一种利用广西金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法

摘要

本发明公开了一种利用广西金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法，它是以分布于广西桂林地区的野生金线莲进行人工授粉所得的蒴果为外植体，通过种子→原球茎→完整植株→移栽的途径快速繁育种苗。繁育过程中，种子和原球茎使用无激素培养，原球茎不经过继代培养直接分化成苗形成完整的小植株。一颗广西金线莲蒴果通过8~10月的组培培养，可快繁培育出10万株以上的优质组培苗，炼苗移栽成活率达到95％以上。该项技术操作简便，生产成本低，便于大规模工业化生产应用。利用该项技术繁殖金线莲，有利于保持种苗的优良性状，提高种苗使用的安全性，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有十分积极的影响。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种利用金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法。

背景技术

金线莲[Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.]为兰科开唇兰属(金线莲属)多年生草本植物。该属植物有40多种，分布于亚洲热带地区至大洋洲，我国20种，2个变种。金线莲为名贵中草药，享有“药王”、“金草”、“神药”、“乌人参”等美誉，在我国经典医学书籍《本草求源》和《国药大药典》等均有记载。金线莲种子在自然条件下萌发率极低，资源再生较慢，加上长期采挖，种质资源稀缺，已濒临灭绝，难以满足市场需求。广西金线莲是我国分布的3个主要野生居群之一，是行业公认的品质最优的药材，被视为药材珍品。目前已有的研究多以福建、广东和台湾金线莲为主，且主要以茎段为外植体材料进行繁殖，未见有关利用广西金线莲蒴果快速繁育种苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用广西金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法，本方法不仅可以进行工厂化生产以满足市场需求，而且能有效保护野生资源。

本发明一种利用广西金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法，包括如下步骤：

（1）蒴果成熟度的选择：将野外采集的金线莲植株引种在人工资源圃内，于花期选择优良株系进行人工授粉和果实培育，金线莲蒴果在成熟过程中，内部种胚的颜色由乳白色浆状逐渐转变成金黄色的丝状，其中以人工授粉后生长120~150天的未开裂蒴果为最佳材料；

（2）种子的萌发培养：将选取的蒴果材料经外表灭菌处理后，取出内部的种胚，均匀的撒播到萌发培养基上，在温度24~28℃、光照强度20μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养25天后，种子萌发形成原球茎；

（3）原球茎的分化：将播种后形成的原球茎及时转入分化培养基中，在温度24~28℃、光照强度30 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养20~30天，原球茎分化形成带叶的芽苗；

（4）分化苗的增殖及壮苗培养: 将原球茎分化的幼嫩芽苗转入转接到增殖及壮苗培养基里，在温度24~28℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养约30天可培养出4~6cm高的健壮大苗；

（5）生根培养: 经已分化的广西金线莲芽苗转接到生根培养基上，在温度24~28℃、光照强度40μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养约35天可培养出5cm高以上根系发达的完整大苗；

（6）驯化及移栽：经过生根培养的健壮大苗，待根系生长发达后，便可进行出瓶移栽。出瓶前，将试管苗转移到温室大棚内炼苗15~20天，然后将试管苗从瓶中取出，小心地将根部附着的培养基洗净，待植株表面水分稍干便可种植。腐殖土或塘泥均可作为移栽基质，移栽后保持温度为22~28℃，湿度为75% ~80%，成活率达到95％以上。

所述蒴果消毒是将外植体在流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作台上用70%的酒精浸泡60秒，再用0.1%的HgCl₂消毒8分钟，取出用无菌水浸洗5次，用无菌滤纸吸干材料表面水分。

步骤（2）中所述萌发培养基为MS+AC1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH为5.8。

步骤（3）中所述原球茎分化培养基为MS+马铃薯汁200g/L +AC1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH 5.8。

步骤（4）中所述增殖及壮苗培养基为MS+香蕉汁100g/L +AC1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH 5.8

步骤（5）中所述生根培养基为1/2MS+NAA0.5~1.0mg/L+蔗糖20g/L +琼脂6.0g/L，pH 5.8。

 本发明的优点在于：本发明以金线莲蒴果为外植体，通过种子→原球茎→完整植株→移栽的途径快速繁育种苗，建立了金线莲蒴果快速繁殖再生体系，该体系中种子和原球茎使用无激素培养，原球茎不经过继代培养直接分化成苗，形成完整的小植株。该方法具有生长周期短、生产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点；另外，利用该方法繁殖的金线莲种苗，避免了衰退、变异等问题的发生，有利于保持种苗的优良性状，提高种苗使用的安全性，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有十分积极的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例一 

本发明一种利用广西金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法， 包括如下步骤：

（1）蒴果成熟度的选择：将野外采集的金线莲植株引种在人工资源圃内，于花期选择优良株系进行人工授粉和果实培育，金线莲蒴果在成熟过程中，内部种胚的颜色由乳白色浆状逐渐转变成金黄色的丝状，其中以人工授粉后生长120~150天的未开裂蒴果为最佳材料；

（2）种子的萌发培养：成熟蒴果经灭菌处理后，取出内部的种胚，接种到萌发培养基1/2MS+AC1.0g/L+蔗糖30g/L +琼脂6.0g/L上，在温度24~28℃、光照强度20 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养25~35天，种子萌发形成白色原球茎，萌发率为80.3%；

（3）原球茎的分化：将播种后形成原球茎及时转入分化培养基1/2MS+马铃薯汁200 g/L+ AC 1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L、pH 5.8上，在温度24~28℃、光照强度30 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养20~25天，原球茎分化形成带叶的芽苗，分化率为79%，苗高1~3cm。

（4）增殖及壮苗培养：将原球茎分化的幼嫩芽苗转入MS+香蕉汁100g/L +AC1.0g/L+蔗糖30 g/L +琼脂6.0g/L的增殖及壮苗培养基里，培养约30天可培养出4~6cm高的健壮大苗。

（5）生根培养:将培养获得的健壮大苗转入1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖20 g/L +琼脂6.0g/L的生根培养基里，培养约35天，生根率为88.7%，平均株高为5.6cm，此时可出瓶炼苗、移栽。

（6）驯化及移栽：出瓶前，将试管苗转移到温室大棚内炼苗15~20天，然后将生长健壮的试管苗从瓶中取出，小心地将根部附着的培养基洗净，待植株表面水分稍干便可种植。腐殖土或塘泥均可作为移栽基质，移栽后保持温度为22~28℃，湿度为75% ~80%。

实施例二

本发明一种利用广西金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法， 包括如下步骤：

（1）蒴果成熟度的选择：将野外采集的广西金线莲植株引种在人工资源圃内，于花期选择优良株系进行人工授粉，采摘人工授粉后生长90~120天的蒴果，于室内用自来水洗去表面灰尘，并用刀片轻轻削去表面的脏物，然后移至超净工作台内进行无菌操作，先放入75%酒精中浸泡30秒后，转入0.1%HgCl₂ 溶液中消毒8min，期间不断摇动，无菌水漂洗5遍，用无菌滤纸吸干材料表面水分，取出内部的种胚，接种到萌发培养基上，在温度24~28℃、光照强度20 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养25~30天，种子萌发形成原球茎，萌发率为76.3%； 

（2）种子的萌发培养：成熟蒴果经灭菌处理后，取出内部的种胚，接种到萌发培养基MS+AC1.0g/L+蔗糖30g/L +琼脂6.0g/L上，在温度24~28℃、光照强度20 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养25~35天，种子萌发形成白色原球茎，萌发率为82.5%；

（3）原球茎的分化：将播种后形成原球茎及时转入分化培养基MS+马铃薯汁200g/L + AC 1.0 g/L+ 蔗糖30 g/L +琼脂6.0 g/L、pH 5.8上，在温度24~28℃、光照强度30 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养20~25天，原球茎分化形成带叶的芽苗，分化率为100%，苗高2~4cm。

（4）生根培养:将培养获得的健壮大苗转入1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.0g/L的生根培养基里，培养约35天，生根率为100%，平均株高为6.1cm，此时可出瓶炼苗、移栽。

其余均与实施例1相同。

实施例三

本发明一种利用广西金线莲蒴果快速繁育其种苗的方法，    包括如下步骤：

（1）蒴果成熟度的选择：将野外采集的广西金线莲植株引种在人工资源圃内，于花期选择优良株系进行人工授粉，采摘人工授粉后生长120~150天的蒴果，于室内用自来水洗去表面灰尘，并用刀片轻轻削去表面的脏物，然后移至超净工作台内进行无菌操作，先放入75%酒精中浸泡30秒后，转入0.1% HgCl₂ 溶液中消毒8min，期间不断摇动，无菌水漂洗5遍，用无菌滤纸吸干材料表面水分，取出内部的种胚，接种到萌发培养基上，在温度24~28℃、光照强度20 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养25~30天，种子萌发形成原球茎，萌发率为81.9%；

（2）种子的萌发培养：成熟蒴果经灭菌处理后，取出内部的种胚，接种到萌发培养基MS+蔗糖30g/L +琼脂6.0g/L上，在温度24~28℃、光照强度20 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养25~35天，种子萌发形成白色原球茎，萌发率为77.8%；

（3）原球茎的分化：将播种后形成原球茎及时转入分化培养基MS+马铃薯汁100g/L + AC 1.0 g/L+ 蔗糖30 g/L +琼脂6.0 g/L、pH 5.8上，在温度24~28℃、光照强度30 μmol·m^-2·s^-1、光照时间12 h/d的条件下，培养20~25天，原球茎分化形成带叶的芽苗，分化率为100%，苗高1~4cm。

（4）生根培养:将培养获得的健壮大苗转入1/2MS+NAA1.0mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.0g/L的生根培养基里，培养约35天，生根率为100%，平均株高为6.0cm，此时可出瓶炼苗、移栽。

其余均与实施例1相同。

下面表1 至表3显示实例一至三中不同的蒴果成熟度及培养基配方对萌发、继代和生根培养的影响。

表1 不同成熟度种子的萌发情况

表2　不同种子萌发培养基对种子萌发的影响

 培养基组成萌发率（%）原球茎生长情况实施例11/2MS+AC1.0g/L+蔗糖30 g.L +琼脂6.0g/L80.3增殖多，白色实施例2MS+AC1.0g/L+蔗糖30 g.L +琼脂6.0g/L82.5增殖多，白色，部分尖端变为绿色实施例3MS+蔗糖30 g.L+琼脂6.0g/L77.8增殖多，白色

表3　不同球茎分化培养基对球茎分化的影响

 培养基组成分化率（%）分化苗长度（cm）原球茎生长情况实施例11/2MS+马铃薯汁200 g/L + AC 1.0 g/L + 蔗糖30 g/L +琼脂6.0g/L791~3尖端长出叶片，生长速度快实施例2MS+马铃薯汁200 g/L + AC 1.0 g/L + 蔗糖30 g/L +琼脂6.0 g/L1002~4尖端长出叶片，生长速度快实施例3MS+马铃薯汁100 g/L + AC 1.0 g/L + 蔗糖30 g/L +琼脂6.0 g/L1001~4尖端长出叶片，生长速度快

表4　不同生根培养基对生根的影响

 培养基组成生根率（%）平均株高( cm)实施例11/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖20 g/L +琼脂6.0g/L88.75.6实施例21/2MS+NAA0.5mg/L +蔗糖20 g/L+琼脂6.0g/L1006.1实施例31/2MS+NAA1.0mg/L +蔗糖20 g/L+琼脂6.0g/L1006.0