一种超滤膜应用于鼠李糖脂的分离方法

摘要

本发明公开了一种超滤膜应用于鼠李糖脂的两步分离方法；两步法超滤，在第一步时，将去除菌体发酵液pH调节至4.0-6.0，使鼠李糖脂的截留率在95%以上，在第二步时，加入15-45%（v/v）的乙醇，同时调节溶液的pH至8.0-10.0，鼠李糖脂的透过率为90%以上。经过两步法超滤，鼠李糖脂的回收率达80%以上；两步法超滤可以代替现有的鼠李糖脂的传统分离工艺，大幅度减少有机溶剂的用量，降低能耗，从而降低分离成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种膜分离方法，尤其涉及一种超滤膜应用于鼠李糖脂的分离方法。

背景技术

鼠李糖脂，是一种生物表面活性剂，其主要由铜绿假单胞菌在一定的环境下代谢生成的，其具有良好的表面活性及界面活性，可以广泛地应用于石化、环境、医药、食品以及农业等领域。随着目前国家在环境保护及修复方面越来越重视，同时由于鼠李糖脂在环境修复方面突出的表现，其需求量在与日俱增，但是，高额的分离成本极大程度地限制了其广泛的使用。

鼠李糖脂的传统分离包括以下步骤：

（1） 先将灭菌后的菌体高速离心，以去除菌体；

（2） 将去除菌体的发酵液的pH调节至2.0-3.0；

（3） 然后用两倍于发酵液的体积的氯仿：甲醇（2：1 v/v）分两次萃取；

（4） 合并萃取液后，再将其蒸发浓缩；

（5） 然后进行层析分离；

（6） 最后将经层析分离的样品蒸干。

以上的这些步骤中，（1）、（4）和（6）中高速离心和蒸发浓缩需耗费大量的能耗，而且大幅度增加分离的的前期设备投入；（3）中将耗费大量的有机溶剂，而且在萃取过程中易乳化，延长分离时间，且回收率偏低；（5）中层析分离，需要大量的作为洗脱剂的有机溶剂，纯化效率极低，不易工业放大。

发明内容

本发明的目的在于针对现有分离技术的不足，提供一种超滤膜应用于鼠李糖脂的分离方法，该方法高效，经济，环保。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种超滤膜应用于鼠李糖脂的分离方法，该方法包括以下步骤：

（1）鼠李糖脂粗溶液中加入助滤剂并混匀，然后利用板框压滤机去除菌体，得到无菌体发酵液；

（2）加酸调节无菌体发酵液，使其pH控制在4.0-6.0，在0.08-0.2MPa的操作压力下，利用超滤膜进行超滤操作；待超滤截留体积减少到原体积的1/3-1/5时，终止第一步超滤操作，得到浓缩的鼠李糖脂溶液；

（3）在浓缩的鼠李糖脂溶液中加入低级醇，低级醇的体积为最终鼠李糖脂溶液的15-45%，同时加碱调节溶液pH至8.0-10.0，在0.08-0.2MPa的操作压力下，利用中空纤维超滤膜进行超滤操作，收集超滤的滤过液，待体积减少到原体积的1/5-1/7后，终止第二步超滤，收集鼠李糖脂滤过液；

（4）加酸调节超滤透出液的pH至2.0-4.0，静置离心并干燥后，得到纯度大于90%的鼠李糖脂产品。最终鼠李糖脂回收率大于82%。

进一步地，所述步骤（1）中，所述助滤剂为硅藻土，其用量为鼠李糖脂粗溶液的质量的4%-10%，板框压滤机的操作压力为0.6-1.0MPa。

进一步地，所加的酸可以是盐酸、硫酸或硝酸；所用超滤膜是截留分子量为10-30Kda的聚砜、聚醚砜和醋酸纤维素等材质的超滤膜，其反应器型式为中空纤维膜、卷式膜及平板膜等任何型式的超滤组器。

进一步地，所加的碱为NaOH或NaHCO₃水溶液，其浓度为1-4mol/L，所述低级醇为如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等分子量小于100的醇。

进一步地，所用的酸可以是盐酸，硫酸或硝酸；离心速度为3000r/min，离心时间 10min即可。

本发明的有益效果是，传统方法相比，本发明采用超滤膜分离鼠李糖脂，可以大幅度减少有机溶剂的用量，降低能耗，使得分离成本比传统方法低50%-70%左右。是一种经济，高效，节能，环保，绿色的分离工艺。

具体实施方式

    下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

本发明超滤膜应用于鼠李糖脂的分离方法，包括以下步骤：

1、鼠李糖脂粗溶液中加入助滤剂并混匀，然后利用板框压滤机去除菌体，得到无菌体发酵液；

所用助滤剂为硅藻土，其用量为鼠李糖脂粗溶液的质量的4%-10%。板框压滤机的操作压力为0.6-1.0MPa。

2、加酸调节无菌体发酵液，使其pH控制在4.0-6.0，在0.08-0.2MPa的操作压力下，利用中空纤维超滤膜进行超滤操作；待超滤截留体积减少到原体积的1/3-1/5时，终止第一步超滤操作，得到浓缩的鼠李糖脂溶液；

该步骤中所加的酸可以是盐酸、硫酸或硝酸，其浓度不限。所用超滤膜是截留分子量为10-30KDa的中空纤维型、卷式或平板型超滤膜，其材质不限，可以是聚砜、聚醚砜和醋酸纤维素等。

3、在浓缩的鼠李糖脂溶液中加入低级醇，低级醇的体积为最终鼠李糖脂溶液的15-45%，同时加碱调节溶液pH至8.0-10.0，在0.08-0.2MPa的操作压力下，利用中空纤维超滤膜进行超滤操作，收集超滤的滤过液，待体积减少到原体积的1/5-1/7后，终止第二步超滤；

该步骤中碱为NaOH或NaHCO₃水溶液，其浓度为1-4mol/L，低级醇为如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等分子量小于100的醇。

4、加酸调节超滤的透出液的pH至2.0-4.0，静置离心并干燥后，得到纯度大于90%以上的鼠李糖脂产品，回收率高于80%。

所用的酸可以是盐酸、硫酸和硝酸，浓度不限。离心速度为3000r/min，离心时间 10min即可。

    下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

实施例1

采用聚偏氟乙烯（PVDF）中空纤维超滤膜分离与纯化鼠李糖脂，具体步骤如下：

（1）将灭菌后的含4%鼠李糖脂的550ml发酵液，加入4%的硅藻土混匀后，再利用板框压滤机在0.6MPa进行压滤，得到500ml的30g/L去菌体发酵液；

（2）用浓盐酸调节去菌体发酵液pH至4.0，然后利用截留分子量为10KDa的PVDF中空膜在0.1MPa下进行超滤，待截留体积大约为100ml时，第一步超滤结束，收集截留的鼠李糖脂浓缩液；

（3）在截留的鼠李糖脂浓缩液中，原位加入20ml甲醇，使最终甲醇体积浓度在18.9%，然后用1M的NaOH调节溶液pH至9.0，重复超滤操作（0.1Mpa），收集滤出液，直至剩余体积为20ml时，终止第二步超滤操作；

（4）对收集得到的透出液，用浓盐酸调节pH至2.0，然后在转速3000r/min下离心10min；然后将上层清液倒去，得到下层的鼠李糖脂，经干燥，可得到20 g纯度达91%的鼠李糖脂。鼠李糖脂的最终回收率达82.7%。

采用两步超滤膜分离方法，可以大幅度减少以往鼠李糖脂分离所用的有机溶剂用量，避免使用溶剂蒸发所需的高能耗，使分离成本得到大幅度下降，是一种既经济又高效的分离方法。

实施例2

一种平板超滤膜应用于鼠李糖脂的分离方法，改进方法包括以下步骤：

（1）经过板框压滤处理（硅藻土用量为发酵液的10%，操作压力1.0Mpa）后得到的去菌体发酵液，其鼠李糖脂含量为34 g/L；

（2）取1000ml去菌体发酵液，用浓盐酸调节pH至5.0，然后在室温，0.1MPa下，利用截留分子量为300KDa的聚醚砜（PES）超滤平板膜进行超滤，待截留体积大概为200ml时，第一步超滤结束；

（3）在200ml的超滤截留液中，加入90ml工业乙醇，使最终乙醇体积浓度在45%，然后用1M的NaOH调节溶液的pH至9.0，采用相同于第一步超滤的PES中空膜组件进行超滤，收集滤出液，待剩余体积为47ml时，第二步超滤结束；

（4）用浓盐酸调节上述滤出液pH至2.0，然后在3000r/min转速下离心10min；倾去上清液，收集下层沉淀的鼠李糖脂，经进一步烘干（60度恒温烘箱 ）至恒重，称量得到30.5g。对干燥物进行鼠李糖脂分析，可知其纯度为92%，回收率约86.3%。

采用聚醚砜平板膜进行两步超滤分离，也同样得到高纯度的鼠李糖脂，工艺先进。

实施例3

采用聚砜超滤卷式膜分离鼠李糖脂，具体步骤与结果如下：

（1） 取板框压滤过的发酵液1000mL（含鼠李糖脂3.2%）, 采用浓盐酸调节pH至5.0，然后在室温，0.1MPa下，利用截留分子量为10KDa的聚砜（PSF）中空膜进行超滤，待截留体积大概为200ml时，第一步超滤结束；

（3）在200mL的截留液中，加入86ml丙醇，使最终丙醇体积浓度在30%，然后用1M的NaOH调节溶液的pH至9.0，利用同一套聚砜超滤卷式膜装置进行超滤，收集滤出液，待剩余体积为47ml时，第二步超滤结束；

（4）对超滤滤过液进行浓盐酸调节pH至2.0，然后再3000r/min下离心10min；去上清液，收集下层鼠李糖脂沉淀，在60度恒温烘箱中烘至恒重，得6.0g纯度达93%的鼠李糖脂；最终鼠李糖脂回收率为87.2%。

实施例4

采用自制PEG亲水改性的聚砜中空纤维超滤膜：

（1）将灭菌后的发酵液，加入6%的硅藻土混匀后，再利用板框压滤机在0.8MPa进行压滤，得到1500ml的30g/L去菌体发酵液；

（2）将步骤（1）中的去菌体发酵液用浓盐酸调节pH至5.0，然后在室温，0.1MPa下，利用截留分子量为10KDa的接枝PEG过后的聚砜中空纤维膜进行超滤，待剩余体积大概为300ml时，第一步超滤结束；

（3）将步骤（2）中的剩余的液体，加入130ml工业乙醇，使最终乙醇体积浓度在30.2%，然后用1M的NaOH调节溶液的pH至9.0，在室温，0.1MPa下，利用截留分子量为10KDa的接枝PEG过后的PSF中空纤维膜进行超滤，待剩余体积为70ml时，第二步超滤结束，并将剩余液倒入下一次的步骤（2）中的剩余液；

（4）将步骤（3）中的透出液，用浓盐酸调节pH至2.0，然后再3000r/min下离心10min；然后将上层清液倒去，将下层沉淀干燥，既得43g纯度达91%的鼠李糖脂；总体回收率为87%。

实施例5

一种亲水改性超滤平膜应用于鼠李糖脂的分离方法，具体步骤如下：

（1）将灭菌后的发酵液，加入6%的硅藻土混匀后，再利用板框压滤机在0.8MPa进行压滤，得到100L的31g/L去菌体发酵液；

（2）将步骤（1）中的去菌体发酵液用浓盐酸调节pH至5.0，然后在室温，0.1MPa下，利用截留分子量为10KDa的接枝PEG的聚砜平板膜进行超滤，待剩余体积大概为20L时，第一步超滤结束；

（3）将步骤（2）中的剩余的液体，加入8.6L工业乙醇，使最终乙醇体积浓度在30%，然后用1M的NaOH调节溶液的pH至9.0，在室温，0.1MPa下，利用截留分子量为10KDa的PEG接枝改性的聚砜平板膜进行超滤，待剩余体积为4.5L时，第二步超滤结束，并将剩余液倒入下一次的步骤（2）中的剩余液；

（4）将步骤（3）中的透出液，用浓盐酸调节pH至2.0，然后再3000r/min下离心10min；然后将上层清液倒去，将下层沉淀干燥，既得2.9Ｋg纯度达９２％的鼠李糖脂；回收率为86%。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。