一株高产褐藻酸裂解酶的嗜盐白蚁菌及其应用方法

摘要

本发明属生物技术领域，具体涉及一株高产褐藻酸酶的嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX及其应用方法。首次筛选到了一株高产褐藻酸裂解酶的白蚁菌WX，结合形态特征和生理生化特性，将菌株WX鉴定为嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.5336，保藏日期为2011年10月12日。该菌株可产生褐藻酸裂解酶降解褐藻酸钠，生产褐藻寡糖，酶活力可高达432U/ml。由该菌株产生的褐藻酸酶可以高效降解褐藻胶，生产具有多种生物活性的褐藻寡糖。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产褐藻酸裂解酶的嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans) 及其应用方法。

背景技术

褐藻寡糖具有多种生物活性，其药用价值的研究已成为新的热点，具有良好的抗肿瘤活性和抗凝活性， 副作用小，可降血糖血脂，并且对人的遗传性高血糖也有明显疗效，同时可以防止高胆固醇血症的形成， 有降脂、维护心血管正常功能的作用。目前，生产褐藻寡糖的方法可归纳为：化学降解法、物理降解法和 酶解法。但前两者降解速度慢，会破坏多糖的特有的结构，且需高温、高压，条件复杂不易控制，而酶解 法条件温和，得率高达100％，因此在褐藻寡糖的生产方面倍受到重视，使得后者的医药作用充分得到实 现。此外，褐藻酸裂解酶作为一个重要的海洋生物酶，可以配合一些抗生素降解肺囊性纤维化病人肺中绿脓 杆菌产生的褐藻胶，抑制绿脓杆菌的生长繁殖，也可作为海藻解壁酶从褐藻或红藻中分离DNA、原生质体 和单胞藻，为新药、新功能食品的开发提供新的手段。依靠富集褐藻附生菌筛选产酶菌株是我国现阶段获 得褐藻酸裂解酶的主要手段。微生物褐藻酸裂解酶主要来源于海洋细菌、真菌等，但是由于受到海洋特殊 生长环境的影响，这些褐藻酸降解菌种的产酶性状不稳定。因此，寻找性状稳定、易于培养的高产的褐藻 酸裂解酶菌株具有重要意义。而相关研究，国内外尚未文献报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有褐藻酸裂解酶的生产方法中的技术难点及存在的问题，提供一株新型的高 产褐藻酸裂解酶的嗜盐白蚁菌，利用该菌株发酵可生产高酶活力的褐藻酸裂解酶，该菌株是极具有开发研 究价值的褐藻酸裂解酶的生产菌株。

发明内容

本发明的发明人从国内生产褐藻酸钠的化工厂取得土样与废料样品，分离筛选获得一株产褐藻酸裂解 酶的新型嗜盐白蚁菌WX，并对这株菌进行了发酵研究。根据形态特征和生理生化特性，将其鉴定为 Isoptericola halotolerans，编号为WX。该菌于2011年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5336。

本发明提供的嗜盐白蚁菌WX的形态特征与生理生化特征为：

该菌株形态呈短杆状，或似球形，革兰氏染色阳性；在平板上培养48h的菌落呈浅黄色，圆形微凸、 表面光滑、菌苔湿润、菌落较小，但透明圈明显；单个、成对或短链状排列，无鞭毛，无孢子形成。最适温 度为25℃，最适pH为8.0。可在20％的NaCl、pH为10的培养基中生长。接触酶呈阳性，氧化酶呈阴性， M.R、V.P反应为阴性，可利用葡萄糖、乳糖、甘露醇等，不能利用果糖、甘油等；不能水解淀粉，但可 以缓慢水解明胶；具有硝酸盐还原性，可水解纤维素。生理生化特征见表1

表1

本发明提供的嗜盐白蚁菌WX是具有良好前景的产褐藻酸裂解酶的新型生产菌株，该菌株可在自制培 养基中生长。自制培养基配方为：褐藻酸钠6g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母粉4-10g/L，NaCl 20-30g/L， MgSO₄ 2mM，CaCl₂ 0.5mM，KH₂PO₄ 1mM，FeSO₄ 0.2mM，MnSO₄ 0.3mM，琼脂粉10-20g/L；补充蒸馏 水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.5-8.0，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

上述的嗜盐白蚁菌WX可以采用发酵法生产褐藻酸裂解酶，其步骤如下：

1)采用保藏号为CGMCC No.5336的嗜盐白蚁菌WX为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子 液，将该种子液涂布到自制培养基上；

2)制备的嗜盐白蚁菌WX菌株的细胞液体培养物：挑取步骤(1)的自制培养基上的嗜盐白蚁菌WX一环， 接种于装有20-50mL培养基的250mL锥形瓶中，培养温度为25-30℃，置摇床上以180-230r/min的转速 培养20-24h至对数生长中期，即得到嗜盐白蚁菌WX菌株的细胞液体培养物；

3)发酵培养：按250mL三角瓶装20-50mL的量，投入发酵培养基，接种步骤(2)的嗜盐白蚁菌WX菌 株的细胞液体培养物，接种量为2-5％(w/w)，培养温度为25-30℃，在摇床上以180-230r/min的转速下 培养40-48h，得到发酵液；或按发酵罐容积的40-80％投入所述的发酵培养基，以0.07-0.1MPa高压蒸汽 灭菌维持30min，冷却至25-30℃，接入步骤(2)所述的嗜盐白蚁菌WX菌株的细胞液体培养物，接种量 2-5％(w/w)；培养温度为25-30℃，控制通气量为1∶0.5-2vvm，控制发酵罐的搅拌转速为200-600r/min； 发酵时间为40-48h，得到发酵液；

4)产物检测：将步骤(3)的发酵液在6000-8000r/min下离心10-30min，收集上清，用DNS法测定还原 糖的产量，从而计算出褐藻酸裂解酶的酶活力；

其中步骤(1)、(2)(3)中所述的自制培养基的成分及配比为：褐藻酸钠6g/L；蛋白胨5-20g/L；酵母粉 4-10g/L；NaCl 20-30g/L；MgSO₄ 2mM，Cacl₂ 0.5mM，KH₂PO₄ 1mM，FeSO₄ 0.2mM，MnSO₄ 0.3mM，琼 脂粉10-20g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.5-8.0，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

本发明所述的嗜盐白蚁菌WX菌株产生褐藻酸裂解酶，可高效降解褐藻酸钠，生成具有生物活性的褐 藻寡糖，该菌株所产褐藻酸裂解酶酶活力高，底物转化率高，是一株极具开发研究价值的褐藻酸裂解酶的 生产菌株。

附图说明

图1为本发明的嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX菌株在自制发酵培养基中发酵生产褐藻酸裂 解酶的结果。

具体实施方式

实施例1嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX的分离鉴定以及菌株的保存

(1)嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX的分离、筛选

本发明从国内生产褐藻酸钠的化工厂取得土样与废料样品，称取1.0-2.0g土样于含有0.5％(w/v) 褐藻酸钠的250mL三角瓶中，30℃、200rpm发酵培养48h后，再移取10mL培养液至另一盛有新鲜培养 基的250mL三角瓶中继续培养，连续驯化三次后进行梯度稀释，取0.2mL稀释液涂布于筛选固体平板上， 25-30℃培养20-24h后，挑取能在褐藻酸钠平板上生长的单菌落接种到新鲜的自制液体培养基中培养20h 后，细胞液体培养物以3％(w/v)接种量接于装有30mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，25-30℃，以 180-230r/min的转速振荡培养，48h后收集发酵液，6000-8000r/min离心10-30min，收集上清，用DNS 法测定还原糖的产量，从而计算出褐藻酸裂解酶的酶活力。

(2)嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX的鉴定

生理生化鉴定：该菌株形态呈短杆状，或似球形，革兰氏染色阳性；在平板上培养48h的菌落呈浅黄 色，圆形微凸、表面光滑、菌苔湿润、菌落较小，但透明圈明显；单个、成对或短链状排列，无鞭毛，无孢 子形成。最适温度为25℃，最适pH为8.0。可在20％的NaCl、pH为10的培养基中生长。接触酶呈阳性， 氧化酶呈阴性，M.R、V.P反应为阴性，可利用葡萄糖、乳糖、甘露醇等，不能利用果糖、甘油等；不能 水解淀粉，但可以缓慢水解明胶；具有硝酸盐还原性，可水解纤维素。

(3)菌株保存：挑取一环嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX菌株接种于自制液体培养基中，25-30℃， 200r/min振荡培养20-24h后，取0.5mL的细胞培养液转入装有0.5mL的60％的甘油保藏管中，-20℃冷 冻保藏。该菌2010年5月12日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为 CGMCC No.5336。

实施例2利用嗜盐白蚁菌WX发酵生产褐藻酸裂解酶

(1)制备嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX菌株的细胞液体培养物

挑取固体自制培养基上的嗜盐白蚁菌(Isoptericola halotolerans)WX菌株一环，接种在装有50mL自 制培养基的250mL锥形瓶中，在25℃-30℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养20-24h至对数生 长中期，即制得嗜盐白蚁菌WX菌株的细胞液体培养物。

(2)发酵培养基的成分及配比为：褐藻酸钠6g/L，蛋白胨5-20g/L，酵母粉4-10g/L，NaCl 20-30g/L， MgSO₄ 0.2mM，Cacl₂ 0.05mM，KH₂PO₄ 0.1mM，FeSO4 0.2mM，MnSO4 0.3mM，琼脂粉10-20g/L；补充 蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.5-8.0，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；

(3)摇瓶发酵：将上述嗜盐白蚁菌WX菌株的细胞液体培养物以3-5％(w/v)的接种量接种在装有灭菌 的20-50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在25℃-30℃条件下，置于摇床上以180-230r/min的转速培 养，发酵40-48h，褐藻酸裂解酶酶活力达到432U/ml。

(4)发酵罐发酵：将上述嗜盐白蚁菌WX菌株的细胞液体培养物按发酵罐容积的40-80％投入所述的发酵 培养基，以0.07-0.1Mpa灭菌30min，冷却至25-30℃，接种量为3-5％(w/w)，培养温度为25-30℃，通 气量为1∶0.5-2(vvm)，发酵罐的搅拌转速为200-600r/min；发酵时间40-48h。