具有受控血清药代动力学的人蛋白支架

摘要

本发明提供的构建体包含蛋白支架，其中所述支架包含人血清白蛋白的结构域III、结构域IIIa、或结构域IIIb，或与结构域III、结构域IIIa、或结构域IIIb具有基本序列相同性的多肽；和与所述蛋白支架共价连接的靶向部分；和与所述蛋白支架共价连接的治疗部分和/或成像部分。所述支架可修饰以调整所述构建体的血清药代动力学。除了制备所述构建体的方法，还提供了所述构建体的治疗、成像和诊断用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年4月8日提交的美国临时专利申请序列号61/167844 的优先权，其内容通过引用全部纳入本文用于所有目的。

联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明

本发明是在政府支持下由国立卫生研究院(National Institutes of Health) 授予的基金号CA086306资助完成。政府享有本发明的某些权利。

在光盘上提交的序列表、表格或计算机程序列表附件

无

发明领域

本发明涉及构建体、它们的组合物、及其用途，其中所述构建体包括 人血清白蛋白结构域III作为支架，该支架上结合有一种或多种靶向部分和 一种或多种成像、诊断或治疗部分。

发明背景

过去十年内，组合库技术产生了大量分子，包括肽、适体和小的化学 分子，可选择以高特异性和亲和力结合靶标或组织(Aina等，2007；Barbas 和White，2009；Bembenek等，2009)。然而，当体内施用时，这些分子往 往显示次优的药代动力学(PK)，其特征为瞬时的血清持久性和不能在靶位 点积累至成像或治疗应用的充分水平。为解决这一问题，这些靶向分子可 结合于支架。最近的综述中描述了多种支架(Gronwall和Stahl，2009；Nuttall 和Walsh，2008)。但是，它们或是非人源的(例如，亲和体(affibody)，源自 葡萄球菌(Staphylococcal)蛋白A(Friedman等，2007)，驼科和鲨鱼单结 构域抗体同种型(Saerens等，2008)，源自植物环肽的胱氨酸结小蛋白 (Simonsen等，2008))，或不能提供可控PK(锚蛋白，模拟抗体蛋白(adnectin)、 高亲合性多聚体(avimer)，脂质运载蛋白和抗运载蛋白(anticalin)(Nuttall和 Walsh，2008))。

人血清白蛋白(HSA；67kDa)是人体内最丰富的蛋白质(30-50g/L)，且 已掺入获批药物中(即，诺华公司(Novartis)的Albuferon)。临床前研究 中，HSA被成功用作药物递送的运载体分子(Burger等，2001；Kratz等， 2000；Wosikowski等，2003)和基因递送的载体(Aina等，2007)。作为融合 蛋白，HSA已证明能改善分子的PK，例如干扰素-α(Osborn等，2002)、白 介素-2(Melder等，2005)、重组双特异性抗体分子(Muller等，2007)或scFv 抗体片段(Yazaki等，2008)。与IgG类似，HSA与新生Fc受体-FcRn相 互作用，该受体也称为Brambell受体(Chaudhury等，2003)。该相互作用负 责延长白蛋白的血清持久性。简单来说，通过液相胞饮作用将白蛋白分子 从循环中摄入血管内皮细胞的内体。在初级内体(～pH 6.5)中，白蛋白与位 于该组分内的FcRn结合。内体与溶酶体融合后，内体中未结合的组分被释 放降解，而FcRn结合的白蛋白得到保护。内体循环回内皮细胞的顶面，朝 向循环的中性环境(pH 7.4)，其中白蛋白被FcRn释放回血液。具体地，已 证明HSA结构域III(DIII；23kDa)以pH依赖性方式结合FcRn(Chaudhury 等，2006)。HSA DIII中的三个保守组氨酸残基(H535、H510和H464)被假 定为在HSA-FcRn相互作用中起作用(Bos等，1989；Chaudhury等，2006)。

目前，临床中用于癌症治疗的最成功靶向试剂是完整的抗体(例如，曲 妥珠单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗)。使用抗体的优点除了它们上佳的靶 标亲和力与特异性和良好的安全性，它们还具有实现治疗效应必需的药代 动力学(PK)。抗体的长时间循环持久性主要归因于其Fc结构域与FcRn的 相互作用。抗体Fc结构域的大小是HSA DIII的两倍，除此之外，Fc结构 域还与其它内源性Fc受体相互作用。该生物学功能可在临床应用中引起不 良副作用。抗体的缺点还包括靶标可接近性的某些局限，但主要是其生产 过程的费时与高度费力，这还提高了抗体药物的费用。

也可选择包括肽和适体在内的其它靶向部分以呈现对不同靶标的纳摩 尔级亲和力和高度特异性，与抗体相比，生产这些靶向部分快得多也便宜 得多。其主要缺点是这些低分子量靶向试剂通常很快从循环中清除，典型 的血清半衰期为数分钟。这引起较低靶摄取并限制了它们在诊断成像和治 疗的临床应用中的潜能。现代医学中，在靶向成像和治疗试剂的理想PK内 调整的能力具有很高价值。提供了使用能靶向生物分子并延长血清持久性 的具有多种循环半衰期而不显著改变分子量的分子进行体内治疗与成像的 组合物及其方法。本发明解决了对低分子量、低或非免疫原性试剂的需求， 这些试剂能给肿瘤靶向分子，例如肽、适体或小的化学品提供体内应用所 需的适当药代动力学性质，所述体内应用包括成像和/或治疗。

发明概述

在第一方面，本发明提供HSA DIII在构建体制备中作为支架的用途， 所述构建体含HSA DIII和与HSA DIII偶联的一种或多种小分子靶向试剂， 以及与HSA DIII偶联的一种或多种成像部分或治疗部分。可修饰所述 HSA-DIII支架或运载体以提供具有特定药代动力学的构建体(PK)并提供多 价和/或多特异性的可能性以及用于结合官能团的残基。

在一些实施方式中，本发明提供的构建体包含a)蛋白支架，其中所述 支架包含人血清白蛋白的结构域III、结构域IIIa、或结构域IIIb，或为其改 变的FcRn受体结合性质所选择的变体；b)与所述蛋白支架共价连接的靶向 部分；和c)与所述蛋白支架共价连接的治疗部分或成像部分。

在另一方面，本发明提供检测对象内疾病或病症相关生物分子的方法， 通过将本发明所述构建体给予怀疑患有或者正患有所述疾病或病症的对象 进行检测，其中所述构建体的靶向部分结合所述生物分子并测得构建体所 结合的成像试剂。在一些实施方式中，诊断是否存在所述疾病或病症。

在另一方面，本发明提供与组织内存在生物分子过量表达相关的疾病 或病症的靶向治疗方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明所述构建体 给予患有所述疾病或病症的对象，其中所述构建体的靶向部分结合所述生 物分子，而构建体的治疗试剂在与所述生物分子的存在相关的组织或细胞 内治疗所述疾病或病症。

在另一方面，本发明提出提供经修饰结构域III蛋白库，库内蛋白具有 不同的靶向特异性和预定FcRn亲和力以在本发明所述靶向成像与治疗构 建体的设计中用作支架。在另一实施方式中，本发明提供如本发明所述使 用的一种或多种结构域III支架及其变体的编码核酸。在更进一步的实施方 式中，本发明提供载体，所述载体包含操作性连接有基因调节因子以控制 结构域III支架表达的核酸，并提供含有所述载体或核酸的细胞。

在本发明的所有实施方式和方面中，一些实施方式的前提是，所述构 建体不含有HSA的结构域I或结构域II中其一或两者，或者所述构建体不 含有HSA的结构域II的超过5、10、15或20个连续氨基酸的序列。

附图简要说明

图1.(A)构建体Db-DIII的基因组装。L-哺乳动物细胞分泌的前导 信号肽；抗体的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)通过8个氨基酸(富含甘 氨酸、丝氨酸)的接头连接形成单链可变区片段(scFv，25kDa)。通过18个 氨基酸的接头连接scFv与HSA DIII基因。DIII在盒内侧接SpeI和EcoRI 限制性位点以促进一种DIII与另一DIII的交换(例如，WT交换为H535A 等)。(B)Db-DIII蛋白的漫画示图，其中两个scFv-DIII分子形成非共价二 聚体。

图2.(A)4种Db-DIII蛋白的SDS-PAGE。第1、2与3泳道分别是NR 条件下的H535A、H510A与H464A，第5泳道是R条件下的WT。(B)Db-DIII  WT在NR(第2泳道；用AP偶联的抗小鼠Fab mAb检测)和R(第3泳道； HRP-蛋白L检测)条件下的Western印迹。(C)使用Superdex 200柱和0.5毫 升/分钟流速的大小排阻层析。Db-DIII WT蛋白在28.17分钟洗脱。用峰积 分评估所得纯度约为98％。

图3.(A)由DIIIa(绿)和DIIIb(黄)的半结构域所构成HSA DIII的 PyMOL模型。六个二硫桥显示为红色。箭头标出H535、H510和H464残 基的位置。位于DIIIa的H464残基突变为A以产生DIII H464A变体。位 于DIIIb的氨基酸H535和H510各用A交换以产生DIII H535A和DIII  H510A变体。(B)HSA DIII(绿)和FcRn(橙)与FcRn(橙)分子的对接模型。 红色为FcRn上参与IgG结合的残基，在FcRn与DIII分子的界面彼此相互 作用的残基显示为蓝色。(C)二价Db-DIII分子的模型，其中每个Db在C 末端都携带两个DIII蛋白。构成Db的scFv单体为浅绿和深绿色，18个氨 基酸的接头为蓝色，而DIII分子为黄色。

图4.异种移植有CEA-阳性LS174T(左侧)和CEA-阴性C6(右侧)肿瘤 的无胸腺裸小鼠的小动物PET/CT成像。小鼠注射有¹²⁴I-标记的Db-DIII蛋 白(WT、H535A、H510A或H464A)并用抗CEA Db作为参比。小鼠在5个 不同时间点成像10分钟，显示冠状切片。包括PET/CT的互相配准图像用 于肿瘤和器官位置的解剖学参比。

图5.(A)PET图像的肿瘤对软组织ROI分析。(B)通过各时间点PET 图像的放射活性(％ID/g)定量生成的血液活性曲线。

图6.细胞结合鉴定将浓度升高的偶联有Alexa 647的HSA、DIII WT、 H535A、H510A和H464A蛋白与转导有人FcRn的293细胞一起孵育。偶 联有Alexa的HSA与未转染的293细胞孵育作为对照。

图7.Balb/c小鼠中¹³¹I标记的HSA和DIII蛋白的血液活性曲线。

图8.Db-DIII的DNA和翻译成蛋白的序列。标出了下列DNA和蛋白 区段的具体序列和起始位点：限制性酶消化位点，Kozac序列，前导-分 泌信号肽，V_L，8氨基酸的域间肽接头，V_H，Db和HSA DIII之间18氨基 酸的接头；独立突变为丙氨酸以产生Db-DIII变体的组氨酸残基H535、 H510A和H464，和其后为限制性酶切位点的两个终止密码子。

图9.A.DIII WT的DNA和翻译成蛋白的序列。显示下列DNA和蛋白 区段的重要序列和起始位点：克隆中所用限制性酶消化位点，Kozac序列， 前导序列，HSA DIIIa、HSA DIIIb的起始，组氨酸残基H535、H510和H464， c-Myc肽，其后为限制性酶切位点的两个终止密码子；B.HSA DIIIa；和 C.HSA DIIIb。

图10.¹²⁴I标记的抗CEA肽-DIIIb偶联物的小动物PET/CT成像。注 射后4、20和27小时进行10分钟静态扫描，显示冠状切片。箭头标出CEA 阳性(LS174T)和CEA阴性(C6)肿瘤。

发明详述

本发明提供HSA DIII在构建体制备中作为支架的用途，所述构建体含 HSA DIII和与HSA DIII偶联的一种或多种小分子靶向试剂，和与HSA DIII 偶联的一种或多种成像部分或治疗部分。通过在结构域III内选择影响FcRn 受体结合或提供补充位点以结合靶向、治疗和成像部分的氨基酸序列修饰， 可修饰所述HSA-DIII支架或运载体以提供具有特定药代动力学(PK)的构建 体，并提供多价和/或多特异性的可能性以及结合官能团的残基。

我们发现低分子量的肿瘤靶向分子结合、接枝到以固有血清稳定性为 特征的HSA结构域III蛋白支架上或在其上展示，随后可获得改进的药代 动力学性质和靶摄取。最大化的肿瘤积累能转化成成像应用中的更强信号 或在治疗中的充分药物载荷递送。此外，HSA DIII支架能提供残基以偶联 官能团(例如，放射性核素、细胞毒性药物、毒素)，还能提高疏水靶向分子 的溶解度。该支架具有优势，因为其可以1.基本无免疫原性，2.能为不同的 应用提供最优血清持久性(可调)，3.分子量低，促进外渗、肿瘤穿透和肾清 除(＜60kDa)，这对成像应用为优选，4.通过运用亲和力效应(同一支架上的 2-3个靶向分子)或引入多重特异性来提高靶向分子的功能性亲和力的平台， 和5.可溶于血清，使其表面结合的分子也可溶。

在一些实施方式中，本发明提供的复合物/构建体包含a)蛋白支架， 其中所述支架包含人血清白蛋白的结构域III、结构域IIIa、或结构域IIIb， 或其变体；b)与所述蛋白支架共价连接的靶向部分；和c)与所述蛋白支架 共价连接的治疗部分或成像部分。所述靶向部分是与靶组织或细胞的受体 结合的配体。因此，在一些实施方式中，所述靶向部分是抗体，或更优选 是其免疫活性片段，所述抗体或片段能结合靶组织或细胞的生物分子(例 如，肿瘤特异性抗原)。所述抗体优选为scFv双抗体、三抗体或小抗体。在 一些实施方式中，所述靶向部分是核酸适体。所述靶向部分能结合存在于 对象内或对象的靶组织或细胞上的生物分子。所述生物分子优选为肿瘤特 异性抗原或其在靶标组织或细胞内的存在与疾病或健康状况关联或者在之 中过度表达的其它生物分子。提出的肿瘤特异性抗原包括但不限于CEA、 CD20、HER2/neu、PSCA、PSMA、CA-125、CA-19-9、c-Met、MUC1、 RCAS1、Ep-CAM、Melan-A/MART1、RHA-MM、VEGF、EGFR、整联蛋 白和纤连蛋白的ED-B。因此，在一些实施方式中，靶组织或细胞是癌组织 或细胞。

在本发明所述的一些实施方式中，至少一种或所有靶向部分、成像部 分或治疗部分通过非肽接头或非肽键与支架共价结合。在其它实施方式中， 至少一种或所有靶向部分、成像部分或治疗部分通过异双功能交联剂、同 双功能交联剂、零长度交联剂、二硫键或生理上可切割交联剂与支架共价 结合。靶向、成像和治疗部分的接头优选长2-50个原子(例如，长2-10、4-40、 10-30个原子)。结构域III支架可结合超过一种靶向、成像或治疗部分。

在一些实施方式中，小肽或其它靶向部分(适体、化学品)与HSA DIII 遗传融合或偶联；在其它实施方式中，蛋白质(例如，抗体、抗体片段、酶、 受体配体、细胞因子、趋化因子、生长因子)与HSA DIII支架融合作为靶 向部分；或3)纳米颗粒、抗磁材料、量子点、放射性核素或化合物可与HSA  DIII支架结合作为成像部分。

对于分子成像目的，多种放射性核素可与蛋白支架结合以使用γ或 SPECT相机或PET扫描仪进行检测。可偶联抗磁材料用于MR成像。对于 光学成像，HSA DIII支架可融合荧光染料、蛋白质或生物发光酶(例如，萤 火虫、海肾或高斯(Gaussia)萤光素酶)。

对于治疗应用，治疗用放射性核素、细胞毒性药物、毒素、细胞因子、 酶或其它治疗部分可与靶向HSA DIII支架结合用于靶标特异性递送到肿 瘤。在一些实施方式中，与DIII的连接在生理条件下易受切割(例如，酶切 割、如在溶酶体内的酸性切割)。

本发明提供的优点为，提供分子量低于HSA的低或无免疫原性人HSA 结构域III蛋白(例如，23或11kDa)，其具有改变或延长所结合分子的血清 持久性至限定程度的能力。

在上述任意实施方式中，HSA结构域III优选为野生型和在H535、H510 或H464处有突变以改变所述结构域与FcRn受体的结合。在一些实施方式 中，所述突变是H535A、H510A、H464A；H535A和H510A和H464A； H535A和H464A；H535A和H510A；或H510A和H464A。在上述一些实 施方式中，所述蛋白支架基本由HSA结构域III、结构域IIIa、或结构域IIIb 或与这三种结构域序列基本相同的多肽组成。

在一些实施方式中，所述构建体的治疗部分是药物。例如，所述治疗 部分可以是治疗用放射性核素、细胞毒性药物、细胞因子、化疗剂、放射 致敏剂或酶。在进一步实施方式中，多个治疗部分与所述蛋白支架共价连 接。

在其它实施方式中，所述构建体包含成像剂。合适的成像剂包括但不 限于放射性核素、抗磁材料、顺磁颗粒、荧光团、发色剂、量子点、纳米 颗粒和生物发光酶。支架可共价结合一个或多个成像剂。

在一些实施方式中，所述构建体是单价或多价。例如，所述靶向部分 或构建体的其它成分(例如与DIII支架结合的靶向部分，参见图3)自身可以 是单价、双价、三价或多价，各成分与其HSA DIII支架共价连接或结合。

在另一方面，本发明提供检测对象内疾病或病症相关生物分子的方法， 通过将本发明的构建体给予怀疑患有或者正患有所述疾病或病症的对象进 行检测，其中所述构建体的靶向部分结合所述生物分子并检测构建体所结 合的成像剂。在一些实施方式中，根据所述检测诊断是否存在所述疾病或 病症。例如，所述生物分子是癌症中过量表达的肿瘤特异性抗原时，可通 过将本发明所述构建体给予对象并检测对象中结合于构建体的成像部分来 确定是否存在与所述肿瘤特异性抗原相关的癌症。测得的构建体成像部分 在肿瘤位点处的定位表明癌症的存在。在一些实施方式中，通过选择含有 突变的结构域III多肽来微调所述构建体或成像剂的血清持久性，所述突变 使结构域III(DIII)对FcRn受体的亲和性改变。用于成像的放射性核素包括 但不限于用于SPECT成像的I-131、I-123、In-111和Tc-99m和用于PET 成像的F-18、I-124、Cu-64、Y-86。

在另一方面，本发明提供与组织内存在生物分子过量表达相关的疾病 或病症的靶向治疗方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明所述构建体 给予患有所述疾病或病症的对象，其中所述构建体的靶向部分结合所述生 物分子，且构建体的治疗剂在与所述生物分子的存在相关的组织或细胞内 治疗所述疾病或病症。例如，在一些实施方式中，所述靶向部分结合癌症 的肿瘤特异性抗原，所述待治疗的疾病或病症是所述癌症，且所述治疗剂 是治疗用放射性核素、细胞毒性药物、细胞因子或化疗剂。可结合靶向DIII 的治疗性化疗药物包括但不限于：吉西他滨、多柔比星、长春新碱、拓扑 替康、伊立替康。可与DIII偶联的毒素的示例有耳他汀或假单胞菌外毒素 A。治疗用放射性核素包括但不限于：β发射体-Y-90、Lu-177、I-131、 Sm-153与Sr-89；和α发射体-Ra-223、Th-227、Ac-225、At-211、Bi-212 与Bi-213。所述DIII支架可共价结合一种或多种治疗剂。

在一些实施方式中，治疗和成像官能团可同时结合于同一靶标特异性 DIII平台用于如下应用：观察所述药物偶联物靶向到肿瘤/疾病位点，通过 分子成像监控治疗过程并确定代谢清除的路径。

因此，本发明还提供1)包含上述治疗和成像构建体和生理学可接受的 赋形剂或运载体的药物或诊断组合物；2)本发明所述治疗用构建体在治疗 疾病或病症所用药物的生产中的应用；和本发明所述成像构建体在检测疾 病或病症所用诊断剂生产中的应用。

本发明提出将肿瘤靶向肽与选定DIII平台化学偶联。例如，可用¹²⁴I(t^1/2  4.2天)或⁶⁴Cu(t_1/2 12.7小时)标记的蛋白注射荷瘤对象，并通过PET成像评 估这些蛋白靶向至抗原阳性肿瘤。这些可变区序列在天然抗体主链上的表 达，或作为scFv、三抗体、双抗体或小抗体，标记有放射性核素，在携带 靶标细胞的体内检测中特别有用。在主链或天然抗体主链上的这种表达优 选不但用于靶向还阻断靶标生物分子的功能和/或杀死或抑制体内携带这些 分子的细胞的生长或增殖。

另一方面，本发明提出提供经修饰结构域III蛋白库，库内蛋白具有不 同的预定FcRn亲和力以在本发明所述靶向成像与治疗构建体的设计中用 作支架。在另一实施方式中，本发明提供如本发明所述使用的一种或多种 结构域III支架及其变体的编码核酸。在更进一步的实施方式中，本发明提 供载体，所述载体包含操作性连接有基因调节因子以控制结构域III支架表 达的核酸，并提供含有所述载体或核酸的细胞。

HSA DIII中的三个保守组氨酸残基-H535、H510和H464被假定为在 HSA-FcRn结合中起作用，还具体提出了在这些残基处的变体。为评估调节 HSA-FcRn相互作用的能力，我们生成并表达融合蛋白，所述蛋白由抗CEA 二抗体(Db，两个scFv的非共价二聚体；55kDa)和野生型HSA DIII(WT， 无突变)或其3种变体之一构成，这些变体各掺入H535、H510或H464变 为丙氨酸残基的一种突变。用¹²⁴I标记的Db-DIII蛋白注射异种移植无胸腺 小鼠的小动物PET/CT成像显示HSA DIII能延长Db的血清持久性，同时 保持肿瘤靶向。图像分析和生物分布研究表明Db-DIII WT在循环中持续最 久，估算所得平均停留时间(MRT)为56.7小时，其次为Db-DIII H535A(25 小时)＞H510A(20小时)＞H464A(17小时)和Db(2.9小时)。生成HSA DIII  WT和变体(H535A、H510A与H464A)以及DIIIa亚结构域(氨基酸残基 384-492；14.2kDa)和DIIIb亚结构域(510-585；12.2kDa)。通过在Balb/c 小鼠中，静脉内注射各¹³¹I标记的DIII蛋白评估它们在血液中的药代动力 学性质。在8个不同时间点(0-72小时)从尾部取血，在γ井式计数器中对 放射性计数。各蛋白的终末血清半衰期(t_1/2β)确定为如下：与完整HSA蛋白 (17.3小时)相比，DIII WT(15.3小时)、H535A(10.7小时)、H464A(10.2小 时)、H510A(9.75小时)、DIIIa(8.93小时)与DIIIb(6.87小时)。选定DIII 蛋白将用作接枝或化学偶联肿瘤靶向分子(肽、适体或小化学部分)的支架， 以及直接用于产生组合展示文库。具有适用于诊断用途的药代动力学的靶 标特异性支架可用于成像应用。或者，可将潜在的抗肿瘤药物与具有治疗 用最优特征的靶向支架偶联并用于癌症治疗。

本发明还提供对接模型表明DIII中还有两个残基对与FcRn的相互作 用很重要(即，谷氨酸残基E505与E531)。因此，本发明的一些实施方式提 供DIII、DIIIa或DIIIb蛋白支架的变体与核酸、和含有所述核酸的载体与 转导细胞，所述变体在E505和/或E531处具有氨基酸取代，除此以外与 HSA的结构域III、IIIa或IIIb的序列基本相同或者相同。在一些实施方式 中，用天冬氨酸取代这两个残基之一或两者，在其它实施方式中，用不带 电氨基酸取代这两个残基之一或两者，在更进一步实施方式中，用丙氨酸 或甘氨酸取代E505与E531之一或两者。在其它实施方式中，所述取代是 E505D、A、G、I、V或L或者E531D A、G、I、V或L取代，这些取代 干扰DIII结合FcRn并从而调节靶标特异性DIII成像或治疗剂的循环半衰 期。

靶向部分可以是能结合靶标生物分子的任何分子。在一些实施方式中， 靶标分子是细胞外表面存在的肿瘤特异性抗原。靶向部分可以是抗体，或 更优选为对所述抗体识别的分子有亲和力的抗体片段。在优选实施方式中， 所述抗体是scFv、双抗体、小抗体或三抗体。在一些实施方式中，所述靶 向部分是能结合所述生物分子的核酸适体或小肽(例如，长为5-30个氨基 酸，2-20个氨基酸)。所述靶向部分优选对所述生物分子有高亲和力，K_d低于100nM、30nM、10nM或1nM。此外，每个支架使用针对靶标生物 分子的多个(2、3、4或更多个)此类或亲和力较低的靶向部分，可通过亲和力 效应促进与靶细胞的结合。

本文所用术语“成像剂或部分”指能直接或通过与信号产生系统的补 充成员间的相互作用提供可检测信号的试剂或部分。优选地，构建物在对 象体内产生信号时，所述信号能外部测得。

“治疗部分”指可用于治疗疾病或病症或对对象靶组织和/或细胞有一 些其他预期益处的试剂。治疗部分可以是治疗药物、激素、细胞因子、干 扰素、抗体或抗体片段、核酸适体、酶、多肽、毒素、细胞毒素或化疗剂。 治疗部分可以是放射致敏剂。

用于将靶向部分、成像部分或治疗部分与支架相连的接头可包含共价 键或长度为1-100个原子或更长的链。接头可在链中包含碳、氮、硫、或 氧原子。具体考虑碳链(例如，约5-约50个碳)。接头可包含核酸或氨基酸。 碳链作为接头的示例包括但不限于烷基、烯烃或醛。所述碳链可有一种或 多种取代、未取代、无分支或有分支。接头可包含约5纳米-约50纳米、 3-30nm的长度，且更优选约5-10nm。接头的示例可包括但不限于长度为 约10-约20个碳的碳链。也考虑聚亚烷基二醇(例如PEG)接头。接头可包 括非肽键。接头包括但不限于异双功能交联剂、同双功能交联剂、零长度 交联剂、二硫键或生理上可切割交联剂。靶向、成像和治疗部分的接头优 选长2-80个原子(例如，长为2-10、4-40、10-30、2-50个原子)。当所融合 试剂为多肽时，也考虑结构域III和至少一种靶向剂、成像剂或治疗剂的融 合蛋白。也预期所述靶向、成像和治疗剂可不必各自与支架连接成融合蛋 白，或经另一氨基酸或经肽键与支架连接。

成像剂和治疗部分可采用本领域熟知的常规方法直接与DIII蛋白支架 偶联。常规采用放射性与非放射性标记(酶、光化学和化学法标记核酸与蛋 白质的综述参见Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》)，第2版， Greg T.Hermanson，学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)，2008年， 共1202页)。

适体是结合特定靶分子的寡核苷酸分子。适体通常由大型随机序列库 中的选择操作产生。用本领域熟知的方法，可通过重复轮次的体外选择或 等同的SELEX(指数式富集配体的系统进化)获得核酸适体以结合不同分子 靶标如小分子、蛋白质、核酸、乃至细胞与组织。正如本领域熟知的，可 通过对基于复合核酸的组合型文库(例如，每个文库＞10¹⁴种核酸)采用名 为SELEX的过程(参见通过引用纳入本文的美国专利公开号20090004667) 进行体外筛选产生核酸适体。SELEX是随机RNA序列池的文库与选定蛋 白靶标一起孵育的迭代过程。然后，相互作用的RNA与未结合RNA分离 并经逆转录然后聚合酶链反应扩增(RT/PCR)得以扩增。可使用DNA模板用 允许掺入2′氟修饰嘧啶的突变T7 RNA聚合酶经体外转录产生富集的RNA 池。这些修饰使RNA更耐受核酸酶。得以产生富集RNA池的步骤被称为″ 筛选轮次″。针对蛋白靶标的筛选轮次通常持续直至结合亲和性的推进达到 平台。然后，可从池中分离个体克隆并测序。适体可提供能与抗体相当甚 至超越抗体的分子识别性质。除了特异识别外，适体提供超越抗体的优点。 适体可在试管内完全工程改造，并可通过化学合成方便地制得。适体还具 有所需的保存性质和溶解性质，并在治疗应用中很少或不引起免疫原性。 本发明所述使用的适体可以是与CEA、CD20、HER2/neu、PSCA、PSMA、 CA-125、CA-19-9、c-Met、MUC1、RCAS1、Ep-CAM、Melan-A/MART1、 RHA-MM、VEGF、EGFR、整联蛋白和纤连蛋白的ED-B高亲和性结合(例 如，Kd低于100nM、10nM或1nM)的核酸。适体优选长度为10-30、10-20 或15-25个核酸。

本发明所述结构域III的氨基酸序列是HSA结构域III、IIIa或IIIb的 序列(分别参见图9a、b、c)或与其基本相同的序列。结构域III 1)包含以下 氨基酸序列、由或基本由以下氨基酸序列组成：与图9a、9b或9c所示多 肽相比，优选在其全部序列或在其至少约15、20、25、50、75、100、125、 150个或更多氨基酸的区段内具有大于约90％，优选91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列相同性，并能结合FcRn (Brambell)受体。结构域III(氨基酸残基384-585)有两个亚结构域-DIIIa(氨 基酸残基384-492)和DIIIb(氨基酸残基510-585)。(参见Sugio等，Protein  Engineering(《蛋白质工程》)，第12卷第6册，439-446，1999年6月， 就HSA序列和结构将该文献通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，权 利要求书所述的结构域III是包含本文所公开的HSA结构域III、结构域IIIa 或结构域IIIb及其H535、H510或H464变体，由其组成或基本由其组成的 多肽。

如本发明所述的结构域III、结构域IIIa或结构域IIIb可以分别是图9a、 b或c所示多肽的保守修饰变体。在优选实施方式中，改变所示变体对FcRn (Brambell)受体的亲和性以微调其血清耐受性。在一些实施方式中，这些结 构域H535、H510、H464位置中的一个或多个组氨酸残基缺失或被另一碱 性或非碱性氨基酸取代。在一些实施方式中，结构域III序列具有或仅有 H535A或G，H510A或G，H464A或G中的一个或多个取代。在一些进一 步的实施方式中，所述取代是H535A、H510A、H464A中的1个、2个或3 个。在其它实施方式中，所述取代是H535V、I或L；H510V、L或I；或 H464V、L或I中的一个或多个。在进一步的实施方式中，在结构域III、 IIIa或IIIb支架的其他位置处有其他保守取代(1、2、3、4或更多个)。GenBank： AAA98797.1也给出了HSA的序列。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚 合物。本领域普通技术人员熟知获得(例如，产生、分离、纯化、合成与重 组生产)多肽的方法。

术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及以类似于天然产生 的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。优选的氨基酸是 如人体内发现的天然产生的氨基酸。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的 氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸 丝氨酸。“氨基酸类似物”指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构 的化合物，即α碳结合于氢、羧基、氨基和R基，如高丝氨酸、正亮氨酸、 甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸) 或修饰的肽主链，但与天然产生的氨基酸的基本化学结构保持相同。氨基 酸模拟物指结构不同于氨基酸的普通化学结构，但作用方式类似于天然产 生的氨基酸的化合物。

本文中氨基酸可用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通用三字母 代号或单字母代号表示。同样，核苷酸可用其普遍接受的单字母代码表示。

至于氨基酸序列的“保守修饰变体”，本领域技术人员将认识到，在 编码序列中改变、加入或删除单个氨基酸或少量百分数氨基酸的核酸、肽、 多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或加入是“保守修饰变体”，其中所述 改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似的氨基酸的保 守取代表是本领域熟知的。这类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、 种间同源物和等位基因的补充且并不排除它们。

以下八组各自含有可互相保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、 赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙 氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸 (C)甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(《蛋白质》)(1984))。

由Hollinger等，PNAS(USA)90(14)：6444-6448(1993)首次描述的双抗 体可用本文所述重链和轻链构建，也可使用本文所述的个体CDR区。双抗 体片段通常包含通过接头与轻链可变结构域(V_L)连接的重链可变结构域 (V_H)，该接头太短以至于同一链上的两个结构域间无法配对。因此，迫使 一个片段的V_H和V_L结构域与另一片段的V_H和V_L结构域互补，从而形成 两个抗原结合位点。可类似构建具有3个抗原结合位点的三抗体。Fv片段 含有完整的抗原结合位点，该位点包括由非共价相互作用保持在一起的V_L结构域和V_H结构域。本发明包含的Fv片段还包括通过戊二醛、分子内二 硫键或其他接头交联V_H和V_L结构域的构建体。重链和轻链的可变区融合 在一起形成单链可变区片段(scFv)，该片段保留亲代免疫球蛋白初始的特异 性。单链Fv(scFv)二聚体由Gruber等，J.Immunol.152(12)：5368-74(1994) 首次描述，可用本文所述重链和轻链构建，也可使用本文所述的个体CDR 区。本领域已知的很多技术能用于制备本发明的特定结合构建体(参见美国 专利申请公开号20070196274和美国专利申请公开号20050163782，这些申 请各通过引用全文纳入本文用于所有目的，特别是关于小抗体和双抗体设 计)。

可用化学交联或杂交的杂交瘤技术产生双特异性抗体。或者，可用重 组技术产生双特异性抗体分子(参见：双特异性抗体)。将连接V_H和V_L结 构域的接头长度从产生scFv片段常用的约15个氨基酸缩短至约5个氨基 酸可促进二聚化。这些接头促进VH和VL结构域的链间组装。SGGGS是 合适的短接头，但也可使用其他接头。从而两个片段组装成二聚体分子。 接头长度进一步缩短成0-2个氨基酸能产生三聚体(三抗体)或四聚体(四抗 体)分子。

可采用本领域已知的许多技术制备抗体如重组、单克隆或多克隆抗体 (参见例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等， Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer  Therapy(《单克隆抗体与癌症治疗》)，ARL有限公司(Alan R.Liss，Inc.)， 第77-96页(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(《最新免疫 学实验方法》)(1991)；Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(《抗 体：实验室手册》)(1988)；和Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and  Practice(《单克隆抗体：原理与实践》)(第2版，1986年))。可从细胞克 隆出编码感兴趣抗体重链和轻链的基因，例如可从杂交瘤克隆出编码单克 隆抗体的基因并用于生产重组单克隆抗体。也可从杂交瘤或浆细胞制得编 码单克隆抗体重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合产 生大量具有不同抗原特异性的抗体(参见例如Kuby，Immunology(《免疫 学》)(第3版，1997年))。可调整单链抗体或重组抗体的生产技术(美国专 利号4,946,778、美国专利号4,816,567)用于生产本发明多肽的抗体。转基 因小鼠或其它生物体如其它哺乳动物也可用于表达人源化或人抗体(参见 例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425； 5,661,016，Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature  368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature  Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826 (1996)；和Lonberg与Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。或者， 噬菌体展示技术可用来鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚体Fab片段 (参见例如，McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)；Marks等， Biotechnology 10：779-783(1992))。抗体也可制成双特异性的，即能识别两 种不同抗原(参见例如，WO 93/08829，Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659 (1991)和Suresh等，Methods in Enzymology 121：210(1986))。抗体也可以是 异源偶联物，例如，两种共价结合的抗体或免疫毒素(参见例如，美国专利 号4,676,980，WO 91/00360；WO 92/200373；和EP 03089)。

本领域熟知人源化或灵长类源化非人抗体的方法。通常，人源化抗体 具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常 称为输入残基，它们一般取自输入可变区。人源化可基本按照Winter及其 同事的方法进行(参见例如Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann 等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988) 和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))，用啮齿类的CDR或CDR 序列取代相应的人抗体序列。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利 号4,816,567)，其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所 取代。实践中，人源化抗体通常是一些CDR残基和可能的一些FR残基被 啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。

″嵌合抗体″是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换 使其抗原结合位点(可变区)结合于类型、效应功能和/或种类有所不同或 已改变的恒定区，或结合于赋予所述嵌合抗体新性质的完全不同分子，例 如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)用具有不同或已改变抗原 特异性的可变区改变、替换或交换所述可变区或其部分。

涉及蛋白质或肽时，术语″特异性(或选择性)结合″抗体或″特异性(或选 择性)与……免疫反应″指能在蛋白质和其它生物物质的异质群体中确定是 否存在所述蛋白质的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，特定抗 体与特定蛋白质的结合至少为背景的两倍，更典型地是背景的10-100倍以 上。在这些条件下与抗体特异性结合需要选择对特定蛋白质特异性的抗体。 例如，可选择多克隆抗体以仅获得与选定抗原特异性免疫反应而不与其它 蛋白质反应的那些多克隆抗体。可通过消减与其它分子交叉反应的抗体来 实现该选择。可利用各种免疫试验形式选择能与特定蛋白质特异性免疫反 应的抗体。例如，常规采用固相ELISA免疫试验选择与蛋白质特异性免疫 反应的抗体(例如参见，Harlow和Lane，Using Antibodies，A Laboratory  Manual(《使用抗体：实验室手册》)(1998)中对可用于确定特异性免疫反应 性的免疫试验形式和条件的描述)。

将核酸置于与另一核酸序列的功能性关系中时，核酸为″操作性连接″。 例如，前序列或分泌前导序列的DNA若表达为参与多肽分泌的前蛋白，则 该DNA与所述多肽的DNA操作性连接；影响编码序列转录的启动子或增 强子与所述编码序列操作性连接；或者所处位置促进编码序列翻译的核糖 体结合位点与所述编码序列操作性连接。通常，″操作性连接″指连接的DNA 序列彼此邻近，且在分泌前导序列的情况下彼此毗连并在阅读相中。但是， 增强子无需毗连。由方便的限制性位点处的连接实现相连。若没有所述位 点，按照常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。

“保守修饰变体”可应用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列， 保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不 编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功 能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和 GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置上，可 将所述密码子改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这类核 酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文编码多肽的每种核酸 序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员应认识，可修 饰核酸中的各个密码子(除了AUG和TGG，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密 码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此， 多肽编码核酸的各沉默变异隐含于就所述表达产物描述的各序列中，但不 针对实际的探针序列。

对于两种或更多核酸或多肽分子序列，术语“相同”或“相同性”百分数 指，采用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下文所述默认参数、或通过 手工比对或目测检查所确定的，两个或更多序列或子序列在特定区域相同 或其中有特定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即，比较和比对比较窗口 或指定区域上的最大对应性时，相同性约60％，优选相同性为65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或更高)(参见例如，NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。 然后，可称这些序列“基本相同”。该定义也指，或可应用于，测试序列的 互补序列。该定义还包括含缺失和/或添加的序列，以及含取代的序列。如 下文所述，优选的算法可考虑缺口等。优选在长度至少约25个氨基酸或核 苷酸的区域上存在相同性，或者更优选在长度50-100个氨基酸或核苷酸的 区域上存在相同性。

对于序列比较，一般将一种序列用作与测试序列比较的参比序列。使 用序列比较算法时，测试和参比序列均输入计算机，必要时指定子序列坐 标，指定序列算法程序参数。优选可使用默认的程序参数，或者可指定另 外的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参 比序列的序列相同性百分数。

本文所用的“比较窗口”包括参考选自20到参比序列全长，通常约 25-100，或50-约150，更常见约100-约150中任一数量毗连位置的区段， 对两个序列进行最优比对后，可将序列与具有相同数量毗连位置的参比序 列作比较。比对序列的比较方法是本领域熟知的。可通过，例如Smith和 Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2：482(1981)，通过 Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48：443(1970)，通 过Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444 (1988)，通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group) 的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、 BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))科学大道 575号，或通过手工比对与目测(参见例如，Current Protocols in Molecular  Biology(《新编分子生物学实验指南》)(Ausubel等编，1995增刊))进行最 优序列比对以便比较。

适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选示例分别是 BLAST和BLAST 2.0算法，其由Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402 (1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)描述。使用BLAST和 BLAST 2.0，设定本文所述的参数，以确定本发明核酸和蛋白质的序列相同 性百分数。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National  Center for Biotechnology Information)公开获得(http://ncbi.nlm.nih.gov/)。此 算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对 (HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的 阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字 命中用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。只要可提高累 积比对评分，该字命中在沿各序列的两个方向上延伸。就核苷酸序列而言， 采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总 是＜0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现 以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比最大获得值 降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以 下；或者达到各序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏 度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)采用的默认值如下：字长(W) 11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP 程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见 Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B) 50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。

“核酸”指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物，和其 互补链。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核 酸，它们是合成、天然产生的和非天然产生的，它们与参比核酸的结合特 性类似，它们与参比核苷酸的代谢方式类似。这种类似物的示例包括但不 限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核 糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

除非另有说明，具体核酸序列也包括其保守修饰变体(如，简并密码子 取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体说，可通过产生一个或多个 选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序 列来获得简并密码子取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)； Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell. Probes 8：91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多 核苷酸可互换使用。

特定核酸序列也隐含“剪接变体”。类似地，核酸编码的特定蛋白质也隐 含该核酸的切割变体编码的蛋白质。顾名思义，“剪接变体”是基因可变剪接 的产物。转录后，初始核酸转录物可剪接使得不同(可变)核酸剪接产物 编码不同多肽。产生剪接变体的机制不同，但包括外显子的可变剪接 (alternate splicing)。该定义也包括由同一核酸经读出转录产生的可变多肽 (alternate polypeptide)。该定义中包括剪接反应的任何产物，包括所述剪接 产物的重组形式。Leicher等，J.Biol.Chem.273(52)：35095-35101(1998)中 讨论了钾通道剪接变体的示例。

用于核酸部分时，术语“异源”指该核酸包含在天然情况下不存在于 同一关系中的两个或更多子序列。例如，所述核酸一般是重组产生的，将 来自无关基因的两个或更多序列排列组成新的功能性核酸，例如启动子来 自一个来源而编码区来自另一来源。相似地，异源蛋白表示该蛋白包含天 然情况下不存在于同一关系中的两个或更多子序列(如融合蛋白)。

术语“严谨杂交条件”指通常在核酸的复杂混合物中，探针与其靶标子 序列杂交，但不与其他序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的，在不 同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广 泛指南参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular  Biology--Hybridization with Nucleic Probes(《生物化学和分子生物学技术— 与核酸探针杂交》)，Overview of principles of hybridization and the strategy of  nucleic acid assays(“核酸测定的杂交原理和方案概览”)(1993)。通常，严谨 条件选择为比特定序列在确定离子强度、pH下的热解链温度(Tm)低约 5-10℃。Tm是50％靶标互补探针与靶序列杂交平衡时的温度(在确定离子 强度、pH和核酸浓度下)(由于靶序列过量，在Tm时50％探针被平衡地占 据)。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。在选择性或特异性杂交 中，阳性信号至少是背景杂交的两倍，优选10倍。示范性的严谨杂交条件 可以如下所述：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，42℃孵育，或者5x SSC、 1％SDS、65℃孵育，用0.2x SSC和0.1％SDS在65℃洗涤。

如果核酸编码的多肽基本相同，那么在严谨条件下彼此不杂交的核酸 仍基本相同。例如，用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝 时可能发生这种情况。在这种情况下，核酸一般在中等严谨的杂交条件下 杂交。示范性“中等严谨杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS 的缓冲液中37℃杂交，并在1X SSC中45℃洗涤。阳性杂交至少是背景的 两倍。本领域普通技术人员不难认识到，可利用其他杂交和洗涤条件提供 类似严谨性的条件。很多文献提供确定杂交参数的其他原则，例如Current  Protocols in Molecular Biology(新编分子生物学实验手册)，Ausubel等编， 约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons.)。

就PCR而言，低严谨性扩增的温度通常约36℃，但退火温度可能取决 于引物长度而在32℃-48℃间变化。就高度严谨PCR扩增而言，典型温度 约62℃，但退火温度可能取决于引物长度和特异性而在约50℃-约65℃范 围内。高和低严谨扩增的典型循环条件包括90℃-95℃30秒-2分钟的变性 期、持续30秒-2分钟的退火期和约72℃ 1-2分钟的延伸期。例如，在Innis 等(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications(《PCR方案： 方法与应用指南》，学术出版社有限公司，纽约)中，提供了低和高度严谨 扩增反应的方法和原则。

″标记″或″可检测部分″或″成像剂或部分″是可通过光谱、光化学、生物 化学、免疫化学、化学、放射学或其它物理手段检测的化合物。例如，可 用的标记包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的 酶)、生物素、地高辛、或半抗原与蛋白质，所述半抗原或蛋白质可通过例 如在肽内掺入放射性标记从而可以检测或用于检测与所述肽特异性反应的 抗体。优选的成像剂或部分是磁性、荧光或放射性的。本领域熟知在体外 与体内检测所述标记所产生信号的方法。

用于例如细胞或核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示所述细胞、核 酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或对天然核酸或蛋白质的 改变进行修饰，或所述细胞源自经此修饰的细胞。例如，重组细胞因此表 达不存在于天然(非重组)形式细胞内的基因或表达原本异常表达、低表 达或完全不表达的天然基因。

组合物。

本发明用于药学目的时，本发明所述构建物通常配制在适当缓冲液中， 该缓冲液可以是任何药学上可接受的缓冲液，例如磷酸缓冲盐水或磷酸钠/ 硫酸钠、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和本领域普通技术人员已知 的其他缓冲液，例如Good等，Biochemistry 5：467(1966)中描述的缓冲液。 所述组合物还可包括稳定剂、增强剂或其他药学上可接受的运载体或载剂。 药学上可接受的运载体可包含生理上可接受的化合物，例如用于稳定本发 明的核酸或多肽及任何相关载体。例如，生理上可接受的化合物可包括碳 水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯 合剂；低分子量蛋白或其他稳定剂或赋形剂。其他生理上可接受的化合物 包括润湿剂、乳化剂、分散剂、或防腐剂，防腐剂对于避免微生物生长或 作用特别有用。熟知各种防腐剂，例如包括苯酚和抗坏血酸。这类运载体、 稳定剂或佐剂的例子可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿 药物科学》)，麦克出版公司(Mack Publishing Company)，宾夕法尼亚州费 城，第17版(1985)。

本发明所述的药学组合物包括治疗有效量的本发明所述构建体和药学 上可接受的运载体。本文中“治疗有效剂量或量”指产生给予组合物所需的效 果(例如，治疗或预防视网膜脱落)。确切的剂量和制剂将取决于治疗的目 的，且本领域技术人员可采用已知技术确定(参见例如，Lieberman， Pharmaceutical Dosage Forms(《药物剂型》)(第1-3卷，1992)；Lloyd，The  Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(《药学混配的 艺术、科学与技术》)(1999)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy (《《雷明顿：药物科学和实践》》)，第20版，Gennaro编(2003)，和Pickar， Dosage Calculations(《剂量计算》)(1999))。所述构建体若是盐，则配制为 “药学上可接受的盐”。

″药学上可接受的盐″包括所述活性化合物的盐，该盐根据给药途径用 相对无毒性的酸或碱制得。当本发明的抑制剂含有相对酸性的官能团时， 可通过将该化合物的中性形式接触足量所需碱来获得碱加成盐，所述碱可 以是纯碱形式或在合适惰性溶剂中。药学上可接受的碱加成盐的示例包括 钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基或镁盐，或类似盐。本发明化合物含 有相对碱性的官能团时，可通过将该化合物的中性形式接触足量所需酸获 得酸加成盐，所述酸可以是纯酸形式或在合适惰性溶剂中。药学上可接受 的酸加成盐的示例包括：衍生自无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸 盐、碳酸盐、碳酸氢盐，磷酸盐、磷酸氢盐，磷酸二氢盐、硫酸盐、硫酸 氢盐、氢碘酸盐或亚磷酸盐等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，如乙 酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、 辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、对 甲基苯磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。也包括氨基酸如精氨 酸等的盐，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如，Berge等， Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本发明的某些特定化合 物含有能够使该化合物转变为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。

可将该盐与碱或酸接触，并以常规方式分离母体化合物，从而再生该 化合物的中性形式。该化合物的母体形式的某些物理特性如在极性溶剂中 的溶解度与各种盐形式不同，但在用于本发明目的的其它方面该盐等同于 该化合物的母体形式。

除盐形式以外，本发明还提供前药形式的化合物。本文所述化合物的 前药是在生理条件下容易通过化学改变而提供本发明化合物的那些化合 物。此外，在离体环境下，前药可通过化学或生化方法转变为本发明化合 物。例如，放置在含有合适酶或化学试剂的透皮贴片储库中时，前药可缓 慢转变为本发明化合物。

本发明的某些化合物可以非溶剂合形式以及溶剂合形式，包括水合形 式存在。通常，溶剂合形式等同于非溶剂合形式，均应落入本发明范围。 本发明某些化合物可以多晶形式或无定形形式存在。通常，在本发明所考 虑的应用中所有物理形式是等同的，这些物理形式均应在本发明范围内。

除生物聚合物如核酸与多肽以外，本发明的某些化合物具有不对称碳 原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、几何异构体和单个异构 体均应落入本发明范围。在优选实施方式中，所述化合物包含氨基酸或核 酸，所述氨基酸与核酸各为其天然产生的主要生物学对映异构体

给予的所述组合物通常包含如本文所述溶于药学上可接受运载体的试 剂，优选为水性运载体。可使用多种水性运载体，例如缓冲盐水等。这些 溶液为无菌且通常无不良物质。这些组合物可通过常规、熟知的灭菌技术 消毒。该组合物可含有模拟生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如 pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯 化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性试剂浓度可广泛变化，主要根据液体 体积、粘度、体重等因素，按照所选的特定给药方式和患者需要进行选择。

用于本发明的合适配方参见通过引用纳入本文的Remington：The  Science and Practice of Pharmacy(《《雷明顿：药物科学和实践》》)，第 20版，Gennaro编(2003)。此外，对药物递送方法的简要综述参见Langer， Science 249：1527-1533(1990)，其通过引用纳入本文。本文所述的药物组合 物可以本领域技术人员已知的方式制造，即，通过常规的混合、溶解、造 粒、糖衣剂制造、水飞、乳化、包胶、包封或冻干工艺的方法制造。以下 方法和赋形剂仅是示范性且不以任何方式构成限制。

就注射而言，本发明的化合物可配制在水性溶液中，优选生理相容性 缓冲液，如汉克斯(Hank’s)溶液、林格(Ringer’s)溶液或生理盐水缓冲 液。就经粘膜给药而言，在制剂中采用适合待渗透屏障的渗透剂。本领域 通常已知此类渗透剂。

就口服给药而言，用于本发明的抑制剂可通过与本领域熟知的药学上 可接受运载体联用而方便地配制。此类运载体使化合物可以配制为片剂、 丸剂、糖衣丸、胶囊、乳液、亲脂与亲水悬剂、液体、凝胶、糖浆、浆液、 混悬剂等，便于治疗病人口服摄取。可通过以下方法获得口服用途的药物 制剂：将化合物与固体赋形剂混合，任选研磨所得混合物，需要时在加入 合适的辅助剂后将该混合物加工成颗粒以获得片剂或糖衣剂芯体。具体地， 合适赋形剂是填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制 剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲 基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。需要的话，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、 或藻酸或其盐如藻酸钠。

所述药物组合物可根据给药方法以多种剂型和量给予。例如，适合口 服给予的单位剂型包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂。认识 到当抗体口服时，应当保护使其免被消化。这通常通过将所述分子与使其 耐受酸性和酶促水解的组合物复合，或通过将所述分子包装在合适的耐受 性运载体如脂质体或保护性屏障内而完成。本领域熟知保护试剂免受消化 的方法。

具体地，本发明所述构建体的药物制剂可通过混合具有所需纯度的所 述构建体与任选的药学上可接受运载体、赋形剂或稳定剂制得。这些制剂 可以是冻干制剂或水溶液。可接受运载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和 浓度下应对接受者无毒。可接受运载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸、磷 酸、柠檬酸或其他有机酸；抗氧化剂(例如抗坏血酸)；防腐剂；低分子量多 肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶，或亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮； 和氨基酸、单糖、二糖、和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合剂；和离子与非离子型表面活性剂(例如，聚山梨酯)；成盐的抗衡离子 如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂。在一 些实施方式中，所述构建体可配制成浓度在0.5-200mg/ml或10-50mg/ml 之间。

可给予包含本发明构建体的组合物用于诊断、治疗或预防性处理。在 治疗应用中，组合物以″治疗有效剂量″给予患者。可根据患者所需并耐受 的剂量和频率单次或多次给予所述组合物。用于本发明目的的″患者″或″对 象″包括人和其他动物，特别是哺乳动物。因此，所述方法适用于人用治疗 和兽医应用。在优选实施方式中，所述患者是哺乳动物，优选灵长类动物， 且在最优选的实施方式中，所述患者是人。

本文所用术语″运载体″指用作将在体内或体外用于生物系统的活性剂 (例如药物如治疗剂)的稀释剂或载剂的典型惰性物质。该术语也涵盖 使所述组合物具有粘合特性的典型惰性物质。

本发明的组合物可用常规、熟知灭菌技术消毒或可在无菌条件下生产。 水溶液原样包装以供使用，或者在无菌条件下过滤并冻干，在临给药前将 冻干制剂与无菌水溶液混合。所述组合物可含有模拟生理条件所需的药学 或生理上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂 等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单月桂 酸酯和三乙醇胺油酸酯。

治疗方法

术语″医治″或″治疗″包括：

(1)预防疾病，即，使疾病的临床症状不在可能暴露于生物体但尚未 发生或显示疾病症状的哺乳动物中发展，

(2)抑制疾病，即，阻滞或减缓疾病或其临床症状的发展。这包括降 低观察到的脱落程度或对象数量或对象发生脱落的风险。

(3)减轻疾病，即，使疾病、或其临床症状减退。

如本发明所述使用的构建体可通过任何给药途径给予(例如，静脉内、 外用、腹膜内、胃肠外、口服、阴道内、经直肠、经眼、玻璃体内与眼内)。 它们可作为大丸剂、或通过持续一段时间的连续输注、通过肌肉内、腹膜 内、皮下、口服、外用或吸入途径给予。优选静脉内或皮下给予抗体。所 述给予可以是局部或全身的。它们可给予诊断患有疾病、有患病史或有患 病风险的对象。

实施例

提供以下实施例，以说明而非限制要求保护的本发明。本发明用CEA 和结构域III支架的融合蛋白(参见图8)示范说明，同时也考虑将支架与 靶向试剂和或成像与治疗剂偶联的其他方法。

实施例1：我们测试由研究透彻的抗体片段靶向癌胚抗原(CEA)和HSA  DIII野生型(WT，无突变)或三种HSA DIII变体之一组成的融合蛋白，所述 变体各有H535、H510或H464成为丙氨酸残基的突变。用¹²⁴I标记的Db-DIII 或Db蛋白注射异种移植无胸腺裸小鼠，进行系列小动物PET/CT成像研究 以评估HSA DIII调节Db体内持久性的能力。此外，我们能就H535、H510 与H464残基对白蛋白的FcRn结合与循环持久性的相对重要性得出结论。

材料和方法

生成Db-DIII构建体

通过聚合酶链反应(PCR)用市售HSA cDNA(OG技术公司(OriGene  Technologies)，马里兰州洛克威尔)为模板和引物引入5’SpeI和3’EcoRI 限制性位点扩增HSA DIII基因。引物序列如下：

正向：SpeI-DIII：5’-CCACTAGTGGCGAAGAGCCTCAGAATTTAATC-3’

反向：DIII-EcoRI：5’-GAGAATTCTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’

使用Quick-Change诱变试剂盒(司查塔基公司(Stratagene)，加利福尼亚 州拉霍亚)通过位点定向诱变在DIII中引入组氨酸残基H535、H510或H464 成为丙氨酸的突变，使用适当的诱变引物(仅列出正向引物)：

H464A(用丙氨酸残基交换464位的组氨酸残基)

5’-CTGAACCAGTTATGTGTGTTGGCTGAGAAAACGCCAGTAAGTGAC- 3’

H510A

5’-GTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCGCTGCAGATATATGCACAC-3’

H535A

5’-CTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAAGCCAAGCCCAAGGCAAC-3’

完整的DIII(WT、H535A、H510A与H464A)基因克隆入pCR2.1-Topo 载体(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)然后转入pUC18载 体(NEB公司(New England Biolabs)，马萨诸塞州贝伏利)，该载体已含有抗 CEA Db(Wu等，1999)。利用XbaI和EcoRI位点，从pUC18载体切出完 整的Db-DIII基因并接入pEE12哺乳动物表达载体(Bebbington等，1992)。

表达、筛选与纯化

NS0小鼠骨髓瘤细胞(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里 州圣路易)维持于非选择性无谷氨酰胺Dulbecco改良的Eagle培养基(DME/ 高度改良，SAFC生物科学公司(SAFC Biosciences)，堪萨斯州来尼克谢)， 培养基中加有5％热灭活、经透析的胎牛血清(FBS；欧米茄科学有限公司 (Omega Scientific Inc.)，加利福尼亚州塔杂纳)，1％v/v的200mM L-谷氨 酰胺(密迪亚泰克有限公司(Mediatech，Inc.)，弗吉尼亚州马纳萨斯)和1％v/v 的青霉素-链霉素(10,000IU/ml青霉素，10,000μg/ml链霉素；密迪亚泰克 有限公司)。通过电穿孔用10μg pEE12-Db-DIII DNA转染处于对数生长期 的1x10⁷NS0细胞，所述DNA如之前所述(Kenanova等，2005)经SalI(NEB 公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)消化而线性化。

Db-DIII生产由ELISA测定，并经Western印迹确认。ELISA中用蛋白 A(塞摩费舍尔科学有限公司(Thermo Fisher Scientific)，伊利诺伊州洛克福 德)捕获Db-DIII蛋白。碱性磷酸酶(AP)-偶联的抗小鼠Fab-特异性抗体(西 格玛-艾尔德里奇公司)在ELISA和Western印迹中都用于检测。转染的NS0 细胞维持于选择性无谷氨酰胺DME/高度改良培养基(SAFC生物科学公司) 中，培养基中加有5％热灭活的经透析FBS(欧米茄科学有限公司)、2％v/v 的50x GS补充剂(SAFC生物科学公司)和1％v/v青霉素-链霉素(密迪亚泰 克有限公司)。所选出大量表达Db-DIII蛋白的克隆逐步扩增至3个摇瓶(努 克隆公司(Nunclon)，纽约州洛切斯特)，各摇瓶含300ml加有2％热灭活经 透析FBS(欧米茄科学有限公司)和1％v/v青霉素-链霉素(密迪亚泰克有限 公司)的选择性培养基。

培养达到终末期(～3周)时，将收集所得上清用实验室级的切向流过滤 (TFF)系统(密理博公司(Millipore)，马塞诸塞州比尔瑞卡)由截留分子量 (mwco)30,000Da的过滤器离心、过滤除菌并浓缩。用AKTA纯化仪(GE 医疗保健公司(GE Healthcare)，新泽西州皮斯卡特维)将Db-DIII蛋白在蛋白 A柱(塞摩费舍尔科学有限公司)上纯化。结合的蛋白用溶于1x PBS的15％ 0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH 2.1)洗脱，向洗脱蛋白中直接加入80％v/v的1M  Tris碱(pH 8.2)以立即中和pH。合并含Db-DIII蛋白的组分，用1x PBS透 析，并用Vivaspin 20(mwco：30,000；S-S生物技术公司(Sartorius Stedim  Biotech Gmbh)，德国哥庭根)浓缩。用A₂₈₀测定纯化Db-DIII蛋白的终浓度， 消光系数ε＝1.5。

鉴定Db-DIII蛋白质

通过非还原(NR)与还原(R)条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)、Western印迹、质谱和尺寸排阻色谱法分析纯化的 Db-DIII蛋白。为还原蛋白质，加入1M二硫苏糖醇(DTT)至终浓度0.2M。 对于SDS-PAGE，运行4-20％梯度Tris-HCl即用型凝胶(伯乐实验室有限公 司(Bio-Rad Laboratories，Inc.)，加利福尼亚州赫尔库斯)且用基于瞬时考 马斯蓝的溶液(Instant Blue Coomassie-based solution)(EPS公司(Expedion  Protein Solutions)，英国剑桥)显影。Western印迹中Db-DIII蛋白的检测由 AP-偶联的羊抗小鼠Fab-特异性单抗(西格玛-艾尔德里奇公司)使用硝基蓝 四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)(普洛麦格(Promega)，威斯康星 州麦迪逊)AP底物或用辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的蛋白L(西格玛-艾尔 德里奇公司)并用4-氯-1-萘酚/3，3’-二氨基联苯胺(CN/DAB)底物试剂盒(热 科学公司(Thermo Scientific)，伊利诺斯州洛克福德)显影来实现。

使用LTQ-FT超线性离子阱傅立叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪 (塞摩费舍尔公司)进行质谱分析以证实纯化蛋白的身份。简要地说，分离 Db-DIII蛋白，然后进行凝胶内胰蛋白酶消化过程，该过程详述于 http://massspec.wiki.zoho.com/In-Gel-Trypsin-Digest.html。在整合有Eksigent  nano-LC的LTQ-FT(塞摩费舍尔公司)上进行纳米液相色谱串联质谱 (nLC-MSMS)和碰撞活化解离(CAD)分段。针对最新的国际蛋白索引数据库 (3.54版，有39,925个条目)用Mascot(英国MS公司(Matrix Science，UK)) 和Sequest(塞摩费舍尔公司)程序搜索图谱。用严格的评分过滤标准和10 ppm质量分辨过滤器过滤结果。鉴定出的肽也和Db-DIII序列匹配。

用Superdex 200 HR 10/30柱(GE医疗保健公司)通过尺寸排阻色谱法确 定纯化后Db-DIII的蛋白纯度，天然、非变性条件(1x PBS，pH 7.4)下的 Db-DIII蛋白构型，和评估分子尺寸。

用PyMOL软件(德拉诺科学公司(DeLano Scientific))产生DIII和 Db-DIII分子的计算机模型。此外，用ZDOCK-FFT算法(Chen等，2003) 实现HSA与DIII之间蛋白对接的建模，该算法在公共服务器上可得 (http://zlab.bu.edu/rong/dock)。

Db-DIII融合蛋白的放射性碘化、异种移植成像与生物分布

纯化的Db-DIII WT、H535A、H510A与H464A通过正电子发射体¹²⁴I (溶于0.02M NaOH中的碘化钠；IBA分子公司，弗吉尼亚州斯特林)用前 人所述的Iodogen方法(Olafsen等，2006)放射性碘化。标记反应(0.114-0.130 ml)含0.1mg纯化蛋白与12.9-18.0MBq Na¹²⁴I。如前人所述(Olafsen等，2006) 使用单克隆抗体ITLC条试剂盒(BMS公司(Biodex Medical Systems)，纽约 州雪利)通过即时薄层层析(ITLC)测定标记效率。

对于体内研究，在7-8周龄无胸腺裸小鼠(查尔斯河实验室公司(Charles  River Laboratories)，马萨诸塞州威明顿)的左肩区域皮下注射1-5x10⁶ CEA- 阳性LS174T人结肠癌细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type  Culture Collection)，弗吉尼亚州马纳萨斯)，并在右肩区域注射大约相同数 量的CEA-阴性C6大鼠胶质瘤细胞(ATCC)。使肿瘤体平均发展10天，达 到最大200mg重量。每种构建体用3.9-5.4MBq ¹²⁴I标记的Db-DIII或盐水 /1％HSA中的Db尾静脉注射4只荷瘤小鼠。在5个不同时间点(4小时、 20小时、28小时、44小时和51小时)，注射小鼠用2％异氟烷麻醉，放上 实验床，成像10分钟。第51小时的最终PET扫描后完成10分钟CT扫描。 所有成像实验利用Focus 220小动物PET(西门子临床前方案公司(Siemens  Preclinical Solutions)，田纳西州诺克斯威尔)和小动物CAT II(协和微系统 公司(Concorde Microsystems)，田纳西州诺克斯威尔)扫描仪。最后的扫描(51 小时)后，杀死小鼠。收集血液、肿瘤(LS174T与C6)、肝、脾、肾、肺和 尸体，称重并在Wallac WIZARD自动γ计数器(帕金埃尔默生命与分析科 学有限公司(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.)，马萨诸塞州韦尔 斯利)中计数。衰变校正后，计算各组织/器官每克注射的百分剂量(％ID/g)， 包括对各蛋白标记效率的校正和标准差(SE)。

成像分析与统计

所有图像用滤波反投影(FBP)算法(Defrise等，1997)重建并用AMIDE 软件(Loening和ambhir，2003)呈现。所有图像采用相同的颜色阈值。在CEA- 阳性肿瘤区域和身体下部的低活性、软组织区域(肌肉)内画出感兴趣区域 (ROI；椭圆形，0.4mm深，n＝4)。确定各小鼠的肿瘤对软组织(T∶ST)比， 对各时间点和构建体取平均。各图像的心脏上画出ROI(n＝4)，输入以MBq 计的注射剂量和以MBq/cc/图像为单位的圆筒因子(cylinder factor)作为输入 函数后通过AMIDE软件计算血液的％ID/g。用ADAPTII软件包从血液活 性曲线计算各蛋白的平均停留时间(MRT)(D′argenio和Schumitzky，1979)。 对所有比值和％ID/g值计算SE，作图表示(误差线)。用非配对斯氏T检验 分别比较所有T∶ST ROI比和血液活性曲线以判断显著差异。认为双侧P值 低于或等于0.05为统计上显著。

结果

Db-DIII蛋白质的产生和生化鉴定

a.产生、表达与纯化

Db-DIII构建体长约1.4千碱基对，侧接XbaI与EcoRI限制性位点(图 1A)。在转染NS0细胞的末期培养中，ELISA测得工程改造Db-DIII分子表 达为10-16μg/ml。尽管蛋白L能结合Db-DIII蛋白质，蛋白A的捕获更有 效。因此，选择蛋白A亲和层析进行纯化。Db是两个scFv分子的非共价 二聚体，各Db分子在其C末端结合有两个DIII蛋白，因此融合蛋白计算 所得分子量约101kDa(图1B)。

b.SDS-PAGE和Western印迹

在NR和R条件下用SDS-PAGE分析纯化Db-DIII WT和变体(图2A)。 在NR条件下，Db-DIII蛋白产生对应其约101kDa预测分子量的主要条带 (图2A，泳道1、2与3)。在SDS-PAGE考马斯染色凝胶(图2A，泳道1、2 与3)和用抗小鼠Fab特异性抗体探测的Western印迹(图2B，泳道2)中都注 意到较低分子量的两个弱条带。还原时，主条带[(scFv-DIII)₂；101kDa]分 成对应于scFv-DIII片段(～48kDa)和DIII分子(～23kDa)的2个条带(图2A， 泳道5)。用多克隆抗HSA抗体检测融合蛋白DIII部分的尝试未能成功，因 此Western印迹中改用结合Db-DIII蛋白Db组分的HRP-偶联蛋白L(图2B， 泳道3)。仅测得上部[(scFv-DIII)₂；101kDa]和中部(scFv-DIII；48kDa)条带。 因此，在还原蛋白SDS-PAGE凝胶上约23kDa的较小条带(图2A，泳道5) 应该仅代表DIII结构域。为确认纯化的蛋白确实是Db-DIII，进行了质谱分 析。确定了匹配Db或DIII氨基酸序列的多个肽，证实所述蛋白的身份(数 据未显示)。

c.尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法显示Db-DIII WT(101kDa)作为单一峰洗脱，洗脱时间 为28.17分钟(图2C)。相同条件下，Db-DIII H535A、H510A与H464A蛋 白的特征是平均洗脱时间为28.2分钟，未测得聚集或多聚体化。尺寸排阻 色谱法峰的积分显示一步蛋白A亲和柱纯化后蛋白纯度约为98％。

d.计算机模拟HSA DIII、DIII-FcRn相互作用和Db-DIII

根据HSA的晶体结构(Sugio等，1999)产生HSA DIII的结构模型(图 3A)。DIII包含通过环彼此连接的10个α-螺旋(DIIIa中6个，DIIIb中4个)。 标出残基H464(DIIIa中)、H535与H510A(都在DIIIb中)。还利用DIII与 FcRn的晶体结构(Martin等，2001)产生DIII与FcRn的对接模型(图3B)。 ZDOCK算法偏向包括FcRn残基H161与H166(Andersen等，2006)和HSA  DIII H535、H510与H464的相互作用。产生了11种候选结构。分选出这 些结构并用PyMOL分析可能的强pH依赖性结合。这些分析的总体印象是， 围绕FcRn残基H166与H161的保守芳香族残基出现在多数预测的结构中， 因此它们可能与两个DIII H510与H535残基接触。FcRn H166与H161看 来可能与DIII上的谷氨酸残基相互作用，当组氨酸在低pH环境下质子化 时会提高亲和性。此外，FcRn残基D102和N101在很多所提出结构中相 互作用，可能起到作用。认为ZDOCK提供的第10种所得结构最可能显示 强pH依赖性结合。该结构含有DIII H535与FcRn F157；DIII H510与FcRn  W51和Y60；DIII H464与FcRn D101和N102或K123；FcRn H166与DIII  E505；以及FcRn H161与DIII E531之间可能的相互作用。最后，用T84.66 双抗体的晶体结构(Carmichael等，2003)产生Db-DIII分子的模型(图3C)。 每个二聚双抗体经18个氨基酸的接头结合两个DIII分子，接头将产生相对 灵活的分子结构。

放射性标记和小鼠异种移植成像研究

Db-DIII融合蛋白的¹²⁴I标记效率为63.9-81.5％，而注射特异性活性为 13.0-18.0 GBq/μmol。系列小动物PET成像可就肿瘤靶向和循环中的持久性 在体内比较Db-DIII融合蛋白与单独Db(图4)。图像显示所有5种蛋白靶 向LS174T(CEA阳性)肿瘤。在CT图像上肿瘤解剖学位置清晰可见。对于 Db与Db-DIII H464A，早在4小时就注意到靶向，而Db-DIII WT、H535A 与H510A分子在20小时发现靶向。对于所有蛋白质，CEA阳性肿瘤中的 信号持续了整个研究过程(51小时)，而背景(循环活性)有变化。对Db-DIII 与Db蛋白在不同时间点T∶ST ROI比的统计比较(图5A)显示在4和20小 时，所有蛋白显示的T∶ST比彼此间没有显著差异(P＞0.05)。从28小时起， 到44-51小时，Db T∶ST比值保持为显著大于所有Db-DIII蛋白(P值在 0.04-0.01范围内)。在第51小时，由于软组织信号减弱速度更快，H535A (P＝0.03)、H510A(P＝0.02)与H464A(P＝0.01)变体显示的T∶ST比值显著高 于WT。但是，H510A T∶ST比值与H535A没有显著差异(P＝0.1)。H464A T∶ST 比值与H510A T∶ST比值没有显著差异(P＝0.07)。H464A T∶ST比值与H535A 有显著差异(P＝0.02)。各时间点血液中放射性(％ID/g)的PET图像定量分析 可产生血液活性曲线(图5B)并计算血液中各蛋白的MRT(表1)。与所有组 氨酸突变体和单独Db相比，Db-DIII WT显示的血液清除动力学显著更慢 (P＜0.05)。Db-DIII H535A与H510A，和H510A与H464A彼此的血液活性 曲线没有显著差异(分别为P＝0.09和P＝0.08)，但H535A与H464A变体相 比，特征在于血液持久性显著更长(P＝0.01)。因此血清MRT从最长到最短 依次为：Db-DIII WT＞H535A≥H510A≥H464A＞Db，其中Db-DIII  H535A的循环停留时间比H464A显著延长。第51小时的生物分布证实血 清持久性的排序(表2)。Db-DIII蛋白在血液中测得的活性范围为4.0-1.6 ％ID/g，而LS174T肿瘤摄取为2.5-1.3％ID/g，相比之下Db的摄取为0.5 ％ID/g。此前的研究显示放射性碘化T84.66Db在注射后2小时达到最大肿 瘤摄取(13.68±1.49％ID/g)，此后肿瘤内的活性开始降低(Wu等，1999)。 LS174T与C6肿瘤的肿瘤体平均值分别为161mg与126mg。注意到血清 停留时间更长通常与更高的LS174T肿瘤摄取相关联。Db-DIII蛋白的CEA 阳性对阴性肿瘤摄取比值范围为1.5-2.2，相比之下单独Db在51小时的摄 取比值为13。

表1.生物分布，按蛋白循环持久性(血液％ID/g)降序(从上至下)显示¹²⁴I标 记的Db-DIII蛋白。

注：每种蛋白用4只小鼠按组分析。器官摄取表示为％ID/g。

表2.Db-DIII与Db在荷瘤无胸腺裸小鼠中的血液半衰期估算值。

¹AUC是曲线下面积-∫u(t)dt从0到无穷时间。²第一Mo是第一时刻： ∫t u(t)dt/∫u(t)dt，u(t)为测得的(％ID/g)血液曲线。3平均停留时间为相同相 同积分形式，但用du/dt替换u(t)。

讨论

第一步是对HSA DIII能作为可调PK蛋白支架的原理证明，我们涉及 了由两个组分组成的融合蛋白。其一为抗CEA T84.66 Db，这是一种已在 体内广泛研究的小型二价抗体片段。所述抗CEA Db在LS174T(CEA阳性) 荷瘤小鼠中显示的终末β半衰期范围为2.89小时(¹²³I)-3.04小时 (¹¹¹In)(Yazaki等，2001)。该Db也已成功与其他蛋白质融合(即，海肾或高 斯(Gaussia)萤光素酶)，融合后仍保持其体内靶向能力(Venisnik等，2007； Venisnik等，2006)。因此，所述Db是靶向分子概念论证研究的良好模型。 第二组分具有未知特征，名为HSA DIII WT或其具有突变H535、H510或 H464残基的变体。所述Db-DIII融合蛋白在哺乳动物细胞内表达以确保适 当折叠。表达水平合理且亲和纯化所得蛋白的分子量与计算所得101kDa (图2A)一致。Db是两个scFv分子的非共价二聚体，在SDS-PAGE条件下 这两个分子彼此分离并迁移约25kDa(Wu等，1999)。我们预期Db-DIII分 子作为scFv-DIII(～48kDa)物质迁移，因为DIII与scFv中的所有半胱氨酸 残基都已配对(Curry等，1998；Dugaiczyk等，1982；Wu，1999)。有意思的 是，在非还原条件下，蛋白主体保持其二聚体形式[(scFv-DIII)₂；101kDa]， SDS条件下显示结构稳定性提高。仔细检查Db-DIH计算机模型(图3C)后， 将Db与DIII之间接头长度从18个氨基酸缩短至5个(数据未显示)。这一 改变不影响所述蛋白的迁移模式[(scFv-DIII)₂；图2A]。由于该意外表现， 切出SDS-PAGE凝胶的Db-DIII蛋白条带(图2A)，质谱分析所提取的蛋白 (数据未显示)。结果证实，约101kDa的蛋白确实是Db-DIII。SDS与热稳 定性的提高可能是两个scFv-DIII分子间极性、离子相互作用的结果，正如 β-糖基化酶的情况(Gentile等，2002)。生理条件下的尺寸排阻色谱法证实 Db-DIII蛋白的分子大小。Db-DIII的洗脱时间接近另一相似分子量的蛋白 (scFv-Fc，105kDa)，相同条件下后者在约27.3分钟时洗脱(Kenanova等， 2005)。稍小些的Db-DIII在约28.2分钟时洗脱，而单独的Db在38.2分钟 洗脱(Kenanova等，2005)。除了高纯度，色谱图(图2C)上的单峰显示Db-DIII 蛋白的完整性并显示其作为单一物质存在。DIII-FcRn对接模型(图3B)的分 析有助于确定H535、H510与H464中可能的FcRn相互作用伴侣并能确定 它们在FcRn结合中的重要性。但DIII组氨酸残基的实际排序通过体内分 子成像确定。

分子成像，特别是PET的长处在于能在注射示踪剂后多次对同一个体 进行拓扑成像以获取PK、肿瘤靶向、交叉反应性的定量信息。本研究中， 负荷CEA阳性和阴性异种移植的小鼠接受¹²⁴I标记Db-DIII或Db蛋白注 射并在5个不同时间点成像。这允许一一比较各Db-DIII蛋白以及单独的 Db的循环持久性和肿瘤靶向。由于Db是恒定组分，Db-DIII蛋白间的不同 PK是DIII的功能所致。因此，PET成像使我们能对DIII蛋白的体内表现 得出结论，尽管这是间接的。血清清除更快的靶向试剂在较早时间点获得 更高的T∶ST比。因此，仅仅基于各时间点的T∶ST ROI比(图5A)，我们就 能推导出血液清除最快(T∶ST比最高)到最慢(T∶ST比最低)的顺序为： Db＞＞Db-DIII H464A＞H510A＞H535A＞WT。有意思的是，统计分析显示 Db-DIII H510A的清除并不显著快于H535A。H535和H510残基都位于DIIIb 亚结构域。这一发现可能提示白蛋白内H510和H535残基可能是冗余的， 在其中一种无功能性或不能结合FcRn的情况下彼此起到后备作用。该假说 尚待阐明。两个残基同时突变可提供更多认识。对各时间点时各蛋白在小 鼠心脏内的放射性的定量分析所得血液活性曲线也证实了相同的循环清除 排序(图5B)。血液活性曲线的统计学比较得到和上述相同的结论— Db-DIII H535A的清除显著慢于H464A，但与H510A相比无显著差别。由 于缺少更多在示踪剂注射后最初12小时内的时间点，计算MRT而非α与 β半衰期更为可行。MRT的范围从Db-DIII WT的约2.4天到Db-DIII H464A 的17小时，相比之下单独的Db为2.9小时。Db-DIII融合蛋白的总体大小 (101kDa)超出肾脏清除的阈值(～60kDa)。因此，Db-DIII蛋白通过肝胆途 径消除，而Db(55kDa)通过肾脏清除。因此Db和Db-DIII蛋白质之间分 子量的差异是MRT不同的主要原因。然而，可通过单个氨基酸突变(分子 量相同)调节体内Db-DIII PK这一事实表明，除了分子大小的增加外，还 有其他分子机理控制体内血清PK(例如，FcRn相互作用)。此外，突变 (H535A、H510A或H464A)允许微调总体的蛋白血清停留时间。可以从数 日到数小时的范围内选择各种循环半衰期。这有利于筛选特定血清PK要求 的诊断或治疗试剂。

成像研究清楚表明HSA DIII结构域能提高Db的循环持久性，同时保 持肿瘤靶向。所有Db-DIII蛋白在血液中的保留时间比单独的Db显著延长 (P＜0.05)。在第51小时对注射Db-DIII蛋白小鼠血液中剩余放射性的直接 计数(％ID/g)结果比注射Db的小鼠高50倍(WT)到20倍(H464A)。总之， 我们的发现表明HSA DIII WT和突变体本身应能调整其结合部分的血清停 留时间。预期血液清除的DIII排序与实验所确定的Db-DIII顺序保持相同。 DIII WT也能延长Db的血清持久性，其延长稍高于完整HSA分子对T84.66  scFv血清持久性的延长(Yazaki等，2008)。LS174T异种移植无胸腺裸小鼠 注射¹²⁵I标记抗CEA scFv-HSA融合蛋白(～90kDa)后48小时，血液中剩余 活性为2.79％ID/g，相比之下，注射¹²⁴I标记Db-DIII WT后51小时的剩 余活性为4.00％ID/g(表2)。这一差异可能由Db-DIII的较大分子量得到解 释。尽管如此，仍表明DIII对于维持完整HSA分子的血清半衰期是必要且 充分的。H464(位于DIIIa)看来对FcRn结合与循环持久性有最大影响。此 外，由于H535A和H510A突变产生比WT显著更快的血清清除，我们认 为亚结构域DIIIa和DIIIb都参与保持血清持久性。

Db-DIII蛋白的目的在于说明HSA DIII用作具有受控PK的单一结构域 支架的潜力。不含靶向部分的DIII WT与变体的表达及其体内PK的评估是 筛选具有成像或治疗应用最优特性的DIII支架的下一步工作。本研究中描 述的DIII支架可用于移植或化学偶联肿瘤靶向分子(肽、适体、小化学分子) 或直接产生展示组合库。具有用于成像的适当PK的靶向支架可用于诊断目 的。或者，可将潜在的抗肿瘤药物与具有癌症治疗用最优特征的靶向支架 偶联。

实施例2.

用Alexa Fluor 647偶联DIII蛋白进行结合研究

用Alexa Fluor 647蛋白标记试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，俄勒冈州尤 金)按照生产商说明书将荧光团Alexa Fluor 647(1.25kDa)与HSA、DIII  WT、H535A、H510A和H464A蛋白偶联。各荧光蛋白在0.316-3160nM范 围内的稀释液(一式三份)与表达人FcRn的融合293人胚胎肾细胞(Petkova 等，Int Immunol.2006；18：1759-1769)于pH 6.5下在圆底96孔板中孵育。偶 联有Alexa Fluor 647的HSA的稀释液也与不表达FcRn的293细胞孵育(对 照反应)。用1x PBS(pH 6.5)进行清洗步骤后，细胞由Maestro^TM体内荧光 成像系统(CRi公司，马萨诸塞州沃本)使用深红(671-705nm)激发和红(700 nm长程)发射滤光片成像。各孔中划出相同尺寸的感兴趣区域(ROI)，测定 荧光信号并对各稀释液取平均。用平均荧光作为偶联有Alexa-Fluor 647的 DIII蛋白浓度的函数产生结合曲线。测得50％荧光的DIII浓度代表DIII蛋 白对FcRn的相对结合亲和性(参见图6)。

DIII蛋白结合人FcRn

图7显示偶联有荧光团的HSA与DIII蛋白的结合曲线左移较多的曲线 (HSA与DIII WT)表示和表达FcRn的293细胞结合更强，相对结合亲和性 的范围为100nM，其次为DIII H535A与H510A(分别为～200与300nM)， 而DIII H464A的相对结合亲和性最低，约1μM。偶联有Alexa Fluor 647 的HSA不结合293细胞(无FcRn)，因此表明与FcRn的特异性相互作用。 基于细胞结合研究，与人FcRn的结合亲和性从高到低的顺序如下：HSA＞ DIII WT＞DIII H535A＞DIII H510A＞DIII H464A。

DIII蛋白在小鼠中的循环半衰期

HSA与DIII蛋白的¹³¹I标记效率为39.6-93.6％，而注射特异活性为 1.5-3.1μCi/μg。完整HSA与所有DIII蛋白的血液活性曲线(图10)显示的消 除顺序与Db-DIII融合蛋白所观察到的相同，但加入了DIIIa与DIII。此外， HSA与DIII对FcRn相对结合亲和性的降低(图7)与循环持久性的缩短成比 例。表3小结了血液半衰期的估算值。血液清除从慢到快的顺序如下：HSA ＞DIII WT＞DIII H535A＞DIII H510A＞DIII H464A＞DIIIa＞DIIIb。慢相(β) 半衰期从最慢(DIII WT)到最快清除(DIIIb)蛋白间跨越约2倍，t_1/2β范围为 15.3-6.9小时。这一循环停留时间的范围允许选择最适合所需应用(例如， 治疗、成像)的DIII平台。

表3.HSA和DIII蛋白在Balb/c小鼠中的血液半衰期估算值。

¹用Aα和Aβ给出两种组分的幅度，其中Aα与Aβ的加合是总％ID/g。 ²t_1/2α＝ln2/k1，t_1/2β＝ln2/k2。³曲线下面积(AUC)为血液摄取的时间积分 (％ID/g x h)。

实施例3.

产生并偶联筛选DIII支架的适体分子。可通过含T7 RNA聚合酶启动 子的双链DNA模板的失控转录产生含核酸酶耐受性嘧啶2’-氟UTP和2’F  CTP的经修饰靶标特异性适体。转录反应可使用T7 RNA聚合酶的Y639F 突变体进行。反应中所用核苷酸由ATP、GTP、2’F dCTP与2’F dUTP组成。 为将所述适体与DIII支架偶联，琥珀酰亚胺基6-肼基烟酸丙酮腙(SANH) 可与DIII支架赖氨酸残基反应(下图)。两个分子间的双-芳基腙键在354nM 下可UV追踪，因此可以分光光度法确定偶联比。纯化后，可在体外(细 胞)然后在体内(异种移植小鼠)评估所有偶联产物结合靶标的能力。

适体与支架DIII的偶联化学(显示为实心圆)。第一反应步骤后需要脱 盐步骤以除去未反应的SANH。

通过用两个异双功能接头实现靶标特异性肽或其他蛋白质的生物偶 联。其一是合成在肽或蛋白质C-或N-末端的芳族肼[6-肼基烟酰胺(HyNic)]。 另一是结合在DIII蛋白质随机赖氨酸(K)残基上的芳族醛[4-甲酰基苯甲酰 胺(4FB)]。4FB掺入过程称为DIII的“修饰”。修饰后，对功能化的DIII 和肽分子脱盐除去过量接头并将生物分子换入偶联相容性缓冲系统。然后 将两种经修饰的生物分子混合在一起，通过在两种物质间形成热稳定并可 在A_354nm以分光光度法测定的双-芳基腙而发生偶联。然后计算肽/DIII比。 可用SoluLink公司(加利福尼亚州圣迭戈)的市售试剂完成该偶联反应。

实施例4.

评估抗CEA肽-DIIIb偶联物：

CEA特异性环肽(SDWVCEFIKSQWFCNVLASG，Kd＝160nM)为商业 合成，在C末端有HyNic基团(SoluLink公司)。该肽溶于水溶液时会沉淀。 在水中缺乏溶解度立即使这一肽不适于体内应用。在偶联前，HyNic修饰 的肽溶于有机溶剂二甲基甲酰胺(DMF)。按照SoluLink提供的方案修饰纯 化的DIIIb以在随机赖氨酸残基处掺入4FB部分。偶联后，通过测定A354nm 确定肽/DIII比，平均为每分子DIIIb对应2个CEA特异性肽，偶联物可溶 于水溶液。使用Superdex 200柱(GE医疗保健公司，新泽西州皮斯卡特维) 进行尺寸排阻色谱来纯化。然后用¹²⁴I标记纯化的抗CEA肽-DIIIb偶联物 并静脉注射4只负荷LS174T(CEA阳性)和C6(CEA阴性)肿瘤的无胸腺裸 小鼠。在4、20和27小时用小动物PET/CT对小鼠成像，此后杀死小鼠， 解剖并在γ井式计数器中对组织/器官计数。下表4显示注射27小时后计算 所得每克的百分注射剂量(％ID/g)。

PET/CT图像(图10)表明肽-DIIIb偶联物靶向CEA阳性肿瘤的能力。注 意到高循环活性，表明DIIIb延长肿瘤靶向肽循环半衰期的功能得以保留。 但是，靶向部分(肽)不能有效结合靶标，引起肽-DIIIb偶联物解离并返回循 环中。生物分布数据证实了这一点(表4)，注射后27小时的LS174T肿瘤摄 取相对较低而血液活性较高。

表4.¹²⁴I标记抗CEA肽-DIIIb偶联物在荷瘤小鼠中的生物分布(n＝4)

  组织/器官   ％ID/g   标准差   血液   3.00   0.32   肝脏   1.42   0.08   脾脏   1.04   0.16   肾脏   3.66   0.66   肺   2.36   0.87   肌肉   0.30   0.03   胃   1.07   0.19   LS174T肿瘤   1.53   0.20   C6肿瘤   1.26   0.20   尸体   0.56   0.08

肿瘤/肌肉比为5.1是可接受的，并与抗体成像相当。肿瘤/血液和(CEA 阳性)肿瘤/(CEA阴性)肿瘤比相对较低(分别为0.51和1.2)，表明血液中的 高活性和肿瘤靶向减少。这一观察再次表明偶联物在血液中停留时间足够 长(DIIIb功能)，但肽未有效结合靶标(LS174T肿瘤所表达的CEA)。我们认 为优选具有高亲和性的肽(例如，Kd＜10nM)用于偶联DIII的成像，因为 亲和力本身无法弥补弱亲和性。

参考文献

Aina，O.H.，Liu，R.，Sutcliffe，J.L.，Marik，J.，Pan，C.X.和Lam，K.S.(2007)Mol. Pharm.，4，631-651.

Andersen，J.T.，Dee Qian，J.和Sandlie，I.(2006)Eur.J.Immunol.，36， 3044-3051.

Barbas，A.S.和White，R.R.(2009)Curr.Opin.Investig.Drugs，10，572-578. Bebbington，C.R.，Renner，G.，Thomson，S.，King，D.，Abrams，D.和 Yarranton，G.T.(1992)Biotechnology(N Y)，10，169-175.

Bembenek，S.D.，Tounge，B.A.和Reynolds，C.H.(2009)Drug Discov.Today，14， 278-283.

Bos，O.J.，Labro，J.F.，Fischer，M.J.，Wilting，J.和Janssen，L.H.(1989)J.Biol. Chem.，264，953-959.

Burger，A.M.，Hartung，G.，Stehle，G.，Sinn，H.和Fiebig，H.H.(2001)Int.J. Cancer，92，718-724.

Carmichael，J.A.，Power，B.E.，Garrett，T.P.，Yazaki，P.J.，Shively，J.E.， Raubischek，A.A.，Wu，A.M.和Hudson，P.J.(2003)J.Mol.Biol.，326，341-351. Chaudhury，C.，Brooks，C.L.，Carter，D.C.，Robinson，J.M.和Anderson，C.L. (2006)Biochemistry，45，4983-4990.

Chaudhury，C.，Mehnaz，S.，Robinson，J.M.，Hayton，W.L.，Pearl，D.K.， Roopenian，D.C.和Anderson，C.L.(2003)J.Exp.Med.，197，315-322.

Chen，R.，Li，L.和Weng，Z.(2003)Proteins，52，80-87.

Curry，S.，Mandelkow，H.，Brick，P.和Franks，N.(1998)Nat.Struct.Biol.，5， 827-835.

D′Argenio，D.Z.和Schumitzky，A.(1979)Comput.Programs Biomed.，9， 115-134.

Defrise，M.，Kinahan，P.E.，Townsend，D.W.，Michel，C.，Sibomana，M.和 Newport，D.F.(1997)IEEE Trans Med.Imaging，16，145-158.

Dugaiczyk，A.，Law，S.W.和Dennison，O.E.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 79，71-75.

Friedman，M.，Nordberg，E.，Hoiden-Guthenberg，I.，Brismar，H.，Adams，G.P.， Nilsson，F.Y.，Carlsson，J.和Stahl，S.(2007)Protein Eng.Des.Sel.，20， 189-199.

Gentile，F.，Amodeo，P.，Febbraio，F.，Picaro，F.，Motta，A.，Formisano，S.和 Nucci，R.(2002)J.Biol.Chem.，277，44050-44060.

Gronwall，C.和Stahl，S.(2009)J.Biotechnol.，140，254-269.

Kenanova，V.，等(2005)Cancer Res.，65，622-631.

Kratz，F.，Muller-Driver，R.，Hofmann，I.，Drevs，J.和Unger，C.(2000)J.Med. Chem.，43，1253-1256.

Loening，A.M.和Gambhir，S.S.(2003)Mol.Imaging，2，131-137.

Martin，W.L.，West，A.P.，Jr.，Gan，L.和Bjorkman，P.J.(2001)Mol.Cell，7， 867-877.

Melder，R.J.，等(2005)Cancer Immunol.Immunother.，54，535-547.

Muller，D.，Karle，A.，Meissburger，B.，Hofig，I.，Stork，R.和Kontermann，R.E. (2007)J.Biol.Chem.，282，12650-12660.

Nuttall，S.D.和Walsh，R.B.(2008)Curr.Opin.Pharmacol.，8，609-615.

Olafsen，T.，Kenanova，V.E.和Wu，A.M.(2006)Nat.Protoc.，1，2048-2060.

Osborn，B.L.，Olsen，H.S.，Nardelli，B.，Murray，J.H.，Zhou，J.X.，Garcia，A.， Moody，G.，Zaritskaya，L.S.和Sung，C.(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.，303， 540-548.

Saerens，D.，Ghassabeh，G.H.和Muyldermans，S.(2008)Curr.Opin.Pharmacol.， 8，600-608.

Simonsen，S.M.，Sando，L.，Rosengren，K.J.，Wang，C.K.，Colgrave，M.L.， Daly，N.L.和Craik，D.J.(2008)J.Biol.Chem.，283，9805-9813.

Sugio，S.，Kashima，A.，Mochizuki，S.，Noda，M.和Kobayashi，K.(1999)Protein  Eng.，12，439-446.

Venisnik，K.M.，Olafsen，T.，Gambhir，S.S.和Wu，A.M.(2007)Mol.Imaging. Biol.，9，267-277.

Venisnik，K.M.，Olafsen，T.，Loening，A.M.，Iyer，M.，Gambhir，S.S.和Wu，A.M. (2006)Protein Eng.Des.Sel.，19，453-460.

Wosikowski，K.，Biedermann，E.，Rattel，B.，Breiter，N.，Jank，P.，Loser，R.， Jansen，G.和Peters，G.J.(2003)Clin.Cancer Res.，9，1917-1926.

Wu，A.M.，Williams，L.E.，Zieran，L.，Padma，A.，Sherman，M.，Bebb，G.G.， Odom-Maryon，T.，Wong，J.Y.C.，Shively，J.E.和Raubitschek，A.A.(1999) Tumor Targeting，4，47-58.

Wu，A.M.，Williams，L.E.，Zieran，L.，Padma，Q.，Sherman，M.A.，Bebb，G.G.， Odom-Maryon，T.，Wong，J.Y.C.，Shively，J.E.，和Raubitschek，A.A.(1999) Tumor Targeting，4.

Yazaki，P.J.，Kassa，T.，Cheung，C.W.，Crow，D.M.，Sherman，M.A.，Bading，J.R.， Anderson，A.L.，Colcher，D.和Raubitschek，A.(2008)Nucl.Med.Biol.，35， 151-158.

Yazaki，P.J.，Wu，A.M.，Tsai，S.W.，Williams，L.E.，Ikler，D.N.，Wong，J.Y.， Shively，J.E.和Raubitschek，A.A.(2001)Bioconjug.Chem.，12，220-228.

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明，本领域技术人员 应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的精神和权限以 及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通 过引用全文纳入本文以用于所有目的。