美国肉参岩藻糖基化粘多糖及其用途

摘要

本发明公开了一种美国肉参岩藻糖基化粘多糖，其结构式为：

说明书

技术领域

本发明涉及一种大分子化合物--美国肉参岩藻糖基化粘多糖的结构鉴定和用途，属于天然高分子领域。 

背景技术

研究发现存在于海参体壁的多糖主要分两类：一类为岩藻糖基化的海参硫酸软骨素(sea cucumber fucolysated chondroitin sulfate)(38，39)，是由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-岩藻糖组成的分支杂多糖，相对分子质量为4万-5万；另一类为海参岩藻多糖(Holothurian fucan)(40，41)，是由L-岩藻糖所构成的直链多糖，相对分子质量为8万-10万。两者的组成糖基虽不同，但糖链上都有部分羟基发生硫酸酯化，并且硫酸酯基类多糖含量均在32％左右，两种海参多糖的特殊结构，均为海参所特有。 

海参硫酸软骨素多糖是海参两种主要多糖之一，其结构复杂，且因海参种类和生长环境的不同而有差别。近年来，国内外对海参硫酸软骨及其异构物的药理作用进行了研究，证明其具有抗肿瘤，提高机体免疫力，抗血栓，抗凝血，降低血粘度，保护神经组织及抑菌等多种生理活性，对人体的生理功能调控、维系生命最佳状态具有极其重要的意义。 

目前，文献研究报道的海参硫酸软骨素主要有以下两种： 

其一为Paulo A.S.等从L.grisea海参中提取出一种海参多糖，类似硫酸软骨素的结构，糖组成分析表明其含有Fuc∶GalNAc∶GlcA∶SO4约为1∶1∶1∶2.7，采用稀酸酸水解并结合NMR技术观察水解过程中核磁共振¹H NMR谱图变化表明，岩藻糖支链主要连接在葡萄糖醛酸的3位上。采用硫酸软骨素ABC酶并对产物进行二糖组成分析，表明主链含有硫酸软骨素，硫酸软骨素4-S和的硫酸软骨素4，6-S。而核磁分析表明其支链岩藻糖以4-O-SO₄取代为主，并含有3，4和2，4-O-SO₄取代。 

其二为Kariya等从日本刺参(S.japonicus)体壁中分离纯化出海参糖胺聚糖，经酸解后测定其单糖和硫酸基组成，发现其为硫酸软骨素E型结构，硫酸基(SO₄^2-)、氨基半乳糖(GalN)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和岩藻糖(Fuc)的摩尔比为3∶2∶2∶1。进一步的结构分析表明这种硫酸软骨素的岩藻糖支链以2，4-O-SO₄为主，并且含有3，4和4-O-SO₄取代。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗血栓活性和抗凝血功能的美国肉参岩藻糖基化粘多糖。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种美国肉参岩藻糖基化粘多糖，其结构式为： 

n＝70。 

作为本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的改进：美国肉参岩藻糖基化粘多糖主链为硫酸软骨素E结构，同时带有硫酸岩藻糖构成的支链，该支链通过糖苷键连接在主链的β-D-葡萄糖醛酸上，且硫酸基的取代方式以2，4-O-SO₄为主，为从一种从海参中分离得到的结构新颖硫酸软骨素多糖。 

作为本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的进一步改进：支链为2，4位硫酸化的α-D-岩藻糖。 

作为本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的进一步改进：美国肉参岩藻糖基化粘多糖是一种含有2，4位硫酸化的α-D-岩藻糖支链的硫酸软骨素。 

本发明还同时提供了上述美国肉参岩藻糖基化粘多糖的用途：其具有抗血栓活性或者抗凝血功能；因此能用于制备抗血栓剂或抗凝血剂。 

本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖主链为硫酸软骨素E结构，同时带有硫酸岩藻糖构成的支链，该支链通过糖苷键连接在主链的β-D-葡萄糖醛酸上，且硫酸基的取代方式以2，4-O-SO4取代为主，为从一种从海参中分离得到的结构新颖硫酸软骨素多糖。美国肉参岩藻糖基化粘多糖具有包括抗凝血，抗血栓活性等活性。其用法和用量可参照目前现有的海参硫酸软骨素的用法和用量。 

综上所述，本发明发现一种新型的岩藻糖基化粘多糖，对其的抗凝抗栓活性的研究具有重要的意义。 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1是本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖的红外光谱图； 

图2是美国肉参岩藻糖基化粘多糖的¹HNMR； 

图3是美国肉参岩藻糖基化粘多糖的2D谱图； 

a；TOCSY谱图；b HMQC谱图；c NOESY谱图； 

图4是美国肉参岩藻糖基化粘多糖的¹³CNMR； 

图5美国肉参岩藻糖基化粘多糖的凝血酶FIIa和凝血因子FXa的抑制作用； 

a抗凝血酶III介导的对FIIa抑制活性；b肝素因子II介导对对FIIa抑制活性； 

c抗凝血酶III介导的对FXa抑制活性。 

具体实施方式

实施例1、美国肉参岩藻糖基化粘多糖的提取方法，依次进行以下步骤： 

1)、将50g美国肉参的干参(含水率低于10％)磨成粉状物，加入1500mL的混合缓冲溶液，并加入5mg木瓜蛋白酶，于60℃水浴下搅拌反应24h。 

该混合缓冲溶液的制备方法如下：在每L 0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)中加入15mmol的EDTA和5mmol的半胱氨酸。 

2)、将步骤1)所得的酶解后产物离心(2000g，15min，20℃)，向上清液(即海参酶解液)中加入80mL质量浓度为10％的氯化十六烷基吡啶(CPC)水溶液，室温下放置24小时后，离心(2000g，15min)，弃去上清液。 

3)、将步骤2)所得的沉淀溶解于500mL的NaCl的乙醇水溶液(NaCl的浓度为3mol/L，乙醇水＝100∶15v/v)中，再加入1000mL 95％(体积浓度)乙醇溶液，4℃放置24小时，离心(2000g，15min)，沉淀分别用30mL 80％和95％(均为体积浓度)乙醇溶液洗2次，最后将沉淀于60℃干燥2小时，用蒸馏水溶解，用截流分子量为6000Da的中空纤维膜超滤并脱盐，浓缩，冻干(于-62℃)，得海参粗多糖5g，提取率约为10％。 

4)、将海参粗多糖经过DEAE-52阴离子交换柱分离纯化。具体纯化步骤如下： 

3g的海参粗多糖采用DEAE阴离子交换树脂(4.6*20cm)分离纯化，采用0-1.4mol/LNaCl的缓冲盐溶液(以0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 6.0)作为溶剂)进行线性梯度洗脱，总系统体积为2000ml，流速为0.5mL/min，每10min收集一管，于280nm处测吸光值检测蛋白含量，采用改良的苯酚-硫酸法检测各管的多糖含量。 

并通过液相TSK4000柱子检测组分单一的管，第75～110管为符合上述要求的管。收集后经截留分子量为14000Da的透析袋透析，真空冷冻(0.025MPa，-62℃)干燥，得美国肉参岩藻糖基化粘多糖1.2g。 

所得的多糖采用醋酸纤维膜电泳和高效液相色谱鉴定纯度和分子量。结果表明该美国肉参岩藻糖基化粘多糖的分子量约为109KDa。纯度为98.2％。 

实施例2、对实施例1所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖进行结构分析： 

(1)取上述实施例1所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖约2.0mg于安培瓶中，加入1mL2mol·L^-1TFA，充氮气封管，110℃水解8h。冷却至室温，50℃挥干TFA，逐次分别以2mol·L^-1、0.3mol·L^-1NaOH溶液调至中性，超纯水定容至1mL，取400μL并入50μL 2mM/L的内标物乳糖进行PMP衍生化。色谱条件：色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪、色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18分离柱(4.6×150mm，5μm)、检测器：紫外检测器，250nm、流速：1.0mL·min^-1、柱温：25℃、流动相：溶剂A：15％(V/V)乙腈+0.05mol·L-1磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)，溶剂B：40％(V/V)乙腈+0.05mol·L-1磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH，pH 6.9)、梯度模式：时间梯度：0→10→30min，浓度梯度：0→8％→20％溶剂B、进样体积：10μL。结果表明：美国肉参岩藻糖基化粘多糖的单糖组成为葡萄糖醛酸(GlcUA)、氨基半乳糖(GalN)和岩藻糖(Fuc)，其比例约为1∶1∶1.1。 

(2)取上述实施例1所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖(大约2mg)，加5mL浓HCl及1.5mL浓HNO₃消化约2小时至微黄为止，将剩余的少量溶液定容到50mL，取2.5mL采用离子色谱法测定硫酸基含量。以硫酸钾作标准品建立标准曲线。结果表明美国肉参岩藻糖基化粘多糖多糖的硫酸基约为34.3％。 

(3)取上述实施例1所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖与KBr压制成片，使用Vector22型傅立叶红外光谱仪，扫描4000～400cm^-1波数范围的光谱吸收值。结果如图1所示，表明美国肉参多糖在3600-3200cm^-1都出现了一个宽的O-H伸缩振动峰，在2990cm^-1和2940cm^-1为岩藻糖甲基的吸收峰，在1430cm^-1附近(羧基C＝O伸缩，-OH弯曲)处有吸收，说明美国肉参岩藻糖基化粘多糖中含有糖醛酸，这与单糖组成分析结果相一致。此外在1261～1220cm^-1(S＝O的伸缩振动峰)和860～820cm^-1(C-O-S的伸缩振动峰)处有强烈吸收，进一步表明所有样品为富含硫酸基的多糖。其中827cm^-1处的吸收峰是C-O-S的伸缩振动(轴向配位)，是C-4位硫酸基取代的岩藻糖，说明美国肉参岩藻糖基化粘多糖以C-2，4取代为主； 

(4)上述实施例1所得的美国肉参岩藻糖基化粘多糖各取50mg，以0.5mL D₂O(99.96％)连续交换2次，经0.5mL D₂O(99.96％)溶解后，用JNM-ECP 600核磁共振波谱仪测定 ¹H NMR。测定条件：60℃，600MHz；内标：丙酮。¹³C NMR和二维谱图¹H-¹H COSY，TOCSY在20℃下分析得到。对于糖化合物来说，¹H NMR谱中C-1上的质子(H-1)信号通 常在δ4.8～5.6ppm，较易解析，其他C-2～C-6的质子信号均集中在δ3.2～4.8ppm，互相重叠交叉，解析困难。美国肉参岩藻糖基化粘多糖主链为类似于由β-D-GlcUA和β-D-GalNAc交替构成的硫酸软骨素的结构，而支链为岩藻糖糖基。5.1～5.6ppm处的信号被归属为岩藻糖的异头氢信号。美国肉参岩藻糖基化粘多糖在5.56ppm处显示了一个主要峰和强度较弱的峰(图2)，参考Mourao等在海参L.grisea中的数据^[7]，它们被归属为2，4-O-SO₄。此外美国肉参岩藻糖基化粘多糖在5.23ppm还有一个信号较弱的峰，参考之前文献数据，被归属为4-O-SO₄。在岩藻糖的甲基信号区域(1.0～1.3ppm)，美国肉参岩藻糖基化粘多糖(图2-4a)仅显示了1.19ppm的甲基信号，因此可以被归属于2，4-O-SO₄的甲基氢信号。美国肉参岩藻糖基化粘多糖，只在1.89-1.93ppm区域显示了一个甲基信号峰，表明他们主链上GalNAc的取代类型相似(硫酸软骨素E，下文讨论)。二维TOCSY(图3a)显示了岩藻糖异头氢信号H-1和H-2的相关信号(如图3a所示)，如a1/a是2，4岩藻糖中H-1和H-2的相关信号(如图3a所示)。所有岩藻糖基的化学位移如表1所示。而HMQC和NEOSY谱图则表明了其主链为硫酸软骨素E的结构(如图3b和3c所示)。 

表1美国肉参岩藻糖基化粘多糖岩藻糖基的¹H NMR化学位移 

“-“表示海参多糖信号未被检测到

5)美国肉参岩藻糖基化粘多糖的¹³C-NMR谱图如图4所。它不像氢谱一样直接明了地得出海参岩藻糖基的硫酸基取代情况。但是我们可以得出美国肉参岩藻糖基化粘多糖的碳谱和标准硫酸软骨素E和刺参S.japonicus硫酸软骨素(其主链为硫酸软骨素E结构)的碳谱非常相似，因此我们对其主链首先进行分析。67.5ppm的信号可以很明显地归属于硫酸化的GalNAc的C-6位，但是C-4的信号由于和其他信号堆叠在一起很难归属。在异头碳部分，美国肉参(图4)在97.1、99.8和104.1ppm显示了三个非常清晰地信号，分别归属于其三个单糖单元Fuc，GalNAc和GlcA的异头碳信号。 

6)实施例1所得美国肉参岩藻糖基化粘多糖的结构式为： 

n～＝70。 

实施例3、美国肉参的抗凝抗栓活性 

1)、人静脉取血，按照9∶1(体积比)比例加至含0.109mol/L的构椽酸钠抗凝剂的塑料管中。轻轻混合均匀，3000r/min，15min离心，取血浆用于凝血活性实验；对于凝血酶原时间(PT)实验，72μL血浆混合8μL样品溶液，37℃孵育1min。然后给混合液中加入20μL PT检测试剂，37℃孵育5min，同时凝血时间由自动血凝仪纪录。对于活化部分凝血活酶时间(APTT)实验，72μL血浆混合8μL样品溶液，37℃孵育1min。然后给混合液中加入20μL APTT检测试剂，70C孵育5min。最后加入预温(37℃)10μL，0.025mol/L氯化钙(calciumchloride溶液，同时凝血时间由自动血凝仪计时。对凝血酶时间(TT)实验，45μL血浆混合5μL样品液，37℃孵育1min，最后加入50μL TT检测试剂，同时纪录凝血时间。所有凝血实验均平行操作6次，取均值。抗凝活性由凝血时间表示。肝素钠作为阳性药物，待测美国肉参岩藻糖基化粘多糖终浓度分别为4，16，64μg/mL。空白血清作对照。所有样品包括肝素钠均溶于生理盐水中。实验结果表明，本发明的美国肉参岩藻糖基化粘多糖有显著地延长APTT和TT时间的效果，而没有延长PT时间效果，其活性与标准肝素比对后，分别为183IU/mg和157IU/mg。 

2)、对凝血酶(FIIa)和凝血因子FXa的抑制。该实验在384孔微孔板进行，反应体系终体积40μL，包含终浓度为10nmol/L抗凝血酶III(AT III)或30nmol/L HC II，2nmol/LFIIa或FXa，以及不同浓度的美国肉参岩藻糖基化粘多糖和肝素钠样品(0.00025μg/mL-25μg/mL浓度梯度)。各样品均溶于TS/PEG buffer(0.02mol/L Tris/HCl，0.15mol/LNaCl和1.0mg/mL PEG 8000，pH 7.4)中。FIIa/FXa最后加入反应体系启动反应，37℃孵育60s，然后加入25μL 0.4mmol/L FIIa发色底物/FXa发色底物，然后将微孔板置入酶标仪中，记录405nm OD值300s。OD变化率和保留在体系中的FIIa/FXa活性成比例，根据OD的变化率来观察体系中的凝血因子活力，从而计算加入的样品对凝血因子的抑制作用。空白实验包括FIIa/FXa与AT III/HC II混合孵育，但不加入各样品。空白实验中未见任何凝血因子 的抑制作用。所有实验平行操作3次。 

其活性如图5所示，图5a，随着美国肉参岩藻糖基化粘多糖的浓度增加，体系中FIIa的活力逐渐降低，显示其抑制作用逐渐增加，但是其活性都显著低于肝素的活性。图5b相比于图5a，凝血辅因子发生变化，由ATIII换为HC II，目标蛋白酶仍是F II a，图形趋势基本和图5a一致，随着加入样品剂量的增加，样品的抑制作用逐渐增强，和ATIII介导的不同的是，其活性略高于肝素样品，这说明美国肉参岩藻糖基化粘多糖中存在着HC II结合位点，他与肝素因子II结合后进而抑制凝血酶的活性。图5c显示了AT III介导的抑制FXa的效应曲线，由图中可以看到其活性明显弱于标准肝素。 

3)、美国肉参岩藻糖基化粘多糖体外抗血栓实验。健康雄性SD大鼠，体重250～300g，按体重随机分为5组，分别为正常对照组、肝素对照组和低分子量肝素组(剂量分别为0.2mg/kg和0.5mk/kg)、海参肉参低和高剂量组(剂量分别为0.3mg/kg和0.5mg/kg)。各组按1mL/kg尾静脉注射药品，正常对照组注射生理盐水，1次/d，连续3d。SD大鼠给药后0.5h，用20％的乌拉坦麻醉，腹主动脉取血。每只取血4mL，加入到事先置入0.38％的枸橼酸钠溶液0.5mL，混匀。取1mL抗凝血液加入到血栓管中，并放入到预热至37℃的血栓测定仪中，转动10min后，取下血栓管，将其中的血栓及血液一同倾倒在滤纸上，用游标卡尺测量血栓长度。再将放有血栓的纸片置恒温烤箱中，于60℃烘干40min后，称取血栓干重。实验结果采用Tukey’s test评价结果的统计学差异，以p＜0.05作为有显著性差异的标准。所有结果均以means±SD表示。所有分析统计检验采用GraphPad Instat 4.0软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)。实验表明，美国肉参岩藻糖基化粘多糖组(高剂量组(0.5/mg/ml)和低剂量组(0.3/mg/ml))与正常组相比，其血栓湿重显减小(P＜0.01)；但是其作用效果与肝素组和低分子量肝素组相比，其高剂量组(0.5/mg/ml)的作用效果仍低于肝素组(0.3/mg/ml)的作用效果，但是高于低分子量肝素组的作用效果，而低剂量组(0.3/mg/ml)的作用效果和低分子量肝素组相当。 

表2美国肉参岩藻糖基化粘多糖的体外抗血栓研究 

  组别   血栓长度cm   血栓干重mg   正常对照组   2.16±0.52   110.47±9.49   标准肝素对照组(0.3/mg/ml)   未形成血栓   未形成血栓   低分子量肝素组(0.5/mg/ml)   1.83±0.74   35.83±4.73^*  MR-CHS(0.3/mg/ml)   1.89±0.39   35.40±7.15^*  MR-CHS(0.5/mg/ml)   1.81±0.27   32.73±5.35^**

[0054] 对比实验1：分离纯化出日本刺参(S.japonicus)体壁海参硫酸软骨素，研究其体外抗凝效价，结果其体外延长APTT活性为100IU/mg，TT活性为80IU/mg，明显低于本发明报道的美国肉参岩藻糖基化粘多糖。体外抗血栓活性分析表明，其0.5mg/kg剂量时，其体外形成血栓干重为38.7±6.75，其体外抗血栓效果弱于本发明所涉及的多糖。因此，与日本刺参硫酸软骨素相比，美国肉参岩藻糖基化粘多糖的明显优于日本刺参，且在实验过程中并未发现明显的出血副作用，同时具有体外抗血栓活性优于日本刺参，是一种潜在的优良抗凝血及抗血栓药物。

对比实验2：分离纯化出巴西湾海参(L.grisea)体壁海参硫酸软骨素，研究其体外抗凝效价，结果其体外延长APTT活性为40IU/mg，TT活性为32IU/mg，明显低于本发明报道的美国肉参岩藻糖基化粘多糖。体外抗血栓活性分析表明，其0.5mg/kg剂量时，其体外形成血栓干重为42.35±6.75，其体外抗血栓效果弱于本发明所涉及的多糖。因此，与巴西湾海参硫酸软骨素相比，美国肉参岩藻糖基化粘多糖的明显优于日本刺参，且在实验过程中并未发现明显的出血副作用，同时具有体外抗血栓活性优于日本刺参，是一种潜在的优良抗凝血及抗血栓药物。 

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。