特异结合胰腺癌细胞或组织的核酸适体及其用途

摘要

本发明涉及特异性地识别并结合胰腺癌细胞或组织的核酸适体。所述核酸适体仅与胰腺癌细胞或组织特异性结合，而不与正常胰腺组织结合，因此可有效地作为诊断和治疗胰腺癌的组合物。此外，所述核酸适体不仅能检测胰腺癌晚期细胞系Capan-1，还可检测胰腺癌早期细胞系Panc-1，因此可用于胰腺癌的早期诊断，从而有助于增加胰腺癌患者的成活率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够特异性地识别并结合胰腺癌细胞或组织从而可用于 诊断和治疗胰腺癌的核酸适体及其用途。

背景技术

近年来，已经对用于癌症诊断和治疗的一些生物标记进行了研究。其中， 癌细胞特异性的膜蛋白被认为是最适当的生物标记，因为它们经常以可检测的 量脱落到体液中，且体液的临床表现通常优于活检取样的侵入性方法。除此之 外，膜蛋白还由于它们在癌症成像和靶向治疗策略中的潜在用途而受到关注。

同时，生物标记鉴定领域主要依赖于2D凝胶电泳(2D-GE)质谱分析。 然而，用这种技术来阐明膜蛋白却有相当多的限制。只有30％的总细胞蛋白来 自于细胞膜且这当中只有5％可用2D-GE进行检测。因此，作为另一种选择， 已经开发出膜蛋白的特异探针作为鉴定所结合的靶标的工具。

过去的十年中，可以高亲和力及特异性结合靶标蛋白的核酸探针-适体领 域有所复兴。具体地，为一些疾病相关蛋白开发了适体，这些适体是用SELEX (指数富集配体的系统进化)技术分离的，且它们中有许多目前正处于临床试 验阶段，这些适体本身作为治疗的一部分或作为成像或药物递送的工具(Lee， J.F.et al.，Curr Opin Chem Biol.，10(3)：282，2006；Gilbert，J.C.et al.，Circulation.， 116(23)：2678，2007)。

除了以前的SELEX技术以外，用细胞SELEX技术可筛选针对活细胞和 组织等复杂靶标的适体(Guo et al.Int.J.Mol.Sci.，9(4)：668，2008)。细胞SELEX 技术的优势在于即便是未知的表面标记靶标，SELEX技术也可开发用于疾病 细胞的适体。此外，细胞SELEX技术比以前的SELEX法更有优势，因为靶 标蛋白处于分离状态下时不能显示它们的原有性质，因而在筛选过程中，处于 生理状态下的靶标蛋白的功能性较好。因此，用细胞SELEX法首先开发了腱 生蛋白-C的ssDNA适体(Daniels et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 100(26)：15416，2003)，然后也开发了急性髓细胞的PTK7(蛋白酪氨酸激酶)适体 以及小肺癌细胞的DNA适体(Chen H.W.et al.，Chem.Med.Chem.，3(6)：991， 2008)。用消减SELEX技术合成了可结合分化的PC12细胞但不结合亲代细胞 的DNA适体，从而可用于临床诊断(Brand，R.&Mahr，C.，Curr.Gastroenterol. Rep.，7(2)：122，2005；Lee，M.X.&Saif，M.W.，Jop.，10(2)：104，2009)。然而，因 为细胞表面蛋白酶的复杂性，细胞SELEX技术需要经过优化和特异筛选过程 来进行限制性控制。因此，适当的阴性筛选过程对细胞SELEX法的成功是至 关重要的。

同时，胰腺癌是全世界第14位常见的癌症，单在美国就是排行第四的致 死性癌症。这些胰腺肿瘤中约90％是导管腺癌(PDAC)(Bardeesy，N.&DePinho， R.A.，Nat.Rev.Cancer，2(12)：897，2002)。这是一种中期生存率非常低的、侵袭 性的恶性肿瘤。相关的高死亡率可归咎于低劣的预测方法和对传统化疗手段的 深度排斥(Koliopanos，A.et al.，Hepatobiliary Pancreat.Dis.Int.，7(4)：345，2008)。 这些肿瘤中只有15-20％是可切除的，且早期诊断标记不足是实时检测所面临 的一个主要问题(Brand，R.&Mahr，C.，Curr.Gastroenterol.Rep.，7(2)：122，2005； Lee，M.X.&Saif，M.W.，Jop.，10(2)：104，2009)。因此，有必要发开可改善早期诊 断且有助于开发有效治疗剂的新型胰腺癌生物标记。

因此，本发明人做出了大量的努力来分离可用于胰腺癌的早期诊断和治疗 的胰腺癌特异性的生物标记。结果，本发明人通过细胞SELEX(指数富集配 体的系统进化)法筛选出了只特异性地结合胰腺癌细胞系的适体，并发现所筛 选出的适体只与胰腺癌细胞系结合而不与正常的胰腺组织结合，从而完成了本 发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种特异地结合胰腺癌细胞或组织的核酸适体。

本发明的另一个目的是提供一种用所述核酸适体检测胰腺癌的方法。

本发明的又一个目的是提供一种诊断或治疗胰腺癌的、包括所述核酸适体 的组合物。

为了达到上述目的，本发明提供了核苷酸长度为20-100nt的核酸适体，所 述核酸适体包括选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：35的核酸序 列或其片段中的任一种，并且可特异性地结合胰腺癌细胞或组织，其中，如果 核酸适体是DNA，则核酸序列中的U为T。

本发明还提供一种用所述核酸适体或包括其化学修饰的核酸适体来检测 胰腺癌的方法。

本发明还提供一种诊断或治疗胰腺癌的组合物，所述组合物包含所述核酸 适体或包括其化学修饰的核酸适体。

本发明还提供一种诊断或治疗胰腺癌的方法，所述方法包括给予所述核酸 适体或包括其化学修饰的核酸适体。

本发明还提供所述核酸适体或包括其化学修饰的核酸适体在诊断或治疗 胰腺癌中的用途。

本发明提供一种诊断胰腺癌的传感器，所述传感器上固定有所述特异性地 结合胰腺癌细胞或组织的核酸适体。

本发明还提供一种诊断胰腺癌的、包含所述核酸适体或包括其化学修饰的 核酸适体的试剂盒。

本发明还提供一种用所述诊断胰腺癌的传感器或试剂盒来检测胰腺癌的 方法。

本发明还提供一种胰腺癌特异性的药物递送组合物，所述药物递送组合物 包含所述核酸适体或包括其化学修饰的核酸适体。

本发明还提供一种用所述核酸适体或包括其化学修饰的核酸适体来检测 胰腺癌细胞特异性的表面生物标记的方法。

通过以下的详细说明及所附权利要求书将更明确本发明的其它特征和实 施方式。

附图说明

图1是示出本发明的特异性地结合胰腺癌细胞或组织的适体的筛选过程 的示意图。

图2示出根据图1所示的示意图，在细胞SELEX法第14轮中所筛选的适 体池的测序结果。

图3是示出细胞SELEX各轮所筛选的适体池对胰腺癌细胞系的结合亲和 力的实时PCR测量结果图表。

图4是一组示出用荧光检测来观察细胞SELEX第14轮所筛选的适体池的 结合亲和力的结果图表。

图5是示出在细胞SELEX第14轮中所筛选的适体池对胰腺癌细胞系或其 它癌症细胞系的结合亲和力的定量实时RT-PCR测量结果图表。

图6是示出本发明的适体对胰腺癌细胞系的结合亲和力的实时RT-PCR测 量结果图表。

图7是一组示出本发明的适体对Capan-1细胞系的结合亲和力图表。

图8是一组示出本发明的适体对Panc-1细胞系的结合亲和力图表。

图9是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ1对胰腺癌细胞系和 正常细胞系的结合亲和力的结果图表。

图10是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ2对胰腺癌细胞系和 正常细胞系的结合亲和力的结果图表。

图11是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ6对胰腺癌细胞系和 正常细胞系的结合亲和力的结果图表。

图12是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ2、SQ4和SQ8对胰 腺癌细胞系Capan-1的结合亲和力的结果图表。

图13是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ2、SQ4和SQ8对胰 腺癌细胞系Pan-1的结合亲和力的结果图表。

图14是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ2、SQ4和SQ8对胰 腺癌细胞系Aspc-1的结合亲和力的结果图表。

图15是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ2、SQ4和SQ8对胰 腺癌细胞系Bxpc-3的结合亲和力的结果图表。

图16是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ2、SQ4和SQ8对胰 腺癌细胞系Hapaf-II的结合亲和力的结果图表。

图17是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ2、SQ4和SQ8对胰 腺癌细胞系Miacapa-2的结合亲和力的结果图表。

图18是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ1-SQ8对胰腺癌细胞 系Capan-1的结合亲和力的结果图表。

图19是一组示出用荧光检测来观察本发明的适体SQ1-SQ8对胰腺癌细胞 系Panc-1的结合亲和力的结果图表。

图20示出了通过截短适体SQ2而获得的适体对胰腺癌细胞系的结合亲和 力的相对比率。

图21示出了适体SQ2的二级结构(图21A)和SQ2 6-30的二级结构(图 21B)。

图22是一组示出用荧光检测来观察SQ2 6-30对胰腺癌细胞系和正常细胞 系的结合亲和力的结果图表。

图23是一组示出用荧光检测来观察SQ2 6-30对非胰腺癌细胞系 SK-N-SH、T98G、A549和Bend-3的结合亲和力的结果图表。

图24是一组示出用荧光检测来观察SQ2 6-30对非胰腺癌细胞系Hela、 Hep G2、LnCap、SK-Br3、T98G、A549和Bend-3的结合亲和力的结果图表。

具体实施方式

除非另有定义，否则本发明所使用的全部科技术语都具有本发明所属领域 的普通技术人员理解的含义。通常，本发明中所使用的术语和下文将描述的实 验方法都是本领域公知的以及常用的。

本发明的详细说明中所用的主要术语的定义如下。

本发明使用的术语“核酸适体”是指以高的亲和力特异性地识别其靶标的 小单链寡核苷酸。

本发明使用的术语“样品”是指待分析的可能包括胰腺癌的标记的组合物。 样品的实例包括胰腺组织、胰腺细胞、血液、血清、血浆、唾液、痰和尿液。

本发明使用的短语“同源性至少90％、但小于100％的核酸序列”是指这样 的核酸序列，其包括对参照序列的一个至数个核苷酸进行添加、缺失或替代， 使所产生的序列与参照序列相比具有至少90％、但小于100％的同源性，并显 示出与参照序列相似的结合胰腺癌细胞的亲和力。

一方面，本发明涉及一种核酸适体，包括选自 AGCUUAUUCAAUURCCUGARDMBBB(R＝G或A；D＝A、U或G；M＝A或 C；和B＝G、C或U；SEQ ID NO：35)组成组的任一种核酸序列和以下SEQ ID  NO：14以及SEQ ID NO：15所列的核酸序列或它们的片段，并且该核酸适体可 特异性地结合胰腺癌细胞或组织。

在本发明中，SEQ ID NO：35所列的核酸序列优选 AGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCU(SEQ ID NO：41)，而包括SEQ ID  NO：35所列的核酸序列并可特异性地结合胰腺癌细胞或组织的核酸适体可包 括选自下列SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：13中的任一核酸序列。

SQ1：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAUUAG CGGUAUCACG AUUACUUACC UUCGUUGCUG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：1)

SQ2：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG CUAUCGCCCA AUUCGCAGUG AUAUCCUUUA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：2)

SQ3：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAC CUGGUCUCUC UGUCAGCAAA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：3)

SQ4：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAGUAG CUGGGUCCGU CCCCACACAU UACCAUUUGU AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：4)

SQ5：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAC UGGUGUACCU CUUUGCCCUA UCUUAUCUGG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：5)

SQ6：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAGAC UGGAUAUACU CUUAAGCAUU UCUAUAAUCG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：6)

SQ7：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAACU GCUGCAUCGU CUCCCACGUA UUACACAUGA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：7)

SQ8：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG UUGAACUCCA AAUACGCGCU G AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：8)

S49：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG UGGCCUCCCU ACAAAGAACU UAUAUCAUCC AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：9)

S20：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG UUUAUCCCCC UUUUAGCGUU UACCAUAAUG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：10)

S59：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU ACCUGAAAAC UGGUUUCCGG CAUCCCGUAU UGCGGCUUUA C AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：11)

S 11：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAGAG CGAAGUAAAU CUCUCACUGC GUCACUACA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO： 12)

S52：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU ACCUGAGUAG CGUUUCCCGG CAUUAUACUA UAAACUU AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO： 13)

S68：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU CCUGAAAGUU UGGAUAUCUU GGCGCUUGAC UAGAAAACUU GAAAUUUGU AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：14)

S3：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU CUUAUGUUCA UGCCAGCGCA AUUGCC AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：15)

上述各适体的5’端和3’端的划线部分是为PCR扩增和cDNA合成而引入 的部分，如可参见以下SEQ ID NO：16。

在此，适体的核苷酸总数可以是20-200nt，并优选20-100nt。优选地，适 体的核苷酸总数可以是25nt或更多，或85nt或更少。如果适体的核苷酸数量 少，则适体的化学合成和大量生产将比较容易且具有成本优势。此外，适体将 容易被化学修饰，在体内高度稳定且毒性低。除此之外，包括在适体内的各核 苷酸可包括一个或多个相同或不同的化学修饰，例如可在核糖的2’位进行任何 原子或基团的核苷酸取代。作为这种原子或基团的实例，可提及用氢原子、氟 原子或-O-烷基基团(如-O-Me基团)、-O-酰基基团(如-O-CHO基团)、或氨 基基团(如-NH₂基团)取代的核苷酸。进一步地，以单链DNA或RNA分子 的形式来提供核酸适体。在本发明中，如果核酸是DNA，则核酸序列中的“U” 将被理解为“T”，而且很明显，对本领域的普通技术人员来说，这些序列都落 在本发明的范围之内。

在本发明的一个实例中，如图1所示，通过SELEX法筛选具有如SEQ ID  NO：1至15所列的核酸序列的适体，然后用实时PCR分析法、荧光检测法和 平衡过滤法来测量所筛选的适体的亲和力。结果发现，SEQ ID NO：1至15所 列的核酸序列确实特异性地结合胰腺癌细胞系。

根据本发明的核酸适体显示了具有共同的保守区，如CCUGA、 GCCUGAAA或AGCUUAUUCAAUURCCUGARDMBBB(SEQ ID NO：35)。这 些共同保守区的存在意味着与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15中的任一核 酸序列具有至少90％、但小于100％同源性的核酸序列是可特异性地结合胰腺 癌细胞系的核酸适体。关于本发明的核酸适体间的序列相似性，如果任何核酸 包括有相对于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15中的任一核酸序列的一个至 数个核苷酸添加、缺失或替代而具有至少90％、但小于100％序列同源性，那 么该核酸将显示出与本发明核酸适体类似的结合胰腺癌细胞系的亲和力。具体 地，在本发明的一个实例中，发现即使本发明适体的5’端和3’端区域部分缺失， 所述适体仍显示出对胰腺癌细胞系的亲和力。此检测结果证明，如果任何核酸 序列包括有相对于本发明的核酸序列的一个至数个核苷酸添加、缺失或替代而 具有至少90％、但小于100％序列同源性，那么该核酸将显示出与本发明核酸 适体类似的结合胰腺癌细胞系的亲和力。

同时，在本发明的另一个实例中，发现包括SEQ ID NO：1到15的核酸序 列的第14轮适体池除了结合胰腺癌细胞系外，基本上不结合其它人癌症细胞 系，表明所述适体池特异性地检测胰腺癌细胞系。具体地，用荧光检测法来观 察分离的适体SQ1、SQ2和SQ6对胰腺癌细胞系和正常人胰腺导管细胞系 (HPEDE)间的亲和力比较。结果发现所述适体特异性地检测分别标志着胰腺癌 末期和早期的胰腺癌细胞系Capan-1和Panc-1，表明了本发明的适体可检测胰 腺癌标记，并因此可有利地用于胰腺癌的诊断。具体地，本发明适体检测Panc-1 的能力表明了所述适体可实现胰腺癌的早期诊断。在本发明的另一个实例中， 发现本发明的核酸适体不仅确实特异性地结合用于阳性筛选过程的胰腺癌细 胞系，而且还结合其它的胰腺癌细胞系，表明了所述适体可有利地用于胰腺癌 的实质诊断。此外，在本发明的另一个实例中，发现本发明的核酸适体不识别 除胰腺癌以外的其它癌细胞系。

因此，在另一方面，本发明涉及一种诊断胰腺癌的组合物，所述组合物包 含上述本发明的核酸适体。

在又一方面，本发明涉及一种用本发明的适体来检测胰腺癌的方法。本发 明的检测方法包括使核酸适体与选自胰腺组织、胰腺细胞、血液、血清、血浆、 唾液、痰和尿液的样品相接触。此外，样品没有特殊的限制并且可以是包含胰 腺癌标记的任何样品，如分离自哺乳动物(优选人类)的样品，和通过微创便 可获得的分泌的体液、体外培养成分等。

当核酸适体接触样品时，核酸适体将特异性地结合样品中存在的胰腺癌标 记。因此，通过用荧光染料或类似物来标记核酸适体并使经标记的核酸适体接 触样品，然后测定胰腺癌标记的信号的存在或缺失来检测胰腺癌。

胰腺癌的生物标记可通过分析结合到核酸适体的样品物质而检测。因此， 在又一方面，本发明涉及一种用核酸适体来检测胰腺癌细胞特异的表面生物标 记的方法。例如，通过将生物素缀合到核酸适体的末端，使核酸适体与来自胰 腺癌细胞系的膜提取蛋白样品结合，并用链霉亲和素缀合的磁性颗粒沉淀适 体，然后用质谱法分析适体来检测特异性地结合适体的表面生物标记。

同时，特异性地结合胰腺癌细胞或组织的核酸适体可固定在常规的支持物 上，如珠子、颗粒、试纸条、纤维、过滤器、膜以及硅烷或硅酸盐支持物(如 玻片)，从而提供可用于诊断胰腺癌的检测传感器。因此，本发明的另一方面 涉及一种诊断胰腺癌的传感器，所述传感器上固定有与胰腺细胞或组织特异性 地结合的核酸适体。

上述固定支持物包括至少一个实质上是硬的表面，可通过任何常规的化学 结合方法将核酸适体固定到所述硬表面上。例如，可通过将生物素缀合到核酸 适体的末端形成缀合物，从而将核酸适体固定到支持物的表面上，并将链霉亲 和素固定到支持物的表面上以诱导固定在支持物表面上的蛋白链菌素和生物 素之间相互作用。

同时，本发明的方法可以以试剂盒的形式提供来，以增加可携带性。具体 地，在另一方面，本发明涉及一种诊断胰腺癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包含 与胰腺癌细胞或组织特异性地结合的核酸适体。如果需要的话，胰腺癌的诊断 试剂盒可包括缓冲溶液和用于进行检测和分析的容器。胰腺癌的诊断试剂盒可 以是瓶、盆、袋、包、管、安瓿及类似的形式，该试剂盒可部分或全部由塑料、 玻璃、纸、箔、蜡及类似物形成。传感器容器可装配有或全部或部分可分离的 盖子，所述盖子可以是容器的原始部件或可以是通过机械、粘着或其它方式附 着于容器。容器也可以装配有塞子并通过注射针来接触内含物。检测试剂盒可 包括外包装，外包装可包括有关组分用途的说明。

此外，本领域公知，特异性地结合癌细胞系的适体可抑制癌症的机制从而 治疗癌症。因此，本发明的适体将特异性地结合胰腺癌细胞或组织以抑制胰腺 癌的机制。因此，本领域的技术人员将理解，包含所述核酸适体的组合物使得 该组合物可用于治疗胰腺癌。

适体可以附着到脂质体或纳米颗粒的表面，从而将脂质体或纳米颗粒中包 含的抗癌剂、毒素、癌生长抑制剂基因或siRNA(小干扰RNA)选择性地递送到 胰腺癌细胞中。已知的胰腺癌特异性药物、诱导癌细胞死亡的毒素、抗癌剂、 已知的自杀基因，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)或胞嘧啶脱氨酶(CD)、 或抑制在胰腺癌细胞生长和转移中扮演重要角色的基因表达的siRNA(小干扰 RNA)可附着到本发明的适体，然后被递送到胰腺癌细胞中。因此，可以以胰 腺癌特异性药物递送组合物的形式来提供本发明的核酸适体(aptamer-siRNA  conjugate：Silence.2010 Feb 1；1(1)：4.″Aptamer-targeted cell-specific RNA  interference.″Zhou J，Rossi JJ.；aptamer-toxin conjugate：Cancer Res.2006 Jun 15；66(12)：5989-92.″Aptamer：toxin conjugates that specifically target prostate  tumor cells.″Chu TC，Marks JW 3rd，Lavery LA，Faulkner S，Rosenblum MG， Ellington AD，Levy M.；aptamer-liposome：Chem Commun(Camb).2010 Jan 14；46(2)：249-51.Epub 2009 Nov 23.″A liposome-based nanostructure for aptamer  directed delivery.″Kang H，O′Donoghue MB，Liu H，Tan W.)。

本发明的适体可以其药物上可接受的盐的形式用于药物组合物中。此外， 本发明的适体可单独使用或与其它药学活性化合物结合使用。

可根据传统方法来配制本发明的药物组合物。例如，它可配制为粉剂、粒 剂、片剂、胶囊剂、悬剂、乳剂、糖浆剂、外用制剂、栓剂和无菌注射剂溶液 的形式。组合物中包含的载体、赋形剂和稀释液包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、 山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、凝胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维 素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟苯酸盐、丙基羟 苯酸盐、滑石、硬脂酸镁和矿物质油。

用常用的稀释液或赋形剂，如填料、膨胀剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂和 表面活性剂进行配制。非经肠道给药的剂型包括无菌的水溶液、无水溶剂、悬 剂、乳剂、冻干剂、栓剂等。可用丙二醇、聚乙二醇、植物油、(如橄榄油)， 或注射用的酯(如油酸乙酯)来制备无水溶剂和悬剂。

可根据患者的状况和体重、疾病的严重度、药物的类型和给药途径及周期 来适当地选择本发明组合物的优选剂量。本发明的组合物可通过多种途径给药 于哺乳动物，包括大鼠、小鼠、家畜和人类。所有给药途径都可考虑，包括， 例如直肠内、静脉内、肌肉内、子宫内、鞘的或脑血管内的注射。

实施例

以下将参考实施例进一步详细描述本发明。显然，对本领域的普通技术人 员来说，这些实施例仅作为解释的目的而不能理解为对本发明范围的限制。

实施例1：分离特异性地结合胰腺癌细胞系的适体

1-1：制备ssRNA文库和用于PCR扩增以及cDNA合成的引物

用PAGE(Genotech Inc.，韩国)化学合成并分离具有以下序列的随机ssDNA 文库。

5′-ATA CCA GCT TAT TCA ATT NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NAG ATA GTA AGT GCA ATC T-3′(SEQ ID  NO：16)

初始文库包含7×10¹³个分子。用SEQ ID NO：17的N40上游引物和SEQ ID  NO：18的N40下游引物进行PCR扩增并及cDNA合成。

上游引物：5′-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCA ATT-3′(SEQ ID NO：17)

下游引物：5′-AGATTGCACTTACTATCT-3′(SEQ ID NO：18)

用Durascribe T7RNA聚合酶(Eqicentre)将扩增的文库转为RNA。在此， 分别使用2′-F UTP和2′-F CTP代替UTP和CTP，从而使生成的RNA中的U 和C的2′-F被2′-OH所代替从而增强对RNA酶的抗性，从而使得在体内应用 RNA成为可能。

1-2：筛选特异性地结合Panc-1和Capan-1的活体

如图1所示，进行人胰腺癌细胞系Panc-1(美国典型培养物保藏中心， American Tissue Culture Collection)和Capan-1(美国典型培养物保藏中心)的阳 性筛选，其中每轮筛选都变换细胞系。

具体地，将实施例1-2中的N40RNA文库在结合缓冲液(含4.5g/L葡萄糖、 5mM MgCl₂、0.1mg/ml酵母tRNA、1mg/ml BSA的Dulbecco′s PBS)中、在 95℃下变性5分钟，然后在冰上终止。然后，用冲洗缓冲液(含4.5g/L葡萄糖、 5mM MgCl₂的Dulbecco′s PBS)冲洗细胞两次，每次5分钟，以去除未结合的 序列，再在4℃下用500nM文库处理5×10⁶生长成单层的细胞(轮流用Panc-1 或Capan-1)30分钟。然后，用冲洗缓冲液收集细胞并在95℃下加热5分钟， 从而洗脱细胞表面的序列。用PCI(酚∶氯仿∶异戊醇提取液；Bioneer，韩国)提取 来分离洗脱后的序列。用ImProm-II^TM反转录体系(Promega，美国)将获得的 RNA进行反转录并通过PCR进行扩增。用T7聚合酶(Ambion，美国)将分离 的PCR产物进行体外转录。

阳性筛选进行10轮后，进行2轮正常的胰腺细胞系HPEDE(Ontario Cancer  Institute，多伦多大学)的阴性筛选，而阳性筛选轮与阴性筛选轮交替进行，如 图1所示。结果，总共进行了14轮的阳性筛选和2轮阴性筛选。

为了筛选具有高亲和力和特异性的适体，用于每轮筛选的细胞数量逐渐减 少到1×10⁶个细胞，冲洗时间逐渐增加到15分钟，且结合缓冲液中的酵母tRNA 的浓度增加了两倍。

结合适体的富集用实时定量RCR(实时qPCR)来定量并于第14轮达到饱和 状态。为此原因，将在第14轮筛选的产物克隆到TA载体(RBC，韩国)中。 用Multialighn软件(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)对所制备的 50个克隆进行测序，并分析不同克隆之间的共同序列。结果，从50个克隆中 获得15个序列，并从而获得如下所示的本发明的RNA适体序列：

SQ1：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAUUAG CGGUAUCACG AUUACUUACC UUCGUUGCUG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：1)

SQ2：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG CUAUCGCCCA AUUCGCAGUG AUAUCCUUUA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：2)

SQ3：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAC CUGGUCUCUC UGUCAGCAAA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：3)

SQ4：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAGUAG CUGGGUCCGU CCCCACACAU UACCAUUUGU AGAUAGUAAGUGCAAAUCU-3′(SEQ ID  NO：4)

SQ5：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAC UGGUGUACCU CUUUGCCCUA UCUUAUCUGG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：5)

SQ6：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAGAC UGGAUAUACU CUUAAGCAUU UCUAUAAUCG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：6)

SQ7：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAACU GCUGCAUCGU CUCCCACGUA UUACACAUGA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：7)

SQ8：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG UUGAACUCCA AAUACGCGCU G AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：8)

S49：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG UGGCCUCCCU ACAAAGAACU UAUAUCAUCC AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：9)

S20：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAAAG UUUAUCCCCC UUUUAGCGUU UACCAUAAUG AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：10)

S59：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU ACCUGAAAAC UGGUUUCCGG CAUCCCGUAU UGCGGCUUUA C AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID  NO：11)

S11：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU GCCUGAAGAG CGAAGUAAAU CUCUCACUGC GUCACUACA AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO： 12)

S52：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU ACCUGAGUAG CGUUUCCCGG CAUUAUACUA UAAACUU AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO： 13)

S68：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU CCUGAAAGUU UGGAUAUCUU GGCGCUUGAC UAGAAAACUU GAAAUUUGU AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：14)

S3：5′-AUACCAGCUUAUUCAAUU CUUAUGUUCA UGCCAGCGCA AUUGCC AGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(SEQ ID NO：15)

每个适体的5′端和3′端的下划线部分与为PCR扩增和cDNA合成而引入 的部分相对应，如可见于SEQ ID NO：16，且SEQ ID NO 1-15的核酸序列共同 包括所述下划线部分。显示出SEQ ID NO：1-14的核酸序列都包含序列 CCUGA，并且核酸适体SQ2(SEQ ID NO：2)、SQ3(SEQ ID NO：3)、SQ5(SEQ ID  NO：5)、SQ8(SEQ ID NO：8)、S49(SEQ ID NO：9)和S20(SEQ ID NO：10)特别地 包含共同的保守序列GCCUGAAAA。

具体地，可看出本发明适体的5’端序列是保守的。特别地，SEQ ID NO：1-13 的适体具有保守序列如AGCUUAUUCAAUURCCUGARDMBBB(R＝G或A， D＝A、U或G，M＝A或C，和B＝G、C或U；SEQ ID NO：35)。

实施例2：用细胞SELEX筛选的胰腺癌细胞系的适体的检测活性的测量

2-1：用实时PCR分析法来测量对胰腺癌细胞的结合亲和力

用定量的RT-PCR分析法来测量初始ssRNA文库以及细胞SELEX法第5、 10和14轮所筛选的文库的结合亲和力。

具体地，浓度为1×10⁶的细胞的Capan-1和Panc-1细胞系都各用100nM 的、初始文库和RNA池各进行处理。用正常人胰腺细胞系(HPEDE细胞系)作 为对照组。

输入的适体池和输出的适体池均用作cDNA合成的模板。根据生产商的操 作说明，使用一步实时PCR仪(Applied Biosystems)进行定量的实时PCR来分 析每轮的经稀释的cDNA，并计算输出信号与输入信号的比率。在此，用SEQ  ID NO：17和18的引物进行PCR扩增。

结果如图3所示，随着起始材料N40文库进入SELEX筛选轮，每轮所获 得的适体池中的结合RNA的比率(％)逐渐增加。然而，在正常的胰腺细胞系 (HPEDE)中，结合DNA的比率在阴性筛选轮后却下降。

具体地，根据本发明的细胞SELEX方法，可筛选只特异性地结合胰腺癌 细胞系而不识别正常胰腺细胞系的富集的适体池。

2-2：通过荧光检测来测量对胰腺癌细胞系的结合亲和力

为了通过荧光检测来测量结合亲和力，使用5’TMARA-标记的下游引物。 以5′-TAMRA-AGATTGCACTTACTATCT-3′(SEQ ID NO：19)作为TMARA-标记 的3′引物。

首先，将退火缓冲液(30mM HEPES-KOH pH 7.4、100mM KCl、2mM MgCl₂、50mM NH₄Ac)中的TMARA-标记的引物与相同浓度的初始RNA文库 和第14轮的适体池各进行混合，然后将各混合物进行热变性、冷却、于37℃ 下孵育20分钟，从而使之退火。将生长于皮氏培养皿底部的细胞用1μM标记 的适体池和结合缓冲液(含4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl₂、0.1mg/ml酵母 tRNA、1mg/ml BSA的Dulbecco′s PBS)在37℃下培养20分钟。然后用冲洗缓 冲液(含4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl₂的Dulbecco′s PBS)快速地冲洗细胞两次， 然后用荧光显微镜(Olympus)以400倍的放大率来检测荧光。

结果如图4所示，根据本发明的细胞SELEX方法，可筛选只特异性结合 胰腺癌细胞系而不识别正常胰腺细胞系的富集的适体池，与实施例2-1的结果 相似。

2-3：测量对其它癌细胞系的结合亲和力

为了测定在第14轮最终筛选的适体池对其它的人癌细胞系的结合亲和 力，用胰腺癌细胞系Capan-1以及Hela(子宫颈癌，美国典型培养物保藏中心)、 T98G(恶性胶质瘤，美国典型培养物保藏中心)、MDAMB-231(乳癌，美国典型 培养物保藏中心)和Huh7(肺癌，美国典型培养物保藏中心)对适体进行实施例 2-1所述的定量RT-PCR。

结果如图5所示，可以看出第14轮筛选的适体池可特异性检测胰腺癌细 胞系而基本上不结合其它癌细胞系。

实施例3：胰腺癌细胞系的各分离的适体的检测活性的测量

3-1：用实时PCR分析法测量对胰腺癌细胞系的结合亲和力

为了测量实施例1所获得的适体对胰腺癌细胞系的结合亲和力，用 Capan-1细胞系和Panc-1细胞系，以与实施例2-1相同的方式对适体进行定量 RT-PCR。

结果如图6所示，适体对胰腺癌细胞Capan-1和Panc-1具有结合亲和力。 具体地，适体中的SQ2(SEQ ID NO：2)和SQ6(SEQ ID NO：6)显示出对这两种细 胞系具有非常高的结合亲和力。

3-2：用平衡过滤法来测量对胰腺癌细胞的解离常数(Kd)

由于适体SQ2、SQ4、SQ6、SQ8和适体SQ1都显示出高的拷贝数量，因 此用平衡分析法来进行结合分析。具体地，用1nM至1μM的各种适体来孵育 浓度为0.5×10⁶细胞的Pan1和Capan-1细胞系中每一种，然后以与实施例1相 同的方式进行结合反应。以与实施例2-1相同的方式，用定量RT-PCR进行结 合适体的定量。

为了计算解离常数，使用Sigmaplot 10.0软件及以下的等式来绘制结合的 胰腺癌细胞对ssRNA浓度的百分比，并将数据点进行非线性的回归分析。

y＝(B_max.ssRNA)/(K_d+ssRNA)

其中，y是饱和度，B_max是结合位点最大值，和K_d是解离常数。

结果如图7(Capan-1)和图8(Panc-1)所示，适体对胰腺癌细胞系显示出强烈 的结合亲和力。特别地，SEQ ID NO：2的适体SQ2对癌细胞系具有最高的亲和 力。

3-3：用荧光检测法来测量对胰腺癌细胞系的结合亲和力

为了测量适体SQ2、SQ6以及显示高拷贝数量的适体SQ1对胰腺癌细胞 系的亲和力，以与实施例2-2相同的方式，用5′TMARA-标记的下游引物进行 荧光检测。

结果如图9-11所示，在正常细胞系HPEDE中均未观察到SQ1(图9)、 SQ2(图10)和SQ6(图11)的信号，但在胰腺癌细胞系Capan-1和Panc-1中都观 察到它们的信号。这表明本发明的适体可特异性地检测胰腺癌细胞系，并因此 可有利地作为诊断胰腺癌的组合物。特别地，显示了适体还可检测象征着早期 胰腺癌的胰腺癌细胞系Panc-1，表明该适体可用于胰腺癌的早期诊断。

实施例4：各分离的适体对不同的胰腺癌细胞系的检测活性的测量(1)

为了检查适体SQ2、SQ4和SQ8是否可特异性地检测除Panc-1和Capan-1 以外的其它胰腺癌细胞系，用如实施例2-2中的5′TMARA标记的下游引物对 胰腺癌细胞系Bxpc-3、Aspc-1、Miacapa-2和Hapaf-2进行荧光检测。

结果如图12-17所示，不仅是在用于阳性筛选轮的胰腺癌细胞系 Capan-1(图12)和Panc-1(图13)中观察到适体的信号，而且在Aspc-1(图14)、 Bxpc-3(图15)、Hapaf-II(图16)和Miacapa-2(图17)中也观察到适体的信号。特 别地，发现本发明的适体不仅可用于检测阳性筛选过程中所用的胰腺癌细胞 系，还可用于检测其它胰腺癌细胞系，表明该适体可有效地用于胰腺癌细胞的 诊断。

实施例5：各分离的适体对胰腺癌细胞系的检测活性的测量(2)

5-1：用荧光检测来测量对胰腺癌细胞系的亲和力

为了用荧光检测来测量结合亲和力，用5′TMARA标记的下游引物SEQ ID  NO：19进行荧光检测。

首先，将退火缓冲液(30mM HEPES-KOH pH 7.4、100mM KCl、2mM MgCl₂、50mM NH₄Ac)中的TMARA标记的引物与相同浓度的SQ1至SQ8适 体中每种进行各混合，然后将各混合物加热变性、冷却、于37℃下孵育20分 钟，从而使之退火。将生长于皮氏培养皿底部的细胞用100nM的3’-TAMRA 标记的标记适体和结合缓冲液(含4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl₂、0.1mg/ml酵 母tRNA、1mg/ml BSA的Dulbecco′s PBS)在37℃下培养20分钟。然后用冲洗 缓冲液(含4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl₂的Dulbecco′s PBS)快速地冲洗细胞两 次，然后用荧光显微镜(Olympus)以400倍的放大率来检测荧光。

结果如图18和19所示，适体SQ1至SQ8均对胰腺癌细胞系Capan-1和 Panc-1具有结合亲和力，且特别地，适体SQ2具有最高的结合亲和力。

5-2：用实时PCR分析法来测量对胰腺癌细胞系的结合亲和力

除此之外，为了测量适体SQ1到SQ8对胰腺癌细胞系的结合亲和力，用 与实施例3-2中相同的方式，通过平衡过滤法来进行结合分析，并测定解离常 数。

表1、通过qRT-PCR检测的适体的结合亲和力(Kd)

  适体   Panc-1(Kd：nM)   Capan-1(Kd：nM)   SQ1   82   78   SQ2   26.15   24.7   SQ3   57   5.2   SQ4   100   69   SQ5   26   16   SQ6   150   56

  SQ7   23   5.6   SQ8   89   46

结果如表1所示，以与实施例5-1中相同的方式，适体SQ1到SQ8全部 对胰腺癌细胞系显示出亲和力，特别地，SQ1、SQ2、SQ4、SQ6和SQ8对两 种胰腺癌细胞系Panc-1和Capan-1都显示出高亲和力。

实施例6：截短适体的结合亲和力的测量

按照下述将在荧光检测中显示出最高亲和力的适体SQ2截短，然后测量 截短适体对胰腺癌细胞系Capan-1的结合亲和力：

SQ2下部截短(SEQ ID NO：36)：包括适体SQ2的3’端缺失18nt；SQ2上 部截短(SEQ ID NO：37)：包括适体SQ2的5’端缺失18nt；SQ26-58(SEQ ID NO： 38)：包括适体SQ2的3’端缺失18nt并且5’端缺失5nt；SQ26-50(SEQI ID NO： 39)：包括适体SQ2的3’端缺失26nt并且5’端缺失5nt；SQ21-50(SEQ ID NO： 40)：包括适体SQ2的3’端缺失26nt；以及SQ26-30(SEQ ID NO：41)：包括适 体SQ2的3’端缺失51nt并且5’端缺失5nt。

SQ2全长(SEQ ID NO：2)：

5′-AUACCAGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCUAUCGCCCAAUUCG CAGUGAUAUCCUUUAAGAUAGUAAGUGCAAUCU-3′(76nt)

SQ2下部截短的(SEQ ID NO：36)：

5′-AUACCAGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCUAUCGCCCAAUUCG CAGUGAUAUCCUUUA-3′(58nt)

SQ2上部截短的(SEQ ID NO：37)：

5′-GCCUGAAAAGCUAUCGCCCAAUUCGCAGUGAUAUCCUUUAAGA UAGUAAGUGCAAUCU-3′(58nt)

SQ2 6-58(SEQ ID NO：38)：

5′-AGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCUAUCGCCCAAUUCGCAGUG AUAUCCUUUA-3′(53nt)

SQ2 6-50(SEQ ID NO：39)：

5′-AGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCUAUCGCCCAAUUCGCAGUG AU-3′(45nt)

SQ2 1-50(SEQ ID NO：40)：

5′-AUACCAGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCUAUCGCCCAAUUCG CAGUGAU-3′(50nt)

SQ2 6-30(SEQ ID NO：41)：

5′-AGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCU-3′(25nt)

适体SQ2具有T7启动子的结合位点。为了用2-F来修饰适体和如上所述 截短适体，适体用T7启动子退火并用DuraScribeT7转录试剂盒 (EPICENTREBiotechnologies)进行体外转录。然后用与实施例3-2相同的方 式来测量适体对Capan-1的结合亲和力并与适体SQ2的结合亲和力相比较。

结果如图20所示，通过截短适体SQ2序列所获得的适体对胰腺癌细胞系 仍具有亲和力，且特别地，通过截短适体SQ2的3’端所获得的SQ2下部截短 (SEQ ID NO：36)显示出比适体SQ2更高的结合亲和力。此外，没有缺失的适体 SQ2或者适体SQ2的5’端缺失5nt所获得的适体都显示出与适体SQ2相似或 更高的结合亲和力。然而，包括适体SQ2的5’端缺失18nt的SQ2上部截短(SEQ  ID NO：37)对胰腺癌细胞系Capan-1显示出相对低的结合亲和力。同时，上述 检试结果表明即使是具有25nt长的短序列，也就是 AGCUUAUUCAAUUGCCUGAAAAGCU(SEQ ID NO：41)也对胰腺癌细胞系 显示出高的结合亲和力。

此外，如图21所示，将全长的SQ2的二级结构(SEQ ID NO：2)(图21A) 与SQ2 6-30(SEQ ID NO：41)(图21B)的二级结构相比较。结果可见，在适体SQ2 的二级结构中的茎1和2以及环3扮演重要的角色。在图21中的结构是用RNA draw 1.1软件预测出来的，且2D基团结构以及自由能是在4℃和37℃下计算 所得，且序列的5’端由同心圆表示。

这种结果表明本发明的适体的5’端保守序列是很重要的。根据本发明所分 离的SEQ ID NO：1到15的适体的5’端具有保守序列，且具体地，SEQ ID NO： 1到13的适体具有如AGCUUAUUCAAUURCCUGARDMBBB(R＝G或A，D＝ A、U或G，M＝A或C，并且B＝G、C或U；SEQ ID NO：35)的保守序列。

因此，可以看出包括任何选自包括SEQ ID NO：35的核酸序列之一的核酸 适体都可与胰腺癌细胞或组织特异性地结合。

实施例7：截短适体对胰腺癌细胞系或其它癌细胞系的检测活性的测量

7-1：用荧光检测法测量对胰腺癌细胞系的荧光活性

如上所述，SQ26-30(SEQ ID NO：41)对胰腺癌细胞系显示出高的结合亲和 力，即使是其长度只有25nt。为了测定SQ2 6-30对胰腺癌细胞系Capan-1、 Panc-1和HPAF-Ⅱ(ATCC)的结合亲和力，用与实施例2-2相同的方式，使用 5′TMARA标记的下游引物进行癌细胞系的荧光检测。

结果可见于图22，在正常细胞系HPEDE中未观察到适体SQ26-30(SEQ ID  NO：41)的信号，而在胰腺癌细胞系Capan-1和Panc-1中观察到其信号。

从而可见，截短适体可特异性地检测胰腺癌细胞系，并因此可有效地作为 诊断胰腺癌的组合物。特别地，截短适体还可检测象征着早期胰腺癌的胰腺癌 细胞系Panc-1，表明它们可用于胰腺癌的早期诊断。

7-2：用荧光检测法测量对其它癌细胞系的荧光活性

为了检查本发明的适体是否只特异性地检测胰腺癌，用与实施例2-2相同 的方式，使用5′TMARA-标记的下游引物在其它癌细胞系SK-BR-3(人乳癌， ATCC)、LnCap(人前列线癌，ATCC)、Hep G2(人肝癌，ATCC)、Hela(ATCC)、 A549(人肺腺癌，ATCC)、SK-N-SH(人神经母细胞瘤，ATCC)、T98G(ATCC) 以及Bend-3(鼠内皮细胞，ATCC)中进行荧光检测。

表2

 细胞系   来源   SQ2 6-30结合  SK-BR-3   人乳癌   -  LnCap   人前列线癌   -  Hep G2   人肝癌   -  Hela   人子宫颈癌   ±  A549   人肺腺癌   -  SK-N-SH   人成神经细胞瘤   -  T98G   人成胶质细胞瘤   -  Bend-3   鼠内皮细胞   -

结果可参见图23和图24以及表2，除胰腺癌细胞系以外，SQ26-30(SEQ  ID NO：41)不识别其它癌细胞。这表明本发明的适体可用于胰腺癌的特异诊断 和治疗。

工业应用

如上所述，本发明的核酸适体仅特异性地结合胰腺癌细胞或组织，而不结 合正常的胰腺组织，因此可有效地作为诊断及治疗胰腺癌的组合物。此外，所 述核酸适体不仅可检测晚期胰腺癌细胞系Capan-1，还可检测早期胰腺癌细胞 系Panc-1，因此可用于胰腺癌的早期诊断，从而有助于提升胰腺癌患者的生存 率。

尽管参考具体特征详细地描述了本发明，显然对本领域的技术人员来说， 这种描述仅仅是优选的实施方式而并不限制本发明的范围。因此，本发明的实 质范围将由所附的权利要求书及其等同来限定。