包括结核分枝杆菌复合群分枝杆菌的分枝杆菌培养基和培养方法

摘要

本发明涉及新的分枝杆菌培养基，特别是结核分枝杆菌复合群的培养基，所述培养基明显减少培养分离时间，并因此减少诊断分枝杆菌特别是结核病分枝杆菌的时间。本发明的培养基含有去纤维蛋白血液、卵磷脂和去补体的胎牛血清。本发明还涉及培养和鉴定分枝杆菌、特别是结核分枝杆菌复合群的细菌的方法。更具体而言，本发明涉及新的净化方法，其中用氯己定处理所谓的新的分离和分枝杆菌培养基中的生物学样品。本方面还涉及通过本发明的固体培养基，通过表型确定分枝杆菌对抗生素敏感性的方法。最后，本发明还涉及通过质谱分析法在液相中进行鉴定的新方法，因此有助于明显缩短诊断分枝杆菌病特别是结核的时间。为了进行质谱分析，根据本发明，分析通过双离心直接由培养液所获得的细菌。

说明书

本发明涉及分枝杆菌特别是结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium  tuberculosis complex)的分枝杆菌的新培养基，其可显著减少通过培养进行分 离的时间以及因此减少诊断分枝杆菌病、特别是结核的时间。

本发明还涉及培养和鉴定分枝杆菌和特别是结核分枝杆菌复合群的细 菌的方法。

具体而言，本发明涉及在所述用于分离和培养分枝杆菌的新培养基中 净化生物学样品的新方法。

本发明还涉及，使用本发明的固体培养基中的培养物，快速确定分枝 杆菌特别是结核分枝杆菌复合群对抗生素敏感性的表型的方法。

最后，本发明涉及通过质谱分析法进行液相鉴定的新方法，从而有助 于显著减少诊断分枝杆菌病特别是结核的时间。

分枝杆菌是通过16S rRNA基因测序和通过所谓的“多基因座系统发育 (multilocus phylogeny)”分析被归类于放线菌门(Actinobacteria phylum)的细 菌[Mignard S，Flandrois JP.A seven-gene，multilocus，genus-wide approach to  phylogeny of mycobacteria using supertrees.Int J Syst Evol Microbiol.2008； 58：1432-41]，且其特征在于在它们的细胞壁中存在分枝菌酸和染色体具有＞ 60％的高G+C％，所述分枝酸赋予它们特别的染色亲和性(Ziehl-Neelsen染 色)[Pfyffer GE.Mycobacterium：general characteristics，laboratory detection，in  staning procedures.In：Murray Pr，Baron EJ，Jorgensen JH，Landry ML，Pfaller  MA.Manual of Clinical Microbiology 9th Ed.Amercian Society for  Microbiology，Washington DC；2007，pp.543-572]。分枝杆菌属 (Mycobacterium)包括60多个种，包括分离自惰性环境(突然、水)的环境种 类、与动物有关的种类和严格的人类种类即麻风分枝杆菌(Mycobacterium  leprae)，其是麻风病的病因[Cole S et al.Massive gene decay in the leprosy  bacillus.Nature 2001；409：1007-11]。某些环境种类是造成人类机会性感染的 原因(例如鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex)的种类)，且某 些种类是造成人畜共患病的原因，特别是造成结核的结核分枝杆菌复合群 的某些种类。

分枝杆菌病的诊断基于来自人或动物临床样品的分枝杆菌属的种类之 一的分离和培养。根据这一观点，分枝杆菌属包括不可培养的种类(麻风分 枝杆菌)、在培养不到7天产生可见菌落的快速生长的种类(偶发分枝杆菌 (Mycobacterium fortuitum)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、脓肿分 枝杆菌(Mycobacterium abscessus))和缓慢生长的种类，所述缓慢生长的种类 在培养7天以上，或以常规实践，在培养3-8周之间，特别是用Middlebrook 培养基，产生可见菌落。在人类医学中，鸟分枝杆菌复合群的种类在培养 10-20天后是可检测的，而结核分枝杆菌复合群的种类需要10-100个活生 物/ml样品和培养6-8周，以便获得100％阳性样品[Colebunders R，Bastian I. A review of the diagnosis and treatment of smear-negative pulmonary  tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis.2000；4：97-107]。根据人类结核病例的数 字重要性和严重性，在结核的诊断中，确实在实验室技术上已经取得特别 显著单独改善。实际上，结核是由结核分枝杆菌复合群7个种之一在人类 和动物中引起的感染性疾病：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(和由其衍生的BCG)、非洲分枝杆菌 (Mycobacterium africanum)、Mycobacterium canettii、山羊分枝杆菌 (Mycobacterium caprae)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)以及海豹分 枝杆菌(Mycobacterium pinnipedii)[Dye C.et al.Prospects for worldwide  tuberculosis control under the WHO DOTS strategy.Lancet 1998； 352：1886-91]。世界健康组织(WHO)估计，在2006年，结核是造成9.2百万 新病例和1.6百万死亡的原因[World Health Organization.2008.Global  tuberculosis control：surveillance，planning，financing.WHO report.Geneva： World Health Organization.WHO/HTM/TB/2008.393]。这些数字强调了优化 结核的微生物诊断以便改善患者和其家人朋友的医药管理的重要性。

结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的分离和培养，从表现出表示结核的 病征和症状的患者获得的临床样品开始。最常见的临床形式也是传染性的 唯一临床形式，是肺结核，其通过从呼吸样品分离和培养结核分枝杆菌复 合群的分枝杆菌来诊断，所述呼吸样品如痰、支气管抽吸物、支气管镜检 获得的支气管肺泡灌洗液或肺部活检。在不产生痰的患者中，在肺结核的 情况下，胃抽吸液可以用作分离和培养结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的 可选方案。还存在结核的其他临床形式，特别是淋巴结核和骨结核(卜德氏 病(Pott′s disease))以及消化道结核。取决于临床形式，可将不同的临床样品 送往实验室，供分离和培养结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌并诊断肺部外 形式。

固体培养基、液体培养基以及具有固相和液相的两相培养基可用于分 离和培养结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌。固体培养基基于琼脂制造。通 常使用含有全卵的培养基，并且最常用的培养基是罗氏培养基 (Lowenstein-Jensen medium)。该培养基和其他含有卵的培养一样，含有有助 于抑制污染性微生物生长的孔雀绿。已经提出了几种含有不同浓度的孔雀 绿的制剂，恒定的结果是，孔雀绿浓度的降低增加培养基污染的比例，且 孔雀绿浓度的增加倾向于降低结核组分枝杆菌的分离和培养。另一类固体 培养基包括琼脂培养基特别是Middlebrook 7H10培养基和培养基7H11(培 养基7H10加0.1％水解的酪蛋白)。Middlebrook培养基含有促进鸟分枝杆菌 复合群的分枝杆菌的培养的2％甘油。液体培养基基本上与Middlebrook 7H9 培养基一致。

然而，结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的分离非常缓慢，因为各种结 核分枝杆菌复合群种类的所有菌株在6-8周的时间内分离。因此，该时间的 任何减少都代表了结核和其他分枝杆菌感染的实验室诊断的显著改善。

在多次努力后，本发明开发了培养基的新配方，从而允许更快速地分 离结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌和分枝杆菌，特别是允许从临床样品开 始，在不到15天内，甚至在10天内检测和鉴定。本发明的培养基配方允 许在适合装置或自动检测的液体培养基中和在手工检测的固体培养基中分 离分枝杆菌，另外，在可能包含呈现抑制分枝杆菌生长风险的共生菌群细 菌的临床样品的情况下，其与用氯己定净化相容。

更准确而言，本发明提供了分枝杆菌培养基，包含分枝杆菌生长因子 和优选地无抗分枝杆菌活性的抗生素，其特征在于，其包含下列附加成分：

-卵磷脂，和

-去纤维蛋白血液，和

-去补体胎牛血清。

因此，本发明发现，组合添加去纤维蛋白血液、卵磷脂以及去补体胎 牛血清满足了本发明的目的，特别是在由液体培养液直接培养和鉴定的情 况下。

胎牛血清是经常用于细胞培养和细胞内微生物分离但不是用于分离细 胞外细菌的组分的试剂。

以已知的方式，通过加热、特别是在56℃加热1小时，使胎牛血清去 补体，即从胎牛血清中去除所有称为“血清补体”的蛋白。已知该血清补体具 有抗菌活性。

应当理解，本发明的分枝杆菌培养基由已知用于培养分枝杆菌的基础 培养基构成，特别是，包含矿物盐、糖、氨基酸、蛋白以及维生素的基础 培养基，所述基础培养基补充有上文提到的所述附加成分。

根据实施本发明的优选特征：

-所含的卵磷脂的重量比为0.1-5％，优选0.5-1％，

-卵磷脂是蛋黄卵磷脂，

-所含的去补体胎牛血清的体积比为2.5-25％，优选10-20％，

-所含血液的体积比为2.5-15％，优选5-10％，

-血液是去纤维蛋白的兔血液，或优选去纤维蛋白的绵羊血液。

更具体而言，本发明的分枝杆菌培养基包含分枝杆菌基础培养基，除 了蒸馏水以外，所述基础培养基还包含下列成分：硫酸铵、硫酸镁、硫酸 铜、硫酸锌、枸橼酸钠、枸橼酸铁铵、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷 酸氢二钠、L-谷氨酸、生物素以及吡哆醇。特别是，这些成分是称为 Middlebrook培养基的分枝杆菌培养基所含的成分。

在实践中，这种培养基最初采用上文所列成分的冻干物形式，用于在 蒸馏水中稀释，以便形成本发明的培养基。

更具体而言，所述无抗分枝杆菌活性的抗生素是多粘菌素、萘啶酮酸、 甲氧苄啶、阿洛西林和万古霉素，且培养基含包含抗真菌剂，优选两性霉 素B。

上文提到的抗生素和抗真菌剂的组合，例外是万古霉素，构成了本领 域技术人员已知的称为PANTA的组合。

根据本发明的第一实施方案，所述培养基是液体培养基。

更具体而言，本发明的分枝杆菌培养基包含：基础培养基，其是参照 号为7H9的Middlebrook液体培养基；和分枝杆菌的下列附加生长因子： 酪蛋白水解产物、甘油、聚山梨醇酯、氯高铁血红素、乳酸、生物素、聚 氧乙烯硬脂酸酯、牛血清白蛋白、葡萄糖和优选补充物H(supplement H)。 补充物H是高度精炼的酪蛋白消化物。

根据本发明培养基的第二实施方案，所述培养基是含有优选选自糖的 胶凝剂的固体培养基，所述胶凝剂的重量比为0.5-5％，更优选1-2％。

更具体而言，所述培养基是参照号为7H10的Middlebrook类型的含水 固体培养基，添加有所述胶凝剂和分枝杆菌的下列附加生长因子：油酸、 牛白蛋白优选牛白蛋白的级份V、葡萄糖、过氧化氢酶以及甘油。包含于 培养基7H10的孔雀绿是除了分枝杆菌以外的细菌的生长抑制剂。上文提到 的分枝杆菌的附加生长因子，除了甘油，由名称OADC因子而知名。

本发明还提供了通过本发明的分枝杆菌培养基培养分枝杆菌的方法， 其特征在于，在适于培养包含于样品中的分枝杆菌种类的30-37℃温度下， 在上述分枝杆菌培养基中，孵育含有上述分枝杆菌的样品。

大多数分枝杆菌培养于37℃下。然而某些分枝杆菌，如海分枝杆菌 (Mycobacterium marinum)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)、溃 疡分枝杆菌，培养于28℃-30℃的温度下。楚尔盖分枝杆菌(Mycobacterium  szulgai)可以培养于25℃-37℃之间，Mycobacterium conspicuum培养于 22℃-31℃之间。蟾蜍分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)和石氏分枝杆菌 (Mycobacterium shimoidei)的最佳生长温度为45℃。细菌日内瓦分枝杆菌 (Mycobacterium genavense)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、偶发 分枝杆菌，鸟分枝杆菌复合群的细菌，即鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、 胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、嵌合分枝杆菌(Mycobacterium  chimaera)以及Mycobacterium colombiense都培养于37℃。

更具体而言，在本发明的分枝杆菌培养方法中，将含有结核分枝杆菌 复合群的细菌的样品在37℃的温度下培养于上述分枝杆菌培养基中。

本发明的分枝杆菌培养方法还涉及结核分枝杆菌复合群以外的分枝杆 菌，如上文所提到的那些分枝杆菌，特别是海分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合 群的种类、嗜血分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、脓肿分枝杆菌复合群的种类、 日内瓦分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌以及偶发分枝杆菌。

在此，“结核分枝杆菌复合群的细菌”表示结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和 其克隆或BCG亚种、非洲分枝杆菌、Mycobacterium canettii、山羊分枝杆 菌、田鼠分枝杆菌以及海豹分枝杆菌种类的细菌。

有利的是，在本发明的分枝杆菌培养方法中，进行下列4个阶段：

-培养可能含有分枝杆菌的生物学样品，直到细菌的生长是可检测的， 和

-通过染色试验，优选Ziehl-Neelsen或Kinyoun染色试验，鉴定所检 测的细菌是分枝杆菌属的细菌，和

-如有需要，通过分子分析，优选通过质谱分析法分析细菌蛋白的分子 量，鉴定所述分枝杆菌属的种类。

Kinyoun染色包括双染色，连续用碱性sushine(basic fushine)处理和用 亚甲蓝处理。当在蓝色细胞背景下有红色细菌染色时，染色是阳性的。

所下文所解释的，分子分析方法是分析细菌蛋白的方法，特别是通过 利用质谱分析法测定它们的分子量。然而，可选地，可能的是，借助于用 对不同分枝杆菌种类具有特异性的探针/或扩增引物的基因组(DNA或RNA) 分子鉴定的经典方法，特别是申请WO 2008/050064中所述。特别是，为了 检测结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌，借助于称为多间隔序列分型 (multispacer sequence typing，在本文中缩写为MST)的系统是可能的，所述 系统由一系列结核分枝杆菌复合群细菌基因组非编码基因间区(noncoding  intergenic zone)的核酸的片段构成，所述片段构成了这样的基因标记，其允 许通过分析称为MST的所述区的片段的序列鉴定结核分枝杆菌复合群的不 同种类并对结核分枝杆菌复合群的一相同(one and the same)种类的分离物、 特别是结核分枝杆菌的分离物进行基因分型。

有利的是，在不到15天内，优选在不多于10天内，检测结核分枝杆 菌复合群的细菌生长因子。

此外，本发明的培养基允许在不到1周内检测50％的所有各种主要的 分枝杆菌种类，即海分枝杆菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群细菌， 即细菌结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、Mycobacterium canettii、 山羊分枝杆菌、海豹分枝杆菌以及田鼠分枝杆菌。

在包括培养可能含有分枝杆菌和污染性细菌的生物学样品的优选实施 方案中，所述污染性细菌的生长抑制分枝杆菌的生长，所述方法的特征在 于：

1/用氯己定对所述培养基中的所述样品进行有限时期的初步阶段的初 始净化，以便将氯己定的作用限制在针对除了分枝杆菌以外的其他细菌的 活性，优选在1％氯己定溶液中处理约15分钟，同时搅拌，和

2/通过以下方法除去氯己定：用中性缓冲液洗涤由阶段1/因此处理的 样品，随后离心并回收含有因此失活的污染性细菌和没有失活的分枝杆菌 的细胞团，将所述细胞团接种于上述分枝杆菌培养基中。

以前，将作为净化剂的氯己定的用途限于在固体培养基中净化样品， 因为氯己定导致液体培养基沉淀。此外，已知氯己定大体上对分枝杆菌是 有毒性的。然而，本发明发现，培养基中卵磷脂的存在一方面使得避免或 延迟液体培养基沉淀是可能的，另一方面，通过应用所述洗涤阶段2/，氯 己定的时间限制作用使得抑制随后的氯己定抗分枝杆菌的活性是可能的。 然而，氯己定保存其抗共生菌群的细菌的主要活性，所述抗共生菌群的细 菌在上文中称为污染性细菌，其生长可抑制分枝杆菌的生长。

特别是，对于已知是共生菌群的携带者的生物学样品，如来自痰、皮 肤活检、大便样品的样品，它们代表了可用于分枝杆菌分析的95％的生物 学样品，应用该初步净化阶段。然而，对于诸如从血培养物或淋巴结活检 或肺活检或骨活检获得的样品的生物学样品，并不需要该净化。

因此，当所述分枝杆菌培养基是分枝杆菌的液体培养基时，上文的方 法特别有利。

当所述生物学样品是大便样品时，上文的方法也特别有利。

在一实施方案中，所述培养基是上述分枝杆菌的液体培养基，并通过 定期分析培养容器中氧浓度检测所述分枝杆菌的生长。

优选地，最多每3小时，测量氧浓度，直到到达氧浓度的阈值，优选 与对应于至少10⁴个细菌/ml的细菌生长一致。

通过测量氧浓度检测细菌的这一方法是已知的，并且自动检测的装置 可商购获得。取决于用于自动检测的装置，分枝杆菌的最小浓度不同并且 通常对应于10³-10⁴个分枝杆菌/ml的浓度，从所述最小浓度开始，检测到 显著的氧消耗和因此氧浓度的显著减低。

在另一实施方案中，所述培养基是固体培养基，且当可在所述固体培 养基上观察到细菌菌落形式时，用肉眼检测到所述分枝杆菌的生长。

通常，观察到细菌菌落的形成，对应于10⁶个细菌/ml的细菌浓度。

在本发明方法的优选实施方案中，通过分子分析鉴定分枝杆菌属细菌 的种类，所述分子分析包括分析通过质谱分析法所获得的蛋白特征谱，并 将其与用培养于相同培养条件下的不同种类的分枝杆菌的参照菌株的样品 所获得的一系列蛋白特征谱进行比较。

在此，“相同的培养条件”表示，对于分枝杆菌的一个相同种类，在相同 的培养温度下，使用相同的培养基。

本发明还提供了培养和鉴定生物学样品中分枝杆菌的方法，其特征在 于将所述上文样品培养于上述分枝杆菌液体培养基中，并为了进行质谱分 析，根据下列阶段，直接由培养液分析通过双离心所获得的细菌团：

a-通过在90℃以上，优选在95℃，加热1小时，优选同时搅拌，灭 活培养的生物学样品悬浮液中的分枝杆菌，其中已经检测了所述样品中的 细菌的生长，和

b-以低速、优选500rev/min，对所述的培养的生物学样品的上清液进 行第一次离心，其中已经检测了所述样品中的细菌的生长，进行所述第一 次离心，直到所述样品中所含的血液中的红细胞发生沉淀，和

c-由阶段a-的第一次离心回收上清液，并以高速、优选至少10,000 rev/min、优选约14,000rev/min，进行第二次离心，进行该第二次离心，以 便获得细菌团的沉淀，和

d-优选地，用中性缓冲液，如PBS，洗涤来自阶段b-的所述细菌团， 并进行化学处理，优选地用乙腈和三氟乙酸的混合物，以便从细菌中分离 蛋白，从而使得它们可以通过质谱分析法分析，以及

e-回收来自阶段d-的细菌蛋白团，并将其存放在质谱分析板上。

阶段a-的灭活方法经证明，与阶段e-中获得质量良好的质谱相容。

通过质谱分析法直接从液体培养基的样品鉴定的这一方法由于其快速 性而特别有利，因为在现有技术中，质谱分析法仅用于分析直接从固体培 养基采集的细菌菌株。因此，如果是培养于液体培养基的临床样品，在通 过质谱分析法鉴定之前，再接种细菌并随后将其培养于固体培养基上，取 决于分枝杆菌的类型，这另外花费3-8周的时间，特别是对于结核分枝杆菌 复合群的细菌而言，在所述固体培养基上培养6-8周。

根据本发明，可以直接由获得自液体培养基的细菌团进行质谱分析。

总之，考虑到上文的加热阶段和离心阶段a-至e-的时间，通过培养， 在检测所述细菌的生长后约1.5h，通过质谱分析法获得蛋白分析谱是可能 的，所述蛋白分析谱，如上述，在结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的情况 下，可以在不多于15天甚至10天内获得。

本发明还涉及快速确定分枝杆菌特别是结核分枝杆菌对抗生素的敏感 性的表型的方法。

结核的治疗基于组合了5种抗生素的综合化学疗法，所述5种抗生素 为利福平、异烟肼、乙胺丁醇以及吡嗪酰胺，它们与链霉素一起称为一线 抗结核药物。在全世界，已经出现了抗利福平和抗异烟肼的称为“多药物抗 性的”的结核杆菌菌株(MDR-TB)，和抗性广泛的菌株(XDR-TB)，所述抗性 广泛的菌株(XDR-TB)是还对二线抗结核药物(氟喹诺酮、氨基糖苷、卷曲霉 素)有抗性的MDR-TB菌株[Gagneux S.Clin Infect Dis.2009；15：S1：66-68]。 在法国，它们的流行程度据估计为15％。术语“原发性抗性”指分离自从未 接受抗结核治疗的患者的抗性菌株，术语“继发性抗性”指，分离自在分离菌 株之前已经由抗结核治疗获利的患者的抗性菌株[Schluger NW，Up-to-date  2009]。

结核分枝杆菌复合群的抗性菌株造成了治疗难题，因为它们需要给予 二线抗结核药物，所述二线抗结核药物具有以下缺陷：

(1)它们不及第一线抗结核抗生素有效，

(2)与第一线抗结核抗生素相反，它们必须以胃肠外的方式给予，

(3)它们比第一线抗结核抗生素更具毒性。

因为结核的预后与有效抗生素的给药有关，因此绝对需要以可能最短 的延迟确定菌株对抗结核药物的敏感性(抗菌谱)。检测靶基因中突变存在的 基因分型方法，基于并非广泛可用的技术和专门技能[Woods GL，Warren NG， Inderlind CB.Susceptibility test methods：Mycobacteria，Nocardia，and other  actinomycetes in：Annual of Clinical Microbiology，9th edition(Nurray PR， Baren EJ，Jorgensen JH，Bry NL，Psaller MA.American Society for  Microbiology，2007，page 1223-1247]。对于除了利福平以外的抗生素，靶基 因的突变和抗性表型之间的统计关联非常低。这是为何对表型试验有这类 兴趣的原因。在液体培养基中，后者可以是自动化的；但是，该技术仅允 许每种菌株试验一种或两种浓度的抗生素，并且对结核分枝杆菌的抗性和 污染性菌株间的混乱耐受[Anthony RM et al.Int J Tuberc Lung Dis.2009； 13：1051-1053]。因此，优选在固体培养基中进行该试验，从而允许区分污 染性菌落。这些试验基于，在存在已知浓度的抗生素的情况下，相对于无 抗生素而生长的对照，结核分枝杆菌生长抑制的观察。目前，在固体培养 基中表型试验的限制是，获得结果和操作大量结核分枝杆菌(3级致病菌)延 迟3-4周，这对应于每种所试验的抗生素的浓度一种培养基。

本发明的固体培养基使得在存在抗生素的情况下减少结核分枝杆菌菌 落的生长时间成为可能，并且因此快速获得抗菌谱结果。此外，本发明发 现，有利地使用进行结核分枝杆菌抗菌谱的E试验(E-test)方法是可能的。E 试验(AB Biodisk，Solna，Sweden；BioMérieux，Marcy-l’Etoile，France)由浸入 了所研究的浓度梯度的抗生素的试纸条构成，从而直接给出抑制细菌生长 的浓度读数(Minimum Inhibitory Concentration，MIC，最小抑制浓度)。对于 在不同于本发明的培养基的参照培养基上的结核分枝杆菌，E试验是有效的 [Esteban J.et al.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005；24：856-857]，并且所述 本发明固体培养基的特征不允许预测它是否适合进行E试验。

本发明已经证明，本发明的固体培养基还允许比标准培养基更快速地 进行和更容易地读取结核分枝杆菌复合群抗生素敏感性和抗性的表型试 验。

因此，如实施例所述，本发明提供了用于分离结核分枝杆菌复合群和 使其快速生长的培养基，供用于快速进行结核分枝杆菌复合群对抗结核抗 生素敏感性的表型试验。

更准确地说，本发明提供了允许快速确定分枝杆菌对抗生素敏感性的 表型的培养方法，根据所述方法，进行下述阶段：

i/-在不同的已知浓度的至少一种给定的抗生素存在的情况下，在所述 培养基上，培养上述分枝杆菌，优选结核分枝杆菌复合群，和

ii/-测定抑制所述分枝杆菌所有可见生长的抗生素的最小浓度(MIC：最 小抑制浓度)，所述抗生素选自：利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和 链霉素。

因此，如所述知的，对于每个分枝杆菌-抗生素对，可以测定最小抑制 浓度或MIC，并将其与患者可以无风险地接受且阻断所讨论的细菌菌株生 长的抗生素的临界浓度进行比较。随后按如下确定细菌对抗生素的敏感性 或抗性。

-如果MIC低于较低的临界浓度，则细菌对抗生素敏感，和

-如果MIC高于上部的临界浓度，则细菌对所讨论的抗生素有抗性。

在本发明优选的实施方案中，在阶段i/-，将至少一试纸条放置在所述 固体培养基上，其中沿着所述试纸条按浓度梯度浸有不同浓度的所述抗生 素。

具体而言，以至少10⁴个菌落/ml、优选10⁶个菌落/ml的浓度，接种包 含本发明固体培养基的皮氏培养皿，然后将上述的试纸条置于所述培养基 上，特别是，从头到尾包含连续梯度的浓度渐增的抗生素E试验类型的试 纸条，将所述抗生素的浓度直接写在试纸条上，并且孵育上面具有试纸条 的皮氏培养皿，在细菌生长抑制盘(disk)与试纸条的交叉点读取MIC。

根据其他已知的应用方法，可以用浸入了临界浓度的抗生素的印迹纸 盘取代试纸条，以便证实盘周围抑制圈的存在，从而确定菌株对抗生素是 敏感的。

根据另一已知的应用变型，可以将抗生素以所述临界浓度直接并入大 部分所述固体培养基中，且可以将菌株在浸入了所述抗生素的固体培养基 中的生长与一相同(one and the same)菌株在一不含有抗生素的相同固体培 养基中的生长进行比较，以证实在抗生素存在或不存在的情况下，所述培 养基中细菌生长的存在或缺少，并且，如果在含有所述抗生素的固体培养 基中观察到菌株生长较少，则推论该菌株对抗生素是敏感的。

通过阅读下文给出的实施例，参考图1-7，本发明的其他特征和优势会 变得更明显，其中：

图1-4表示，对于参照培养基(图1)和本发明的培养基而言(图2-4)，如 由1-10所示，代表检测结核分枝杆菌10株菌株的细菌数量的累积时间T(以 小时表示)的图；

图5表示根据实施例2培养于固体培养基中的2个分枝杆菌菌落的照 片；

图6表示在实施例中培养于固体培养基中的菌落的Ziehl-Neelsen染色 的照片；

图7A和7B在实施例5中通过质谱分析法所获得的谱；

图8A和8B表示在参照固体培养基(图8A)和与浸入了抗生素的印迹试 纸条接触的本发明的固体培养基(图8B)上细菌生长的照片。

实施例1：结核组分枝杆菌在液体培养基中的培养

在本实施例中，本发明人在具有补充物F和PANTA的Middlebrook 7H9 参照培养基(Becton-Dickinson，Grenoble，France)和自己发明的三种培养基 之一中，并行接种结核分枝杆菌的菌株，对于40ml的瓶而言，所述三种培 养基之一的组成在下文给出，试验以所述40ml的体积进行：

实施例1A：培养基B25％的最终组成(对于1000ml而言)

1-Middlebrook 7H9培养基

无菌蒸馏水：750ml

硫酸铵：1g

L-谷氨酸：0.5g

枸橼酸钠：0.1g

吡哆醇：1mg

生物素：0.5mg

磷酸氢二钠：2.5g

磷酸二氢钾：1g

枸橼酸铁铵：0.1g

硫酸镁：0.05g

氯化钙：0.5mg

硫酸锌：1mg

硫酸铜：1mg

酪蛋白水解产物：1g

补充物H：3g

甘油：1g

聚山梨醇酯80：0.05g

氯高铁血红素：0.005g

2-附加生长因子

乳酸：168mg

聚氧乙烯硬脂酸酯：110mg

牛血清白蛋白：5.6g

葡萄糖：1100mg

生物素：0.57mg

3-无抗分枝杆菌和抗真菌活性的抗生素：

多粘菌素：40 000个单位

萘啶酮酸：16mg

甲氧苄啶：4mg

阿洛西林：4mg

万古霉素：20mg

两性霉素B：4mg

4-本发明的其他成分：

去补体胎牛血清：250ml

去纤维蛋白的绵羊血液：50ml

卵磷脂：0.5g

实施例1B：培养基C15％的最终组成(对于1000ml而言)

1-Middlebrook 7H9 medium

无菌蒸馏水：750ml

硫酸铵：1g

L-谷氨酸：0.5g

枸橼酸钠：0.1g

吡哆醇：1mg

生物素：0.5mg

磷酸氢二钠：2.5g

磷酸二氢钾：1g

枸橼酸铁铵：0.1g

硫酸镁：0.05g

氯化钙：0.5mg

硫酸锌：1mg

硫酸铜：1mg

酪蛋白水解产物：1g

补充物H：3g

甘油：1g

聚山梨醇酯80：0.05g

氯高铁血红素：0.005g

2-附加生长因子：

乳酸：168mg

聚氧乙烯硬脂酸酯：110mg

牛血清白蛋白：5.6g

葡萄糖：1100mg

生物素：0.57mg

3-无抗分枝杆菌和抗真菌活性的抗生素

多粘菌素：40 000个单位

萘啶酮酸：16mg

甲氧苄啶：4mg

阿洛西林：4mg

万古霉素：20mg

两性霉素B：4mg

4-本发明的附加成分：

去补体胎牛血清：150ml

去纤维蛋白的绵羊血液：50ml

卵磷脂：0.5g

实施例1C：培养基D5％的最终组成(对于1000m而言)

1-Middlebrook 7H9培养基：

无菌蒸馏水：750ml

硫酸铵：1g

L-谷氨酸：0.5g

枸橼酸钠：0.1g

吡哆醇：1mg

生物素：0.5mg

磷酸氢二钠：2.5g

磷酸二氢钾：1g

枸橼酸铁铵：0.1g

硫酸镁：0.05g

氯化钙：0.5mg

硫酸锌：1mg

硫酸铜：1mg

酪蛋白水解产物：1g

补充物H：3g

甘油：1g

聚山梨醇酯80：0.05g

氯高铁血红素：0.005g

2-其他生长因子：

乳酸：168mg

聚氧乙烯硬脂酸酯：110mg

牛血清白蛋白：5.6g

葡萄糖：1100mg

生物素：0.57mg

3-无抗分枝杆菌和抗真菌活性的抗生素：

多粘菌素：40 000个单位

萘啶酮酸：16mg

甲氧苄啶：4mg

阿洛西林：4mg

万古霉素：20mg

两性霉素B：4mg

4-本发明的附加组分：

去补体胎牛血清：50ml

去纤维蛋白的绵羊血液：50ml

卵磷脂：0.5g

在本实施例中，将10株结核分枝杆菌临床菌株并行接种于对照培养基 A0％和三种称为B25％、C15％以及D5％的本发明的培养基中。这10株菌 株包含6株对抗结核抗生素敏感的菌株、抗链霉素和抗异烟肼的结核分枝 杆菌菌株No.9、抗链霉素和抗利福平的结核分枝杆菌菌株No.10和抗链霉 素、抗利福平、抗乙胺丁醇以及抗异烟肼的2株结核分枝杆菌菌株No.11 和No.12(所谓的多药物抗性MDR菌株)。对于一相同(one and the same)菌 株，将相同的接种体并行接种于这4种培养基中。在孵育于37℃的恒定温 度下的BACTEC 9000MB自动培养箱(Becton-Dickinson，Grenoble，France) 中的玻璃瓶中，制备液体培养基。以相同的菌株，将实验重复3次。自动 培养箱检测瓶中氧消耗即细菌生长标志的存在，并表示所述检测和将瓶置 于自动培养箱中之间的时间。该时间是本实施例所用的标准。因此本实施 例中的评估标准是待通过BACTEC 9000MB自动培养箱检测的所鉴定的分 枝杆菌生长所花费的时间。

在本实施例中，对来自瓶中的上清液进行革兰氏染色(以证实缺少污染 性细菌)，对来自瓶中的上清液的进行Kinyoun染色(以证实存在醇酸抗性细 菌，这是分枝杆菌的特征)，随后通过实时PCR扩增对结核分枝杆菌复合群 的细菌有特异性的插入序列IS6110，之后，证实通过自动培养箱检测分枝 杆菌的特异性。

根据以下方案，进行Kinyoun染色：在制备细胞涂片载玻片(cytospin  slide)后，将载玻片浸入甲醇中10min，然后将其浸入Kinyoun溶液(碱性 Fushine 40g、苯酚80ml、乙醇200ml、水，终体积1升)，3小时。在用水 漂洗后，将载玻片用Gabett溶液(亚甲蓝10g、硫磺酸60°B 200ml、无水 乙醇300ml以及水，终体积500ml)覆盖5分钟，用水漂洗，干燥、并用光 学显微镜在X1000放大倍率下读数。当在蓝色细胞背景中存在红色细菌染 色时，染色是阳性的。

对结核分枝杆菌复合群的细菌具特异性的插入序列IS6110描述于[van  Embden JD et al.Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA  Fingerprinting：recommendation for a standardized methodology.J.Clin. Microbiol.1993；31：406-409]中。

本发明人还观察到，添加5％、15％或25％的去纤维蛋白的绵羊血液不 诱导自动培养箱所检测的O₂消耗，因此无假阳性；该实验进行3次。

本发明人因此试验了从公共收集物(public collection)获得的分枝杆菌属 几个种类的标准菌株，以及来自自己实验室诊断活性的一些临床菌株，包 括海分枝杆菌菌株。

标准菌株是：结核分枝杆菌H37RV、牛分枝杆菌CIP 105050、牛分枝 杆菌BCG牛痘CIP 105060、非洲分枝杆菌CIP 105147^T、海豹分枝杆菌CIP  7177、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium ssparatuberculosis)ATCC 19698^T。

与Middlebrook 7H9培养基相比，在用本发明的培养基培养的情况下， 检测时间总是减少，特别是对于非洲分枝杆菌，时间从375小时减少到55 小时，对于海豹分枝杆菌，时间从336小时减少到29小时，并且对于牛分 枝杆菌，时间从450小时减少到35小时。

对于结核分枝杆菌种类，本发明人小心试验了对抗结核药物敏感的临 床菌株和对某些抗结核药物敏感的临床菌株。

这些试验的结果显示于图1-4的图表中，其在纵坐标上表示结核分枝杆 菌复合群不同种类菌株的数量，在横坐标上表示，相对于参照培养基A0％ (图1)，对于本发明3种培养基中的每一种(培养基B25％(图2)、C15％(图 3)以及D5％(图4))，检测纵坐标上所示的高达10株不同的结核分枝杆菌复 合群种类的菌株的数量的、以小时表示的累积时间。

这些图表表示：

1/-本发明的培养基用于培养结核分枝杆菌的优越性，因为相对于参照 培养基，在本发明的培养基中，观察细菌生长检测的培养时间较少，

2/-事实是，本发明的培养基允许独立于结核分枝杆菌菌株的抗结核抗 生素抗性的特征培养所述菌株。

在不到15天或甚至不到10天内，检测细菌生长总是可能的。

而且，用本发明的培养基，允许检测50％所接种的菌株的中值时间小 于或等于一周。

实施例2：分枝杆菌在固体培养基中的培养

在本实施例中，本发明人用3株结核分枝杆菌的临床菌株并行接种不 同的含有琼脂的固体培养基。所述培养基是(1)Middlebrook 7H10，加琼脂 0.5％，(2)Middlebrook 7H10，加琼脂1％、加5％去纤维蛋白的绵羊血液、 加5％胎牛血清、加0.5％卵卵磷脂，(3)Middlebrook 7H10，加琼脂0.5％、 加5％去纤维蛋白的绵羊血液、加15％胎牛血清、加0.5％卵卵磷脂，(4) Middlebrook 7H10，加琼脂0.5％、加5％去纤维蛋白的绵羊血液、加25％胎 牛血清、加0.5％卵卵磷脂。系统地并行使用两种对照琼脂，即琼脂 Middlebrook 7H10加琼脂1％和琼脂Middlebrook 7H10加琼脂1％、加5％ 去纤维蛋白的绵羊血液、加5％胎牛血清、加0.5％卵卵磷脂。于37℃在含 有5％CO₂的空气中、在防止脱水的塑料袋中，孵育对照琼脂(没有接种)和 接种的琼脂。每天检查琼脂。

本实施例所用的评估标准是出现菌落的时间，所述菌落是肉眼检查琼 脂所检测的，并通过Ziehl-Neelsen染色和测序证实为结核分枝杆菌菌落。

所用的固体培养基具有下列组成：

为了明确证实菌落的出现，本发明人对所述菌落进行照相。然后，本 发明人对来自所述菌落的样品，以及离开所述菌落，对来自物菌落的相同 琼脂的一区域的样品进行Kinyoun染色。在所有的情况下，离开所述菌落， 都检测不到醇酸抗性细菌，而在菌落中检测到所述细菌。

菌落的实例如图6所示。

图5.表示用结核分枝杆菌的临床菌株10天前接种的含有琼脂的培养 基C15％，显示2个菌落(圆)。

图6.表示，对在10天内从固体培养基C15％中的结核分枝杆菌的临床 菌株获得的菌落进行的Ziehl-Neelsen染色。

实施例2A：1000ml的固体培养基B25％：

1-Middlebrook 7H10培养基：

无菌蒸馏水：750ml

硫酸铵：0.50g

磷酸二氢钾：1.50mg

磷酸氢二钠：1.50g

枸橼酸钠：0.4g

硫酸镁：0.025g

氯化钙：0.00050g

硫酸锌：0.0010g

硫酸铜：0.0010g

L-谷氨酸：0.50g

枸橼酸铁铵：0.04g

吡哆醇盐酸盐：0.0010g

生物素：0.000050g

孔雀绿：0.0000250g

琼脂：15g

2-附加生长因子

氯化钠：8.50g

牛白蛋白(级份V)：50g

葡萄糖：20g

过氧化氢酶：0.030g

油酸：0.60ml

甘油：0.5％

3-无抗分枝杆菌和抗真菌活性的抗生素：

多粘菌素：40 000个单位

两性霉素B：4mg

萘啶酮酸：16mg

甲氧苄啶：4mg

阿洛西林：4mg

万古霉素：20mg

4-本发明的附加成分：

去补体胎牛血清：250ml

去纤维蛋白的绵羊血液：50ml

卵磷脂：0.50g

实施例2B：1000ml的固体培养基C15％：

1-Middlebrook 7H10培养基：

无菌蒸馏水：750ml

硫酸铵：0.50g

磷酸二氢钾：1.50mg

磷酸氢二钠：1.50g

枸橼酸钠：0.4g

硫酸镁：0.025g

氯化钙：0.00050g

硫酸锌：0.0010g

硫酸铜：0.0010g

L-谷氨酸：0.50g

枸橼酸铁铵：0.04g

吡哆醇盐酸盐：0.0010g

生物素：0.000050g

孔雀绿：0.0000250g

琼脂：15g

2-附加生长因子：

氯化钠：8.50g

牛白蛋白(级份V)：50g

葡萄糖：20g

过氧化氢酶：0.030g

油酸：0.60ml

甘油：0.5％

3-无抗分枝杆菌和抗真菌活性的抗生素：

多粘菌素：40.000个单位

两性霉素B：4mg

萘啶酮酸：16mg

甲氧苄啶：4mg

阿洛西林：4mg

万古霉素：20mg

4-本发明的附加成分：

去补体胎牛血清：150ml

去纤维蛋白的绵羊血液：50ml

卵磷脂：0.50g

实施例2C：1000ml的固体培养基D5％：

1-Middlebrook 7H10培养基：

无菌蒸馏水：750ml

硫酸铵：0.50g

磷酸二氢钾：1.50mg

磷酸氢二钠：1.50g

枸橼酸钠：0.4g

硫酸镁：0.025g

氯化钙：0.00050g

硫酸锌：0.0010g

硫酸铜：0.0010g

L-谷氨酸：0.50g

枸橼酸铁铵：0.04g

吡哆醇盐酸盐：0.0010g

生物素：0.000050g

孔雀绿：0.0000250g

琼脂：15g

2-附加生长因子：

氯化钠：8.50g

牛白蛋白(级份V)：50g

葡萄糖：20g

过氧化氢酶：0.030g

油酸：0.60ml

甘油：0.5％

3-无抗分枝杆菌和抗真菌活性的抗生素：

多粘菌素：40.000个单位

两性霉素B：4mg

萘啶酮酸：16mg

甲氧苄啶：4mg

阿洛西林：4mg

万古霉素：20mg

4-本发明的附加成分：

去补体胎牛血清：50ml

去纤维蛋白的绵羊血液：50ml

卵磷脂：0.50g

实施例3：分枝杆菌的净化和液体培养基中的培养

必须从通常污染有共生菌群的临床样品中分离和培养分枝杆菌，例如 在为实验室内最常见的痰样品的情况下，或大便样品。几个净化方法已经 在文献中提出。它们基本上包括用氢氧化钠净化。用与二硫苏糖醇混合的 2％N-乙酰基-L-半胱氨酸预处理使得将氢氧化钠的终浓度减少为1％-2％成 为可能。本发明人的有关分离结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌、特别是从 大便样品中分离的经历是，该方案不能提供令人满意的净化，特别是对于 大便样品的净化。因此，本发明人试验了另一种基于使用氯己定的方案， 即用于从患有粘液粘稠病的患者的呼吸样品分离结核分枝杆菌复合群外的 分枝杆菌的净化[Ferroni A，Vu-Thien H，Lanotte P，Le Bourgeois M， Sermet-Gaudelus I，Fauroux B，Marchand S，Varaigne F，Berche P，Gaillard JL， Offredo C.Value of the chlorhexidine decontamination method for recovery of  nontuberculous mycobacteria from sputum samples of patients with cystic  fibrosis.J Clin Microbiol.2006；44：2237-9]。然而，该方法在接种含有卵的固 体培养基(罗氏培养基，例如Coletsos培养基)的过程中进行，但不用于液体 培养基。可是，本发明人发现，本发明的液体培养基与用于灭活抑制分枝 杆菌生长的污染性细菌的氯己定净化相容，而不抑制分枝杆菌的生长，如 下文所述。

从20％葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine digluconate，Sigma，Illkirch， France)开始，通过在无菌蒸馏水即时稀释，本发明人制备并使用1％的葡萄 糖酸氯己定。稀释的氯己定保存24小时。

净化方案如下：

-在50-ml Falcon管中制备5ml样品，

-添加3体积(即15ml)1％葡萄糖酸氯己定

-涡旋

-在搅拌器上于室温下搅拌15min

-添加30ml pH 6.8的磷酸盐缓冲液

-通过倒置摇动

-以3500rev/min离心20min

-轻轻倒出上清液

-将沉淀置于500μl pH 6.8的磷酸盐缓冲液中

-涡旋

-200-300μl该悬浮液/瓶的比率接种。

该方案成功地用于用作全分枝杆菌属的对照菌株的戈氏分枝杆菌 (Mycobacterium gordonae)的临床菌株。

实施例4：通过在液体培养基中培养临床样品分离分枝杆菌

在本实施例中，本发明人并行比较了自己发明的培养基与用于从在 Ziehl-Neelsen染色后表现出醇酸抗性细菌存在的临床样品中分离结核分枝 杆菌分枝杆菌的参照培养基。根据医药文献已知，醇酸抗性细菌的存在是 样品的接种体≥10⁴分枝杆菌/mL的证据[Hobby GL，Holman AP，Iseman MD， Jones JM.Enumeration of tubercle bacilli in sputum of patients with pulmonary  tuberculosis.Antimicrob Agents Chemother.1973；4：94-104]。

在本实施例中，本发明在下述培养基中并行接种了用氢氧化钠净化的 表现出表示分枝杆菌的醇酸抗性细菌的各种临床样品：Middlebrook 7H9培 养于，其添加有Becton-Dickinson销售的抗生素和两性霉素B(抗真菌剂) 与字母缩略PANTA的混合物，以及实施例1的培养液，其包含Middlebrook 培养基7H9-PANTA、加5％去纤维蛋白的绵羊血液、25％去补体胎牛血清加 0.5％卵卵磷脂。将所述培养基包含于并行孵育在37℃的BACTEC 9000MB 自动培养箱中的瓶中，同时如上述检测氧消耗。如上述，证实分枝杆菌的 存在并鉴定它们。

所用的评估标准是用于通过BACTEC 9000MB自动培养箱检测分枝杆 菌生长的时间。

通过在Middlebrook 7H9加血液中培养3.22天，对比Middlebrook 7H9 中培养5天，检测支气管抽吸样品；通过在Middlebrook 7H9加血液中培 养8天和在Middlebrook 7H9中培养13天，检测痰样品；通过在Middlebrook  7H9加血液中培养4.52天和在Middlebrook 7H9中培养7.34天，检测支气 管肺泡灌洗样品。本实施例说明了本发明的培养基分离分枝杆菌特别是分 离结核分枝杆菌复合群的分枝杆菌的优越性。

这构成了对用于诊断和预后的时间的重要的结果。

实施例5：通过质谱分析法直接从液体培养基鉴定分枝杆菌

由液体培养基中的培养物鉴定分枝杆菌目前基于Ziehl染色，随后根据 文献所公开的各种方法进行分子鉴定。这些方法的局限是它们数个小时 (4-24小时)的时间和花费。本发明人设想，利用通过质谱分析法进行的蛋白 特征谱分析鉴定细菌，用于根据本发明的培养基之一直接从培养瓶的上清 液快速鉴定结核分枝杆菌。实际上，通过质谱分析法分析蛋白特征谱目前 仅研发用于分离和培养于固体培养基中的分枝杆菌菌株，而未用于包含培 养于固体或液体培养基中的分枝杆菌的生物学样品的培养物[Hettick JM， Kashon ML，Simpson JP，Siegel PD，Mazurek GH，Weissman DN.Proteomic  profiling of intact mycobacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization  time-of-flight mass spectrometry.Anal Chem.2004；76：5769-76；Hettick JM， Kashon ML，Slaven JE，Ma Y，Simpson JP，Siegel PD，Mazurek GN，Weissman  DN.Discrimination of intact mycobacteria at the strain level：a combined  MALDI-TOF MS and biostatistical analysis.Proteomics.2006；6：6416-25； Pignone M，Greth KM，Cooper J，Emerson D，Tang J.Identification of  mycobacteria by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass  spectrometry.J Clin Microbiol.2006；44：1963-70]。使用质谱分析法直接在它 们的培养的生物学样品中快速鉴定结核分枝杆菌分枝杆菌遇到许多困难， 这些困难与一旦将样品收集于液体培养基的瓶中需要灭活分枝杆菌而不改 变它们的蛋白特征谱有关。例如使用在具有2.5％三氟乙酸(TFA)或具有1％ 戊二醛的培养基中灭活分枝杆菌的几个方案，未提供区别性的谱。最后， 本发明人利用下文详述的热灭活方案获得鉴定谱。

制备用于通过质谱分析法检测和鉴定本发明培养基中分枝杆菌培养基 的方案如下：

1-在安全水平为P3的实验室，从培养瓶中取5ml上清液置于5个无 菌管(1ml/管)中

2-于95℃加热1h

3-从P3实验室取出

4-以500rev/min的低速离心15min

5-从5个管中的每一个管中回收上清液，并置于新的无菌管中

6-以14000rev/min的高速，离心上清液10分钟

7-弃去上清液

8-用1ml PBS洗涤颗粒

9-以14000rev/min离心10分钟

10-弃去上清液

11-添加5μL 20％三氟乙酸(TFA)

12-添加5μl 100％乙腈

13-静置10min

14-涡旋

15-将1μl混合物存放于质谱分析板上

16-静置干燥

17-存放1μl基质溶液

18-静置干燥

19-对板进行质谱分析。

对于每个样品，本发明人在质谱仪平板上并行做了4次存放。存放物 用2μL基质溶液覆盖，即α-氰基-4-羟基肉桂酸在50％乙腈中的饱和溶液 和2.5％三氟乙酸的饱和溶液。使基质溶液在室温下结晶5分钟。利用装备 有337nm波长的氮激光Autoflex II分光计(Bruker Daltonik)，进行质谱分 析。以线性模式记录谱型(时间170ns、离子源1(IS1)电压20kV；离子源2 (IS2)电压18.5kV；镜头电压7kV；分子量介于2-20kDa)。自动模式下以 可变的激光电源和30-60秒/存放物的收集时间675次放电(firing)后，获得 每个谱型。自动数据采集由AutoXecute收集对照软件提供。对于每个样品， 将4个获得的谱型输入BioTyper版本2.0软件(Bruker Daltonik GmbH)，并 利用缺省参数进行分析。将谱型与本发明人制备的分枝杆菌的本地谱型库 进行比较。选择代表在文献中和以本发明人的经历主要在人类病理学中发 现的组/种类的分枝杆菌的种类，即鸟分枝杆菌鸟亚种(Mycobacterium avium  ss avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobaterium avium ss paratuberculosis) 作为缓慢升值的分枝杆菌，和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmalis)作为 快速生长的分枝杆菌。所述分析方法包括介于3-15kDa之间的m/z比。

图7A-7D表示在质谱分析法中由本发明的液体培养基的培养物获得的 不同分枝杆菌菌株的谱型。

图7A和7B表示通过质谱分析法由培养于本发明的液体培养基B25％ 中的10株结核分枝杆菌临床菌株获得的蛋白特征谱。图7C表示从相同的 未接种的液体培养基B25％获得的阴性对照谱型，并用于比较。图7D从相 同的本发明液体培养基B25％获得的谱型，所述培养基接种有：鸟分枝杆菌 鸟亚种(11)、鸟分枝杆菌副结核亚种(12)以及耻垢分枝杆菌(13)。

对于相同结核分枝杆菌种类的不同的上述的菌株的图7A和7B的谱型， 表现出菌株间很大的可再现性，而且不同于图7D的其他分枝杆菌菌株的谱 型，另一方面，不同于图7C中的对照。

比较图7A-7D中的谱型，就会观察到，对于结核分枝杆菌而言，特异 性地获得对应于具有下列分子量的4种蛋白的峰(单位：道尔顿)：8548±1、 6228±1、6025±1、5415±1。

制备用于通过质谱分析法检测和鉴定本发明固体培养基中分枝杆菌培 养基的方案如下：

1-摇动后，从瓶中取1ml上清液，置于无菌管中

2-通过于95℃加热1小时，灭活分枝杆菌

3-以500rpm的低速离心15分钟

4-将上清液回收于新的无菌管中

5-以14000rev/min将上清液离心10分钟

6-弃去上清液

7-用1ml缓冲溶液PBS洗涤颗粒

8-以14000rpm离心10分钟

9-弃去上清液

10-添加5μL 20％TFA

11-添加5μl 100％乙腈

12-静置10分钟

13-涡旋

14-将1μl混合物存放于光谱测定板上

15-静置干燥

16-存放1μl基质溶液

17-室温下静置干燥10分钟

18-对板进行质谱分析。

所有操作必须在排风罩下、在全安全装备(帽子、面罩、防护服 (over-jacket)和手套)中进行。

实施例6：结核分枝杆菌对抗生素的敏感性的表型测定

a/-方法：

本发明人试验了在其临床微生物实验室中在常规诊断中从呼吸样品分 离的结核分枝杆菌种类的6株临床菌株。通过其Ziehl染色后的成串特征形 态、随后通过PCR扩增以及基因间间隔区测序，将这6株菌株鉴定为结核 分枝杆菌种类[Djelouadji Z et al.A Single-Step Sequencing Method for  Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Species.PLoS Negl  Trop Dis.2008 Jun 18；2(6)：e253]。在固体培养基中利用参照表型试验，对于 所试验的4种抗生素，仅试验了所谓的临界浓度：异烟肼0.2μg/ml；利福 平1μg/ml；乙胺丁醇5μg/ml以及链霉素5μg/ml，这6株菌株经试验对一 线抗生素敏感。[Woods GL，Warren NG，Inderlind CB.Susceptibility test  methods：Mycobacteria，Nocardia，and other Actinomycetes in：Manual of  Clinical Microbiology，9th edition(Nurray PR，Baren EJ，Jorgensen JH，Bry NL， Pfaller MA.American Society for Microbiology，2007，page 1223-1247]。并行 试验了在固体培养基中通过参照方法所测定的抗抗结核药物的临床菌株(利 福平的最小抑制浓度＞1μg/ml)[Woods GL，Warren NG，Inderlind CB. Susceptibility test methods：Mycobacteria，Nocardia，and other Actinomycetes  in：Manual of Clinical Microbiology，9th edition(Nurray PR，Baren EJ， Jorgensen JH，Bry NL，Pfaller MA.American Society for Microbiology，2007， page 1223-1247)。将这些菌株以10⁶菌落/ml的浓度悬浮于无菌的磷酸盐缓 冲液中。根据上文的实施例2B，将悬浮液并行用于充满含有参照标准培养 基即补充有油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶(OADC)的混合物的 Middlebrook 7H10培养基的无菌皮氏培养皿和含有本发明的15％固体培养 基的皮氏培养皿。

本发明人使用称为E-test(Biomérieux，France)的系统确定菌株对各种 抗生素的敏感性。该系统由试纸条构成，连续浓度梯度的抗生素(异烟肼或 乙胺丁醇)沿着所述试纸条浸入所述试纸条。该装置允许肉眼读取这样的浓 度，即从所述浓度开始，不再观察到结核分枝杆菌的生长，因此对于正试 验的结核分枝杆菌而言，限定了抗生素(异烟肼或乙胺丁醇)的最小抑制浓 度。在含有5％CO₂空气中，于37℃，将皮氏培养皿孵育2周，同时从孵 育的第6天开始，每天观察。基于它们的外观和Ziehl染色后，表现出成串 的醇酸抗性细菌，证实所述菌落为结核分枝杆菌。在含有浓度高于最小抑 制浓度的抗生素区的试纸条周围，形成细菌生长抑制盘，这可以理解为， 后者可以通过试纸条与抑制盘的交叉点测定。

b/-结果：

本发明人观察到：

-(1)结核分枝杆菌菌落在本发明的培养基上孵育7天后和在参照培养 基上孵育11天后出现，

-(2)在7本发明的培养基上孵育7天后，在这些条件下，E试验读数 是可能的，因为存在允许读数的足够数量的菌落和菌落间非常好的对比， 所述对比在本发明培养基的红色背景下看起来呈灰色；而由于菌落在参照 培养基中的不完全生长和菌落颜色(半透明)与参照培养基间的低劣对比，在 参照培养基上孵育11天后，读数仅是局部的且困难的，

-(3)本发明培养基中所获得的异烟肼和乙胺丁醇E试验的结果与预 先通过参照方法所获得的结果相似，

-(4)在本发明的培养基中所获得的异烟肼和乙胺丁醇E试验的结果 比参照试验的结果更准确，从而允许测定真实的最小抑制浓度。

本实验证明，通过使用本发明的固体培养基，根据E试验方法，进行 结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性的表型试验，能够比在固体参照培养 基上进行E试验更快速且更便利。

图8A和8B表示在接种结核分枝杆菌种类的一相同(one and the same) 菌株后孵育的含有参照培养基(图8A)和本发明培养基的(图8B)皮氏培养皿 的照片，表现出存在结核分枝杆菌菌落，所述菌落在本发明的培养基中7 天后易于可见(图.8B)，但在参照培养基上在11天后难以观察(图.8A)，从 而允许方便地读取第一试纸条上的异烟肼(IZ)和第二试纸条上的乙胺丁醇 (ET)的抑制浓度。

在图8A和8B中，我们可以观察到，在试纸条周围，在部分含有抑制 浓度的抗生素的试纸条周围卵形盘形式的细菌生长抑制圈，以致所述抑制 圈的较低界限与试纸条的交叉点使得在色调渐降试纸条上读取抗生素的最 小抑制浓度成为可能。