一种利用二氧化碳培养海洋绿藻积累淀粉的方法

摘要

一种利用CO

说明书

技术领域

本发明涉及海洋绿藻培养积累淀粉，具体的说是一种利用气体中的二 氧化碳(CO₂)(包括工厂排放尾气中的CO₂)及添加营养盐的培养方式， 在光照生物反应器中，采用合适的光照、温度、pH和通气条件，培养海水 绿藻并积累淀粉。可用于CO₂减排和循环利用、藻类培养以及淀粉生产和 以淀粉为原料的能源、食品、医药等相关领域。

背景技术

人类目前正面临日趋严重的环境问题。大规模的工业发展带来了二氧 化碳的过量排放。由CO₂所引起的温室效应和全球气候变化正逐渐威胁到 人类的生存和发展。CO₂的减排成为了全世界关注的焦点。

海洋绿藻(Marine Green Algae)是生长于海洋中的低等绿色植物，它们 能够通过光合作用将CO₂和太阳光转化成生物质并释放氧气。海洋绿藻因 其生长速度快、CO₂固定效率高、环境适应力强、不占耕地、易于人工控制、 能实现连续生产等优点，被认为是生物固定CO₂非常可行的方法之一，同 时其产生的高附加值物质使其在经济上具有可行性。

淀粉是绿藻光合作用的积累产物，它以淀粉粒(granule)的形式储存于 细胞中。能大量积累淀粉的绿藻很多集中在淡水藻中，如小球藻(Chlorella vulgaris)在蛋白合成受阻的情况下能积累占干重50％以上的淀粉；斜栅藻 (Scenedesmus basilensis)在异养和混合养时能积累占干重40％～60％以上 的淀粉；莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)也能达到50％以上的淀粉 含量。而海洋绿藻能大量积累淀粉的报道不多。利用占地球水体积97％的 海水生产海藻淀粉，可以大大减少对淡水资源的需求，在淡水资源紧张的 今天，其环保意义尤为突出。此外，目前大多数能积累淀粉的微藻培养方 法都为添加有机物的异养或混合养，这使得淀粉生产成本较高，而利用CO₂， 尤其是利用乙醇发酵尾气或烟道气等工业废气中的CO₂为唯一碳源进行微 藻淀粉积累，则将明显降低生产成本。

发明内容

本发明目的是提供一种利用CO₂培养海水绿藻，并积累大量绿藻淀粉 的方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

将CO₂与空气混合后通入藻培养光照反应器中，通过控制营养元素、 光照、温度和pH等培养条件，以光合自养的方式使海洋绿藻积累大量淀粉 并在合适的时机收获藻细胞。

以海洋绿藻亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)为实验材料，在 光照生物反应器中，利用气体中的CO₂及添加营养盐的培养方式，连续照 光，使藻细胞生长并积累淀粉。

可按如下步骤具体操作：

1)藻细胞种子液的获得

藻种培养基的配制：于0.3μm孔径的微滤膜过滤的海水中添加营养盐 及其最终浓度为：NaNO₃ 100mg/L，NaH₂PO₄·2H₂O 20.0mg/L，EDTA-Na₂45.0mg/L，H₃BO₃ 33.6mg/L，MnCl₂·4H₂O 0.36mg/L，FeCl₃·6H₂O 1.3mg/L， ZnCl₂ 0.21mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.20mg/L，(NH₄)₄Mo₇O₂₄·4H₂O 0.09mg/L， CuSO₄·5H₂O 0.20mg/L，KNO₃ 1g/L，KH₂PO₄ 0.05g/L，Tris 0.81g/L，CH₃COOH 0.346g/L。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。

藻细胞种子液的培养：挑取平板分离纯化的亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)单藻落，在摇瓶中逐级放大培养，培养条件为：温度25～30 ℃，光照强度30～70μmol E·m^-2·s^-1，白色荧光灯，光暗比14～24h∶10～ 0h，静置培养，每天手工摇动3次以上。

2)光照生物反应器培养

培养基的配制：于0.3μm孔径的微滤膜过滤的海水中添加营养盐及其 最终浓度为：NaH₂PO₄·2H₂O 20.0mg/L，EDTA-Na₂ 45.0mg/L，H₃BO₃33.6mg/L，MnCl₂·4H₂O 0.36mg/L，FeCl₃·6H₂O 1.3mg/L，ZnCl₂ 0.21mg/L， CoCl₂·6H₂O 0.20mg/L，(NH₄)₄Mo₇O₂₄·4H₂O 0.09mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.20mg/L；并加入KNO₃终浓度0.4～0.6g/L。110℃高压蒸汽灭菌15min， 冷却后备用。

藻细胞的培养：用NaClO浸泡灭菌后的反应器用无菌水清洗干净，接 入培养基和藻细胞种子液。培养条件为：细胞接种时初始干重0.4～0.5g/L， 温度25～30℃，海水pH 6～8，光照强度100～250μmol E·m^-2·s^-1，连续 光照，通入空气流量0.125～0.375VVM，CO₂含量1％～3％，培养4～6 天后在细胞进入稳定期时收获藻细胞，细胞淀粉含量达到藻干重的45％～ 55％，可进行间歇或者半连续培养。整个过程淀粉产率可达到0.25～0.31 g·L^-1·d^-1。

所述海水为天然海水或人工海水；人工海水配方为：NaCl 27g/L， MgSO₄·7H₂O 6.6g/L，MgCl₂·6H₂O 5.6g/L，CaCl₂·2H₂O 1.5g/L，NaHCO₃0.04g/L。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.环境友好：海洋绿藻培养过程无污染，可利用CO₂为唯一碳源进行 光合自养，CO₂利用效率高，从而实现CO₂减排，缓解温室效应。

2.淀粉生产的可持续性好：利用资源充沛的海水通过绿藻进行淀粉生 产，减少淡水资源的消耗；同时绿藻淀粉生产可以在不适合粮食种植和人 类居住的地域进行，解决淀粉生产的与人争粮、争地的问题。

3.培养成本低，淀粉积累迅速：海洋绿藻培养基配方简单，所需营养 元素来源广泛，成本低；淀粉在藻细胞内迅速积累，生产周期短。

总之，本发明利用气体中的二氧化碳(包括工厂排放尾气中的CO₂) 培养海洋绿藻积累淀粉，实现CO₂减排和循环利用，可以广泛应用于淀粉 生产和以淀粉为原料的能源、食品、医药等相关领域。

附图说明

图1为本发明绿藻培养装置示意图；注：1.光照生物反应器主体；2.光 源；3.挡板；4.曝气管；5.气体过滤器；6.气体流量计；7.空气压缩机； 8.气体减压阀；9.CO₂气瓶；箭头代表气流方向。

图2为本发明不同光暗时间比下绿藻细胞生长动力学曲线；

图3为本发明不同光暗时间比下绿藻淀粉积累动力学曲线；

图4为本发明不同光暗时间比下绿藻淀粉所占单位细胞干重比例动力 学曲线；

图5为本发明不同KNO₃浓度下绿藻细胞生长动力学曲线；

图6为本发明不同KNO₃浓度下绿藻淀粉积累动力学曲线；

图7为本发明不同KNO₃浓度下绿藻淀粉所占单位细胞干重比例动力 学曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法和结果进行说明。本发明以海洋 绿藻亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)为实验材料，在光照生物反 应器中，利用气体中的CO₂及添加营养盐的培养方式，连续照光，使绿藻 积累淀粉。

所述光照生物反应器为气升式平板光照生物反应器，反应器底部中间 位置插有曝气管将导入的气体分散成小气泡，提高气液传质效率，曝气管 通过管路与气源相连；反应器内悬置有两平行挡板，挡板与反应器底部间 设有间隙，反应器中藻液没过挡板，曝气管置于两平行挡板之间，使气体 于挡板中间上升，带动反应器中藻液在挡板中间上升，于挡板两侧下降， 形成循环，避免死角；反应器所用材质为二氯甲烷粘结成的透明有机玻璃； 反应器两侧均设白色荧光灯；所述气源为空气压缩机和CO₂气瓶，其流量 通过管路上设置的气体减压阀和气体流量计控制；由空气压缩机产生的空 气与来自于气瓶的CO₂经过流量调节达到所需CO₂浓度后导入反应器。

实施例1

考察光暗周期对藻细胞生长和淀粉积累的影响。亚心型四爿藻 (Tetraselmis subcordiformis)由辽宁省大连水产研究所提供，并经过本实验 室平板纯化。

1)藻细胞种子液的获得

营养盐母液的配制：用去离子水配制1000倍营养盐母液，其配方为： NaNO₃ 100g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 20.0g/L，EDTA-Na₂ 45.0g/L，H₃BO₃ 33.6g/L， MnCl₂·4H₂O 0.36g/L，FeCl₃·6H₂O 1.3g/L，ZnCl₂ 0.21g/L，CoCl₂·6H₂O 0.20g/L， (NH₄)₄Mo₇O₂₄·4H₂O 0.09g/L，CuSO₄·5H₂O 0.20g/L。110℃高压蒸汽灭菌 15min，冷却后备用。

藻种培养基的配制：0.3μm孔径的微滤膜过滤天然海水。每升过滤海 水中加入1mL上述营养盐母液，KNO₃ 1g，KH₂PO₄ 0.05g，Tris 0.81g， CH₃COOH 0.346g。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后备用。

藻细胞种子液的培养：挑取平板分离纯化的亚心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)单藻落，分别在试管、100mL摇瓶、1000mL摇瓶和3000mL 摇瓶中逐级放大培养，培养条件为：温度25℃，光照强度50μmol E·m^-2·s^-1， 白色荧光灯，光暗比14h∶10h，静置培养，每天手工摇动3次以上。

2)光照生物反应器培养

无氮营养盐母液的配制：用去离子水配制1000倍无氮营养盐母液，其 配方为：NaH₂PO₄·2H₂O 20.0g/L，EDTA-Na₂ 45.0g/L，H₃BO₃ 33.6g/L， MnCl₂·4H₂O 0.36g/L，FeCl₃·6H₂O 1.3g/L，ZnCl₂ 0.21g/L，CoCl₂·6H₂O 0.20g/L， NH₄)₄Mo₇O₂₄·4H₂O 0.09g/L，CuSO₄·5H₂O 0.20g/L。110℃高压蒸汽灭菌 15min，冷却后备用。

培养基的配制：0.3μm孔径的微滤膜过滤天然海水。每升过滤海水中加 入1mL上述无氮营养盐母液和0.4g KNO₃。110℃高压蒸汽灭菌15min，冷 却后备用。

藻细胞的培养：用NaClO浸泡灭菌后的反应器用无菌水清洗干净，接 入培养基和藻细胞种子液。培养条件为：细胞接种时初始干重0.5g/L，温度 25℃，海水pH 7，光照强度140μmol E·m^-2·s^-1，通入空气流量0.25VVM， CO₂含量3％，光暗时间(h)比分别设为24∶0、14∶10和12∶12。

所述光照生物反应器如图1所示，为气升式平板光照生物反应器，其 主体1尺寸为照光面长80mm，高750mm，光径40mm，装液量1.6L。反 应器底部插入曝气管4，离反应器底高25mm，能将导入的气体分散成小气 泡，提高气液传质效率。反应器内置两挡板3，高度为510mm，挡板下边 缘离反应器底高26mm，能使气体于中部上升，带动反应器中藻液在中部上 升，两边下降，形成循环，避免死角。反应器所用材质为二氯甲烷粘结成 的透明有机玻璃。反应器两侧均设白色荧光灯2。所述气源为空气压缩机7 和CO₂气瓶9，其流量通过气体减压阀8和气体流量计6控制。由空气压缩 机7产生的空气与来自于气瓶9的CO₂经过气体流量计6的流量调节达到 所需CO₂浓度，经过空气过滤器5除菌后导入反应器。

从图2可以看出，利用上述光照生物反应器进行海洋绿藻培养，在初 始接种量、温度、光照强度、通气速率、CO₂浓度和营养供给等培养条件均 一样的情况下，采用连续光照(光暗比24∶0)的反应器内藻干重从初始的 0.5g/L在4天之内上升到2.1g/L，而采用光暗比为14∶10和12∶12时藻干 重上升速度明显低于连续光照的情况。采用连续光照的方式可以使藻细胞 在较短的时间内固定较多的CO₂并迅速生长。

从图3和图4可以看出，利用上述光照生物反应器进行海洋绿藻培养， 在初始接种量、温度、光照强度、通气速率、CO₂浓度和营养供给等培养条 件均一样的情况下，采用连续光照(光暗比24∶0)的反应器内淀粉浓度从 初始的0.05g/L在4天之内上升到1.18g/L，藻细胞淀粉含量从接种时的10％ 上升到55％左右，而采用光暗比为14∶10和12∶12时反应器内淀粉浓度 的上升速度明显低于连续光照的情况。采用连续光照的方式培养4天后进 入稳定期，收获藻细胞，细胞淀粉含量达到藻干重的55％，淀粉产率可达 到0.28g·L^-1·d^-1。

实施例2

考察初始KNO₃浓度对藻细胞生长和淀粉积累的影响。亚心型四爿藻 (Tetraselmis subcordiformis)由辽宁省大连水产研究所提供，并经过本实验 室平板纯化。

藻细胞种子液的获得和无氮营养盐母液的配制同“实施例1”。

培养基的配制：0.3μm孔径的微滤膜过滤人工海水。人工海水配方为： NaCl 27g/L，MgSO₄·7H₂O 6.6g/L，MgCl₂·6H₂O 5.6g/L，CaCl₂·2H₂O 1.5g/L， NaHCO₃ 0.04g/L。每升过滤海水中加入1mL无氮营养盐母液。110℃高压蒸 汽灭菌15min，冷却后备用。

藻细胞的培养：用NaClO浸泡灭菌后的反应器用无菌水清洗干净，接 入培养基和藻细胞种子液。培养条件为：细胞接种时初始干重0.4g/L，温度 25℃，pH 7，光照强度140μmol E·m^-2·s^-1，连续光照，通入空气流量 0.25VVM，CO₂含量3％，加入KNO₃使其浓度分别为0、0.12、0.6和1.2g/L。

从图5可以看出，在初始接种量、温度、光照强度、光照周期、通气 速率和CO₂浓度等培养条件均一样的情况下，KNO₃浓度为0.6g/L和1.2g/L 的反应器内藻干重从初始的0.4g/L在6天之内分别上升到3.4g/L和3.8g/L， 明显高于KNO₃浓度较低的实验组，说明较高的KNO₃浓度有利于藻细胞固 定CO₂和积累生物质。但是从图6和图7可以看出，KNO₃浓度为1.2g/L 时淀粉含量最高只能达到35％；虽然藻细胞淀粉含量在KNO₃浓度较低时 上升很快且能达到48％，但在培养两天后淀粉含量迅速下降，且由于生物 量的限制，反应器内淀粉浓度远远低于KNO₃浓度为0.6g/L的实验组。在 KNO₃浓度为0.6g/L时，藻细胞在培养6天后进入稳定期，淀粉含量从初始 的6％上升到45％，淀粉产率达到0.25g·L^-1·d^-1。