过表达ATP降解酶的重组酿酒酵母菌株中乙醇产量的提高和生物质积累的减少

摘要

描述在乙醇发酵时通过使用ATP降解酶凭借生物质积累的减少而增加乙醇产量的一种新方法。克隆到表达盒中在甘油-3-磷酸脱氢酶基因(GPD1)启动子控制下的编码核糖体关联伴侣(ribosome associated chaperon)的细胞质ATP酶结构域的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SSB1基因的部分被引入到酿酒酵母BY4742菌株中。测试重组菌株在葡萄糖厌氧和需氧培养时生长和生产乙醇的能力。过表达SSB1的ATP酶结构域的菌株具有减小的细胞内ATP浓度。其积累升高量的乙醇并且以在厌氧和需氧条件下与野生型菌株相比减少的生物质积累为特征。相似地，编码ATP/ADP水解磷酸酶的来自大肠杆菌(E.coH)的三磷酸腺苷双磷酸酶基因apy和酿酒酵母的SSB1基因的ATP酶结构域在半乳糖可诱导的GAL1启动子的控制下共表达。重组酿酒酵母菌株显示出生物质积累的轻微减少，而在半厌氧条件下乙醇半乳糖发酵时ATP酶比活性、乙醇积累和产量增加。

说明书

技术领域

本公开内容涉及用于提高经发酵的乙醇生产的修饰的酵母，更具体地 涉及被修饰以在生产乙醇的条件下生长时产生更少的ATP的酵母，以及 还更具体地涉及有或没有共表达三磷酸腺苷双磷酸酶活性的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中细胞质ATP酶活性的过表达，均导致在用 于生产乙醇的厌氧和需氧生长条件下细胞中ATP的同时减少，细胞生物 质积累的减少和乙醇生产的增加。

相关申请的交叉引用

本申请主张于2009年6月26日提交的编号为61/220,814的美国临 时申请的优先权。

发明背景

乙醇发酵是厌氧分解代谢葡萄糖和一些其他己糖，引起细胞外乙醇和 CO₂的产生。在分解代谢过程中，ATP形成并用于合成代谢目的，导致细 胞生长和繁殖(Bai等人，2008)。与1摩尔葡萄糖导致36摩尔ATP产生 的需氧分解代谢相比，厌氧葡萄糖分解代谢中ATP合成的效率是很低的， 依据具体的葡萄糖分解代谢途径而从每摩尔消耗的葡萄糖1摩尔ATP (Entner-Doudoroff或ED途径)变化到2摩尔ATP (Embden-Meyerhof-Parnas或EMP途径)。相应地，通过细胞分裂和生长， 葡萄糖转化成细胞生物质的效率在厌氧的ED分解代谢途径中最低而在 需氧的葡萄糖氧化中最高。

在体积基础上，乙醇发酵代表用于传统酒精饮料(葡萄酒、啤酒、烈 性酒精饮料，等)及工业和燃料乙醇生产的工业生物技术的一个极大领域。 由于经济和环境原因，在上一个十年燃料乙醇的生产发生了指数增长 (Schubert，2006)。虽然木质纤维素被认为是在未来燃料乙醇生产的最有 前景的原料，现有燃料乙醇的工业生产仍基于传统原料诸如蔗糖(甘蔗或 甜菜的)和从含淀粉材料(玉米、马铃薯等)获得的葡萄糖的发酵。现有 用于工业乙醇生产的仅有的生物体是面包酵母酿酒酵母。该酵母通过糖酵 解的EMP途径分解代谢葡萄糖，产生每摩尔消耗的葡萄糖2摩尔ATP。 因为该途径的代谢效率低，最大生物质产量仅为大约7％，而从葡萄糖的 乙醇产量理论值为90％和93％之间(Ingledew，1999)。尽管如此，在工业 规模上，7％的生物质是巨大量的副产品，虽然其作为动物饲料成分具有 一定的经济价值，但仍然显著降低主要产品的可能的产量，即，理论上可 以获得的乙醇的可能的产量。由于乙醇年生产达到500亿升以上，少如 1-2％的乙醇产量的提高可以提供另外的亿升到十亿升的乙醇并且显著提 升乙醇生产的经济参数。

与酿酒酵母相比，细菌运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)通过 ED途径发酵葡萄糖，其给出每摩尔葡萄糖仅1摩尔ATP并且将仅3％的 葡萄糖导向生物质，使乙醇产量达到高至理论可能值的97％(Sprenger， 1996)。而且，运动发酵单胞菌有另外一个重要的优势：与酿酒酵母相比 它更快地将葡萄糖发酵为乙醇(Sprenger，1996；Panesar等人，2006)，然 而，这一特性主要通过更快的糖摄取率和后来的分解代谢而非较低的ATP 产量来解释。尝试将酿酒酵母替换为运动发酵单胞菌用于工业乙醇的生产 被认为是使通过发酵的乙醇产量增加大约3-4％的可能的方法，这将转化 为每年在世界范围内上亿升。然而运动发酵单胞菌并不是没有严重的缺 陷，该缺陷妨碍其在现在和不久的将来的工业使用。它们是：(i)其具有 非常窄的底物范围(几乎不发酵蔗糖，且因而具有低产量)，(ii)其具有 对赖氨酸、甲硫氨酸和一些维生素的天然营养缺陷型，(iii)其具有非 GRAS状态，阻止生物质副产品作为饲料添加剂使用(Jeffries，2005；Bai 等人，2008)。此外，作为乙醇生产的主要工作(workhorse)，酵母细胞乙 醇发酵技术很发达而细菌细胞如运动发酵单胞菌的发酵技术远欠发达。

一种现有技术方法尝试将酵母中EMP途径的基本组件替换成来自具 有该途径基因的细菌诸如运动发酵单胞菌的ED途径的那些。该方法包括 酿酒酵母的磷酸果糖激酶缺陷突变体中ED脱水酶和ED醛缩酶基因edd 和eda的表达(Lancashire等人，1998)。虽然并未测量ED脱水酶和ED 醛缩酶的活性，生成的酵母转化子生长并将葡萄糖发酵成乙醇。显然地， 并未在科学文献中看到该方法进一步的发展。一种解释可能是或许由于不 正确的折叠或不稳定性，在酿酒酵母宿主中原核酶很经常表现低活性或无 活性(Hahn-Hagerdal等人，2007)。此外，在工程改造以使用ED途径的 酵母中NADP再生可能有困难，因为由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶产生的 NADPH应该被醇脱氢酶反应再氧化。然而，酿酒酵母中主要的醇脱氢酶 使用NADH而非NADPH且酵母不具有NADH/NADPH转氢酶(Lescovac 等人，2002；Jeffries和Jin，2004)。

因此，本领域中对找到提高用酵母诸如酿酒酵母生产乙醇的方法存在 持续的需求。本发明提供了通过在酵母中操纵ATP水平同时减少酵母生 物质积累和增加乙醇生产的方法。

发明概述

本公开内容教导通过降低酵母细胞质中ATP的水平而增加乙醇生产 的方法，其模拟细菌ED途径作用而不需要表达ED基因。结果具有若干 可区分但相关的方面和实施方案。

一方面是酵母菌株。该实施方案包括两种酵母菌株，该菌株包括编码 在酵母细胞质中降低ATP水平的ATP降解蛋白的重组核酸，所述酵母菌 株的特征在于重组核酸包括可操作地连接以过表达编码ATP降解蛋白的 核酸的可操作的启动子。一方面ATP降解蛋白是细胞质可溶的ATP酶。 另一方面ATP降解蛋白是三磷酸腺苷双磷酸酶。

在一个实施方案中，酵母菌株包含仅编码细胞质可溶的ATP酶的重 组核酸。细胞质可溶的ATP酶的一个具体的实施方案是可溶的酿酒酵母 SSB2蛋白的N-末端部分。可溶的酿酒酵母SSB2蛋白的N-末端部分的示 范性实施方案是根据SEQ.ID NO：3，并在具体情形中，编码酿酒酵母SSB2 蛋白的N-末端部分的核酸是根据SEQ.ID NO：2。

在另一个实施方案中，酵母菌株包含仅编码三磷酸腺苷双磷酸酶的重 组核酸。在一个具体情形中，三磷酸腺苷双磷酸酶为大肠杆菌(E.coli) 三磷酸腺苷双磷酸酶。大肠杆菌三磷酸腺苷双磷酸酶的示范性实施方案是 根据SEQ.ID NO：6，并且一个示范性的编码三磷酸腺苷双磷酸酶的核酸 的是根据SEQ.ID NO：5。

在某些实施方案中，细胞质可溶的ATP酶和三磷酸腺苷双磷酸酶均 被过表达。示范性的和具体的实施方案包括以上提到的相同的序列的组 合。

虽然可溶的ATP酶和/或三磷酸腺苷双磷酸酶可以在任何酵母中表 达，但是优选的实施方案是酵母菌株为酿酒酵母。

在另一方面，提供了通过使用任何前述酵母菌株的酵母发酵提高乙醇 生产的方法。该方法包括，在碳水化合物来源被发酵产生乙醇的条件下在 碳水化合物来源上使过表达ATP降解蛋白的重组酵母菌株生长。通过重 组酵母菌株在生长条件下产生乙醇的量比缺少过表达ATP降解蛋白的重 组核酸的重组酵母菌株的亲本中产生乙醇的量更大。

这些提高乙醇生产的方法的实施方案包括使酵母在需氧条件或厌氧 条件下生长，或者在第一时间段使酵母在需氧条件下生长而后在第二时间 段使酵母在厌氧条件下生长并且其中提高的乙醇生产发生在厌氧生长条 件下。

另一个方面是以上酵母菌株中使用的重组核酸。这样的重组核酸包括 可操作地连接到编码至少一种酶的核酸以在酵母中过表达核酸的可操作 的启动子元件，所述酶选自由细胞质可溶的ATP酶和三磷酸腺苷双磷酸 酶组成的组。该方面的示范性的和具体的实施方案包括任何和所有以上提 到的序列。

附图简述

图1示出以下的线性化的图谱：A，携带GPD1启动子和CYC1终止 子的质粒pGPD1P(表达盒)。B，携带GPD1启动子控制下和用CYC1 终止子终止的NSSB1的质粒pUSgpdp-zeo；ZeoR，赋予对博莱霉素 (zeocin)的抗性的ble基因。C，携带GPD1启动子控制下和用CYC1 终止子终止的apy基因的质粒pYES2-apy。D，携带GPD1启动子控制下 和用CYC1终止子终止的NSSB1基因的质粒pYES2-NSSB；URA3营养 缺陷型选择标记。

图2A示出编码核糖体关联的分子伴侣的酿酒酵母SSB2基因的全部 ORF的核苷酸序列(SEQ.ID NO：1)；图2B示出编码细胞质可溶的N末 端(具有ATP酶活性的411aa区域(NSSB2)的ORF的1,233bp片段(SEQ. ID NO：2)；且图3C示出由N-末端编码的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。

图3示出由含有以GPD1启动子驱动的NSSB2的酿酒酵母的重组菌 株在补充2％葡萄糖的YPD培养基中在厌氧条件下生长5天之后的生物 质(3A)和乙醇(3B)积累。18、19、21-稳定重组菌株。BY-野生 型菌株BY4742。

图4示出含有在GPD1启动子控制下的NSSB2的酿酒酵母菌株在补 充4％葡萄糖的YPD培养基中在厌氧条件下生长5天之后的生物质(A) 和乙醇(B)积累以及乙醇：生物质比率(C)。18、19、21-稳定重组菌 株。BY-野生型菌株BY4742。

图5阐明由含有以GPD1启动子驱动的NSSB2的酿酒酵母菌株在需 氧条件下乙醇积累的动力学。18、19、21-稳定重组菌株。BY-野生型 菌株BY4742。

图6示出含有以GPD1启动子驱动的NSSB2的酿酒酵母菌株在补充 4％葡萄糖的YPD培养基中在需氧条件下生长5天之后的生物质(A)和 乙醇(B)积累以及乙醇：生物质比率(C)。18、19、21-稳定重组菌株。 BY-野生型菌株BY4742。

图7示出在补充1％葡萄糖+10％半乳糖(A)或5％葡萄糖+10％半乳 糖(B)的SD培养基中在半厌氧条件下，带有质粒pYES2(对照)、 pYES2-apy(含有以GAL1启动子驱动的apy基因)和pYES2-NSSB(含 有以GAL1启动子驱动的NSSB1)的酿酒酵母转化子的生物质积累的动 力学。

图8阐明在补充1％葡萄糖+10％半乳糖(A)或5％葡萄糖+10％半乳 糖(B)的SD培养基中在半厌氧条件下，带有质粒pYES2(对照)、 pYES2-apy(含有以GAL1启动子驱动的apy基因)和pYES2-NSSB(含 有以GAL1启动子驱动的NSSB1)的酿酒酵母转化子的乙醇积累。

图9阐明在补充1％葡萄糖+10％半乳糖(A)或5％葡萄糖+10％半乳 糖(B)的SD培养基中在半厌氧条件下，带有质粒pYES2(对照)、 pYES2-apy(含有以GAL1启动子驱动的apy基因)和pYES2-NSSB(含 有以GAL1启动子驱动的NSSB1)的酿酒酵母转化子的乙醇产量。

图10A示出编码三磷酸腺苷双磷酸酶的大肠杆菌apy基因的完整 ORF的核苷酸序列(SEQ ID.NO.4)；10B示出编码不含有N-末端周质 靶向序列的三磷酸腺苷双磷酸酶的224aa区域的核苷酸序列的675bp片 段(SEQ ID NO 5)；且10C示出三磷酸腺苷双磷酸酶的224aa区域的蛋 白序列(SEQ ID NO 6)。

详述

发明人发现在酵母细胞中的乙醇发酵生长时降低ATP产生水平能够 增加乙醇产量并同时减少底物向生物质的转化。这通过构建在乙醇发酵时 产生更少的ATP(如，一摩尔ATP，像运动发酵单胞菌在ED途径中所做 的)而非将ED途径的活性转移到酵母中的酵母菌株实现。生成的酵母菌 株将酵母的所有可利用的优势与运动发酵单胞菌代表的高乙醇产量结合。 能够使用两种方法构建这样的酵母菌株。

发明人已发现为了在通过EMP途径的酵母乙醇发酵时保持ATP低水 平，并不需要将其替换为ED途径活性来降低ATP效率。可以通过细胞 质ATP酶或外源三磷酸腺苷双磷酸酶的激活或过表达或者通过引入诱导 酵母中消耗细胞ATP池的无效循环的剂(agent)来保持EMP途径不变而 降低ATP的水平。

本公开内容描述通过过表达编码细胞质ATP酶结构域的内源酿酒酵 母SSB2基因的5’部分使细胞ATP成功的降低。工程菌株示出在厌氧和 需氧培养中减小的细胞ATP水平，并且以在厌氧、需氧或半厌氧条件下 葡萄糖利用中生物质产量的减少和乙醇产量的相应增加为特征。菌株被工 程改造以过表达大肠杆菌三磷酸腺苷双磷酸酶，其为一种将两个磷酸从 ATP裂下(cleave)的酶，并且这些共表达菌株中的一些也发生增加的乙 醇生产和减少的生物质积累。这些方法对于构建与传统(葡萄糖、蔗糖) 或其他非传统碳水化合物为基础的原料(木质纤维素)相比以提升的乙醇 产量为特征的新一代工业酿酒酵母菌株是有用的。

示范性实施方案使用的材料和方法

菌株、质粒和生长条件。酿酒酵母菌株BY4742(MATα、his3Δl、 1eu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0；Giaever等人，2002)用于编码ATP酶结构域 的SSB2ORF的5’部分的表达。大肠杆菌DH5α(Φ80dlacZΔM15、recA1、 endA1、gyrA96、thi-1、hsdR17(rK-、mK+)、supE44、relA1、deoR、 Δ(lacZYA-argF)U169)用于一般目的和常规亚克隆。

对于质粒DNA分离，如描述地将大肠杆菌菌株在LB培养基中37℃ 生长18小时(Sambrook和Rusell，2001)。酿酒酵母菌株在30℃孵育。对 于常规应用，酵母菌株保持在富YPD(0.5％酵母提取物、1％蛋白胨和2％ 葡萄糖)或SD(0.67％，不含氨基酸的酵母氮源，DIFCO)培养基中。对 于乙醇发酵，使用补充2或4％葡萄糖或10％半乳糖的YPD培养基或SD 培养基。需要抗生素筛选时，与氨苄青霉素(100μg/ml)、博莱霉素(对 大肠杆菌25μg/ml和对酿酒酵母150μg/ml)一起孵育菌株。需要时添加 组氨酸(20mg/L)、亮氨酸(60mg/L)、赖氨酸(20mg/L)或尿嘧啶(20 mg/L)。显色底物X-gal和启动子诱导子IPTG(Fermentas，Vilnius， Lithuania)根据制造商说明书使用。

DNA操作。使用基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison， WI，USA)分离酿酒酵母菌株的基因组DNA。使用Plus SV  Minipreps DNA纯化系统(Promega)分离大肠杆菌的质粒DNA。根据供 应商(Fermentas)的推荐使用Taq和高保真聚合酶混合物、T4DNA连接 酶、T4DNA聚合酶和限制酶。通过标准规程(Sambrook和Rusell 2001) 实施酿酒酵母转化。

质粒构建。表达盒准备。用GPD1PF (TGAGCTCAGCGTGTAGACGTAGTATAAC)和GPDIPR (TCTAGATCTCTATCAGCAGCAGCAGACAG)引物从酿酒酵母 BY4742的染色体将GPD1启动子(编码酿酒酵母甘油-3-磷酸脱氢酶的 GPD1基因的启动子，Albertyn等人，1994)扩增为874bp片段；并T/A 克隆到pBluescriptIISK+的EcoRV位点。分别的启动子区域被回收为 SacI-XbaI片段(限制性核酸内切酶SacI和XbaI的位点加下划线)并克 隆到pUC57载体的相应位点形成pUGPD1P质粒。用CYC1F (ATCCCGGGAAGCCTGTGAGTAAACAGGC)和CYC1R (TAGTCGACTGTTA CATGCGTACACGCGT)引物从酿酒酵母BY4742 的染色体将酿酒酵母CYC1基因终止子区域扩增为234bp片段(限制性 核酸内切酶SmaI和SalI的位点加下划线)并克隆到pBluescriptIISK+的 EcoRV位点，然后回收为SmaI-SalI片段并克隆到pUGPD1P质粒的相应 位点以产生pGPD1P构建体(表达盒在图1A中示出)。

NSSB2表达质粒。编码具有ATP酶活性的SSB2的411个N-末端氨 基酸残基的SSB2ORF的1,233bp片段(NSSB2；图2)和ORF的起始 密码子前面的12bp用SSB2F (ATCTAGATCCTCATTAACAATGGCTGAAGGT)和SSB2R (ATCCCGGGAATTCAACCTTGCATACCAACACC)引物(限制性核酸 内切酶XbaI和SmaI的位点加下划线)从酿酒酵母BY4742的染色体扩增 并T/A克隆到pUC57中。获得的质粒用XbaI和SmaI限制性核酸内切酶 消化且将NSSB2亚克隆到pGPD1P表达盒的XbaI-SmaI位点，在产生的 pUSgpdp的GPD1启动子的控制下。质粒pUSgpdp用HindIII消化，使末 端平齐且博莱霉素抗性的盒被克隆到质粒中以给出pUSgpdp-zeo(图1B)。 获得的构建体用SacI线性化并转化到酿酒酵母BY4742中。转化子被稳 定化并且通过使用启动子特异性的正向引物和NSSB2特异性的反向引物 的PCR程序验证重组构建体(GPD1启动子控制下的NSSB2)的存在。

在半乳糖可诱导启动子的控制下表达apy和NSSB1的质粒。用引物 Ko390(CGCGGATCCATGCTGAAGGCAGAAGGTTTTCTC)和Ko391 (TTTGCGGCCGCTTATGGGGTCAGTTCATTGGTAGGAGTATTTAATT  C)(图3B)从缺少编码内源N-末端周质靶向序列的前70bp的毒性质粒 pinv(genbank登记号AJ315184)(图3A)扩增来自大肠杆菌菌株HN280 的三磷酸腺苷双磷酸酶基因apy。接着NSSB1基因使用pusgpdp为模板， 用引物V3f(CGCGGATCCATGGCTGAAGGTGTTTTCCAAGGTG)和 Ko389(TTTGCGGCCGCTCAACCTTGCATACCAACAC)扩增。合成的 片段用bamhi/noti双重消化，与bamhi/noti已消化的质粒pyes2(包含作 为选择标记的URA3基因和用于表达的GAL1启动子)(Invitrogen)连接。 产生的质粒被命名为pyes2-apy(图1C)和pyes2-NSSB(图1D)。

选择酿酒酵母的稳定转化子。通过在非选择性和选择性培养基中的交 替培养稳定酿酒酵母转化子。认为在该培养之后保持由显性ZeoR标记提 供的其表型(博莱霉素抗性)的转化子为稳定的转化子。通过PCR证实 稳定的转化子基因组中期望的构建体(在GPD1启动子控制下的NSSB2) 的存在。通过大肠杆菌转化和随后的限制性分析的质粒营救实施包含复制 型质粒的酵母转化子的验证。

乙醇生产和生长分析。菌株在YPD培养基中过夜生长，用无菌水洗 并将等量的每个培养物接种到测试培养基中。对于酿酒酵母BY4742 pUSgpdp-zeo+菌株使用补充2或4％葡萄糖的YPD。对于厌氧生长使用 GENbox系统(bioMérieux，Marcy l′Etoile，France)。菌株在28℃旋转震荡 培养箱1000Heidolph(Schwabach，Germany)中生长，并且在需氧条件情 况下每24小时取样而在厌氧生长情况下在接种之后立即取样和在生长5 天后取样。对于半乳糖发酵，重组菌株在SD培养基中过夜生长。半乳糖 发酵的初始生物质浓度为15μg/L。在补充1％或5％葡萄糖和10％半乳糖 的混合物的SD培养基上评估用质粒pYES2-apy、pYES2-NSSB和对照质 粒pYES2获得的转化子的半乳糖发酵的效率。在1-3天中在半厌氧(120 转/分钟)条件下进行发酵。通过用分光光度计在600nm的光密度测量生 物质并计算细胞密度。乙醇和葡萄糖浓度由之前描述的规程(Gonchar等 人，2001；Gonchar，1998)测量。

酵母细胞中ATP和ATP酶的测定。通过作为对本领域技术人员可获 得的若干适合方法之一的发明人实验室开发的方法实施酵母细胞中的 ATP测定。方法使用从过表达编码激酶的FMN1基因的重组无名假丝酵 母(Candida famata)菌株中获得的核黄素激酶的制剂。ATP用三氯乙酸 (5mg细胞、30分钟)从受试酵母细胞中提取。反应混合物包含(1ml 总体积)：75mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0；1mM MgSO₄·7H₂O；1mM核 黄素；0.25mg核黄素激酶(30mU/mg蛋白)和ATP提取样品。反应在 37℃持续30分钟并然后通过煮沸5分钟终止。在色谱分离5％Na₂HPO₄中的黄素单核苷酸(FMN)之后用Turner Quantech FM 109510-33荧光计 通过荧光分析测定生成的FMN。每个反应测量只包含测定培养基的空白。 使用ATP的标准校正曲线计算形成的ATP。

由有轻微修改的其他地方描述的方法(Tashima，1975)测量ATP酶 活性。反应混合物包含50mM Tris/HCl(pH 7.5)、70mM KCl、35mM NaCl、2mM MgCl₂、70μM CaCl₂和3mM ATP。所加蛋白的终浓度为0.05 mg/ml。在37℃孵育15分钟之后用三氯乙酸终止反应并用已建立的规程 (Fiske和Subbarow，1925)确定从ATP释放的磷酸。

结果

酿酒酵母基因组的可溶的ATP酶基因的筛选：如本文之前提到的， 不同的策略能够用于控制细胞内ATP水平。一个第一种方法基于消耗ATP 水解能量用于反向代谢反应的无效循环的产生。一个研究最多的无效循环 是通过使用ATP由磷酸果糖激酶催化的果糖-6-磷酸到果糖-1，6-双磷酸的 转化和由果糖-1，6-双磷酸酶催化的其对应转化(counterpart)。尽管该策略 确实是本发明的可选的实施方案，注意无效反应的生成还包括导致以这样 的方法影响最终生产水平的乙醇积累的生化途经的一些改变。本领域技术 人员能够容易地获得编码酿酒酵母果糖-1，6-双磷酸酶的序列并且在GPD 启动子可操作的控制下对其进行与本文进行的类似地工程改造，或者使用 任何其他的酿酒酵母启动子以生成本实践的示范性实施方案。

本文更全面例示的第二方法是基于ATP水解酶：ATP酶的调控的过 表达。多数ATP酶是异寡聚体(heterooligomer)的成分并定位于细胞膜 或与细胞膜关联。这类酶的这一特点使其在细胞质中过表达困难，由于能 够由细胞质区室(cytoplasmic compartment)中不溶蛋白积累引起的潜在 的毒性作用。为寻找一种更合适的候选ATP酶，发明人进行对酿酒酵母 基因组的搜索，寻找编码可溶的ATP酶的基因。选择两个基因作为过表 达的候选。SAP1编码具有未知功能但是显示ATP水解酶典型特点的大细 胞质蛋白。预测SAP1编码AAA家族(与不同细胞活性关联的ATP酶) 的蛋白。之前通过与酿酒酵母染色质蛋白Sin1p的相互作用鉴定SAP1 (Liberzon等人，1996)。虽然本文未例示，SAP1蛋白的过表达是减少酵 母中ATP的另一种适合的候选。

例示的候选是编码核糖体关联分子伴侣的SSB2基因的ATP酶结构 域(图2)。SSB2蛋白(SSB2p)负责新生多肽链从核糖体释放期间的正 确折叠。ATP水解的能量用于使SSB2p与新生蛋白的复合物稳定。SSB2p 由三个明确的结构域组成。位于蛋白的N末端44kDa区域的其中之一具 有被其他两个C末端结构域抑制的ATP酶活性。表明分离的44kDaATP 酶结构域与全长蛋白相比具有更高的ATP亲和性和增加的反应速度 (Pfund等人，2001)。因此选择SSB2p蛋白的N-末端结构域例示本发明 的方法。

本文也还例示可以表达水解ATP和ADP的γ-和β-磷酸的酶ATP-二 磷酸水解酶或三磷酸腺苷双磷酸酶的第三方法。其在其比活性、核苷酸底 物特异性、二价阳离子需求和对抑制剂的敏感性方面与其他磷酸水解酶不 同(Plesner，1995；Handa和Guidotti，1996)。三磷酸腺苷双磷酸酶在真核 细胞中广泛地表达并且另外已在一些原核细胞中被发现，说明这些酶跨物 种的普遍作用。在本示范性实施方案中来自大肠杆菌的细菌三磷酸腺苷双 磷酸酶apy用于减少酵母细胞内ATP水平，而其他三磷酸腺苷双磷酸酶 可能与大肠杆菌酶作用一样好或比大肠杆菌酶作用更好。

编码ATP酶结构域的SSB2基因5’末端部分的克隆和过表达：在图 2B中描述编码SSB2p蛋白的N-末端411氨基酸残基(本文特指NSSB2) 的SSB2ORF的1,233bp片段，其与ORF的起始密码子之前的12bp一 起使用PCR规程扩增。以在编码天冬氨酸残基的GAC位置产生TGA终 止密码子的方法设计引物。这样在411个密码子之后终止蛋白合成，引起 相当于前述SSB2p的ATP酶结构域的分子量44kDa的截短蛋白(truncated  protein)产生。获得的DNA片段通过T/A克隆克隆到pUC57中并亚克隆 到如图1A阐明的pGPDIP表达盒中，在GPD1基因启动子的控制下。已 知该启动子在酵母中是组成型作用的并且在渗透胁迫条件下上调 (Albertyn等人，1994)。将博莱霉素抗性基因克隆到生成质粒的HindIII 位点，产生如图1B所描述的pUSgpdp-zeo。将质粒引入到酿酒酵母 BY4742菌株中。选择稳定的博莱霉素抗性转化子用于进一步研究。通过 PCR和两组相应引物的使用验证重组菌株中GPD1启动子控制下的ZeoR 基因和NSSB2的存在。最后，选择3种重组菌株用于进一步研究。

含有在GPD1启动子控制下的NSSB2的重组酿酒酵母菌株的生长和乙醇积累：测试含有在GPD1启动子控制下的NSSB2的菌株的生长和生 产乙醇的能力。由于选定的启动子不需要任何针对其基本功能的其他因子 或诱导剂的事实，在补充2或4％葡萄糖的富YPD培养基实施测试。

在补充2％葡萄糖的培养基中在厌氧条件下生长5天之后，表达由 GPD1启动子驱动的NSSB2的酿酒酵母菌株与野生型菌株相比在乙醇生 产中并未显示任何差异。重组子的生长轻微减少3-5％(参见图3)。然而， 向培养基补充4％葡萄糖时，同样的菌株表现出与野生型相比生物质积累 的减少(高达20％)。此外，在这些条件下我们观察到重组菌株的升高的 乙醇积累。因此酿酒酵母pUSgpdp-zeo+的最终乙醇：生物质比率与亲本菌 株相比显著更高(参见图4)。

在需氧条件下进行相同的实验。每24小时取样并且测量生物质和乙 醇的浓度。就野生型菌株而言，在生长24-30小时之后观察到乙醇生产的 最高水平并达到14-15g每升(参见图5)。在该时间当中几乎所有葡萄糖 都被受试菌株发酵。那之后，细胞进入生长的氧化阶段并开始再利用培养 基的乙醇。因此就野生型菌株而言在生长5天之后最终乙醇浓度减小到 0.6-1.2g每升(参见图6)。就表达在GPD1启动子控制下的NSSB2的重 组菌株而言，在生长24到48小时之间观察到最大乙醇积累，这与葡萄糖 活跃发酵和生物质增长同时发生。然而，与野生型菌株不同，重组子并不 能有效地再利用培养基中的乙醇(参见图5)。因此，即使重组菌株培养5 天之后，培养基中的乙醇浓度高达8-12g每升，与亲本酿酒酵母BY4742 菌株相比高出10到12倍。值得注意的是，重组菌株也以减少的生长为特 征。在孵育48小时之后重组菌株的生长速率被抑制并且在孵育5天之后 其达到1-1.2×10⁷细胞每ml，比BY4742的少两倍。

在所研究的重组菌株之一中测定ATP。如表1所示，那表明重组菌 株#18的细胞在补充4％葡萄糖的YPD培养基中在需氧条件下孵育5天之 后含有与亲本BY4742菌株相比低2.5倍的ATP量。

表1

在补充4％葡萄糖的YPD培养基中在需氧条件下生长5天之后表达以 GPD1启动子驱动的NSSB2的重组菌株#18中ATP的测定

  菌株   ATPμmol/g细胞   BY4742   1.0   #18   0.4

证明重组菌株中减少的生长速率和减小的ATP含量都由SSB2基因 的5’部分的表达引起。已知SSB2p的N-末端部分具有强ATP酶活性 (Pfund等人，2001)。在需氧和厌氧条件下生长的过表达NSSB2p的重组 菌株表现出增加的乙醇生产。酵母生长由两个时期组成。在孵育的前数小 时中葡萄糖被有效地发酵为乙醇并伴随ATP的快速产生和乙醇的积累。 该ATP被消耗用于生物质增长并且也用于起始分解代谢反应，引起之前 产生的乙醇的再使用。SSB2的ATP酶结构域的表达因此表现为造成细胞 内ATP水平的减少，引起生长减少并抑制积累的乙醇的次级再利用，导 致每个细胞的乙醇生产增加。

含有在半乳糖可诱导启动子控制下的NSSB1和Ecapy的重组酿酒酵 母菌株的生成和评估

来自缺少N-末端周质靶向序列的大肠杆菌的三磷酸腺苷双磷酸酶基 因apy被扩增为675bp片段，并且与酿酒酵母的NSSB1基因平行地克隆 到在复制型质粒pYES2的框架中半乳糖可诱导的GAL1启动子的控制下。 将生成的质粒pYES2-apy和pYES2-NSSB转化到酿酒酵母的受体BY4742 菌株。在缺少尿嘧啶的基本培养基上筛选转化子并通过大肠杆菌转化的质 粒营救验证转化子。在靶基因的转录激活条件下分析获得的重组菌株的生 长动力学、乙醇合成、ATP酶活性。

在50ml爱伦美氏烧瓶(Erlenmeyer flask)中包含半乳糖培养基(1％ 葡萄糖+10％半乳糖和5％葡萄糖+10％半乳糖)的20ml限定培养基中分 析带有质粒pYES2-apy和pYES2-NSSB的酿酒酵母转化子的生长动力学。 初始生物质浓度为15mg/L。转化子以在包含1％葡萄糖+10％半乳糖的培 养基上培养时轻微的生长迟缓为特征(图7A)。然而在含5％葡萄糖+10％ 半乳糖的培养基上培养时未显示生长的显著差异(图7B)。显然地培养基 中较高的葡萄糖浓度抑制靶基因的表达。

在这些条件下评估获得的带有质粒pYES2-apy、pYES2-NSSB和对照 质粒pYES2的转化子的半乳糖发酵效率。除了合成的乙醇的总体低量， 包含1％葡萄糖+10％半乳糖的培养基中表现出选定转化子的乙醇发酵和 乙醇产量的增加(图8A、9A)。带有pYES2-NSSB的转化子的乙醇积累 和产量在发酵的第三天最高并且为与亲本菌株相比按该顺序22％和39％ 的增加(表2)。带有pYES2-apy的转化子表现出与对照菌株相比乙醇积 累和产量的17％和28％的增加(表2)。也在包含5％葡萄糖+10％半乳糖 的糖混合物的培养基上测量乙醇半乳糖发酵的效率。仅在含有 pYES2-NSSB的转化子中达到乙醇积累和产量的增加，而含有pYES2-apy 的转化子如对照菌株地合成乙醇(图8B、9B)。含有pYES2-NSSB的转 化子显示与对照菌株相比37％和17％的乙醇积累和产量的增加(表2)， 而ATP酶比活性仅在含有pYES2-NSSB的转化子(具有最高乙醇生产水 平的转化子)中更高(表2)。

表2

发酵第三天酿酒酵母转化子和对照菌株的乙醇合成、产量和ATP酶比活 性

因此，带有GAL1启动子的构建体确认了以前获得的概念的证据，即 SSB1-编码ATP酶的诱导，即使在由半乳糖诱导的该启动子控制下也会引 起乙醇产量明显增加。不幸的是，该启动子由于受葡萄糖的强抑制并不是 非常方便。

本申请引用若干参考文献，总结于下文。每个这样的引用都为帮助本 领域技术人员更好的理解本发明和找到使本领域技术人员能够实践本发 明的许多实施方案中的任何一个的序列、重组技术、测试和其他常规信息 的来源。因此，每个引用的参考文献通过引用其全部并入本文，除了那些 如果包含与本文教导的信息相冲突的信息的那些文献的部分，在该情况下 应该认为本公开内容比并入的参考文献具有更高的控制权。

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