(核心+盐包被层；包被的脱水微 生物)在25℃下暴露于0-75％RH 28天时的水蒸气吸附等温 线。样品16的包被层：KH2PO4(83％干重)、滑石(17％干重)。
实施例
表1是所有测试样品的总结。一些是指用本发明的包被层包 被的脱水微生物，而其它是用不同组成包被和在压迫条件下不显 示增强的微生物稳定性的脱水微生物。
表1
注：所有的百分比都是指“干燥的”包被层(wt％干重)，样品以包 被的脱水微生物重量的30wt％的第1包被层制备。
实施例1-液体途径-典型组成
在Aeromatic MP-1流化床中，以顶喷模式，用含8％开口的 分布板进行本试验。喷雾嘴是Schlick的1mm喷嘴，其置于整个 过程的最低位置。使用Watson-Marlow泵将喷射物质输送至喷 嘴。
初级颗粒的制备：
通过将含有嗜酸乳杆菌NCFM的液体组合物喷涂惰性载体颗 粒(即惰性核心)来制备初级颗粒。
通过混合以下成分来制备含有微生物(培养混合物)的液体 组合物：
*所用液体培养浓缩物为嗜酸乳杆菌NCFM。
混合物的pH以10M NH4OH调节至7.5。
流化床装有2.8kg蔗糖核心。然后以下列工艺参数将0.8kg培养 混合物喷涂于核心上：
包被层的制备
制备下列液体包被组合物：
通过将蔗糖和钾磷酸盐溶解于水然后分散滑石(作为抗结块 剂加入)来制备该液体包被组合物。混合物的干固体含量为 43.5％。
流化床装有2.4kg初级颗粒。以下列工艺参数将2.8kg液体 包被组合物喷涂于初级颗粒上：
液体包被组合物喷涂于初级颗粒上之后，进行后干燥步骤， 直至排出空气中得到稳定的湿度值。得到的包被脱水微生物对应 于样品11。它的最终组成为：59％惰性核心；8％培养混合物； 33％本发明的包被层。
表1的其它相关的包被脱水微生物(样品10、12-19、22- 28)以同样的方式制备但使用不同的第1包被层组成配方。
一些包被的脱水微生物用常规的外包被层进一步包被以获得 样品17、18和19。使用了下列材料之一：
-由羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素以及来自Seppic(Air Liquid Group的子公司)的硬脂酸组成的LP30；
-Shellac(125，水基虫胶溶液(25％)，来自 Innovative Material Technologies)；
样品4至9的颗粒仅用常规的外包被层包被(不加入本发明 的吸湿盐包被层)。使用了下列材料之一：
LP30；
-虫胶；
-甘油三酯(来自于Danisco的PS 101)，
-来自于Exaflor的TM 50/50(硬脂酸和棕榈酸 的混合物50/50)。
羟丙基甲基纤维素(HPMC，来自于Dow Chemicals的 E15)。
也可以使用以下其它的常规外包被层材料：
-改性淀粉(来自于Roquette Freres SA的RS780 或来自于Grain Processing Corporation的PURE-)；
-单甘油酯，
-单甘油酯和双甘油酯的混合物，
-完全氢化的甘油三酯，
-脂肪酸，
-水胶体。
实施例2-固体途径-典型成
用GF-3(德国Binzen的Glatt Air Techniques制造)以底喷模 式在流化床工艺中制备包被的脱水微生物。
制备下列液体包被组合物(与实施例1中的第一包被层组合 物相同)：
通过将蔗糖和钾磷酸盐溶解于水中然后分散滑石(作为抗结 块剂加入)来制备该液体包被组合物。混合物的干固体含量为约 43％。
装入1000g嗜酸乳杆菌NCFM的冻干粉末并使用55℃的热 床温度流化。然后用下列工艺参数将1180g本发明的液体包被组 合物喷涂于冻干粉末上：
液体包被组合物喷涂于冻干粉末上之后，进行后干燥步骤， 直至排出气体中得到恒定的湿度。
得到的包被脱水微生物的最终组成为：66％冻干微生物； 34％本发明的包被层。得到的颗粒对应于样品20。
表1的其它相关的包被脱水微生物(即样品21)以同样的方 式制备但使用不同的第1包被层配方。
可以用常规的外包被层进一步包被该包被的脱水微生物(样品 20和21无外包被层)。此处可以使用实施例1中所用的同样的外 包被层材料。
实施例3-热稳定性
比较根据实施例1(液体途径)制备的用第一包被层包被的 脱水嗜酸乳杆菌NCFM与用常规包被层：脂肪(PS101/葵花籽油) 或低渗透性聚合物(Sepifilm LP30)包被的脱水嗜酸乳杆菌NCFM 的耐热性。对照由未包被的脱水嗜酸乳杆菌NCFM细胞组成。
将各制剂的1g样品加入单独的密封囊袋中并保持于50℃的 水浴中。
然后，24小时后将各制剂的密封囊袋从水浴中取出，适当稀 释后用标准平板培养方法立即测定有活力的细菌的浓度(表 2)。
表2
RT＝室温
从表2的结果可以观察到，与未包被的脱水微生物(样品 1)、脂肪包被层包被的脱水微生物(样品4)以及Sepifilm LP30包被层包被的脱水微生物(样品6)相比，本发明的包被层 (样品11)显著改善了脱水微生物的热稳定性。
而且，如下面表3所示，可以观察到包被层K2HPO4(48％干 重)、KH2PO4(35％干重)、滑石(17％干重)和蔗糖(0％干重)(样品 10)以及K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、滑石(14％干重) 和蔗糖(17％干重)(样品11)在保护细菌嗜酸乳杆菌NCFM抵御热 方面更有效。事实上，这两个样品的热稳定性远高于：
-包含被含太少量吸湿盐的包被层包裹的脱水微生物的包被 脱水微生物的热稳定性，比如样品12(K2HPO4(14％干重)、 KH2PO4(11％干重)、滑石(22％干重)和蔗糖(54％干重))。
-或包含被不含任何吸湿盐的包被层包裹的脱水微生物的包 被脱水微生物的热稳定性(样品13和14仅包含一种非吸湿盐， 分别为硫酸钠和硫酸镁)。
表3
RT＝室温
为了更好地区分提供高热保护性的盐包被层和提供低热保护 性的盐包被层，还在更严格的条件下测试了样品，例如64℃下 18小时。
表4
正如可以从表4中看到的，可以观察到下列包被层在保护细 菌嗜酸乳杆菌NCFM抵御热方面非常有效：
-K2HPO4(30％干重)、三水合醋酸钠(30％干重)、滑石(14％干 重)和蔗糖(17％干重)(样品26)；
-K2HPO4(83％)、滑石(17％)，pH调节至6.5(样品27)；
-KH2PO4(83％)、滑石(17％)，pH调节至6.5(样品28)；以 及
-K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、滑石(14％干重)和 蔗糖(17％干重)(样品11)，
-MgCl2(100％干重)(样品25)
相反，与样品25、26、27、28和11相比，被不含任何吸湿 盐(样品13和14)或含不足量的吸湿盐(样品12)或pH不合 适(样品15和16)的包被层包裹的包被的细菌嗜酸乳杆菌 NCFM对热的耐受性差得多。
实施例4-调制奶酪加工期间的稳定性
调制奶酪试验涉及下列步骤：
i)研磨凝乳，
ii)加入水胶体(无熔化盐)以获得最终产物的适当质地
iii)加热至60℃，以及
iv)60℃下搅拌。
将未包被(对照)或包被的嗜酸乳杆菌NCFM样品在60℃ 搅拌条件下加入熔融混合物。继续搅拌约1分钟，随后进入模制 阶段。最后，迅速冷却含嗜酸乳杆菌NCFM的模制的调制奶酪。 然后评价包被的嗜酸乳杆菌NCFM在调制奶酪加工过程中的生存 力，并与未包被的脱水嗜酸乳杆菌NCFM(对照)进行比较。结 果如表5所示。
表5
RT＝室温，n.a.不适用(对照)
从实验可以观察到，包含被由本发明包被层组成的第一包被 层包裹并具有含聚合物的外包被层的脱水微生物的包被脱水微生 物(样品17和18)在调制奶酪加工过程后具有显著增强的存活 率。而且，它们也比未包被细菌(样品2)、脂肪包被的细菌 (样品5)、聚合物包被的细菌(样品8)和脂肪包被+聚合物底 层包被的细菌(样品9)具有改进的稳定性。这表明了本发明包 被层的功效。
实施例5-饲料制粒稳定性
用由本发明包被层组成的第一包被层和随后用聚合物外包被 层包被的脱水嗜酸乳杆菌NCFM或植物乳杆菌Lp115用严苛条 件(见下面)制粒。制粒后将这些细菌的稳定性与未包被的脱水 嗜酸乳杆菌NCFM或植物乳杆菌Lp115(对照)相比较。
具体地，将各测试样品(即240g包被的脱水细菌)混合入 10kg预混合饲料中并混合10分钟。然后将这10kg预混合饲料 (含240g包被的脱水细菌)加入大型卧式搅拌器中的150kg饲料 中，并在调理前混合15分钟。然后在饲料制粒前通过将“干蒸 汽”(即3.5至4.5wt％的水)直接注入饲料中在75℃下处理饲料 30秒。用3mm染料获得饲料颗粒。然后通过用风扇吹动其周围 空气而使颗粒冷却。5分钟后，温度降至30℃。在另外15分钟 后，温度再次降至室温。此时，颗粒的干物质含量(％DM)为约 80-90％且aw＞0.10。随后用标准平板培养法测定制粒后剩余的 有活力细菌的浓度。
预混合饲料的组成(玉米基饲料)：
表6
RT＝室温，n.a.不适用(对照)
正如上面表6中所观察到的，与未包被脱水细菌(样品2和 3)相比，用本发明的包被层包被的脱水细菌(样品17和19)在 制粒后的稳定性增强了。
实施例6-在中间湿度粉末中的稳定性
以下列条件研究冻干形式的脱水嗜酸乳杆菌NCFM(对照) 和包被的脱水嗜酸乳杆菌NCFM(以液体途径制备)的生存力：
将初始具有等于0.2的水活性(aw)的来自Roquette的麦芽糖 糊精粉末Glucidex IT6暴露于相对湿度为40％的环境中，直到麦 芽糖糊精的′aw ′达到aw＝0.4并在该值下平衡。
以10％wt的包被细菌和90％wt的麦芽糖糊精粉末的比例将 细菌制剂混入麦芽糖糊精粉末(aw＝0.4)中。然后将10g混合物 置于随后以防湿帽密封的玻璃小瓶中。将小瓶在培养箱中保持在 30℃。每月以标准平板培养方法分析小瓶混合物的有活力细胞的 含量。结果列在表7中。有活力细胞的浓度以CFU/g表示，并表 示为各样品在T＝0时的浓度的百分比。
表7
n.a.不适用(对照)
包含如K2HPO4的吸湿盐但pH不相容的包被层(样品15) 或包含如KH2PO4的非吸湿盐的包被层(样品16)无效果或提供 很有限的效果，而本发明的包被层(样品10和11)在中间湿度 时明显地改善了脱水嗜酸乳杆菌NCFM的生存力，并且相比于未 包被的脱水嗜酸乳杆菌NCFM生存力有着高达13倍的提高(见 表7)。参见实施例13，其证明了pH对K2HPO4包被层的影 响。
实施例7-在营养棒中的稳定性
如下制备棒：
-剧烈搅拌条件下使果胶(GRINDSTED Pectin CF 140B)在热 水中水化，
-使其与玉米糖浆(42DE Corn Syrup)和糖一起混合，
-将果胶浆-玉米糖浆+糖混合物加热至106℃(约12.5％水分 损失，82％干物质)以制备结合糖浆，
-使结合糖浆冷却至55℃，
-将410g冷却的结合糖浆浇于590g Cascadian格兰 诺拉燕麦(granola)谷物上，并彻底混合，
-将该制剂在两张油性羊皮纸之间碾平，并使之冷却，
-将碾平的制剂切成34g的棒(生产时各棒的含水量＝8.1％并 且aw＝0.5)，
-将巧克力融化并在28℃时加入含细菌嗜酸乳杆菌NCFM的 试验样品，
-将6g巧克力-细菌混合物沉积于棒上(即6g巧克力-细菌 混合物涂覆于约34g格兰诺拉燕麦棒上)。
-具有巧克力-细菌混合物的棒储存于23℃(表8和9)或 30℃(表10)，并在23℃或30℃储存1、2、3、5、9和12个月期 间后，用标准平板培养方法测定有活力细胞的浓度。
表8
n.a.不适用(对照)
表8中结果表明，当储存于23℃时，如现有技术中之前描述 的用如脂肪(样品4)、低渗透性聚合物Sepifilm LP30(样品 6)或虫胶(样品7)的常规包被层包被的脱水嗜酸乳杆菌 NCFM没有保持生存力，在25℃储存5个月格兰诺拉燕麦棒中有 活力细胞浓度下降大于1.5LOG，且与未包被脱水细菌(样品 2)相比未提供改善的稳定性。
由于一些最终产品具有可能更低的水活性″aw″，进行相似的 实验，但是具有降低的aw，从而产生稍微更干燥的条件。
表9
n.a.不适用(对照)*25℃储存9个月时计算的保护系数
表9的结果表明，当储存于23℃时，本发明的包被层的存在 (样品11、17和18)导致了比未包被脱水细菌(样品2)改进 的细菌稳定性。样品11提供了长时间周期内(12个月)的最大 保护。
棒的巧克力包被层在23℃下储存12个月后，用本 发明的包被层包被的嗜酸乳杆菌NCFM的生存力仍然很高，例 如，样品11在储存12个月后获得60％的生存力(见图2A)。
表10
n.a.不适用(对照)*30℃下储存9个月时计算的保护系数
当储存于30℃时，与未包被脱水细菌(样品2)相比，本发 明的包被层(样品11、17和18)提供的保护显著增加。
棒的巧克力包被层在30℃下储存9个月后，用本发 明的包被层包被的嗜酸乳杆菌NCFM的生存力比未包被微生物获 得的生存力明显更高，例如，样品11在储存9个月后具有1.5 LOG或高出24倍(见图2B)。样品17和18大于2LOG或超 过80倍。
在表11中，在制备燕麦棒并将其在室温下储存之前，将含 微生物嗜酸乳杆菌的试验样品直接加入冷却的结合糖浆和 Cascadian格兰诺拉燕麦谷物中，并彻底混合。储存6个 月后，用本发明的包被层包被的嗜酸乳杆菌NCFM(样品11) 的稳定性比未包被细菌改进了300倍。
表11
n.a.不适用(对照)*25℃储存6个月时计算的保护系数
实施例8-Optima法式香草奶昔混合物中的稳定性
以下列条件研究冻干形式(样品2)和包被颗粒(样品11、 17和18)中的嗜酸乳杆菌NCFM的生存力：
试验样品与粉末为1∶10的比例将试验样品混入 粉末(商售的aw＝0.35的Optima法式香草 奶昔混合物)中。
然后在单独的密封囊袋中将混合物分为10g的样品。
将囊袋在培养箱中保持在30℃下。
在0时和在30℃储存3、6、9和12个月后，以标准平板培 养方法分析各混合物囊袋的有活力细胞的含量。
表12
n.a.不适用(对照)*30℃储存12个月时计算的保护系数
表12的结果表明，本发明的包被层的存在(样品11、17和 18)导致比未包被脱水细菌(样品2)更高的稳定性。
实施例9-吸湿速率(MUR)测定
含有NaCl饱和盐溶液(为了将封闭的盐调节至75％RH)的 玻璃干燥器保存于25℃下。将开放托盘中的各种样品装入干燥器 中并随时间温育。
为确保精确称重调节所用的试验材料的重量(例如样品质量 ＞2克)和小的样品厚度(例如小于1cm)以避免试验样品中水 分含量的不均匀性。
例如，通过在塑料托盘中加入4.7克K2HPO4盐而进行 K2HPO4盐的MUR测试。塑料托盘有如下特征：
托盘质量：3.4克
托盘面积：10.2cm2(直径为3.6cm的圆形托盘)
托盘高度：1.5cm
对于MUR实验，用待测试样品将圆形塑料托盘填装至其高 度的一半。随后，通过以不同时间间隔对温育期之前和期间的样 品称重而测定样品的吸湿。根据方程1测定各个测试的MUR。
方程1：MUR(t)(以％计)＝(mt-mt0)/mt0
MUR(t)：吸湿百分比
mt0：样品的初始质量
mt：在测试时间的样品质量
表13给出了各种盐在25℃，75％RH暴露2、5和7天后的 吸湿速率(MUR)：
表13
从该表可以得出结论，氯化钙(CaCl2)、无水醋酸钠 (CH3COONa)、氯化镁(MgCl2)、磷酸氢二钾(K2HPO4)和碳酸钾 (K2CO3)被视为本发明的吸湿盐，因为它们在7天时的MUR值 (25℃，75％RH)显著高于20％w/w。
从同一表中也可以得出结论，硫酸镁(MgSO4)、乳酸钙 ((CH3CHOHCOOCa)、硫酸钠(Na2SO4)、碳酸钙(CaCO3)、磷酸二 氢钾(KH2PO4)、三水合醋酸钠((CH3COO)2Na·3H2O)和二水合柠檬 酸三钠(HOC(COONa)(CH2COONa)2)被视为本发明的非吸湿盐， 因为它们在7天时的MUR值(25℃，75％RH)显著低于20％ w/w。
图3显示包被的脱水微生物样品的吸湿速率。含有NaCl饱 和盐溶液的玻璃干燥器(为了将包被的脱水微生物样品调节至 75％RH)保存于37℃。将开放托盘中的各种样品装入干燥器中 并培养3天。随后，通过在不同时间间隔的培养期之前和期间称 重样品而测定样品的吸湿。图3显示3天时间内75％RH和37℃ 下随时间变化的包被脱水微生物的％重量增加。
从表3可以得出结论，包含40％或48％吸湿盐(K2HPO4) 的包被层(样品10和11)比仅包含14％吸湿盐(K2HPO4)和76％ 其它任选成分(滑石和蔗糖)的包被层(样品12)更适合于吸收 水分。这种吸湿的差别与吸湿盐的量和/或与包含吸湿盐的包被层 的结构(例如与处理时的包被层的部分结晶度)有关。以太高其 它任选成分含量(即高于70％，样品12)为代价而具有太少量 吸湿盐(即低于25％)的包被层或仅用非吸湿盐(即样品13中的 Na2SO4，样品14中的MgSO4)的包被层不能有效吸收足够量的 水分。
实施例10-X-射线粉末衍射
对盐包被层涉及对脱水微生物的稳定性影响的性质进行了研 究。使用X-射线衍射分析测定不同盐包被层的“晶体”对“无定形” 的性质。
方法描述：
通过将材料置于样品支架中和使上表面水平进行XRD粉末 分析。样品置于X射线衍射仪中，其中X射线聚焦于样品上。X 射线根据样品中原子排列而散射。如果原子以有序的重复结构排 列，如在晶体中，XRD图将显示一系列尖峰。由于每种晶体材 料产生独特的X-射线衍射图，可通过从样品图中将已知成分除 去，然后将剩余谱图与文库(例如国际衍射数据中心(ICDD) 标准集)或已知参考谱图比较而确定样品成分。
包被的脱水微生物：
-通过液体途径获得的包被脱水微生物，其中包被层是以喷 涂共处理的K2HPO4(48％干重)、KH2PO4(35％干重)、滑石(17％ 干重)和0％蔗糖(样品10)(图4-弱结晶)。
-通过液体途径获得的包被微生物，其中包被层是以喷涂共 处理的K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、滑石(14％干重) 和蔗糖(17％干重)(样品11)(图5-弱结晶，盐不结晶)。
-通过液体途径获得的包被微生物，其中包被层是以喷涂共处 理的K2HPO4(14％干重)、KH2PO4(11％干重)、滑石(22％干重)和 蔗糖(54％干重)(样品12)(图6-弱结晶，少量蔗糖晶体为无水 的，盐不结晶)。
-通过液体途径制备的包被微生物，但具有通过喷涂共处理 的一种非吸湿盐(K2HPO4)和滑石的包被层(样品16)(图7- 主要为晶体)。
-通过固体途径获得的包被微生物，其中包被层是以喷涂共 处理的K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、滑石(14％干重) 和蔗糖(17％干重)(样品20)(图8-弱结晶，因此主要为无定形 的)。
-通过固体途径获得的包被微生物，其中包被层是以喷涂共 处理的Na2SO4(样品21)(图9-主要为晶体，因此少量为无定 形的)。
根据本发明产生的包被层的物理状态表现为部分结晶的。在 高蔗糖含量时(样品12)，盐和蔗糖混合物表现出蔗糖结晶的开 始，但没有盐结晶。然而，如图3所示，高蔗糖含量包被层(例 如样品12)降低了包被层的MUR，并因此低晶体固体状态赋予 的效益显著降低了。
实施例11-差示扫描量热法(DSC)测定结晶度和玻璃转化温度
方法：
用DSC获得本发明包被层的玻璃转化温度和包被层中盐的结 晶度。配备内部冷却器的Netzch DSC 204(Netzsch，德国)用于 所有测定，以N2为冲洗剂。尽可能迅速地将10mg样品称量至 标准铝盘中以避免水分吸附。封闭盘，冷却各样品并在初始温 度-50℃下保持2分钟。然后将样品以12℃min-1从-50℃加热至 330℃，在330℃保持3分钟。
样品的制备：
在用于将包被层施加到本发明脱水微生物上的同样的处理条 件下对制备的干燥包被层进行测试。该测试中分析的包被层不施 加到初级颗粒上以避免核心的干扰。事实上，发现来自核心材料 的峰与包被材料的一些峰在同样的温度下出现。
制备磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)及45％ K2HPO4、35％KH2PO4和20％蔗糖的混合物的30wt％水溶液， 并在流化床中将各种溶液雾化和干燥，分别得到样品A、B和 C。
表14描述了通过DSC分析的干燥盐包被层(样品A、B和 C)的组成，表15总结了用于这些样品的处理参数。样品在 55℃的产物温度时进行后干燥15分钟。
表14
表15
DSC数据的解释(第1部分)：
根据样品A、B和C测定的峰的结晶热来确定本发明的包被 层中盐的结晶度。结晶热取决于样品中存在的结晶材料的量。图 10、11和12显示了这三种样品的温谱图的解释。测定观察的各 结晶峰的晶体熔点(开始温度)和结晶热(以J/g计的面积)并 表示在表16中。
表16
*面积对应于结晶热
对于KH2PO4，测定开始T℃＝255℃的晶体熔点和-244.2J/g 的结晶热。
对于K2HPO4，测定开始T℃＝45℃的晶体熔点和-38J/g的结 晶热。
对于KH2PO4/K2HPO4/蔗糖混合物，
-在256.3℃，即与KH2PO4相同的T℃范围测定了一个峰， 但其结晶热-13.1J/g低于KH2PO4(样品A)的测得值，而且
-在46.8℃，即与K2HPO4相同的T℃范围测定了一个峰，但 其结晶热9.2J/g低于K2HPO4(样品B)的测得值。
考虑到混合物中存在的各磷酸盐的量，例如35wt％KH2PO4和45wt％K2HPO4，而且如果混合物中两种盐都是100％晶体， 各产生的结晶热为
-KH2PO4为85.5J/g(85.5J/g＝-244.2J/gxKH2PO4的35 wt％)和
-K2HPO4为17.4J/g(17.4J/g＝-38.7xK2HPO4的45wt％)
然而，该包被层(样品C)测量值比混合物中两种盐都是 100％晶体时估算的值低得多。
-对应于KH2PO4的开始温度256.3℃的峰为13.1J/g
-对应于K2HPO4的开始温度46.8℃的峰为9.2J/g
因此包被层中各盐的结晶度可以如下确定：
-13.1/-85.5＝15.3％，例如K2HPO4为15.3％晶体，84.7％ 无定形
-9.2/-17.4＝52.9％，例如K2HPO4为52.9％晶体，47.1％无定 形
在1g包被层中，有0.35g KH2PO4和0.45g K2HPO4
0.35gx15.3％结晶度＝0.053g晶体形式的KH2PO4
0.45gx52.9％结晶度＝0.238g晶体形式的K2HPO4
因此，晶体形式的盐的总量(KH2PO4+K2HPO4)为每g包 被层0.2916g(0.053g+0.238g)，因此，在处理时，包被层中盐 的结晶度为29.1％。
DSC数据的解释(第2部分)：另外，图4显示了样品C (35％KH2PO4、45％K2HPO4和20％蔗糖)测得的玻璃转化温 度。Tg的存在暗示包被层的无定形结构的存在，用结晶热的方法 验证了上述途径。
DSC数据解释的结论：以玻璃转化温度确定了流化床干燥的 样品C的半晶体结构。包被层中盐的结晶度被定量为约29％。
实施例12-水蒸气吸附等温线
样品的制备：
根据本发明的方法制备具有各种包被层的包被脱水微生物。 这些包被层等同于表1中所述的那些，样品号10、11、13、14、 15、16、23、24、25、26、27和28的“第一包被层”。
将包被层施加到脱水微生物上(标记为“+细胞”)或直接施 加到不含脱水微生物的核心上(标记为“-细胞”)。所施加的包被 层的量为30wt％。处理参数为：
方法：为了产生吸附等温线，将各个不同的样品置于一系列 玻璃干燥器中，各干燥器包含特定盐的饱和盐溶液，以将样品的 相对湿度(％RH)调节为11.3％、22.5％、32.8％、43％和75％。表 17总结了用于在25℃达到目标相对湿度的盐。
表17
将包含样品的玻璃干燥器置于恒定温度，例如25℃下。各样 品按规则时间间隔(t)称重。根据方程1(前面在实施例9中所 述)测定各测量的吸湿速率MUR(t)，并绘出水蒸气吸附等温线 (MUR(t)＝f(t))，其中MUR(t)代表通过在测量时样品的％重量增 加而测定的吸湿百分比。
附图简要说明
图13是用不同盐包被层组合物包被的微生物在25℃下暴露 于11.3％、22.5％、32.8％、43％和75％RH的相对湿度条件下28 天的水蒸气吸附等温线。
图14至19涉及包含包被脱水微生物的颗粒暴露于11.3％、 22.5％、32.8％、43％和75％RH的各种相对湿度条件下28天的 25℃的水蒸气吸附等温线。
颗粒由如下组成：
-仅仅核心(·)
-核心+细胞层(*)-称为“参照样品”
-核心+盐包被层()
-核心+细胞层+盐包被层(◇)-称为“产物”或包被的脱水微生物
盐包被层是表1中描述为第1包被层的样品，即样品11(图 14)、样品10(图15)、样品15(图16)、样品13(图17)、样品12 (图18)、样品16(图19)。
数据解释(图13、表18和表19)：
水蒸气吸附等温线的吸湿曲线容许对湿度对包被脱水微生物 的含水量的影响进行定量。在25℃，75％RH下，2、7和28天 时测定包被脱水微生物或“产物”的吸湿速率(MUR)(表18)。表 19所示包被层的MUR值为根据方程2计算所得。
方程2：脱水包被微生物MUR(t)，以％计＝(mt-mt0)/mt0
MUR(t)：在时间T时脱水包被微生物的吸湿百分比
mt0：脱水包被微生物样品的初始质量
mt：在测定时间的脱水包被微生物的质量
表18
表18的结果显示，取决于所用的盐包被层，包被脱水微生物 吸收水分的量差异很大。样品25、15、10和11是高度吸湿性 的，每单位重量包被脱水微生物吸收9wt％至19wt％的水分。样 品25(MgCl2)和样品15(K2HPO4)是最吸湿的。另外，图13 中的吸湿分布图显示了含水量的逐渐增高，这是无定形或部分无 定形结构的特征。相反，之前显示几乎不对微生物提供保护的样 品，例如样品13(Na2SO4)、样品14(MgSO4)和样品16(KH2PO4) 吸收可忽略量的水。
根据方程3测定盐包被层的MUR并表示于表19中。
方程2：脱水包被微生物的MUR(t)，以％计＝(mt-mt0)/mt0
MUR(t)：在时间T时脱水包被微生物的吸湿百分比
mt0：脱水包被微生物样品的初始质量
mt：在测定时间的脱水包被微生物的质量
方程3：参照MUR(t)，以％计＝(mt-mt0)/mt0
MUR(t)：在时间T时参照样品(核心+细胞层)的吸湿百分 比
mt0：参照样品的初始质量
mt：在测定时间的参照样品的质量
方程4：盐包被层MUR(t)，以％计＝[产物MUR(t)-(参照 MUR(t)*参照wt％)]/盐包被层wt％，
其中参照样品wt％＝70％，
其中盐包被层wt％＝30％
表19
表19的结果显示，取决于用于包被脱水微生物的盐，在不同 包被层中吸收水分的量差异很大。样品25、15、10和11吸收大 量水分并显示出包被层含水量的强烈改变。样品25(MgCl2)和 样品15(K2HPO4)是最吸湿的。相反，Na2SO4(样品13中)、 MgSO4(样品14中)和KH2PO4(样品16中)吸收可忽略量的水 分，并导致包被层含水量的非常小的改变。
从图14至17的图形显示了具有不同核心材料(仅仅核心， 核心+细胞层)但具有相同盐包被层的颗粒吸收水分量的显著差 异。
如图14、图15和图16所示，包含吸湿盐的盐配方(样品 10、11和15)显示具有和没有细胞的颗粒吸湿量没有差异。
如图17、图18和图19所示，包含少于25％的吸湿盐(样品 12)或仅仅由非吸湿盐组成(样品13和16)的盐配方显示具有 和没有细胞的吸湿量的显著性差异。具有细胞层的颗粒(例如包 被的脱水微生物)与不具有细胞层的颗粒相比吸收了更大量的水 分。该结果显示如果包被层允许水分通过，下层材料将吸收更大 量的水分。当包被层包含少于25％的吸湿盐(样品12)或不含 任何吸湿盐而含非吸湿盐(样品13和16)时，含细胞层的样品 可以观察到这一点。在压迫性条件下这些样品不能维持细胞生存 力。
实施例13-盐包被层的pH对包被脱水嗜酸乳杆菌NCFM存活 的影响。
盐包被层的pH对包被的脱水嗜酸乳杆菌NCFM存活的影响的结果在表20中给出。
K2HPO4是碱性盐，在包被前用乳酸将K2HPO4溶液的pH调 节至pH＝6.5。这导致当以包被的脱水微生物的10wt％水溶液测 量时包被的脱水微生物的pH从pH 8降低至pH 6.5。观察到嗜酸 乳杆菌NCFM抗性的显著增强：
i)在流化床包被期间，嗜酸乳杆菌NCFM的处理存活率从 65％提高至90％
ii)在干燥条件下37℃储存14天后，有活力的嗜酸乳杆菌 NCFM的回收率从7％增加至83％，
iii)在热处理(64℃/18hrs)后，嗜酸乳杆菌NCFM的LOG损 失从大于5.3减至0.6。
pH调节至6.5的K2HPO4包被层保持了吸湿性，其中包被脱 水微生物的吸湿性为：在pH调节前吸收12.8wt％水分，在pH 调节后吸收11.6wt％水分。(条件：75％RH、25℃、6天)。
这些结果显示，需要具有与微生物的生存力相容的包被层 pH。
KH2PO4是酸性盐，在包被前用氢氧化钠(NaOH)将KH2PO4溶液的pH调节至pH 6.5。这导致当包被的脱水微生物以10wt％ 悬浮在水中后测定时，pH从pH 5.0增加至pH 6.5。观察到嗜酸 乳杆菌NCFM生存力损失的显著降低：
i)在流化床包被期间，嗜酸乳杆菌NCFM的处理存活率从 47％提高至100％，
ii)在干燥条件下30℃储存14天后，有活力的嗜酸乳杆菌 NCFM的回收率从2％增加至95％，
iii)在热处理(64℃/18hrs)后，有活力的嗜酸乳杆菌NCFM的 LOG损失从＞5.0减至0.6，
iv)在Aw＝0.4的麦芽糖糊精中储存(37℃/9天)后，有活力的 嗜酸乳杆菌NCFM的回收率从1％增加至44％。
pH调节至6.5的KH2PO4包被层的吸湿性可能急剧增加，其 中包被的脱水微生物的吸湿性从pH调节前的1.3％变为以NaOH 调节pH后的12.8wt％吸湿(条件：75％RH、25℃、6天)。这 些结果显示，通过pH调节，可通过将非吸湿性质转化为吸湿性 质而获得适合的包被层，从而能够在各种压迫性条件下稳定嗜酸 乳杆菌NCFM。
表20
*包被脱水微生物10％水溶液的pH
实施例14-固体途径
在实施例6所述条件下研究冻干形式和包被颗粒(固体途 径)中的脱水嗜酸乳杆菌NCFM的生存力。
以10％wt的包被细菌和90％wt的麦芽糖糊精粉末的比例将 细菌制剂混入麦芽糖糊精粉末(aw＝0.4)中。将小瓶在培养箱中保 持在30℃。在30℃储存2个月后，以标准平板培养方法分析小 瓶混合物的有活力细胞的含量。结果列在表21中。有活力细胞 的浓度以CFU/g表示，并表示为各样品在T＝0时浓度的百分 比。
表21
n.a.不适用(对照)*30℃储存2个月时计算的保护系数
施加到冻干嗜酸乳杆菌NCFM粉末上的本发明包被层(样品 20：K2HPO4(40％干重)、KH2PO4(29％干重)、滑石(14％干重)和 蔗糖(17％干重))能在中间湿度下非常有效地维持嗜酸乳杆菌 NCFM的生存力。本发明包被层稳定脱水微生物的效果已经在之 前按照液体途径制备的包被脱水微生物中证明。现在在本实施例 中证明了本发明包被层对按照固体途径制备的包被脱水微生物也 是有效的。
实施例15-在婴儿配方食品中的稳定性
以下列条件研究冻干形式(样品2)和本发明的包被脱水微 生物(样品11)中嗜酸乳杆菌NCFM的生存力。
以测试样品与婴儿配方粉末1∶10的比例将测试样品混入来自 雀巢的商售″Good Sense Gentle Plus″Instant Baby Formula (Aw＝0.157)中。然后在单独的密封囊袋中将混合物分为10g样 品。将囊袋在培养箱中保持在30℃。在0时和在30℃下储存1、 3、6和9个月后，以标准平板培养方法分析各混合物囊袋的有活 力细胞的含量。
表22
n.a.不适用(对照)*30℃储存9个月时计算的保护系数
表22的结果显示，本发明包被层的存在(样品11)导致稳 定性比未包被脱水细菌(样品2)提高。
机译： 具有增强的稳定性和生存力的涂层脱水微生物
机译： 具有增强的稳定性和生存力的涂层脱水微生物
机译： 包被的脱水微生物具有增强的稳定性和生存能力
