用于上皮干细胞和包含所述干细胞的类器官的培养基

摘要

本发明涉及培养上皮干细胞、培养包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞的方法，以及在培养上皮干细胞和分离的组织块时存在骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、有丝分裂生长因子和Wnt激动剂的条件下培养所述细胞或组织块的方法。本发明还涉及含有BMP抑制剂、有丝分裂生长因子和Wnt激动剂的细胞培养基、所述培养基的用途以及在所述培养基中形成的隐窝绒毛的类器官、胃的类器官和胰腺的类器官。

说明书

本发明涉及用于培养上皮干细胞、尤其是肠和结肠上皮干细胞的新 的培养基以及用于培养包含所述干细胞的类器官的新的培养基。本发明 还涉及用本发明的培养基所培养的细胞后代和类器官，以及所述后代在 毒性测定和再生医学中的用途。

自我更新的小肠上皮排列成隐窝和绒毛(Gregorieff and Clevers， 2005.Genes Dev 19，877-90)。细胞在隐窝中新生成，并在绒毛顶部通过凋 亡而丧失，导致小鼠中上皮的更新时间为5天。一直以来都认为自我更 新的干细胞定居在隐窝底部附近，并且产生能向所有谱系分化的快速增 殖的过渡放大(TA)细胞。估计每个隐窝的干细胞数量为4-6个(Bjerknes  and Cheng，1999.Gastroenterology 116，7-14)。三种分化的细胞类型，即肠 上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞由TA细胞形成，并且继续沿着隐窝 -绒毛轴在结合带(coherent band)中迁移。每个绒毛接受来自多个不同的隐 窝的细胞。第四种主要的分化细胞类型是帕内特细胞，其定居在隐窝底 部。

最近鉴定出在第五种细胞类型循环隐窝基部柱状(CBC)细胞中特异 表达的基因Lgr5，所述循环隐窝基部柱状细胞是散布在帕内特细胞之间 的小细胞(在图8b用黑色箭头指示)(Barker et al.，2007.Nature 449： 1003-1007)。利用将GFP/他莫西芬诱导型Cre重组酶盒整合入Lgr5基因 座中的小鼠，通过谱系追踪显示，Lgr5⁺CBC细胞构成产生所有上皮细胞 类型的多能干细胞，甚至在Cre诱导后14个月评估时也是如此。

最近发现，除了Lgr5之外，Lgr6(而不是Lgr4)也是成体干细胞的特 有标志物。Lgr5在脑、肾、肝脏、视网膜、胃、肠、胰腺、乳房、毛囊、 卵巢、肾上腺髓质和皮肤的干细胞中表达，同时Lgr6在脑、肺、乳房、 毛囊皮肤的干细胞中表达。

通常认为，需要上皮干细胞和上皮下成纤维细胞的密切接触来锚定 和支持上皮干细胞，和提供产生正确极化的三维结构所必需的正确方向。

尽管已经描述了多种用于培养包括肠上皮干细胞在内的初级上皮干 细胞的培养体系(Bjerknes and Cheng，2006.Methods Enzymol 419： 337-83)，但是至今还没有建立能维持上皮干细胞的多能性的长期培养体 系。此外，还没有已知能用于保护从结肠或肠分离的隐窝的基本隐窝-绒 毛生理机能，或能用于保护分离的胰腺组织块或胃组织块的基本生理机 能的培养体系。

因此，本发明提供了培养上皮干细胞、培养包含所述上皮干细胞的 分离的上皮组织块或腺瘤细胞的方法，所述方法包括提供细胞外基质， 将上皮干细胞，包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与所 述细胞外基质一起孵育，在存在细胞培养基的条件下，培养所述干细胞、 分离的组织块或腺瘤细胞，所述细胞培养基包含动物或人类细胞的基础 培养基，并向该细胞培养基添加5-500ng/ml的骨形态发生蛋白(BMP)抑 制剂或至少5并且不超过500ng/ml的有丝分裂生长因子，如果培养上皮 干细胞和分离的组织块，还添加Wnt激动剂。

本发明人意外发现，本发明的方法允许培养上皮干细胞、从包含所 述干细胞的小肠、结肠、胃和胰腺所分离的组织块和腺瘤细胞，同时还 能维持保留未分化表型和自我维持能力的干细胞的存在。例如，按本发 明方法培养的分离的隐窝发育成为隐窝-绒毛的类器官，所述隐窝-绒毛的 类器官包含衬有绒毛样上皮的中央腔。隐窝中存在的干细胞维持分离的 隐窝的生长。产生的类器官经历多次隐窝分裂事件。更意外的是观察到， 在不存在干细胞龛的条件下，本发明方法允许单个分离的上皮干细胞长 成隐窝-绒毛的类器官。从胃幽门部分离的胃组织块充当肠隐窝的类器官。 该单元的开放的上部分封闭，并且腔充有凋亡细胞。新形成的胃的类器 官经历连续的出芽事件(表明腺体分裂)，同时保持它们与中央腔的极性。 此外，培养胰腺组织块导致出现能表达胰岛素和其它胰岛特异性标志物 的胰岛样结构，类似于郎格罕氏胰岛。

衬于小肠和大肠幽门部的上皮包括腔突起、绒毛和内陷、隐窝。沿 隐窝-绒毛轴的每个细胞被极化，其中肠绒毛顶部的细胞或结肠隐窝上部 的细胞的分化程度是最高，并且被持续丢失于腔中。定居于隐窝基部的 干细胞的连续增殖和定居于隐窝中部的祖细胞的大量增殖确保脱落细胞 的正确更替。

在成年人和成年小鼠的多个器官中发现干细胞。尽管个体组织中成 体干细胞的确切特性存在很大的变化，但是成体干细胞都具有以下特性： 它们保留了未分化的表型；它们的后代能向相关组织中存在的所有谱系 分化；它们在整个生命中保留自我维持能力；它们能在损伤后再生为相 关组织。干细胞定居于专门的场所，即干细胞龛，所述干细胞龛提供合 适的细胞-细胞接触和维持所述干细胞群的信号。

上皮干细胞能形成组成上皮的不同的细胞类型。诸如皮肤和肠的某 些上皮表现出快速的细胞更新，这表明定居的干细胞必须连续增殖。诸 如肝脏或胰腺的其它上皮在正常条件下表现出非常慢的更新。

可以通过本领域技术人员已知的方案从十二指肠、小肠和大肠(包括 空肠、回肠和结肠)和胃幽门部分离隐窝。例如，可以通过将分离的组织 与螯合剂一起孵育来分离隐窝，所述孵育使细胞从其与基膜和基质细胞 类型的钙依赖性和镁依赖性相互作用中释放出来。洗涤组织之后，用载 玻片从粘膜下层刮出上皮细胞层，并将其切碎。随后在胰酶或更优选 EDTA和/或EGTA中孵育，并利用例如过滤和/或离心步骤从隐窝分离未 消化的组织块和单细胞。诸如胶原酶和/或分散酶I的其它蛋白水解酶可 以用来代替胰酶。同样的方法用于分离胰腺和胃的组织块。

从上皮组织分离干细胞的方法在本领域是已知的。优选的方法基于 以下事实：干细胞在其表面表达Lgr5和/或Lgr6，Lgr5和/或Lgr6属于大 的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。Lgr亚家族的独特之处在于携带大的 富含亮氨酸的胞外结构域，该结构域对于配体结合是重要的。文献中尚 没有描述Lgr5和Lgr6的配体。因此，优选的方法包括从所述上皮组织 制备细胞悬液，使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触，分 离所述Lgr5和/或Lgr6结合化合物，并从所述结合化合物分离干细胞。 优选的是从分离的隐窝通过机械方式产生包含上皮干细胞的单细胞悬 液，因为发现在这个阶段用胰酶处理的上皮干细胞导致相当低的存活率。

优选的Lgr5和/或Lgr6结合化合物包括抗体，例如特异性地识别和 结合Lgr5或Lgr6的胞外结构域的单克隆抗体，例如包括小鼠和大鼠单 克隆抗体的单克隆抗体。利用这种抗体，例如借助于磁珠或通过荧光活 化细胞分选可以分离表达Lgr5和/或Lgr6的干细胞，这对本领域技术人 员是显而易见的。

在本发明的优选方法中，从隐窝、胃组织块或胰腺组织块分离所述 上皮干细胞。例如，从分离自肠的隐窝中分离所述上皮干细胞。优选的 上皮干细胞分离自小肠(包括十二指肠、空肠和回肠)、胰腺或胃。

优选在这样的微环境中培养分离的干细胞：所述微环境至少在一定 程度上模拟所述干细胞天然定居的细胞龛。通过在生物材料存在的条件 下培养所述干细胞来模拟所述细胞龛，所述生物材料例如代表控制干细 胞命运的重要调节信号的基质、骨架和培养基底。所述生物材料包括天 然的、半合成的和合成的生物材料，和/或其混合物。骨架提供二维或三 维网络。适用于所述骨架的合成材料包括选自多孔固体、纳米纤维和水 凝胶的聚合物，例如，包含自组装肽的肽、由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二 醇延胡索酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚纤维素醋酸酯和/ 或以上的共聚物组成的水凝胶(参见，例如，Saha et al.，2007.Curr Opin  Chem Biol.11(4)：381-387；Saha et al.，2008.Biophysical Journal 95： 4426-4438；Little et al.，2008.Chem.Rev 108，1787-1796)。如本领域技术 人员所已知的，骨架的机械特性(例如弹性)影响干细胞的增殖、分化和迁 移。优选的骨架包含生物可降解的(共)聚合物，在移植入个体中之后所述 可降解的(共)聚合物被天然存在的组分替代，例如从而促进组织再生和/ 或伤口愈合。此外，优选的是，所述骨架在移植入个体中之后基本上不 会诱导免疫应答。所述骨架补充有天然的、半合成的或合成的配体，这 些配体提供干细胞的增殖和/或分化、和/或迁移所需的信号。在优选的实 施方案中，所述配体包含限定的氨基酸片段。所述合成的聚合物的实例 包括PluronicF127嵌段共聚物表面活性剂(BASF)和Ethisorb(Johnson  and Johnson)。

细胞龛在一定程度上由干细胞和周围的细胞、以及所述龛中的细胞 产生的细胞外基质(ECM)所确定。在本发明的优选方法中，使分离的隐窝 或上皮干细胞附着于ECM。ECM由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组 成，其中所述糖蛋白包括胶原蛋白、内动蛋白(巢蛋白)、纤连蛋白和层粘 连蛋白。ECM由结缔组织细胞分泌。不同类型的ECM是已知的，其包 括不同的组成，所述不同的组成包含不同类型的糖蛋白和/或糖蛋白的不 同组合。可以通过在容器中培养产ECM的细胞(例如成纤维细胞)来提供 所述ECM，然后取出这些细胞并添加分离的隐窝或上皮干细胞。产细胞 外基质的细胞的实例是主要产胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产 IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、间质前胶原蛋白和纤连蛋白的成纤维细胞， 和主要产胶原蛋白(I、III和V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤 连蛋白和肌糖蛋白C的结肠成肌纤维细胞。可选地，所述ECM是商业提 供的。可商购的细胞外基质的实例是细胞外基质蛋白(Invitrogen)和基质胶 (Matrixgel^TM)(BD Biosciences)。利用ECM培养干细胞能提高干细胞的长 期存活和未分化干细胞的持续存在。在不存在ECM的条件下，不能长时 间培养干细胞培养物，并且不能观察到未分化的干细胞的持续存在。此 外，ECM的存在允许培养三维的组织类器官，在不存在ECM的条件下 不能培养三维的组织类器官。

本发明方法中所用的优选ECM包含至少两种不同的糖蛋白，例如两 种不同类型的胶原蛋白或一种胶原蛋白与一种层粘连蛋白。所述ECM可 以是合成的水凝胶细胞外基质或天然存在的ECM。最优选的ECM由基 质胶(Matrixgel^TM)(BD Biosciences)提供，其包含层粘连蛋白、内动蛋白 和胶原蛋白IV。

本发明方法中所用的细胞培养基包括任何细胞培养基。优选的细胞 培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲至pH7.4(优选7.2-7.6或至少7.2且 不高于7.6)的规定合成培养基，同时细胞在含5％-10％CO₂或至少5％且 不超过10％CO₂，优选5％CO₂的环境中培养。优选的细胞培养基选自补 充有谷氨酰胺、胰岛素、青霉素/链霉素和转铁蛋白的DMEM/F12和RPMI 1640。在另一个优选的实施方案中，使用改进DMEM/F12或改进RPMI， 其经优化用于无血清培养，并且包含胰岛素。在这种情况下，所述改进 DMEM/F12或改进RPMI培养基优选补充谷氨酰胺和青霉素/链霉素。此 外，优选的是，所述细胞培养基补充纯化的、天然的、半合成的和/或合 成的生长因子，并且不包含非规定组分，诸如胎牛血清或小牛血清。诸 如B27(Invitrogen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和N2(Invitrogen)的补充物刺 激某些细胞的增殖，并且如果需要，也可以将这些补充物加到培养基中。

添加到基础培养基中的成分是BMP抑制剂。BMP作为二聚配体与 由两种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶(即I型和II型受体)组成的受体复 合物结合。II型受体将I型受体磷酸化，导致该受体激酶的活化。I型受 体随后将特异性受体底物(SMAD)磷酸化，产生的信号转导通路引起转录 活性。

所述BMP抑制剂被定义为与BMP分子结合而形成复合物的试剂， 其中例如通过阻止或抑制BMP分子与BMP受体的结合来中和BMP活 性。可选地，所述抑制剂是起拮抗剂或反向激动剂作用的试剂。这类抑 制剂与BMP受体结合，并阻止BMP与所述受体结合。后者试剂的实例 是抗体，所述抗体与BMP受体结合，并防止BMP与抗体结合的受体结 合。

所述BMP抑制剂将细胞中的BMP依赖性活性抑制到相对于不存在 所述抑制剂时的BMP活性水平的至多90％，更优选至多80％、更优选至 多70％、更优选至多50％、更优选至多30％、更优选至多10％、更优选 0％。如本领域技术人员所已知的，可以通过测定BMP的转录活性来测 定BMP活性，例如Zilberberg et al.，2007.BMC Cell Biol.8：41中所示。

已知几类天然的BMP结合蛋白，包括Noggin(Peprotech)、脊索蛋白 和包含脊索蛋白结构域的脊索蛋白样蛋白(R&D sytems)、卵泡抑素和包含 卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白(R&D sytems)、DAN和包含DAN 半胱氨酸结结构域的DAN样蛋白(R&D sytems)、硬化蛋白/SOST(R&D  sytems)、核心蛋白多糖(R&D sytems)和α-2巨球蛋白(R&D systems)。

本发明方法中所用的优选的BMP抑制剂选自Noggin、DAN和包括 Cerberus和Gremlin在内的DAN样蛋白(R&D sytems)。这些可扩散的蛋 白能以不同的亲和度与BMP配体结合，并抑制这些BMP配体接近信号 转导受体。向基础培养基中添加任何这些BMP抑制剂能防止干细胞丢 失，否则在培养约2-3周之后就会发生干细胞丢失。

最优选的BMP抑制剂是Noggin。优选以至少10ng/ml的浓度将 Noggin添加到基础培养基，Noggin的浓度更优选至少20ng/ml、更优选 至少50ng/ml、更优选至少100ng/ml。最优选的浓度是约100ng/ml或 100ng/ml。在干细胞的培养过程中，优选每两天向培养基添加所述BMP 抑制剂，而优选每四天更换培养基。

添加到基础培养基中的另一成分是Wnt激动剂。Wnt信号通路由 Wnt蛋白与Frizzled受体家族成员的细胞表面受体结合时发生的一系列事 件界定。这导致Dishevelled家族蛋白的活化，这会抑制包含axin、GSK-3 的蛋白和蛋白APC的复合体从而降解细胞内β-联蛋白。产生的核富集的 β-联蛋白通过TCF/LEF家族转录因子而增强转录。

Wnt激动剂被定义为激活细胞中TCF/LEF介导的转录的试剂。因此， Wnt激动剂选自结合并活化Frizzled受体家族成员(包括任何和所有的 Wnt家族蛋白)的真正的Wnt激动剂、细胞内β-联蛋白降解的抑制剂和 TCF/LEF的激活剂。相对于不存在Wnt激动剂时的Wnt活性水平，所述 Wnt激动剂将细胞中的Wnt活性刺激至少10％，更优选至少20％、更优 选至少30％、更优选至少50％、更优选至少70％、更优选至少90％、更 优选至少100％。如本领域技术人员所已知的，可以通过测定Wnt的转录 活性来确定Wnt活性，例如通过pTOPFLASH和pFOPFLASH Tcf荧光素 酶报告构建体(Korinek et al.，1997.Science 275：1784-1787)。

Wnt激动剂包括分泌型糖蛋白，该分泌型糖蛋白包括Wnt-1/Int-1； Wnt-2/Irp(Int-1相关蛋白)；Wnt-2b/13；Wnt-3/Int-4；Wnt-3a(R&D sytems)； Wnt-4；Wnt-5a；Wnt-5b；Wnt-6(Kirikoshi H et al.2001.Biochem Biophys  Res Com 283：798-805)；Wnt-7a(R&D sytems)；Wnt-7b；Wnt-8a/8d； Wnt-8b；Wnt-9a/14；Wnt-9b/14b/15；Wnt-10a；Wnt-10b/12；Wnt-11和 Wnt-16。在“THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS(分泌型蛋白 的WNT家族)”，R&D Systems目录，2004中提供了关于人Wnt蛋白的 概述。其它的Wnt激动剂包括分泌型蛋白的R-spondin家族，该家族参 与Wnt信号通路的激活和调节，并由4个成员(R-spondin 1(NU206， Nuvelo，San Carlos，CA)、R-spondin 2(R&D sytems)、R-spondin 3和 R-spondin 4)组成；Wnt激动剂还包括Norrin(也被称为Norrie病蛋白或 NDP)(R&D sytems)，其是功能类似于Wnt蛋白的分泌型调控蛋白，能以 高亲和力与Frizzled-4受体结合并诱导Wnt信号通路的活化(Kestutis  Planutis et al.(2007)BMC Cell Biol.8：12)。最近鉴定出Wnt信号通路的小 分子激动剂，即氨基嘧啶衍生物，并且其也明确包括在Wnt激动剂(Liu et  al.(2005)Angew Chem Int Ed Engl.44，1987-90)中。

已知的GSK抑制剂包括小干扰RNA(siRNA；Cell Signaling)、锂 (Sigma)，kenpaullone(Biomol International；Leost，M.et al.(2000)Eur.J. Biochem.267，5983-5994)、6-溴靛玉红-30-丙酮肟(Meijer，L.et al.(2003) Chem.Biol.10，1255-1266)、SB 216763和SB 415286(Sigma-Aldrich)、以 及能阻止GSK-3与axin相互作用的FRAT家族成员和FRAT衍生的肽。 由Meij er et al.，(2004)Trends in Pharmacological Sciences 25，471-480提 供了综述，通过引用将其并入本文。测定GSK-3抑制水平的方法和测定 是本领域技术人员已知的，并且包括例如Liao et al 2004，Endocrinology， 145(6)：2941-9)所描述的方法和测定。

在优选的实施方案中，所述Wnt激动剂选自Wnt家族成员、R-spondin  1-4、Norrin和GSK抑制剂中的一种或多种。本发明人发现，向基础培养 基添加至少一种Wnt激动剂对于上皮干细胞或分离的隐窝的增殖是必需 的。

在另一个优选的实施方案中，所述Wnt激动剂包含R-spondin 1或由 R-spondin 1组成。优选地，以至少50ng/ml的浓度将R-spondin 1添加到 基础培养基中，R-spondin 1的浓度更优选至少100ng/ml、更优选至少200 ng/ml、更优选至少300ng/ml、更优选至少500ng/ml。R-spondin 1的最 优选的浓度是约500ng/ml或500ng/ml。在干细胞的培养过程中，优选 每两天向培养基添加所述Wnt家族成员，而优选每四天更换培养基。

在优选的实施方案中，Wnt激动剂选自：R-spondin、Wnt-3a和Wnt-6。 更优选地，R-spondin和Wnt-3a都用作Wnt激动剂。该组合是特别优选 的，因为该组合对类器官形成具有意想不到的协同效应。对于R-spondin， 优选的浓度是约500ng/ml或500ng/ml，并且对于Wnt3a，优选的浓度是 约100ng/ml或100ng/ml。

添加到基础培养基中的另一成分是选自生长因子家族的有丝分裂生 长因子，所述生长因子家族包括表皮生长因子(EGF；(Peprotech)、转化生 长因子-α(TGF-α；Peprotech)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF； Peprotech)、脑源性神经营养因子(BDNF；R&D Systems)和角质化细胞生 长因子(KGF；Peprotech)。EGF对于多种培养的外胚层和中胚层细胞是有 效的有丝分裂因子，并且对特定细胞的体内和体外分化和细胞培养物中 的某些成纤维细胞的分化具有重要影响。EGF前体以膜结合分子的形式 存在，其经蛋白水解被切割而产生能刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。 优选的有丝分裂生长因子是EGF。优选地，以5-500ng/ml或至少5且不 高于500ng/ml的浓度将EGF添加到基础培养基中。优选的浓度为至少 10、20、25、30、40、45或50ng/ml且不高于500、450、400、350、300、 250、200、150或100ng/ml。更优选的浓度为至少50且不超过100ng/ml。 更优选的浓度为约50ng/ml或50ng/ml。同样的浓度可用于FGF，优选 用于FGF10或FGF7。如果使用多于一种FGF，例如FGF7和FGF10， 那么FGF的浓度按上文所述来限定并且指的是所用的FGF的总浓度。在 干细胞的培养过程中，优选每两天向培养基添加所述有丝分裂生长因子， 而优选每四天更换培养基。可以使用bFGF家族的任何成员。优选地，使 用FGF7和/或FGF10。FGF7也被称为KGF(角质化细胞生长因子)。在 另一个优选的实施方案中，向基础培养基添加有丝分裂生长因子的组合， 例如，EGF和KGF，或者EGF和BDNF。在另一个优选的实施方案中， 向基础培养基添加有丝分裂生长因子的组合，例如，EGF和KGF，或者 EGF和FGF10。

本发明方法的另一个实施方案包括含有Rock(Rho激酶)抑制剂的培 养基。发现添加Rock抑制剂能防止失巢凋亡，尤其当培养单一干细胞时。 所述Rock抑制剂优选地选自R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环 己烷甲酰胺二盐酸盐单水合物(Y-27632；Sigma-Aldrich)、5-(1，4-二氮杂-1- 基磺酰基)异喹啉(法舒地尔或HA1077；Cayman Chemical)和(S)-(+)-2-甲 基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1，4-二氮杂卓二盐酸盐 (H-1152；Tocris Bioschience)。在培养所述干细胞的前7天中，优选每两天 向培养基添加所述Rho激酶抑制剂，例如Y-27632。Y27632的优选浓度 是10□M。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括还含有Notch激动剂的培 养基。已经表明，Notch信号转导在细胞命运决定以及在细胞存活和增殖 中起重要的作用。Notch受体蛋白能与多种表面结合配体或分泌型配体相 互作用，所述表面结合配体或分泌型配体包括但不限于Delta 1、Jagged 1 和2，以及Delta样1、Delta样3、Delta样4。配体结合后，Notch受体 由涉及ADAM蛋白酶家族成员的一系列切割事件和受λ分泌酶早老素调 节的膜内切割而被激活。结果是Notch的细胞内结构域转位到细胞核， 在细胞核中Notch的细胞内结构域转录激活下游基因。优选的Notch激 动剂选自Jagged 1和Delta 1，或其活性片段或衍生物。最优选的Notch 激动剂是具有序列CDDYYYGFGCNKFCRPR的DSL肽(Dontu et al.， 2004.Breast Cancer Res 6：R605-R615)。优选以10μM-100nM或至少10 μM且不高于100nM的浓度使用所述DSL肽(ANA spec)。尤其在培养的 第一周，添加Notch激动剂能使培养效率增加2-3倍。在培养所述干细胞 的前7天中，优选每两天向培养基添加所述Notch激动剂。

Notch激动剂被定义为能刺激细胞中Notch活性的分子，相对于不存 在Notch激动剂时Notch的活性水平，所述分子将细胞中的Notch活性刺 激至少10％，更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少50％、更 优选至少70％、更优选至少90％、更优选至少100％。如本领域技术人员 所已知的，可以通过测定Notch的转录活性来确定Notch活性，例如利 用Hsieh et al.，1996.Mol.Cell.Biol.16，952-959所述的4xwtCBF1-荧光素 酶报告构建体。

本发明还提供了这样的细胞培养基，其包含动物或人类细胞的基础 培养基，并且所述基础培养基添加了骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、Wnt 激动剂和5-500ng/ml或至少5且不超过500ng/ml的、选自EGF、TGF□、 KGF、FGF10和FGF的有丝分裂生长因子。优选地，有丝分裂因子选自 EGF、TGF-□和KGF、或选自EGF、TGF-□和FGF7、或选自EGF、TGF-□ 和FGF、或选自EGF和KGF、或选自EGF和FGF7、或选自EGF和FGF、 或选自TGF□和KGF、或选自TGF□和FGF7、或选自TGF□和FGF。EGF 可以用TGF□替换。根据待获取的类器官将鉴定几种优选的培养基。本发 明的细胞培养基允许细胞外基质上上皮干细胞或分离的隐窝的存活和/或 增殖和/或分化。术语细胞培养基(cell culture medium)与培养基(medium)， 培养基(culture medium)或细胞培养基(cell medium)同义。

在本发明优选的方法中，第一培养基包含作为BMP抑制剂的 Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和角质化细胞生长因子、 和作为Wnt激动剂的R-spondin 1，并补充了B27、N2和N-乙酰半胱氨 酸。可以用FGF或FGF10替换KGF。[Leu15]-促胃液素I、Exendin和/ 或烟酰胺也可以被添加到第一培养基中。

在另一个优选的实施方案，被称为第二培养基的所述培养基与所述 第一培养基相同，除了不含Noggin，并且优选不含[Leu15]-促胃液素I、 Exendin和/或烟酰胺。因此，所述第二培养基包含作为有丝分裂生长因子 的表皮生长因子和角质化细胞生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin  1，并补充了B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。也可以用FGF或FGF10替换 KGF。

这两种细胞培养基支持包含胰腺干细胞的胰腺组织块，所述胰腺干 细胞在基质胶细胞外基质中这些培养基中生长，从而在细胞外基质上形 成包含胰岛样结构的胰腺的类器官。不含Noggin的第二培养基是最低培 养基，而含Noggin的第一培养基形成用于胰腺组织块扩增的改良的培养 基。扩增培养基优选是在至少2天培养中能促进细胞的存活和/或增殖的 培养基。

第三培养基被设计成能在至少5天内促进、诱导细胞向胰腺的类器 官分化。一种优选的向胰腺的类器官形成的分化标志物是神经发生素-3 (Neurogenin-3)，能利用RT-PCR或免疫组化检测神经发生素-3的表达。 例如，当在分化培养基中培养至少5天之后，能利用RT-PCR或免疫组化 检测到神经发生素-3时，则作为第三或第四培养基的所述分化培养基被 认为是有功能的。优选地，在以上所定义的第一或第二培养基的培养基 中进行第一扩增步骤之后，再实施该分化步骤。该第三培养基与以上的 第二培养基相同，除了不含FGF或KGF或FGF10。该第三培养基包含 表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1，并补充了B27、N2和 N-乙酰半胱氨酸。

第四培养基被设计成与所述第一培养基相同，其中所述第四培养基 含还补充有[Leu15]-促胃液素I和/或Exendin。所述第三培养基是最低分 化培养基，而所述第四培养基是改良分化培养基。分化培养基是优选诱 导或促进培养至少5天内的细胞发生特异性分化的培养基。对于胰腺的 类器官，可以通过检测本文之前所定义的与胰腺谱系相关的特异标志物 的存在来测定分化。与胰腺谱系相关的其它标志物的实例包括：在分化 培养基中培养至少7、8、9、10天之后，可利用RTPCR或免疫组化检测 的胰岛素分泌。

因此，在获得和/或培养胰腺的类器官的优选的方法中，在第一步骤 中，在第一或第二培养基中培养上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分 离的组织块、或腺瘤细胞，随后在第二步骤中，在第三或第四培养基中 进行培养。第一步骤可以持续至少2周或可以更长。第一步骤可以进行 大于1、2、3、4、5、6、7、8、9或大于10个月。所述第二步骤可以持 续8、9、10、11、12、13、14、15、16天或更长。优选地，利用本文所 限定的细胞外基质进行每个步骤。每种培养基中存在的每种化合物的优 选浓度已在本文的说明书或实施例中进行了限定。在优选的实施方案中， 如果胰腺的类器官用于再生医学，则可以从上皮细胞或从分离的胰腺组 织块开始。在另一个优选的实施方案中，如果胰腺的类器官被用作药物 开发体系，则可从腺瘤开始。因此，通过本发明方法获得的胰腺的类器 官是本发明的另一方面。因此，另一方面，本发明提供了本文所定义的 第一、第二、第三、第四培养基。

据我们了解，这是首次报道，在培养至少10个月后，获得有功能的 并且活的胰腺的类器官(参见实验部分)。功能性优选的特征为胰岛素的分 泌。由于获得的胰腺的类器官的最终的量与培养的持续时间相关，因此 本领域技术人员应当理解，本发明是开创性的发明，并且有潜力为例如 再生医学中带来新的希望。

因此，在获得和/或培养胰腺的类器官的优选的方法中，在第一步骤 中，在含EGF、KGF或FGF和作为Wnt激动剂的R-spondin 1并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸的培养基中，将上皮干细胞、包含所述上皮 干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质接触培养，随后在第 二步骤中，在含EGF和作为Wnt激动剂的R-spondin 1并补充了B27、 N2和N-乙酰半胱氨酸的培养基中进行培养。

在本发明的另一个优选的方法中，培养基包含作为BMP抑制剂的 Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子、作为Wnt激动剂的 R-spondin 1和/或Wnt3a。该细胞培养基支持分离的小肠隐窝在包含作为 细胞外基质的基质胶的三维培养物中进行培养。

在本发明的另一个优选的方法中，培养基包含作为BMP抑制剂的 Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子、作为Wnt激动剂的 R-spondin、作为Notch激动剂的Jagged-DSL肽和Rho激酶抑制剂 Y-27632。该细胞培养基支持分离的单一上皮干细胞在包含作为细胞外基 质的基质胶的三维培养物中进行培养。

在本发明的另一个优选的方法中，培养基包含作为BMP抑制剂的 Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和/或BDNF、作为Wnt 激动剂的R-spondin 1和/或Wnt3a，并补充了B27、N2和N-乙酰半胱氨 酸中的至少一种。在该优选的方法中，Wnt-3a是优选的Wnt激动剂。该 细胞培养基支持分离的结肠隐窝在包含作为细胞外基质的基质胶的三维 培养物中进行培养。该培养基能促进培养至少2天内的细胞的存活和/或 增殖和/或分化。一种优选的向结肠隐窝形成的分化标志物可以选自以下： 指示肠上皮细胞存在的碱性磷酸酶、指示杯状细胞存在的Muc2和指示内 分泌细胞存在的Neurogenic 3或嗜铬粒蛋白。可以利用RTPCR或免疫组 化检测这些标志物中每一种的表达。能起到促进用于获得结肠隐窝的细 胞的存活和/或增殖和/或分化功能的培养基能使得在培养至少2、3、4、5、 6、7、8、9、10天或更长的时间之后，可以检测出至少一种上述标志物。 优选的培养基包含作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的 表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1和/或Wnt-3a，并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸中的至少一种。该培养基被称为本发明的第 五培养基，这代表本发明的另一方面。

因此，在获得和/或培养结肠隐窝的优选的方法中，在上文所示的培 养基中培养上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤 细胞，优选在第五培养基中进行培养。优选利用本文所限定的细胞外基 质实施该方法。培养基中存在的每种化合物的优选浓度已在本文的说明 书或实施例中进行了限定。因此，可通过本发明方法获得的结肠隐窝是 本发明的另一方面。据我们了解，这是首次报道，在培养至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12个月后，获得有功能的并且活的结肠隐 窝(参见实验部分)。功能性的特征优选为至少一种上文所示的标志物的存 在。本发明是开创性的发明，并且有潜力为例如再生医学中带来新的希 望。

因此，在获得和/或培养结肠隐窝的优选的方法中，在含Noggin、EGF 和作为Wnt激动剂的R-spondin 1和/或Wnt-3并补充了B27、N2和N- 乙酰半胱氨酸的培养基中，将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离 的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质接触培养。

在本发明的另一个优选的方法中，培养基含有作为BMP抑制剂的 Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子、作为Wnt激动剂的 R-spondin 1、并补充了Wnt-3a或KGF，并且还含有B27、N2、N-乙酰半 胱氨酸。将该培养基称为第六培养基，并因此代表本发明的另一方面。 可以用FGF或FGF10替代KGF。该培养基优选含有作为BMP抑制剂的 Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和FGF10、作为Wnt激 动剂的R-spondin 1和Wnt-3a，并且还含有B27，N2，N-乙酰半胱氨酸。 FGF10优选作为FGF，因为它给出的结果优于例如FGF7(图32)。该细 胞培养基支持分离的胃组织块或胃的类器官在含有作为细胞外基质的基 质胶的三维培养物中进行培养。

该第六培养基是用于扩增胃组织块的培养基。扩增培养基是优选促 进至少2天培养内的细胞的存活和/或增殖的培养基。另一种培养基，即 第七培养基，被设计成能在至少2天内促进、诱导细胞向胃的类器官或 胃组织块的分化。该第七培养基与上述的第六培养基相同，除了Wnt-3a 的浓度低于第六培养基。与第六培养基中存在的Wnt-3a浓度相比，第六 培养基中Wnt-3a的浓度降低至少25％、50％、100％、200％、300％、400％、 500％、600％或更多。该第七培养基含有表皮生长因子和作为Wnt激动 剂的R-spondin 1与Wnt-3a、Noggin和FGF10，并补充了B27、N2、N- 乙酰半胱氨酸和促胃液素。促胃液素的使用浓度优选为1nM。

所述第七培养基是分化培养基。分化培养基是优选在至少3、4、5、 6、7、8、9、10天或更长时间培养内诱导或促进细胞发生特异性分化的 培养基。对于胃的类器官或胃组织块，可以通过检测胃谱系相关的特异 性标志物的存在来确定分化。胃谱系相关的标志物的实例包括：MUC5AC (隐窝细胞标志物)、促胃液素和/或生长抑制素(两种都是内分泌细胞标志 物)。优选利用RT-PCR和/或免疫组化或免疫荧光来检测至少一种所述标 志物的存在。优选在分化条件中至少6天，更优选在至少10天之后可以 检测至少一种这些标志物中的存在。当在所述培养基中培养至少6天之 后，可以通过RT-PCR或免疫组化检测到至少一种上述标志物时，诸如第 七培养基的分化培养基被认为是有功能的。优选在上述限定的第六培养 基中的第一扩增步骤之后进行该分化步骤。

因此，在获得和/或培养胃组织块的优选的方法中，在第一步骤中， 在第六培养基中培养上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、 或腺瘤细胞，随后在第二步骤中，在第七培养基中进行培养。优选利用 本文所限定的细胞外基质实施每一步骤。第一步骤可以持续至少3天并 且可以持续更长的时间。第一步骤可以进行超过3、4、5、6、7、8、9 或更多。第二步骤可以持续6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 天或更长时间。每种培养基中存在的每种化合物的优选浓度已在本文的 说明书或实施例中进行了限定。因此，可通过本发明方法所获得的胃组 织块是本发明的另一方面。

因此，在获得和/或培养胃组织块的优选的方法中，在第一步骤中， 在含有作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因 子和FGF10、作为Wnt激动剂的R-spondin 1和Wnt-3a，并且还含有B27、 N2、N-乙酰半胱氨酸的培养基中，将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞 的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质接触培养，随后在第二步骤 中，在含有表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1和Wnt-3a、 Noggin和FGF10，并补充了B27、N2和N-乙酰半胱氨酸的培养基中进 行培养，其中第二步骤中的Wnt-3的浓度低于第一步骤中存在的Wnt-3a 浓度。

在本发明的另一个优选的方法中，培养基含有作为BMP抑制剂的 Noggin和作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子。该细胞培养基支持分 离的腺瘤组织块或分离的单一腺瘤细胞在含有作为细胞外基质的基质胶 的三维培养物中进行培养。

可以向培养基中新鲜加入诸如Wnt3a的配体。可选地，通过用表达 所述配体的合适的表达构建体转染或感染细胞系使细胞系表达所述配 体。培养所述细胞系，并在合适的时间间隔收集含有分泌配体的培养基。 例如，当细胞达到汇合并停止生长时，细胞会产生Wnt3a。将来自没有 用所述表达构建体转染或感染的细胞的培养基用作对照。收集条件培养 基并对其进行检测，例如在测定中检测受TCF反应元件控制的荧光素酶 表达从而检测诸如Wnt3a的Wnt激动剂的存在(Korinek et al.，1997. Science 275：1784-1787)。当用于培养来再生组织时，将所述培养基稀释。 如本领域技术人员所已知的，添加过量的配体有时与添加太少配体一样， 对培养物都是有害的。因此，条件培养基的实际稀释度取决于测验中所 测定的配体的量。

本发明还提供了本发明的培养基在细胞外基质上培养上皮干细胞或 包含这些干细胞的分离的类器官结构中的用途，其中所述干细胞优选不 包含人胚胎干细胞。优选的是人成体干细胞。此外，从小肠、结肠和胃 单分选的上皮干细胞也能在本发明的培养基中起始这些三维类器官。本 发明还提供了本发明的培养基在培养包含干细胞的胰腺组织块中的用 途，所述胰腺组织块形成包含胰岛样结构的胰腺的类器官。

所述干细胞优选是胰腺、胃、肠或结肠上皮干细胞，其中最优选的 干细胞是小肠干细胞。本发明的培养基允许长期培养条件的建立，在该 条件下，单一隐窝经历多次隐窝分裂事件，而同时产生存在所有分化的 细胞类型的绒毛样上皮结构。利用本发明的培养方法可允许至少7个月、 至少8个月，至少9个月、至少10个月的培养期。

培养的隐窝在培养之后，经历显著的形态改变。新鲜分离的隐窝的 上部开口封闭，并且该区域逐渐膨胀并充有凋亡细胞，很像凋亡细胞在 绒毛顶部被剪断。发现隐窝区经历连续的出芽事件而产生其它隐窝，这 是表明隐窝分裂的过程。隐窝样扩展物包含所有分化的上皮细胞类型， 包括增殖性细胞、帕内特细胞、肠上皮细胞和杯状细胞。在任何阶段的 类器官中均未鉴定出成肌纤维细胞或其它非上皮细胞。

出芽隐窝结构的扩增产生类器官，所述类器官在衬有绒毛样上皮细 胞并充有凋亡细胞体的中央腔周围含有＞40个隐窝样结构。隐窝-绒毛的 类器官包含衬有绒毛样上皮的中央腔。该腔在连续的时间间隔是开放的， 从而将内容物释放到培养基中。所述类器官可以传代并且可以保持培养 至少6个月，而不会丧失重要的特性。传代优选涉及类器官的手动破碎。

当培养单一上皮干细胞时，形成相似的隐窝-绒毛的类器官结构。大 约1周后，形成了十分类似于利用完整的隐窝所获得的隐窝-绒毛的类器 官结构的结构。这些类器官的组织学分析也表明：保留了基本的隐窝-绒 毛构造、存在所有分化的细胞类型和不存在非上皮成分。

因此，一方面，本发明提供了隐窝-绒毛的类器官，包含衬有绒毛样 上皮细胞的中央腔，所述绒毛样上皮细胞是通过在本发明的培养基中培 养上皮干细胞或分离的隐窝而产生的。优选地，所述隐窝-绒毛的类器官 是利用本发明的方法获得的。

另一方面，本发明提供了按照本发明的方法培养胰腺组织块所产生 或所获得的胰腺的类器官。在开始培养后7天，约20％的胰腺的类器官 形成出芽结构。与仅非常缓慢生长的腺泡组织相反，胰管快速增殖。在 胰腺的类器官传代之后，观察到分泌胰岛素的胰岛样结构，其类似于健 康胰腺组织中存在的郎格罕氏胰岛。本发明还提供了包含中央腔的胃的 类器官。优选地，所述胃的类器官是通过本发明的方法获得的。

可以向培养基中添加其它生长因子，例如用来增强类器官中胰岛的 存在或进一步支持诸如胃组织块的分离组织块的培养，所述其它生长因 子包括环巴胺(Sonic-hedgehog抑制剂；Tocris Bioscience)、激活素、GLP(胰 高血糖素样肽)及其衍生物(Exendin4；California Peptide Research)、促胃液 素(Genscript)、Notch激动剂(Jagged肽，Ana Spec)、烟酰胺和诸如Wnt-3a 的Wnt激动剂。当以单细胞起始培养时，优选使用Wnt-3a。

本发明还提供了隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官的集合体，每集合体 包含多于10个，优选多于20个、更优选多于40个类器官。隐窝-绒毛的 类器官包围衬有绒毛样上皮的中央腔。该腔充有凋亡细胞体。隐窝-绒毛 的类器官中的细胞是极化的，干细胞定居在结构的基部。隐窝样结构的 顶部包含脱落进腔中的凋亡细胞。所述隐窝-绒毛的类器官集合体优选包 含至少10％的活细胞、更优选至少20％的活细胞、更优选至少50％的活 细胞、更优选至少60％的活细胞、更优选至少70％的活细胞、更优选至 少80％的活细胞、更优选至少90％活细胞。可以在FACS中利用Hoechst 染色或碘化丙啶染色评价细胞活力。

另一方面，本发明提供了本发明的隐窝-绒毛的类器官、胃的类器官 或胰腺的类器官在药物开发筛选、毒性测定或再生医学中的用途。

为了高通量的目的，将所述隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官培养在多 孔板中，例如，96孔板或384孔板。分子文库用来鉴定影响所述类器官 的分子。优选的文库包括抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例 如LOPAP^TM，Sigma Aldrich)、脂质文库(BioMol)、合成化合物文库(例如 LOP AC^TM，Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此外，可 以使用诱导或抑制腺瘤细胞后代中一个或多个基因的表达的基因文库。 这些基因文库包括cDNA文库、反义文库和siRNA或其它非编码RNA 文库。优选将细胞暴露于多个浓度的检测试剂一段时间。在暴露时间结 束时，评估培养物。术语“影响”用于包括细胞中的任何改变，包括但不 限于，增殖降低或丧失、形态改变和细胞死亡。所述隐窝-绒毛、胃或胰 腺的类器官还可以用来鉴定特异性地靶向于上皮癌细胞，但不靶向于所 述隐窝-绒毛，胃或胰腺的类器官的药物。

所述隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官还可以替代诸如Caco-2细胞的细 胞系在可能的新药或现有的或新的食品补充剂的毒性测定中的用途。

此外，所述隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官可以用于培养目前缺乏合 适的组织培养物或动物模型的病原体，例如诺如病毒。

包含隐窝-绒毛的类器官的培养物可用在再生医学中，例如用在肠上 皮的放射后和/或手术后修复、诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎的炎性肠病 患者的肠上皮的修复、以及短肠综合征患者的肠上皮的修复。其它用途 是小肠/结肠遗传病患者的肠上皮的修复。包含胰腺的类器官的培养物也 可用在再生医学中，例如用作胰腺或部分胰腺切除后的植入物和用于治 疗诸如I型糖尿病和II型糖尿病的糖尿病。

在可选的实施方案中，可以使扩增的上皮干细胞成为相关的组织， 例如，包括胰腺β细胞在内的胰腺细胞和肝细胞。目前，从成体干细胞 再生胰腺细胞或肝细胞是不可能的。本发明的培养方法能实现分析使密 切相关的上皮干细胞转分化为包括胰腺β细胞在内的胰腺细胞和肝细胞 的因子。

对于本领域技术人员显而易见的是，基因疗法也可以用在基于修复 受损或患病的组织的方法中。例如，可以利用腺病毒或逆转录病毒基因 递送媒介来将诸如DNA和/或RNA的遗传信息递送至干细胞。本领域技 术人员能替换或修复基因疗法中所靶向的特定基因。例如，可以将正常 基因插入基因组非特异的位置中，从而替换无功能的基因。在另一个实 例中，可以通过同源重组用正常基因序列替换异常基因序列。可选地， 选择性回复突变可以将基因恢复至正常功能。另一个实例是改变特定基 因的调控(激活或关闭基因的程度)。优选地，通过基因疗法途径离体处理 干细胞，随后将其转移至需要治疗的哺乳动物，优选人。

另一方面，本发明提供了培养上皮腺瘤细胞的方法，包括提供细胞 外基质、使上皮腺瘤细胞附于所述细胞外基质、在存在细胞培养基的条 件下培养所述细胞，所述细胞培养基含有动物人类细胞的基础培养基， 并且该基础培养基中添加有骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂和5-500ng/ml 或至少5且不超过500ng/ml的、选自EGF、TGF-α和KGF的有丝分裂 生长因子。可以用FGF或FGF10替代KGF。

上皮结肠腺瘤细胞包含编码APC蛋白的基因中的改变，这导致由包 含APC的蛋白复合体导致的细胞内β-联蛋白的低效降解。结肠腺瘤中常 见的其它突变包括β-联蛋白或Axin2中的突变。总结果是增强的TCF/LEF 信号转导，这是因为细胞核中β-联蛋白的量增加。发现不含Wnt激动剂 的培养基足以使腺瘤细胞增殖。

可以通过本领域内已知的方法从上皮腺瘤分离所述腺瘤细胞，包括 使用诸如EDTA的解离剂。可选地，可以利用Lgr5结合化合物从腺瘤分 离单一Lgr5-或Lgr-6-阳性的腺瘤细胞，随后利用磁珠或FACS分析。

本发明还提供了在存在细胞培养基条件下培养的上皮腺瘤细胞的后 代，所述细胞培养基包含动物或人类细胞的基础培养基，并且该基础培 养基添加有骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂和5-500ng/ml或至少5且不超 过500ng/ml的表皮生长因子(EGF)。培养的腺瘤细胞不能发育成诸如隐 窝-绒毛样构造的极化的三维结构。相反，腺瘤细胞形成气球样结构，其 中细胞随机朝向边缘或中央腔。没有分化成其它上皮细胞类型的迹象。 该结果表明APC在隐窝-绒毛样构造的三维组建中的作用。

此外，本发明提供了腺瘤细胞的后代在靶向药物开发筛选中的用途， 用于鉴定与在相同培养基中进行培养的扩增的正常上皮细胞相比，特异 性地影响腺瘤细胞的药物。为了高通量的目的，将腺瘤细胞的后代培养 在多孔板中，例如，96孔板或384孔板。使用分子文库来鉴定影响所述 后代的分子。优选的文库包括抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文 库(例如LOPAP^TM，Sigma Aldrich)、脂质文库(BioMol)，合成化合物文库 (例如LOPAC^TM，Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此 外，可以使用诱导或抑制腺瘤细胞后代中一个或多个基因的表达的基因 文库。这些基因文库包括cDNA文库、反义文库和siRNA或其它非编码 RNA文库。随后或平行检测影响腺瘤细胞的化合物对扩增的正常上皮细 胞的影响。术语“影响”用于包括细胞中的任何改变，包括但不限于，增 殖降低或丧失、形态改变和细胞死亡。所述后代也可以用来鉴定与上皮 腺瘤细胞相比(包括逆转的癌细胞)，特异性地靶向于上皮癌细胞的药物。

显而易见的是，所述后代也可以用在测定候选药物的体外代谢稳定 性和代谢谱的高通量方法中。

此外，本发明提供了本发明的腺瘤细胞后代、胰腺的类器官、胃的 类器官和隐窝-绒毛的类器官在毒性测定中的用途。所述后代和隐窝-绒毛 的类器官易于培养，并且比诸如当前用在毒性测定中的Caco-2(ATCC HTB-37)、I-407(ATCC CCL6)和XBF(ATCC CRL 8808)的上皮细胞系更 类似于原代上皮细胞。预计的是，利用原代腺瘤培养物或隐窝-绒毛的类 器官获得的毒性结果更接近于患者中获得的结果。基于细胞的毒性测定 用于确定器官特异性细胞毒性。在所述测定中检测的化合物包括癌症化 学预防剂，环境化学品、食品补充剂和可能的有毒物。将细胞暴露于多 个浓度的检测试剂中一段时间。在利用5天暴露时间和从最高可溶浓度 的对数稀释的预实验中确定测定中检测试剂的浓度范围。在暴露时间结 束时，评估培养物的生长抑制。分析数据以确定抑制终点50％时的浓度 (TC50)。

在本文件及其权利要求书中，动词“包括(to comprise)”及其变化词以 非限制性的含义使用，表示包括该词后面的项，但是不排除未特定提到 的项。此外，动词“由……组成(to consist)”可以用“基本由……组成(to  consist essentially of)”替代，表示本文所限定的产物可以含有特定指出的 成分之外的其它成分，但所述其它成分不会改变本发明的特有性质。此 外，本文所限定的方法可以包括特定指出的步骤之外的其它步骤，但所 述其它步骤不会改变本发明的特有性质。此外，由不定冠词“a”或“an”修 饰的元件不排除存在多于一个元件的可能性，除非文中明确指示有且只 有一个元件。因此，不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。单词“约 (about)”或“约(approximately)”当与数值联合使用时(约10)，优选表示该值 可以为10或大于或小于该值的1％。

通过引用将本说明书中所列举的所有专利和参考文献全部整体并入 本文。

仅以示例提供以下实施例，而非意图以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1.隐窝培养的生长因子需要

a：用EGF(E；0-50ng/ml)和R-spondin 1(R：0-500ng/ml)接种500个 隐窝，三个平行样品；接种后7天对隐窝的类器官进行计数。b：用EGF (50ng/ml)和R-spondin 1(500ng/ml)和指定量的Noggin培养500个隐窝/ 隐窝的类器官，随后进行3次传代。每次传代时对隐窝的类器官进行计 数。实验重复三次，得到类似的结果。

图2.肠隐窝培养体系的建立

a：分离的单个隐窝长成类器官的时间过程。差分干涉相差图像显示 隐窝基部的含颗粒的帕内特细胞(箭头)。b，c：单一分离的隐窝有效形成 隐窝的类器官。通过重复的隐窝分裂，结构在第14天时产生多个章鱼样 隐窝的类器官。d：培养3周之后，单个类器官的3D重建共聚焦图像。 Lgr5-GFP⁺干细胞(浅灰色)位于隐窝样结构的顶部。DNA的对比染色： ToPro-3(深灰色)。e：隐窝的类器官的图示。类器官由衬有绒毛样上皮的 中央腔和多个周围的隐窝样结构组成。位于隐窝结构顶部的深灰色细胞 指示存在于每个隐窝结构中的Lgr5⁺干细胞的位置。比例尺显示50μm。

图3.基因表达谱的集群分析。

利用新鲜分离的结肠和小肠隐窝以及小肠的类器官的表达水平的集 群分析表明，小肠的类器官和其来源的组织小肠隐窝之间具有高度的相 似性。结肠隐窝集中在单独的分支上，表明该密切相关的组织的不同的 基因表达模式。值得注意的是，所有表达的基因中只有1.2％显著富集在 对应于小肠隐窝的类器官中，而反之有2％富集在小肠隐窝中。对这些差 异性基因的Ingenuity Pathway分析表明，新鲜分离的隐窝中特异性地存 在淋巴细胞标志，而在类器官富集的少量基因中没有鉴定出明显的通路 (未显示)。我们推断，后一组代表生物学噪音，而来源于污染的上皮内免 疫细胞的淋巴细胞标志在培养时丢失。

图4.隐窝的类器官保留基本的隐窝-绒毛特性。

a-e：Wnt激活码保留在隐窝结构中。a：细胞核β-联蛋白(深灰色，箭 头)仅见于隐窝结构中。图5中显示更高分辨率的图像。星号代表基质胶； Lu代表腔。b：CBC细胞和TA细胞梯度表达EphB2(浅灰色)。观察到用 白箭头指示的Lgr5-GFP⁺干细胞。c：半胱天冬酶3⁺的凋亡细胞(深灰色， 箭头)脱落进衬有肠上皮细胞的中央腔中。d：来自＞3月的隐窝培养物的 细胞涂片的40条染色体。e-g：Lgr5⁺干细胞的体外谱系追踪。e：用他莫西 芬体外刺激来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-lacZ报告基因小鼠的隐 窝12小时，并培养指定的天数。LacZ染色(深灰色)表明，分散的单LacZ⁺细胞(第1天)在体外产生整个LacZ⁺隐窝(第2-14天)。插图显示更高放大 倍数的着色隐窝的类器官。f：组织学分析显示整个LacZ⁺隐窝结构(深灰 色/黑色)进入绒毛结构中。g：具有LacZ⁺细胞的隐窝的类器官的百分比随 时间保持稳定，表明Lgr5⁺细胞具有长期干细胞活性。以三个平行样品接 种500个隐窝，并对LacZ⁺隐窝的类器官进行计数。误差棒是三个平行样 品的标准差。实验重复3次，结果相似。

图5.图4a、图11m和11p的更高分辨率的图像。

图6.隐窝的类器官中没有存在上皮下成纤维细胞的证据。

a：平滑肌肌动蛋白(SMA；深灰色，用黑色箭头指示实例)的免疫染色 表明上皮层下存在上皮下成纤维细胞。b：基质胶(星号)中不存在SMA⁺细胞表明培养体系中没有上皮下成纤维细胞。比例尺：50μm。

图7.a-c：用他莫西芬体外刺激来自 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP报告基因小鼠的隐窝12小时，并 在指定的天数进行成像。Lgr5⁺细胞是浅灰色的且用白色箭头指示。d：用 他莫西芬体外刺激来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP隐窝的7天 长类器官12小时，培养指定的天数并成像。YFP荧光(浅灰色)显示分散 的单YFP⁺细胞(第1天)在随后的5天内在体外产生多个后代。绒毛结构 在第1-1.5天内快速生长，随后形成新的绒毛结构(白圈)。观察到YFP⁺细胞向绒毛结构迁移。

图8.单分选的Lgr5⁺干细胞产生整个隐窝-绒毛结构。

a：将从Lgr5-EGFP-ires-CreERT2肠制备的Lgr5-GFP⁺细胞(底图)与 野生型同窝细胞(littermate)进行比较(顶图)。将GFP⁺细胞分成两群：GFP ^高和GFP^低。b：对新鲜分离的隐窝的共聚焦显微镜分析显示GFP^高存在于 CBC细胞中(黑色箭头)，GFP^低位于CBC上(白色箭头)。c：所分选的GFP ^高细胞。d：培养14天后分选的1000个GFP^高细胞(左)和GFP^低细胞(右)。 e-f：分选后14天，单一GFP^高细胞形成隐窝的类器官，Lgr5-GFP⁺细胞(浅 灰色细胞)和帕内特细胞(白色箭头)位于隐窝底部。比例尺：50μm。f：更 高放大倍数的e中的隐窝基部。g：为了观察增殖的细胞，将类器官与胸 苷类似物EdU(浅灰色，用白色箭头指示实例)一起培养1小时，培养之 后将其固定。观察到只有隐窝结构并入了EdU。复染剂：DAPI(深灰色)。

图9.a：单个孔中分选的单细胞的集落形成效率。给出4个单独实验 的平均值，其中每个实验中肉眼检查100个细胞，然后追踪生长。b：单 个GFP^高细胞成功生长的实例。c：每个单个类器官的细胞数，给出的是5 个生长的类器官的平均值。d：将来自单细胞来源的类器官的单细胞悬液 进行再接种，并生长2周。

图10.单个孔中分选的单细胞的集落形成能力。单个GFP^高细胞成 功生长的实例。箭头指向作为标志的尘粒。比例尺：50μm.

图11.来源于单个干细胞的类器官的组成。a-d为以下的三维重建共 聚焦图像：a：浅灰色的绒毛蛋白(衬于中央腔的肠上皮细胞的顶部)，b：用 白色箭头指示Muc2染色(杯状细胞)，c：浅灰色的溶菌酶(帕内特细胞)， d：浅灰色的嗜铬粒蛋白A(肠内分泌细胞)。用DAPI对细胞核进行复染。 e-g：石蜡切片染色e：黑色的碱性磷酸酶(衬于中央腔的肠上皮细胞的顶 部)，f：深灰色的PAS(杯状细胞)，g：深灰色的溶菌酶(帕内特细胞)，h：深 灰色的突触素(肠内分泌细胞)。i-p：隐窝的类器官的电子显微镜切片表明 存在肠上皮细胞(i)、杯状细胞(j)、帕内特细胞(k)和肠内分泌细胞(l)。m/o： 低倍镜隐窝图像表明不存在基质细胞。n-o：更高放大倍数的m。n：如微 绒毛长度的差异所指示(黑色箭头)，朝向类器官的腔室的刷边缘的成熟。 p：绒毛结构低倍镜图像。Lu：充有凋亡体并衬有极化的肠上皮细胞的隐 窝的类器官的腔。G：杯状细胞；EC：肠内分泌细胞；P：帕内特细胞； 星号：基质胶。比例尺：5μm(m，p)，1μm(n，o)。

图12.体内隐窝和体外培养的隐窝之间的电子显微镜图像比较。

a、b：正常肠：隐窝基部底面具有结缔组织(箭头)。为了比较，类器 官的c-g图像也在隐窝基部进行采集。d：顶膜的高放大倍数图像；两个 相邻细胞的膜之间具有细胞间裂缝(箭头)。观察到桥粒(箭头头部)，然后 是细胞间裂缝。e：基部的高放大倍数图，其中两个相邻细胞的膜之后可 以为细胞间裂缝。这些图像与来自正常小鼠肠的a和b相似。这些细胞 间裂缝可能是由乙醛固定过程中的渗透冲击引起的。f、g：组成类器官的 所有细胞都处于健康的状态，并且没有大的空泡或其它胁迫迹象。可以 观察到有丝分裂图(c)，在每个细胞中都有多个核孔(f，箭头)和完整的线 粒体。可以看到ER和高尔基体(g)，并没有任何膨胀的迹象。没有核破 裂、核溶解或核固缩迹象。因此，没有观察到细胞裂解或凋亡的迹象。 类器官腔中的细胞显示预期的凋亡特征，因为可在正常小鼠的肠中观察 到这个现象。f显示肠内分泌细胞的另一个实例。Mi：有丝分裂的细胞， Lu：腔，EC：肠内分泌细胞，G：高尔基体。

图13.同样可以维持培养结肠来源的隐窝。利用与小肠隐窝相同的 培养条件，来源于结肠的单一分离的隐窝有效地形成隐窝的类器官。通 过重复的隐窝分裂，在第14天时，该结构产生了许多章鱼样隐窝的类器 官。

图14.添加BDNF提高培养效率。在存在EGF、Noggin、R-Spondin 和BDNF的条件下培养单一分离的结肠隐窝。在起始培养后的第0、4和 14天对结肠隐窝的类器官采集的图像。

图15.添加Wnt3a进一步提高结肠隐窝的类器官的培养效率。在存 在EGF、Noggin、R-Spondin的条件下培养单一分离的结肠隐窝。与使用 对照培养基(-Wnt3a)培养结肠的类器官相比，使用Wnt3a条件培养基 (+Wnt3a)将培养效率提高高达30％。

图16.从APC-/-小鼠分离的腺瘤可以在体外生长。将来自APC-/-小 鼠的单个分离的腺瘤解离，并用以上所述的条件进行培养，除了在培养 基中不含R-spondin。a：此处所示的4天时的腺瘤的类器官通常长成简单 的包囊，其包含一个含有凋亡细胞的中央腔。b：更大放大倍数的一个腺 瘤的类器官。c：用β-联蛋白(深灰色)和苏木精(腔中的浅灰色)对一个腺瘤 的类器官进行染色。类器官的外层由具有细胞核β-联蛋白染色的上皮细 胞组成。内腔含有死细胞，死细胞已经摄取苏木精并被染成深灰色。d：更 大放大倍数的上皮细胞外层，其显示出清楚的细胞核β-联蛋白。

图17.添加Wnt3a提高了类器官形成的效率。a：分选出Lgr5-GFP^高细胞，并在正常单一细胞培养条件下(EGF、noggin、R-spondin、Notch 配体和Y-27632，如上文所述的单一细胞培养条件)并且在含有或不含 Wnt3a(100ng/ml)的情况下进行培养。在存在和不存在Wnt3a条件下，培 养类器官的皿的这些图像是有代表性的。b：以100个细胞/孔进行接种， 类器官的数量是接种后14天时的数量。该图表示每皿的类器官数。

图18.R-spondin1作用模型。

当真正的Wnt配体与Frizzled结合并与LRP5/6受体相联时，启动 Wnt/β-联蛋白信号转导。在不存在R-spondin 1的条件下，Wnt信号转导 受细胞表面上的LRP6的量所限，由于DKK1/Kremen1介导的内化而使 LRP6的量保持低水平。R-spondin 1通过拮抗DKK1/Kremen1介导的LRP6 更新而增强Wnt信号转导，导致细胞表面的LRP6水平提高。该图来自 PNAS 104：14700，2007。

图19.在小肠中帕内特细胞与Lgr5⁺干细胞邻近。从 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2敲入小鼠的小肠分离隐窝。此处显示代表性隐 窝的实例。GFP⁺细胞是Lgr5⁺(浅灰色，用黑色箭头指示)，并且其通常与 帕内特细胞邻近(用*指示)。

图20.在不存在活帕内特细胞的情况下，类器官形成效率降低。

将分离的隐窝与1μM Newport Green-DCF(Molecular probe)一起在 PBS+0.1％Pluronic 127(Sigma)中于室温孵育3分钟，随后用PBS洗涤。 在这之后，将隐窝包埋入基质胶中，并用上文所述的标准条件进行培养。

图21.胃的类器官培养的效率。(a)从Lgr5-GFP小鼠的胃幽门部分 离的胃腺的GFP(箭头，指示GFP阳性细胞)和DIC图像。细胞核用DAPI 染色。放大倍数63×；(b)用EGF(E)、R-spondin 1(R)、Noggin(N)、EGF +R-spondin 1(ER)、EGF+Noggin(EN)、EGF+R-spondin 1+Noggin (ERN)、EGF+R-spondin 1+Noggin+Wnt3A(ERNW)或EGF+R-spondin  1+Noggin+Wnt3A+KGF(ERNWK)以100个胃腺/孔进行接种(两个平 行样品)。在2、5和7天后对胃的类器官的数量进行计数。结果显示为2 个独立实验的平均值±标准误。(b)用补充有a中所述的其它生长因子的 Wnt3A重组蛋白(ENRWK)或Wnt3A条件培养基(ENRWCMK)以100个胃 腺/孔进行接种(两个平行样品)。在接种后第7天和第一次传代后的第2 天对出芽的类器官的数量进行计数。

图22.胃的类器官的体外形成。(a)分离的胃腺长成类器官。来自接 种后第1、2、5和7天的差分干涉相差图像。放大倍数10×(第1、2、5 天)。第7天的放大倍数为4×，插图为10×。(b)每4-7天通过机械解离 对培养物进行传代。培养物已生长至少1个月。代表性的图像显示来自 不同代的类器官的出芽结构。第1代(P1)、第2代(P2)和第4代(P4)分别 代表第8、11、20天。

图23.胃腺的标志物(a)来自Lgr5-LacZ小鼠的胃培养物。接种后 第5天，在胃出芽中检测到LacZ表达(参见箭头，指示LacZ阳性细胞(深 灰色))，表明存在Lgr5阳性细胞。放大倍数为20×。(b)Ki67染色(黑色) 显示位于腺样结构基部的阳性增殖细胞。(c)存在于类器官的腔内的半胱 天冬酶3(深灰色)凋亡细胞(d)存在于胃的类器官中的胃粘蛋白5AC(深 灰色)阳性细胞。Lu：类器官腔。放大倍数20×。

图24.胰管可在体外形成胰腺样的类器官。在存在EGF、Noggin、 R-spondin 1和KGF的条件下培养新鲜分离的胰管。来自接种后第0、4 和14天的差分干涉相差图像。

图25.在体外培养约3周后形成胰岛样结构。来自接种后第21天的 差分干涉相差图像。

图26.用单独的介质(A)或R-Spondin(B)注射Axin-LacZ小鼠。2天 后，分离胰腺，并通过X-gal染色检测LacZ表达的存在。B的中间的图 显示更大放大倍数的导管，所述导管为LacZ阳性染色，表明Axin-LacZ 沿胰管内衬表达。左图显示位于泡心细胞或闰管细胞中的小导管细胞表 达Axin2-LacZ(用黑色箭头指示实例)。在每幅图的角落显示放大倍数。 在野生型小鼠中进行胰管结扎。在PDL后的不同时间，分离胰腺，并将 获自PDL和非PDL区域的组织切片进行H&E染色。显示每个时间点的 放大倍数(C)。在wt和Axin2-LacZ小鼠中进行胰管结扎。PDL后7天， 分离胰腺，并通过对固定的组织切片(D)或整体固定的器官组织块(E)进行 X-gal染色来测定Axin2-LacZ表达。白色圆圈指示胰腺的结扎部位。PDL 后5天，胰腺组织切片中Ki67的表达(用箭头指示实例)。显示放大倍数。 (F)用R-spondin体内处理2天之后，胰腺组织中BrdU的并入(用箭头指 示实例)。显示放大倍数。(G)在从经历PDL或对照手术的小鼠获得的胰 腺组织中，利用Q-PCR测定Lgr5mRNA表达。在PDL胰腺中，对PDL 区域和非PDL区域进行Q-PCR。(H)显示了与TATA盒结合蛋白(tbp)相 比的Lgr5表达的倍数提高，TATA盒结合蛋白是一种管家基因。PDL后 13天，分离胰腺，并用对固定的组织切片进行X-gal染色来测定Lgr5-LacZ 表达。用黑色箭头指示着色细胞的实例(I)。

图27.从野生型小鼠分离胰管组织块之后，在不同时间点所采集的 体外生长在EM中的胰管组织块的图像(A，顶图)。泡心细胞未生长超过 7天，7天后泡心细胞破裂(A，底图)。胰腺组织块在存在或不存在EGF(50 ng/ml)、R-spondin(1μg/ml)、FGF10(100ng/ml)或Noggin(100ng/ml)的 条件下生长。在用新鲜分离的胰腺组织块起始培养后7和14天，采集培 养物图像。无EGF的培养物不能存活超过10天(B)。从Axin2-LacZ小鼠 分离的胰腺组织块在不存在或存在R-spondin(1μg/ml)的条件下培养3 天。X-gal染色显示，仅在存在R-spondin的条件下，3和14天之后的导 管细胞中表达Wnt响应性Axin-LacZ(用白色箭头指示实例)。在腺泡或小 岛细胞中没有检测到X-gal染色(C)。从Lgr5-LacZ小鼠分离导管组织块， 并在不存在或存在R-spondin的条件下培养3天。如X-gal染色所示， Lgr5-LacZ的表达显示芽的顶部上的Lgr5⁺细胞，这与其在PDL后的表达 相似(D)。对获自胰腺组织块并在存在Wnt激动剂R-spondin的条件下进 行培养的细胞进行FACS染色。对细胞进行EpCAM(广谱上皮细胞标志 物)和LacZ染色(荧光素二吡喃半乳糖苷，FDG)。当在存在Wnt信号的条 件下培养胰腺组织块时，Lgr5⁺细胞的百分比显著增加(E)。

图28.从PDL处理后7天的小鼠分离胰腺，并用EpCAM-APC和 LacZ的荧光底物(FluoroReporter试剂盒)对胰腺细胞进行染色，分选，并 在含有50％Wnt3A条件培养基和10mM Y-27632的EM中培养4天。4 天之后，将培养基换成无Wnt和Y-27632的EM培养基。在指定的天数 采集图像，并显示为40×的放大倍数。

图29.将胰腺的类器官从EM转移至DM。从扩增培养基去除FGF10 (即得到DM)的效应诱导分化成为小岛。在DM中培养胰腺的类器官10 天，之后可在体外检测到小岛样结构。显示存在和不存在FGF10的条件 下的培养物的图像(A)，并且通过PCR检测，显示某些分化标志物(Ngn3 和生长抑制素)的表达提高。Hprt是管家基因(B)。在转移至DM之后的几 个时间点，利用PCR评估多个标志物的表达(C)。从胰腺包囊至β细胞样 结构(D)的形态改变伴随某些β细胞标志物的出现，例如通过免疫荧光所 检测的胰岛素和C-肽(E)。正如Ngn3的阳性免疫荧光染色所示，DM中 存在R-spondin是β细胞祖细胞再生所必需的(白色箭头指示实例)(F)。

图30.人胰腺组织块是新鲜分离的，并培养在EM中。在起始培养 之后指定的时间点采集培养物的图像。

图31.体外隐窝培养物产生Wnt配体

(A)Wnt通路的图示。当Wnt配体被分泌时，其可以自分泌或旁分泌 激活Wnt信号通路。Porcupine对于适当的Wnt配体分泌至关重要。IWP 抑制剂抑制Wnt配体分泌。

(B)在如实施例1中所示的正常条件下培养的小鼠的类器官。

(C)小鼠的类器官培养物与1μM IWP一起孵育导致类器官培养物的 细胞死亡。

(D)添加Wnt3a条件培养基增强小鼠的类器官培养物。

(E)通过添加Wnt3a条件培养基挽救IWP诱导的类器官死亡。

(B-E)所示的放大倍数为10×。

图32.人肠隐窝培养的建立

在补充有EGF、Noggin和Rspondin并且含有Wnt3a条件培养基(A， B，E，F)和不含Wnt3a条件培养基(C，D，G，H)的培养基中3天(A、C、 E、G)和5天(B、D、F、H)之后，从小肠(A-D)和结肠(E-H)培养出的人的 类器官。

图33.胃的类器官培养的建立

(A)用EGF(E)、R-spondin 1(R)、Noggin(N)、EGF+R-spondin 1 (ER)、EGF+Noggin(EN)、EGF+R-spondin 1+Noggin(ERN)、EGF+ R-spondin 1+Noggin+Wnt3A(ERNW)、EGF+R-spondin 1+Noggin+ Wnt3A+FGF10(ERNWF)、EGF+R-spondin 1+Noggin+对照条件培养 基+FGF10(ERNCCMF)或EGF+R-spondin 1+Noggin+Wnt3A条件培 养基+FGF10(ERNWCMF)以总共100个胃腺/孔进行接种(两个平行样 品)。在2、5和7天之后，对胃的类器官的数量进行计数。将结果显示为 2次独立实验的平均值±标准误。

(B)用Wnt3A条件培养基(ENRWCM)或补充有FGF10的Wnt3A条 件培养基(ENRWCMF)以总共100个胃腺/孔进行接种(两个平行样品)。培 养7、15(第2代)和60天(第10代)之后，对出芽的类器官的数量进行计 数。

(C)在补充有FGF7/KGF(K)或FGF10(F)的Wnt3A条件培养基 (WCM)+EGF+Noggin和R-spondin中以总共100个胃腺/孔进行接种， 使用的FGF7/KGF(K)或FGF10(F)的浓度为100和1000ng/ml。培养4 天(第7代)之后，对出芽的类器官的数量进行计数。显示了代表性的实验。

(D)分离的胃腺发育成为类器官。接种后1、2、3、4、7天的差分 干涉相差图像。1周后，培养物需要以1∶5或1∶6进行传代。按补充材料 和方法部分所描述进行传代培养和维持。培养15天、3个月、4.5个月和 6个月之后的培养物的代表性图像(放大倍数为10×)。

(E)在对照条件培养基中生长5天的培养物的实例。观察到该培养物 没有生长，并且未能形成腺体结构。在这些条件下，所述培养物存活不 超过7天。

(F)在培养3个月的胃的类器官的全标本包埋E-钙粘附蛋白染色。

图34.单个Lgr5^阳性细胞在体外成为长期存活的胃的类器官。

(A)从Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠的胃中新鲜分离的幽门胃单元 的共聚焦分析。箭头指示GFP^高(灰色)、GFP^低(黑色)和GFp^-ve(白色)的不 同群。

(B)根据GFP表达水平，Lgr5-EGFP^阳性细胞可与GFP^低和GFP^-ve群 相区分。FSC：前向散射。

(C)从单个Lgr5^阳性细胞长成类器官的代表实例。箭头指示第7天时 腺样结构的芽的形成。初始放大倍数：第1-4天为40×放大倍数，第5-6 天为20×放大倍数，第7-8天为10×放大倍数和第9天为5×放大倍数。

(D)将来源于单一Lgr5^阳性细胞的类器官解离，并每5-7天进行传代。 3个月的培养物的代表图像。初始放大倍数：左图为4×放大倍数，右图 为10×放大倍数。

(E)从单个GFP^高细胞长出的14天的胃培养物中的表达Lgr5 EGFP 的细胞的共聚焦分析。观察到Lgr5-GFP^阳性细胞位于腺体结构的基部(白 色箭头；10×放大倍数)。

(F)用胸苷类似物EdU(红色)培养类器官1.5小时。只有腺结构能并 入EdU(白色箭头；20×放大倍数)。复染剂：4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI； 细胞核)。

(G)用他莫西芬体外刺激来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP 报告基因小鼠的单细胞培养物的2周长的培养物20小时，并在指定天数 进行成像。YFP荧光(黄色)显示分散的单个黄色细胞(第1.5天)在体外产 生多个后代。观察到YFP^阳性细胞向中央腔迁移(白色虚线的圆)。

(H)来自Lgr5^阳性单细胞的2月长的培养物的胃特异性基因的表达分 析。培养物保持在高Wnt3A培养基中(左图)或低Wnt3A培养基中(中图)。 观察到胃来源的培养物对肠特异性基因是阴性的(右图)。

(I)培养物在低Wnt3A培养基中保持至少10天。上图：ECad染色 的共聚焦图像(红色，上皮来源的类器官)。复染剂：Hoescht 33345(蓝色)。 下图：用Tff2(褐色，颈粘液细胞)、高碘酸-雪夫(红色，小凹细胞)、MUC5AC (褐色，小凹细胞)和嗜铬粒蛋白A(褐色，肠内分泌细胞)进行染色的石蜡 切片。

实施例

实施例1：小肠隐窝和绒毛的体外培养

材料和方法

小鼠：使用6-12周龄的远交系小鼠。之前描述了 Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2等位基因¹的产生和基因型分型¹。Rosa26-lacZ 或YFP Cre报告基因小鼠获自Jackson Labs。

隐窝分离、细胞解离和培养：通过在4℃下在2mM EDTA/PBS中孵 育30分钟使隐窝从鼠小肠释放。对分离的隐窝进行计数并离心。将500 个隐窝与50μl基质胶(BD Bioscience)混合，并接种于24孔板中。基质胶 聚合之后，添加500μl隐窝培养基(具有生长因子(10-50ng/ml EGF (Peprotech)、500ng/ml R-spondin 1¹¹和100ng/ml Noggin(Peprotech)的改 进DMEM/F12)。对于分选实验，将分离的隐窝于37℃在培养基中孵育 45分钟，随后用玻璃移液管重悬。使解离的细胞通过20-μm的细胞过滤 器。通过流式细胞仪(MoFlo，Dako)分选GFP^高、GFP^低或GFP细胞。通 过前向散射、侧向散射和脉冲宽度参数以及碘化丙啶的负染来为单一活 上皮细胞画门。将分选的细胞收集在隐窝培养基中，并以1细胞/孔埋入 含有Jagged-1肽(Ana Spec，1μM)的基质胶(96孔板，5μl基质胶)中。用 含有Y-27632(10μM)的隐窝培养基(48孔板为250μl，96孔板为100μl) 覆盖。每隔一天添加生长因子，并且每4天更换全部培养基。为了传代， 将类器官从基质胶移出，机械解离成单隐窝结构，并转移至新的基质胶 中。每1-2周以1∶5的比例进行传代。

试剂：鼠重组EGF和Noggin购自Peprotech。人重组R-spondin 1¹¹、 Y-27632(Sigma)、4-羟基他莫西芬(Sigma)和Edu(Invitrogen)用于培养实 验。以下抗体用于免疫染色：抗溶菌酶(Dako)、抗突触素(Dako)、抗BrdU (Roche)、抗β-联蛋白(BD Bioscience)、抗E-钙粘附蛋白(BD Bioscience)、 抗平滑肌肌动蛋白(Sigma)、抗EphB2和B3(R&D)、抗绒毛蛋白、抗Muc2、 抗嗜铬粒蛋白A(Santa Cruz)、抗半胱天冬酶-3(Cell Signaling)。

隐窝分离：将分离的小肠纵向剖开，用冷PBS洗涤。将组织切成约 5mm的小块，再用冷PBS洗涤。将组织块在含2mM EDTA的PBS中冰 上孵育30分钟。去除EDTA介质之后，用冷PBS和10ml移液管用力悬 浮组织块。上清是绒毛部分，将其弃去；用PBS重悬沉淀。再一次用力 悬浮和离心之后，上清富集了隐窝。将该部分通过70μm的细胞过滤器 (BD bioscience)，以去除残留的绒毛。将分离的隐窝于300rpm离心3分 钟，以使隐窝与单细胞分离。最终的部分由基本上纯的隐窝组成，并用 于培养或单细胞解离。

他莫西芬诱导和X-gal染色：为了活化CreERT2，将隐窝与低剂量的 4-羟基他莫西芬(100nM)一起孵育12小时，并在隐窝培养基中培养。按 之前的描述¹进行X-gal染色。在未经4-羟基他莫西芬处理时未观察到染 色。

电子显微镜分析：按之前的描述¹，将包含隐窝的类器官的基质胶于 室温在Karnovsky’s固定剂(2％多聚甲醛、2.5％戊二醛、0.1M二甲砷酸 钠、2.5mM CaCl₂和5mM MgCl₂，pH 7.4)中固定5小时。将样品包埋入 Epon树脂中，用Phillips CM10显微镜(Eindhoven，The Netherlands)进行检 查。

微阵列分析：结肠隐窝、小肠隐窝和类器官的基因表达分析。将从 两只小鼠新鲜分离的小肠隐窝分成两部分。从一部分直接分离RNA (RNeasy微型试剂盒，Qiagen)，将另一部分培养一周，之后进行RNA 分离。我们按照生产商的说明书制备了标记的cRNA(Agilent  Technologies)。在两染料互换实验中，将来自两只小鼠的小肠隐窝和类 器官的差异标记的cRNA分别与4X44k Agilent全小鼠基因组双色微阵 列(G4122F)杂交，得到四个分别的阵列。此外，在两染料互换实验中， 将分离的结肠隐窝与差异标记的小肠隐窝杂交，得到四个分别的阵列。 用Feature Extraction(V.9.5.3，Agilent Technologies)检测微阵列信号和本 底信息。用ArrayAssist(5.5.1，Stratagene Inc.)和Microsoft Excel  (Microsoft Corporation)对所有的数据进行分析。通过扣除局部本底校正 原始信号强度。为了允许计算仅存在于一个通道(小肠隐窝或类器官)或 (小肠隐窝或结肠隐窝)中的特征强度之间的比值，将负值转变为接近0 的正值(局部本底的标准差)。通过应用Lowess算法进行标准化，并且如 果两种(小肠隐窝或类器官)或(小肠隐窝或结肠隐窝)强度均改变或如果 两种强度均小于本底信号的2倍，则滤掉个体特征。此外，滤掉不一致 的特征。数据可在GEO(Gene Expression Omnibus(基因表达汇编)，号 码GSE14594)公布时获得。用Cluster 3(距离：城市街，相关性：平均 连锁)对小肠/结肠隐窝和类器官的标准化的强度(Feature Extraction中处 理过的信号)进行无监督分级集群，并用TreeView可视化。如果基因在 所有阵列中都一致地表现出在类器官或隐窝中提高大于3倍，则认为所 述基因显著改变。

成像分析：用共聚焦显微镜(Leica，SP5)、倒置显微镜(Nikon DM-IL) 或立体显微镜(Leica，MZ16-FA)采集隐窝的类器官的图像。对于免疫组 化，用4％多聚甲醛(PFA)于室温将样品固定1小时，并用标准技术¹加工 石蜡切片。按之前的描述¹进行免疫组化。对于全包埋免疫染色，用分散 酶(Invitrogen)从基质胶分离隐窝的类器官，并用4％PFA固定，随后用 0.1％Triton-X进行透化。按生产商的方案进行EdU染色(Click-IT， Invitrogen)。利用DAPI或ToPro-3(Molecular Probe)对DNA进行染色。 用共聚焦显微镜(Leica，SP5)获取3D图像，并用Volocity软件(Improvision) 重建。

结果

在成年哺乳动物中，肠上皮是自我更新最快的组织。我们最近证实， 在小肠隐窝基部存在大约6循环Lgr5⁺干细胞¹。我们目前已经建立了长 期培养条件，在该条件下单个隐窝经历多次隐窝分裂事件，并同时产生 绒毛样上皮结构，在所述绒毛样上皮结构中存在所有分化的细胞类型。 单分选的Lgr5⁺干细胞也能起始这些隐窝-绒毛的类器官。追踪实验表明， Lgr5⁺干细胞的分级保持在类器官中。我们推断，肠隐窝-绒毛单元是自组 织结构，其可以在不存在非上皮细胞龛的条件下从单个干细胞进行组建。

自我更新的小肠上皮排列成隐窝和绒毛²。细胞在隐窝中新生成，并 在绒毛顶部通过凋亡而丧失，导致小鼠中的更新时间为5天。一直以来 都认为自我更新的干细胞定居在隐窝底部附近，并且产生快速增殖的过 渡放大(TA)细胞。估计每个隐窝的干细胞数量为4-6个。肠上皮细胞、杯 状细胞和肠内分泌细胞由TA细胞发育而来，并且这些细胞继续沿着隐窝 -绒毛轴在结合带中迁移。第四种主要的分化细胞类型是帕内特细胞，其 定居在隐窝底部。我们最近鉴定出了基因Lgr5，其在散布于帕内特细胞 之间的循环隐窝基部柱状细胞中特异性地表达¹。利用将GFP/他莫西芬 诱导型Cre重组酶盒整合入Lgr5基因座中的小鼠，我们通过谱系追踪显 示，Lgr5⁺细胞构成产生所有上皮细胞类型的多能干细胞¹，甚至在Cre 诱导14个月后评估时也是如此³。

尽管已经描述了多种培养体系^4-7，但是还没有建立能维持基本隐窝- 绒毛生理机能的长期培养体系²。

将小鼠隐窝制备物悬浮于基质胶中。隐窝生长需要EGF和R-spondin  1(图1a)。传代需要Noggin(图1b)。培养的隐窝表现出定式(图2a)。上 面的开口迅速闭合，腔充有凋亡细胞。隐窝区经历连续的出芽事件，暗 示隐窝分裂¹⁷。帕内特细胞总是存在于出芽位点。大部分的隐窝是可以 培养的(图2b)。进一步的扩增产生了包含＞40个隐窝结构的类器官，所述 隐窝结构位于衬有绒毛样上皮(“绒毛结构”)的中央腔的周围(图2c-e)。E- 钙粘附蛋白染色显示出单细胞层(数据未显示)。每周将类器官机械解离， 并以1/5的预接种密度进行重新接种。培养＞6个月的类器官没有丧失以 下描述的特征。利用微阵列的表达分析表明，例如当与新的结肠隐窝比 较时，类器官与新鲜分离的小肠隐窝高度相似(图3)。

Lgr5-EGFP-ires-CreERT2隐窝的培养表明，Lgr5-GFP⁺干细胞与帕内 特细胞在隐窝基部混杂在一起。通过细胞核β-联蛋白(图4a，图5)和Wnt 靶基因Lgr5(图2d)和EphB2¹⁸(图4b)的表达所证实的Wnt激活限于隐窝。 凋亡的细胞脱落进中央腔，这是表明体内凋亡的细胞在绒毛顶部脱落的 过程(图4c)。培养超过3个月的类器官的中期染色体涂片(Metaphase  spread)一致地显示40个染色体/细胞(n＝20)(图4d)。意外地，我们没有 发现存在成肌纤维细胞或其它非上皮细胞的证据(图6)。

我们将来自与Cre-可激活的Rosa26-LacZ报告基因小鼠杂交的 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠的隐窝进行培养，以允许谱系追踪。用低 剂量的他莫西芬诱导之后，我们立即观察到单一标记的细胞(图4e，g)。 这些细胞中大于90％产生了完全蓝色的隐窝(图4e-g)，这表明Lgr5-GFP⁺细胞确实保留了干细胞特性。来自Cre-可激活的Rosa26-YFP报告基因19 小鼠的隐窝允许通过共聚焦分析进行谱系追踪。他莫西芬处理之后，我 们立即观察到单一标记的细胞，这些细胞在随着接下来数天内诱导谱系 追踪，在新鲜分离的隐窝(图7a-c)和建立的类器官(图7d)中都观察到该现 象。

最近，在体外从单一干细胞建立了乳腺上皮结构²¹。当分选单一 Lgr5-GFP^高细胞时，这些细胞立即死亡。Rho激酶抑制剂Y-27632显著降 低了这种细胞死亡。发现Notch激动肽²⁴能支持增殖性隐窝²³。在这些 条件下，大量的Lgr5-GFP^高细胞存活并且形成大的隐窝的类器官。当接 种GFP^低后代细胞时，很少形成类器官(图8d)。多个Lgr5-GFP^高细胞与 帕内特细胞在隐窝基部混杂在一起(图8e-f)。EdU(胸苷类似物)的并入表 明隐窝中存在S期细胞(图8g)。

我们以1个细胞/孔分选细胞，肉眼检查单细胞的存在，并追踪随后 的生长。在4个单独实验的每一个中，我们鉴定出并追踪到100个单细 胞。平均大约6％的Lgr5-GFP^高细胞长成类器官，而其余的细胞通常在最 初的12个小时内死亡，据推测是由分离程序所固有的物理和/或生物胁迫 所致。GFP^低细胞几乎不能长成类器官(图9a)。图9b和图10显示从单个 Lgr5-GFP^高细胞长成的类器官。在培养4天时，结构由大约100个细胞 组成，这符合增殖性隐窝细胞的12小时的细胞周期²⁵(图9c)。2周后， 将类器官解离成单细胞，并进行再接种来形成新的类器官(图9d)。按照 每两周一次，该程序可重复至少四次，而不会明显丢失再接种效率。

似乎难以将单一干细胞来源的类器官与来自整个隐窝的类器官区分 开来。帕内特细胞和干细胞位于隐窝底部(图8e、f、图11c，g)。通过绒 毛蛋白⁺成熟的刷边缘和顶部碱性磷酸酶所证实的完全极化的肠上皮细胞 衬于中央腔(图11a、e、i)。杯状细胞(Muc²⁺，图11b；PAS⁺，图11f)和肠 内分泌细胞(嗜铬粒蛋白A⁺，图11d；突触素⁺，图11h)分散于类器官结构 中。利用电子显微镜识别出4种成熟细胞(图11i-1)。不存在非上皮(基质/ 间充质)细胞，通过EM成像进行证实(图11i-p，图12c-g)。隐窝(图11m， o)和中央腔上皮(图11p)两者均由单层极化上皮细胞组成，所述细胞直接 位于在基质胶载体上。这些EM图片的高分辨率图像呈现在图5中。具 有红色E-钙粘附蛋白染色和蓝色细胞核复染的类器官表明类器官上皮的 单层性质(数据未显示)。

公知的是，上皮隐窝与上皮下的成肌纤维细胞密切接触^26-28，并且通 常认为后一种细胞在隐窝基部产生了特化的细胞龛^27、29、30。这种龛会产 生特有的环境来锚定和支持肠干细胞。目前，我们证实，利用限定组的 一致存在的生长信号可以建立自我更新的上皮。尽管如此，分离的干细 胞会以高度定式自发产生不对称性。这迅速导致隐窝样结构的形成，重 新产生的干细胞和帕内特细胞位于其基部，并充有TA细胞。这些隐窝样 结构进入由有丝分裂后的肠上皮细胞组成的绒毛样腔结构中，其中凋亡 细胞被夹断入腔中，这表明细胞在绒毛顶部丢失。意外观察到暴露于均 匀促生长环境中的单细胞能产生不对称的结构，这在Wnt通路的研究上 是非常明显的。尽管所有的细胞均暴露于R-spondin 1，但是只有隐窝中 的细胞表现出激活的Wnt信号转导的特征，即细胞核β-联蛋白和Wnt靶 基因的表达。显然，对Wnt信号转导的差异性响应才是隐窝绒毛轴形成 的核心，而不是对细胞外Wnt信号的差异性暴露。

总之，我们推断，单个Lgr5^阳性肠干细胞能独立于来自其环境的位置 信号而运作，并且其可以产生连续扩增的，自组织的、类似正常的肠道 的上皮结构。所述的培养体系会简化干细胞驱动的隐窝-绒毛生物学研究。 此外，它会为再生医学和基因疗法开辟新的途经。

实施例2结肠隐窝和绒毛的体外培养

材料和方法

Wnt3a条件培养基

将表达Wnt3a配体的细胞系和无Wnt3a配体的相同细胞系(对照培养 基)培养3-4周的时间。一旦细胞达到汇合停止生长时，它们就会产生 Wnt3a。收获培养基，并在TOPflash测定中进行检测、TOPflash测定是 利用TCF反应元件-luc构建体(TOP)和在TCF反应元件中具有突变的相 同构建体(FOP)的荧光素酶测定。对于用于培养的培养基，TOP/FOP的比 应该大于20。当用于培养来再生组织时，将所述培养基稀释成25-50％。

剖开新鲜分离的结肠，用PBS或DMEM洗涤，并将其切成小块。 将组织块与2mM EDTA/PBS一起在4℃下轻轻摇动孵育1小时。去除 EDTA溶液之后，用10ml移液管用力将组织块悬浮于10ml冷PBS中。 弃去含有残渣的第一上清液，并用10-15ml PBS悬浮沉淀物。再一次用 力悬浮组织块之后，上清液富集结肠隐窝。将组织块离心沉淀，与基质 胶混合，并按小肠的类器官培养体系进行培养。将基质胶于37℃孵育5-10 分钟。基质胶聚合之后，添加500μl组织培养基(50％改进DMEM/F12/ 50％Wnt-3a条件培养基，补充了200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml  EGF、1μg/ml R-spondin1、100ng/ml Noggin、100ng/ml BDNF (Peprotech))。每2-3天更新全部培养基。对于传代，用1000μl移液管从 基质胶取出类器官，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶。至 少每两周一次以1∶4的分种率(split ratio)进行传代。在这些条件下，使培 养物维持至少3个月。

结果

与小肠的类器官相比，结肠的类器官生长较慢且效率较低。在与小 肠相同的生长因子条件下，从远端结肠分离的结肠隐窝中小于5％生长并 形成类器官结构(图13)。从结肠的近端部分长出结肠隐窝是困难的。由 于我们在微阵列分析(结肠Lgr5-GFP^高细胞与结肠Lgr5-GFP^低细胞相比) 中发现BDNF(脑源性神经营养因子)的受体trkB的上调，我们确定了 BDNF对结肠的类器官的作用。我们一直能观察到，BDNF+培养中的培 养效率高于BDNF-培养大约2倍。通常，一个结肠的类器官含有大约10 个隐窝结构(图14)。没有检测到帕内特细胞，这符合它们的来源。与小 肠的类器官相比，结肠隐窝在隐窝基部没有产Wnt-3a的帕内特细胞，因 此补充Wnt-3能提高结肠隐窝的培养效率，但是对小肠隐窝没有作用。 通常，当添加Wnt-3a条件培养基时，我们获得了高达30％的培养效率(图 15)。

总之，利用上述条件，可以在体外保持和增殖来源于小肠和结肠的 隐窝，使得该所述的第一培养方法能在人工体系中产生肠上皮。

实施例3腺瘤的体外培养

材料和方法

(参见实施例1)

结果

一直以来都难以在体外培养腺瘤。由于上述条件从小肠和结肠成功 地培养出健康的隐窝，因此意图确定相似的条件是否能在体外维持腺瘤。 使用2.5mM EDTA从APC-/-小鼠分离出腺瘤之后，在与上述相似的条件 下培养单个腺瘤。重要的是，这些条件足以维持腺瘤的体外生长，而 R-spondin已变得多余。通过以下事实可以容易解释这点：不再需要诱导 Wnt信号通路，因为这些细胞中不存在APC，所以它们会自动产生细胞 核β-联蛋白。这使得Wnt激动剂R-spondin在腺瘤的体外培养中是多余 的。图16a和更大放大倍数的图16b显示，在正常的隐窝的类器官中可 以看到隐窝发芽带有中央腔，但与此相反，腺瘤的类器官只生长为包囊。 死细胞脱落进腔中，这可以从腔中存在的大量的死细胞推断出。在正常 的隐窝的类器官中，细胞核β-联蛋白仅见于隐窝-结构的基部(参见图4a)。 在腺瘤的类器官(图16c和更大放大倍数的图16d)中，细胞核β-联蛋白可 见于每个上皮细胞中，这符合APC基因突变。这些类器官可以无期传代。

还检测了利用前述的培养条件(无R-spondin)来源于 Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2/APCflox/flox小鼠中的腺瘤的单一Lgr5+分选细 胞是否能在体外形成相似的腺瘤的类器官。事实上，情况正是如此，所 获得的类器官与利用完整腺瘤作为体外培养起始材料所获得的类器官在 结构上高度相似(数据未显示)。

实施例4检测其它Wnt激动剂的效果

为了确定其它Wnt激动剂是否与R-spondin具有相同的效果，即促 进隐窝-绒毛的类器官的体外形成，将可溶性Wnt3a添加到Lgr5⁺分选的 单细胞中，并评价其对体外隐窝-绒毛形成的效果。

材料和方法

分选出Lgr5-GFP^高细胞，并在正常单细胞培养条件(如上文所述的用 于单细胞的EGF、noggin、R-spondin、Notch配体和Y-27632)之外，添加 或不添加Wnt3a(100ng/ml)进行培养。我们接种100个细胞/孔，并在接 种后14天，对类器官的数量进行计数。

分离的隐窝与1μM Newport Green-DCF(MolecularProbes)一起在 PBS+0.1％Pluronic 127(Sigma)中于室温下孵育3分钟，随后用PBS洗涤。 洗涤之后，将隐窝包埋入基质胶中，并使用上文所述的标准条件进行培 养。

结果

在不存在R-spondin的条件下添加Wnt3a对集落形成没有任何效果： 在不存在R-spondin的条件下形成很少集落，甚至没有形成集落。然而， 在存在R-spondin的条件下，仅在存在Wnt3a时观察到类器官形成的效率 提高(图17)。这表明，两种因子彼此支持它们的能力，从而刺激并支持 干细胞分化为完整的上皮细胞层形成所必需的所有细胞。目前的假说是 在信号转导通过Frizzled之前，R-spondin负责抑制Frizzled的共受体LRP6 的内化。一旦Wnt因子与Frizzled和共受体LRP6结合，Wnt信号通路被 激活³¹。当细胞表面存在LRP6时，将发生Wnt激活(图18)。因此，如果 培养基中不存在R-spondin，Wnt3a将不能激活Wnt通路，因为LRP6被 内化，并且不能与Wnt因子联合用于信号转导，从而阻止了Wnt通路的 激活。

Wnt3a是一种可溶性因子，在生理条件下，其由帕内特细胞产生。 这些细胞通常邻近于干细胞(图19)，假设的是这些细胞支持肠上皮细胞 层的不断分化。同样由帕内特细胞分泌的其它Wnt因子是Wnt6、9b和 11。据推测，Wnt6与Wnt3a对干细胞分化具有相同的效应。这些发现支 持这样的看法，帕内特细胞对干细胞龛的形成至关重要。这些数据是出 人意料的，因为对于干细胞龛已有很多推测，但是目前还没有实验数据 支持存在这样的龛。对存在干细胞龛的其它支持来自帕内特细胞被选择 性杀死的实验。从小鼠小肠分离隐窝，并在存在特异性地去除帕内特细 胞的锌螯合剂³²的条件下进行体外培养。以非常低的浓度使用锌螯合剂 并持续很短的时间，使得其仅影响隐窝中的帕内特细胞而不影响其它细 胞。用锌螯合剂处理之后，对类器官形成进行评价。当在初始隐窝中不 再存在帕内特细胞时，观察到类器官形成显著降低(图20)。在存在Wnt3a 的条件下，该降低被部分地恢复(数据未显示)。这支持了帕内特细胞在维 持干细胞龛中的作用，其支持隐窝中Lgr5⁺干细胞的分化。

实施例5培养条件同样支持胃的类器官的生长

胃由3个局部解剖区域(胃底部，胃体部和胃窦)和2个功能性腺区(泌 酸的和幽门的)。泌酸腺区包括该器官的80％，而幽门部包括该器官的 20％。哺乳动物胃上皮被组织成由平面状表面上皮、短的小凹和长的腺体 组成的胃单元。小凹衬有粘液分泌细胞，而腺体由分散于以下三个区域 中的分泌细胞组成：峡部、颈部和基部。胃上皮不断地更新。我们实验 室进行的追踪研究表明，位于腺体基部的LGR5阳性细胞满足干细胞性 的定义(Barker et al.准备中)。迄今而至，胃单层培养物不能覆盖胃单元 的特征，胃单元是由数种分化的胃细胞形成。此外，3-D培养法体系仅报 道了重建高度分化的胃表面粘液细胞，而没有出现任何内分泌细胞。而 且，这些培养仅进行了7天的时间，因此表现出缺乏自我更新的能力 (Ootani A，Toda S，Fujimoto K，Sugihara H.Am J Pathol.2003  Jun；162(6)：1905-12)。这里我们开发出一种从鼠胃的幽门部分离胃单元的 方法，并且已开发出一种能表现出更长保持时间的3D-培养体系。

材料和方法

胃单元分离

将分离的胃纵向剖开，并用冷的改进DMEM/F12(Invitrogen)洗涤。 在体视镜下，切下幽门部，并与胃体和前胃分离，用镊子小心地将幽门 粘膜与肌肉层分离。然后，将组织切成大约5mm的小块，并再一次用冷 的分离缓冲液(Na₂HPO₄ 28mM+KH₂PO₄ 40mM+NaCl 480mM+KCl 8 mM+蔗糖220mM+D-山梨醇274mM+DL-二硫苏糖醇2.6mM)洗涤。 将组织块与分离缓冲液一起在5mM EDTA中于4℃下轻轻摇动孵育2小 时。去除EDTA溶液之后，用10ml移液管将组织块用力地悬浮于10ml 冷的分离缓冲液中。弃掉含有死细胞的第一上清液，并用10-15ml冷的 分离缓冲液悬浮沉淀物。再一次用力悬浮组织块之后，上清液富集胃单 元。每10-20次悬浮，新鲜的冷的分离缓冲液替换上清液，并将上清液保 存在冰上，检测胃单元的存在。重复该步骤直到胃单元完全释放，通常 为4-5次。将富集胃单元的悬液以600rpm离心2-3分钟，以使分离的胃 单元与单细胞分离，并将沉淀物用来培养。

胃培养

按以前部分的描述，通过与5mM EDTA一起于4℃下孵育2小时而 使含有腺体、峡部和凹区的整个胃单元与鼠胃的幽门部分离。对分离的 胃单元进行计数并沉淀。将100个胃单元与25μl基质胶(BD Bioscience) 混合，接种到48孔组织培养板上，并于37℃孵育5-10分钟，直到基质 胶完全聚合。聚合之后，添加250μl组织培养基(改进DMEM/F12，并补 充有B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGF、1μg/ml  R-spondin 1、100ng/ml Noggin、100ng/ml Wnt3A、50或100ng/ml KGF)。 每2天更换全部培养基。为了传代，用1000μl移液管将类器官从基质胶 移出，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶。以1∶4的分种率每 周1次或2次进行传代。在这些条件下，培养物维持了至少1个月。

试剂

改进DMEM/F12和补充物N2和B-27无血清补充剂购自Invitrogen， N-乙酰半胱氨酸购自Sigma。鼠重组EGF、Noggin和人KGF购自 Peprotech，Wnt3A重组蛋白购自Stem Cell Research。对于提到的生长因 子，仅检测了不同浓度的R-Spondin 1和KGF。在50ng/ml时，R-Spondin  1抑制培养物生长。可以以50或100ng/ml使用KGF，但是浓度为100 ng/ml时，出芽效率较高。

按之前所述，制备Wnt3A条件培养基(Willert K，Brown JD，Danenberg  E，Duncan AW，Weissman IL，Reya T，Yates JR 3rd，Nusse R.Nature.2003 May 22；423(6938)：448-52)。

免疫组化和成像分析

对于X-gal染色，用配制在100mM MgCl₂ PBS溶液中的0.25％戊二 醛(Sigma)，将类器官于室温下直接固定于基质胶中1-2小时。之后，用 洗涤溶液(配制在PBS中的0.01％脱氧胆酸钠+0.02％NP40+5mM  MgCl₂)洗3次，并在存在0.21％K₄Fe(CN)₆和0.16％K₃Fe(CN)₆的条件下， 与1mg/ml X-Gal(Invitrogen)一起于37℃下孵育16小时。在PBS中洗涤 之后，用含2％PFA的PBS在室温下对培养物进行后固定15分钟。所有 的试剂均获自Sigma。

对于免疫组化，用胰酶(Tryple Select，Invitrogen)从基质胶分离类器 官，用4％的PFA于室温下将分离的类器官固定1小时，并包埋入石蜡中。 用标准技术加工石蜡切片，并按以前所述进行免疫组化。使用以下抗体： 抗小鼠Ki67(克隆MM1，Monosan)(1∶200)、抗兔切割的半胱天冬酶-3 (Cell Signaling Technology)(1∶400)和抗人胃粘蛋白5AC(Novocastra clone  45M1)(1∶200)。在所有情况下都进行柠檬酸盐缓冲液抗原回收。用Mayer 氏苏木素复染切片。

用倒置显微镜(Nikon DM-IL)或共聚焦显微镜(Leica SP5)来采集胃的 类器官和分离的胃腺的图像。

结果

目前，胃培养物都是单层生长。然而，单层培养物缺乏覆盖整个胃 单元的特征的能力，胃单元由数种分化的胃细胞(小凹粘液细胞、肠内分 泌细胞和增殖性无粘液细胞)形成。最近我们实验室通过体内谱系追踪表 明，存在于肠隐窝基部的Lgr5阳性细胞是真正的肠干细胞(Barker N，van  Es JH，Kuipers J，Kujala P，van den Born M，Cozijnsen M，Haegebarth A， Korving J，Begthel H，Peters PJ，Clevers H.Nature.2007；449：1003-7)。与肠 上皮一样，胃上皮不断更新。在幽门胃腺单元底部发现Lgr5阳性细胞， 追踪研究表明，这些LGR5阳性细胞能表现出自我更新能力和多潜能能 力而满足干细胞性的定义(Barker et al.准备中)。由于我们已经能从单个 Lgr5+细胞培养出3-D结构的肠隐窝，因此意图确定相似的条件是否能维 持幽门胃单元的体外生长。

用5mM EDTA分离胃腺单元之后，将胃腺(图21a)悬浮于基质胶中。 胃培养物生长需要EGF(50ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、R-spondin 1(1 μg/ml)和Wnt3A(100ng/ml)(图21b)。KGF(50或100ng/ml)对于出芽事 件的形成的是必需的，并且因此对培养物的扩增是必需的。因此，培养 的幽门单元表现同肠隐窝的类器官一样。单元开放的上部分是封闭的， 并且腔充有凋亡细胞。新形成的胃的类器官经历连续的出芽事件(表明腺 体分裂)，同时维持它们的极性，胃腺在中央腔出芽。当使用Wnt3A条件 培养基时，检测到出芽形成的效率显著提高(图21c)，这表明出芽形成和 形态发生的Wnt剂量依赖性，所述Wnt3A条件培养基表现出的Wnt活 性高于重组Wnt3A重组蛋白10-100倍。

类器官培养至少1个月，而没有丧失所述特性。每周通过机械解离 将类器官以1∶4进行传代(图22)。Lgr5-LacZ幽门胃单元的培养表明，胃 的类器官中存在Lgr5阳性干细胞(图23a)。如Ki67染色所证明，增殖性 细胞位于腺样结构的基部(图23b)，而发现凋亡的半胱天冬酶3阳性细胞 被挤进腔中(图23c)。胃粘蛋白5AC(MUC5AC)是胃小凹细胞(也称为小 凹细胞)的特异标志物。在类器官中发现MUC5AC阳性细胞，这表明至 少一种分化的胃细胞谱系的存在(图23d)。然而，没有检测到内分泌腺来 源的细胞。因此，需要其它因子。所述因子包括促胃液素释放肽、Hedgehog 和Notch家族的激活剂或抑制剂、Wnt通路的其它激活剂和BMP家族的 其它抑制剂、TGF家族的激活剂。

实施例6a胰腺的类器官可在体外生长

材料和方法

将新鲜分离的胰腺切成小块，并在定轨摇床(80rpm，37℃)中，在 DMEM(Invitrogen)中与消化酶混合物(300U/ml XI型胶原酶(Sigma)、0.01 mg分散酶I(Roche)和0.1mg DNA酶)一起孵育10分钟。孵育之后，通 过机械吹打使组织块温和地解离。使未消化的组织块以正常重力沉降1 分钟，并将上清液转移至新管中。使上清液通过70μm的细胞过滤器， 并用DMEM洗涤残留物。用DMEM冲洗倒转的细胞过滤器来收集细胞 过滤器上残余的组织块，并将其离心沉淀。这些组织块主要由胰腺腺泡 组织组成，并且包含胰管。将沉淀与基质胶混合，并按照小肠的类器官 培养体系(参见实施例1的材料和方法)进行培养。将基质胶于37℃孵育 5-10分钟。在基质胶聚合之后，添加500μl组织培养基(补充有B27、N2、 200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGF、1μg/ml R-spondin 1、100ng/ml  Noggin、50或100ng/ml KGF(Peprotech)的改进DMEM/F12)。每2天添 加生长因子。每4-6天更换全部培养基。对于传代，用1000μl移液管将 类器官从基质胶移出，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶中。 以1∶4的分种率每周1次或2次进行传代。在这些条件下，培养物维持至 少2个月。

结果

在EGF存在下培养3-4天之后，胰腺组织形成了简单的包囊结构。 Noggin和R-spondin协同增加了包囊结构的大小，但是不影响类器官的 形态发生。KGF显著提高出芽形成和培养效率。利用最佳的生长因子组 合(EGF、Noggin、R-spondin 1和KGF)，在生长因子的最佳组合中，大 于80％的胰管生长。

一旦取出培养物中的胰管，胰管立即密封结构的两端，形成简单的 结构。在起始培养之后7天，大约20％的类器官开始形成出芽结构(图24)。 胰管快速增殖，这与腺泡组织相反，腺泡组织生长非常缓慢。

有趣的是，在类器官传代之后，起始培养之后大约2-3周，观察到胰 岛样结构(图25)。在传代之前通常没有观察到这些小岛样结构。这些小 岛存活至少7天，但增殖非常缓慢或根本不增殖。这些小岛样结构与存 在于健康胰腺组织中的郎格罕氏胰岛类似。这类小岛含有分别产生胰高 血糖素和胰岛素的α细胞和β细胞等。所观察到的小岛样结构含有表达 胰岛素、神经发生素3和Pdx-1的细胞。检测数种生长因子，以确定它 们是否能增加来源于胰腺组织的类器官中胰腺β细胞的存在。候选生长 因子包括环巴胺(Sonic-hedgehog抑制剂)、激活素、GLP(胰高血糖素样肽) 及其衍生物(Exendin4)、促胃液素和烟酰胺。

实施例6b胰腺的类器官可在体外生长

材料和方法

将新鲜分离的胰腺切成小块，并在定轨摇床(80rpm，37℃)中，在 DMEM(Invitrogen)中与消化酶混合物(300U/ml XI型胶原酶(Sigma)、0.01 mg/ml分散酶I(Roche)和0.1mg/ml DNA酶)一起孵育10分钟。孵育之后， 通过机械吹打使组织块温和地解离。使未消化的组织块以正常重力沉降1 分钟。用消化酶混合物对未消化的组织块再消化10分钟。重复该消化步 骤直到未消化的组织块主要由胰管组成。在显微镜下从未消化的组织块 手动挑出胰管结构。将该胰管与基质胶混合，并按照小肠的类器官培养 体系(参见实施例1的材料和方法)进行培养。将基质胶于37℃孵育5-10 分钟。在基质胶聚合之后，添加500μl组织培养基(补充有1×Glutamax、 青霉素/链霉素、10mM Hepes、B27、N2、10mM N-乙酰半胱氨酸、10nM [Leu¹⁵]-促胃液素I、100nM Exendin4、10mM烟酰胺、50ng/ml EGF、1 μg/ml R-spondin 1、100ng/ml Noggin、50或100ng/ml FGF7(KGF)或 FGF10(Peprotech)的改进DMEM/F12)。每2天更换培养基。对于传代， 用1000μl移液管将类器官从基质胶移出，机械解离成小组织块，并转移 至新鲜的基质胶中。以1∶4的分种率每周1次或2次进行传代。在这些条 件下，培养物维持至少10个月。

结果

在EGF存在下培养3-4天之后，胰腺组织形成了简单的包囊结构。 Noggin和R-spondin协同增加了包囊结构的大小，但是不影响类器官的 形态发生。FGF7(KGF)/FGF10显著提高出芽形成和培养效率。利用最佳 的生长因子组合(EGF、Noggin、R-spondin 1和FGF7(KGF)/FGF10)，在 生长因子的最佳组合中，大于80％的胰管生长。

一旦从培养物中取出胰管，胰管快速密封结构的两端，形成简单的 结构。在起始培养7天之后，大约80％的类器官开始形成出芽结构(图24)。 胰管快速增殖，这与腺泡组织相反，腺泡组织的生长非常缓慢。

有趣的是，类器官在传代之后，起始培养大约2-3周之后，观察到胰 岛样结构(图25)。在传代之前通常没有观察到这些小岛样结构。这些小 岛存活至少14天，但增殖非常缓慢或根本不增殖。这些小岛样结构与存 在于健康胰腺组织中的郎格罕氏胰岛类似。这类小岛含有分别产生胰高 血糖素和胰岛素的α细胞和β细胞等。所观察到的小岛样结构含有表达 胰岛素、神经发生素3和Pdx-1的细胞。检测数种生长因子，以确定它 们是否能增加来源于胰腺组织的类器官中胰腺β细胞的存在。候选生长 因子包括环巴胺(Sonic-hedgehog抑制剂)、激活素、GLP(胰高血糖素样肽) 及其衍生物(Exendin4)、促胃液素和烟酰胺。

实施例7通过驱动Wnt/Lgr5再生响应而进行的成体胰腺祖细胞的体外 无阻碍扩增

材料和方法

小鼠、试剂和组织

从以下小鼠获得胰腺组织：Axin-LacZ敲入小鼠(Lustig et al.Mol.Cell. Biol.2002)、Lgr5-LacZ敲入小鼠(Barker et al，2007)、Lgr5-GFP小鼠(Barker  et al，2007)。用100μg纯化的人R-spondin 1(由A.Abo，Nuvelo Inc，CA， USA惠赠)腹腔注射Axin-LacZ小鼠，并在48小时以后处死，用于胰腺 中LacZ的表达分析。

胰管结扎按照(Wang et al.，1995)所述的在大鼠中进行结扎的方法并 进行某些较小的修改。PDL的实验步骤如下：用氟阿尼酮∶芬太尼∶咪达唑 仑的混合物分别以3.3mg/Kg、0.105mg/Kg和1.25mg/Kg的剂量进行腹 膜内注射来麻醉动物。以仰卧的姿势放置动物，将腹部表面去毛，并用 抗菌溶液(碘液)清洁。然后，从剑突开始在上前部腹壁制造正中切口，暴 露胰腺。在解剖显微镜下，定位胰的脾叶，并用7-0聚丙烯缝线单丝在距 胃叶管的接点远端约1mm处结扎胰管。手术后，皮下给予剂量为 0.01-0.05mg/Kg的止痛剂丁丙诺啡。然后，用5-0丝线缝合腹壁和皮肤。

按实施例6所述处理新鲜分离的胰腺，将得到的胰腺组织块在以下 所述的条件下培养。机械分离出主胰管和胰管的第一分支。将组织块切 成小块，并在定轨摇床(80rpm，37℃)中，在DMEM(Invitrogen)中与消 化酶混合物(300U/ml XI型胶原酶(Sigma)、0.01mg/ml分散酶I(Roche) 和0.1mg/ml DNA酶)一起孵育30分钟。消化后，大多数腺泡细胞从组织 块释放。使主要由胰管细胞组成的未消化的组织块以正常重力沉降1分 钟，弃掉上清液。在用PBS洗涤三次之后，将未消化的组织块在室温下 与2mM EDTA/PBS一起孵育30分钟。用力吹打组织块，并以正常重力 沉降1分钟。将富集导管细胞的上清液转移到新管中，并用PBS洗涤三 次。将导管细胞离心沉淀，并与基质胶混合。将基质胶于37℃孵育5-10 分钟。在基质胶聚合之后，添加500μl扩增培养基(补充有1×Glutamax、 青霉素/链霉素、10mM Hepes、B27、N2、1mM N-乙酰半胱氨酸、10nM [Leu¹⁵]-促胃液素I、100nM Exendin4、10mM烟酰胺、50ng/ml EGF、1 μg/ml R-spondin 1、100ng/ml Noggin、50或100ng/ml FGF7(KGF)或 FGF10(Peprotech)的改进DMEM/F12)。每2天更换全部培养基。对于传 代，用1000μl移液管将类器官从基质胶移出，机械解离成小组织块，并 转移至新鲜的基质胶中。以1∶4的分种率每周1次进行传代。在这些条件 下，培养物维持至少2个月。对于分化，将扩增培养基换成分化培养基(补 充有Glutamax、青霉素/链霉素、10mM Hepes、B27、N2、200ng/ml N- 乙酰半胱氨酸、10nM[Leu¹⁵]-促胃液素I、100nM Exendin4、50ng/ml EGF、1μg/ml R-spondin 1、100ng/ml Noggin的改进DMEM/F12)。

FGF10获自Peprotech。BrdU获自Sigma。

Q-PCR

利用RNA小型试剂盒(Quiagen)分离RNA，并用莫洛尼鼠白血病病 毒逆转录酶(Promega)进行逆转录。在热循环仪中扩增cDNA。

以下列出所用的引物。

mmTBP(正向)：TATTGTATCTACCGTGAATCTTGG

mmTBP(反向)：CAGTTGTCCGTGGCTCTC

Lgr5(正向)TCCAACCTCAGCGTCTTC

Lgr5(反向)TGGGAATGTGTGTCAAAG(Tm＝57℃)

PCR

为了区分基因组DNA，将所有的引物设计成位于内含子序列侧翼或 跨越内含子序列。

Hprt(F)AAGTTTGTTGTTGGATATGC

(R)CATCTTAGGCTTTGTATTTGG(Tm)57℃，106bp

Ngn3(F)TCCTCGGAGCTTTTCTACGA

(R)TGTGTCTCTGGGGACACTTG(Tm)60℃，239bp/373bp(基因组 条带)

Pax6(F)AACAACCTGCCTATGCAACC

(R)ACTTGGACGGGAACTGACAC TM 60℃，206bp

葡萄糖激酶(F)AAGATCATTGGCGGAAAG

(R)GAGTGCTCAGGATGTTAAG(Tm)57℃193bp

嗜铬粒蛋白A(F)GCTGACAGCAGAGAAGCGGCT

(R)GACAGGCTCTCTAGCTCCTGG(Tm)60℃231bp

Glut2(slc2a2)(F)AAGTTGGAAGAGGAAGTCAG

(R)AGACCTTCTGCTCAGTCG(Tm)57℃124bp

胰岛素(F)TTTGTCAAGCAGCACCTTTG

(R)TCTACAATGCCACGCTTCTG(Tm)57℃，214bp

生长抑制素(F)GAGGCAAGGAAGATGCTGTC

(R)GGGCATCATTCTCTGTCTGG(Tm)57℃，214bp

胰高血糖素(F)TTACTTTGTGGCTGGATTGCTT

(R)AGTGGCGTTTGTCTTCATTCA(Tm)57℃，149bp

图像分析。

利用Leica SP5共聚焦显微镜、倒置显微镜(Nikon DM-IL)或立体显 微镜(Leica，MZ16-FA)采集隐窝的类器官的图像。对于免疫组化，在室 温下用4％多聚甲醛(PFA)对样品固定1小时，并用标准技术(Barker et al， Nature 2007)加工石蜡切片。按以前所述(Barker et al，Nature 2007)进行免 疫组化。对于全包埋免疫染色，用分散酶(Invitrogen)从基质胶分离胰腺的 类器官，并用4％PFA固定，随后用0.1％Triton X-100进行透化处理。以 下抗体用于免疫组化：抗BrdU(Amersham)、抗Ki67(Dako)、抗胰岛素 (Sigma)、抗C-肽(Cell signaling)、抗Ngn3(Developmental hybridoma studies  bank)。

用DAPI或ToPro-3(Molecular Probes)对DNA进行染色。用共聚焦 显微镜获得三维图像。按实施例5中的免疫组化和成像分析进行X-gal 染色。

FACS

在存在或不存在R-Spondin(1μg/ml)的条件下所培养的胰腺的类器 官，并通过机械方式或酶学方式(TrypLE)从基质胶取出胰腺的类器官。用 TrypLE在37℃下对分离的类器官再消化10分钟。使解离的细胞通过40 μm细胞过滤器(BD bioscience)，并用APC偶联的抗EpCAM(eBioscience) 进行染色。利用FluoReporter试剂盒(Invitrogen)，按照生厂商的方案对 LacZ进行染色。用脉冲宽度、侧向散射参数和碘化丙啶染色对单一活细 胞进行画门。

单一Axin2-LacZ阳性胰腺细胞的体外扩增

PDL处理之后7天，从小鼠分离胰腺，并按上述分离胰管。分离的 胰管与TrypLE Express(Invitrogen)一起于37℃孵育20分钟，随后使其通 过40μm细胞过滤器(BD bioscience)。按实施例7中所述用EpCAM-APC 和LacZ的荧光底物(FluoroReporter试剂盒)对细胞进行染色。分析细胞， 并用流式细胞仪(MoFlo；Dako Cytomation)分选单个活的上皮细胞，并将 其收集在EM培养基中。离心沉淀分选的细胞，使其与基质胶混合，并 用含有50％Wnt条件培养基和10mM Y-27632的EM培养基培养4天。4 天之后，将培养基换成无Wnt和Y-27632的EM培养基。

结果

可以培养来源于小肠的单个Wnt依赖性的Lgr5⁺干细胞，从而形成连 续扩增的肠样的类器官(Sato et al，2009)。在健康的成体胰腺中，Wnt通 路是无活性的，并且因此Lgr5是不表达的。当通过部分导管结扎(PDL) 造成损伤时，我们发现Wnt通路变得十分活跃，同时在再生导管的出芽 处出现Lgr5表达。在改良肠培养体系的条件下，新鲜分离的成体导管组 织块起始Lgr5的表达，并形成出芽包囊，其每周扩增10倍，持续＞30 周。生长刺激物的去除将这些包囊转化成具有不成熟小岛形态的结构， 该结构表达内分泌腺和β细胞标志物。来自受损胰腺的单个Wnt刺激的 细胞也可以起始这些长期的培养。我们推断，当在优化条件下培养时， 海弗利克限制(Hayflick limit)不适用成熟祖细胞。因此，有利于器官特异 性成体干细胞扩增的培养方法可以提供基于ES或iPS的组织再生的备选 方案。

尽管很详细地了解胚胎胰腺的外分泌区室和内分泌区室的发育 (Jensen，2004)，但是关于出生后胰腺中小岛细胞的产生却知之甚少 (Bonner-Weir and Weir，2005；Bouwens and Rooman，2005)。遗传谱系追踪 提供了以下证据：在正常的生理条件下和部分胰切除以后，成年小鼠中 先存的β细胞产生了新的β细胞，而不是由干细胞/祖细胞产生新的β细 胞(Dor et al.，2004；Teta et al.，2007)。最近描述了成年小鼠胰腺的管膜中 存在多能祖细胞，在受损的胰腺中该细胞可被活化，从而增加功能性β 细胞的量(Xu et al.2008)。通过在携带Ngn3启动子报告基因的成年小鼠 的胰腺上进行PDL来获得受控损伤，Ngn3编码胚胎小岛细胞祖细胞的主 要开关(Apelqvist et al.，1999；Gradwohl et al.，2000；Gu et al.，2002； Schwitzgebel et al.，2000)，并且其在正常出生后的胰腺中是沉默的(Gu et  al.，2002)。这些β细胞祖细胞的分化是Ngn3依赖性的，并且产生所有 的小岛细胞类型，包括葡萄糖响应β细胞(Xu et al，2008)。目前还不了解 是哪些信号驱动损伤时出现这些祖细胞。这样的观点似乎是重要的，因 为其可以指导设计祖细胞扩增的体外方法。

为了确定Wnt信号转导是否在β细胞祖细胞的诱导中起作用，在成 体胰腺中追踪Axin2-LacZ等位基因的表达。Axin2-LacZ等位基因已被证 实为Wnt信号转导提供可靠的、通常的报告基因(Lustig et al.，Mol.Cell. Biol.2002)。如同预期，该报告基因在成体胰腺中是没有活性的(图26A)。 然而，当我们将Wnt激动剂Rspo1(Kim et al，2005)注射入Axin2-LacZ 小鼠中来激活Wnt信号通路时，我们观察到沿着导管出现Wnt响应细胞， 但是在胰腺泡或胰岛中却没有(图26B)。由于以前仅在胰腺损伤时检测β 细胞祖细胞，因此我们随后检验了在进行PDL造成损伤时，这些细胞中 的Wnt响应是否被生理激活。图26C显示从PDL区域和非PDL区域分 离的胰腺组织切片的H&E染色。如之前所报道的(Abe et al.1995)，5天 之后腺泡细胞凋亡，并通过未完全了解的机制被新形成的导管结构所替 代。7天之后，还观察到小岛数量(小岛再生)和小岛大小的增加(如星号指 示)。这表明PDL是成功的。Axin2-LacZ报告基因特定地沿着胰腺的结 扎部位的导管被激活，而未结扎部位没有表现出该响应(图26D和E)。而 且，通过Ki67染色所测定的增殖响应主要局限于结扎部位的导管，而在 未结扎部位的导管中，没有检测到细胞核Ki67(图26F)。这类似于在用 R-Spondin处理之后的胰腺中检测到增殖性的BrdU阳性细胞(图26G)。

我们已经证实，在肠中某些Wnt响应细胞群是干细胞(Barker et al， 2007)。该细胞群的标志物是Lgr5。Lgr5基因与Axin2类似，是Wnt响 应基因。而在肠和皮肤中，Lgr5基因仅在Wnt刺激的干细胞中表达，但 不在过渡放大细胞中表达(Barker et al，2007；Jaks et al，2008)。因此，Lgr5 基被认为是真正的干细胞标志物。我们猜测，与肠中的Lgr5+细胞相似， 正如损伤后所检测到的，胰腺中的Lgr5+细胞也可能是β细胞祖细胞的起 源。为了检验该猜测，我们在Axin-LacZ和Lgr5-LacZ小鼠的胰腺中进行 PDL，并测定Lgr5 mRNA表达和LacZ染色。有趣的是，在PDL后的时 间过程中利用qPCR可容易地检测到Lgr5(图26H)。此外，如X-gal染色 所示，Lgr5-LacZ敲入小鼠中的PDL导致再生导管的芽中报告基因的特 异活性(星号指示)(图26I)。活性再生位点处Lgr5表达的出现提示Lgr5 可能不仅标志生理上自我更新的干细胞(例如在肠、胃或毛囊中)，而且其 表达还可能预示损伤时通过再生的干细胞/祖细胞的Wnt的激活。

鉴于Wnt依赖的Lgr5干细胞标志物的出现，我们推断，成体胰腺祖 细胞可以在以前所定义的肠的类器官培养条件下扩增(Sato et al，2009)。 之前已经建立胰腺细胞异种群体的培养，并且该培养中通常包含生长因 子和血清补充剂，所述生长因子例如EGF(Githens et al.In Vitro Cell Dev  Biol.1989)、FGF10(Miralles et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1999)和HGF (Lefebvre et al.Diabetes.1998，Suzuki et al.，Diabetes 53，2004)，所述血清 补充剂例如促胃液素(Rooman et al.Gastroenterology 2001)、烟酰胺 (Rooman et al.Diabetologia.2000)等。多种这样的培养导致体外产生具有 β细胞样表型的细胞(Bonner-Weir et al.，2000；Seaberg et al.，2004；Suzuki  et al.，2004)，当将所述细胞移植入糖尿病小鼠中时，在某些条件下其能 逆转高血糖症(Hao et al.，2006；Ramiya et al.，2000)。这些方法中的大多数 以混合的细胞群开始，所述细胞群随时间衰老。似乎可以公平地说，目 前还不存在能维持限定的非转化的成体胰腺祖细胞在很长的一段时间内 保持沿内分泌谱系分化的能力的稳定扩增的完善长期培养体系。

我们首先试图在扩增培养基(EM)中接种纯化的导管组织块。如图 27A所示，小的导管组织块立即经历连续出芽而扩增成为包囊样结构， 同时小岛(数据未显示)和腺泡(底图)逐渐解体。培养物每周扩增10倍(并 且每周进行传代)，持续超过30周。检测了多种生长因子，以确定胰腺细 胞体外最佳扩增所需的信号(图27B)。显然，在不存在EGF的条件下， 培养物在7天之后解体。同样在不存在R-spondin或FGF10的条件下， 培养物的活力在14天以后下降。相反，BMP抑制剂Noggin对胰腺组织 块的持续生长没有任何影响。向扩增培养基添加烟酰胺、Exendin4、促胃 液素不是必需的，但是可以导致培养效率提高(数据未显示)。

由于我们已经证实，Wnt信号转导在PDL时被激活，因此希望能确 定向新鲜分离的胰腺组织块体外添加Wnt激动剂对持续生长的效果。当 自Axin2-LacZ小鼠分离导管时，整个出芽包囊仅在Wnt激动剂Rspondin  1存在的条件下被染成蓝色(图27C)，这与PDL后的体内情况相似(图26D 和E)。在从Axin2-LacZ胰腺新鲜分离的小岛或腺泡中没有观察到蓝色染 色。与PDL时的体内现象一致，只有Lgr5-LacZ包囊的芽被染成蓝色(图 27D)。此外，在存在R-spondin的条件下培养胰腺Lgr5-LacZ类器官14 天显著增加Lgr5+细胞的百分比(图27E)。重要的是，当在不存在 R-Spondin的EM中培养胰腺组织块时，类器官在1个月内停止增殖，而 在存在R-spondin的条件下，它们可以无限期扩增。这些观察结果提示， 位于导管附近的Wnt响应祖细胞激发出芽包囊的生长，所述出芽的生长 包囊随后由具有干细胞样特性的表达Lgr5的细胞来维持。

为了直接检验这个观点，我们从PDL后7天的小鼠分选出 Axin2-LacZ阳性细胞，并且发现这些细胞有效地起始出芽包囊，这些出 芽包囊与导管起始的包囊是无法区分的(图28)。单细胞需要培养基中存 在Wnt3a。对单细胞解离之后存在或不存在Wnt3A条件下的培养效率的 比较显示，在不存在Wnt3A条件下培养的单细胞最初长成小包囊结构， 但是在2-4天之后停止增殖。这与从分离的胰腺组织块起始胰腺培养的情 况不同。有趣的是，可以在4天之后去除Wnt3A，这表明刺激生长不再 必需该信号，或者来源于起始培养的单分选细胞的细胞启动了Wnt3A的 产生。

然后我们试图评价出芽包囊产生内分泌腺谱系细胞的潜能。为了这 个目的，我们检验了对EM的多种改变，以确定分化培养基(DM)。检验 了一系列因子对分化成为内分泌腺谱系的效应。去除FGF10似乎对分化 诱导是至关重要的。只有在不存在FGF10的条件下，才会出现小岛样结 构(图29A)，这与β细胞祖细胞(Ngn3)的数种分化标志物的表达相符，出 现β细胞(胰岛素)、胰高血糖素(α细胞)和生长抑制素(δ细胞)(图29B和 C)。此外，从暴露于DM培养基后10天开始，诸如葡萄糖激酶、Pax6 和嗜铬粒蛋白A的分化标志物上调。因此，DM最好由至少EGF和 R-Spondin组成，并且不含FGF7或10。在分化条件下，干细胞标志物 Lgr5的持续表达可以通过DM中存在Wnt激动剂R-spondin来解释，因 为Lgr5是Wnt响应基因。当在存在烟酰胺的EM中培养细胞时，从该培 养基去除烟酰胺也是重要的，以便获得完全分化。当将培养任何时间之 后的出芽包囊从EM转移至DM时，该包囊经历定式“内卷”过程：壁不 断向内折叠导致包囊被压紧成为更小的在形态上类似于小岛的致密体(图 29D)。通过诸如胰岛素和C-肽的β细胞小岛的标志物证实小岛样形态(图 29E)。为了证实该再生过程步骤对Wnt信号转导的依赖，在存在或不存 在R-spondin的DM中培养胰腺组织块。重要的是，如Ngn3的表达所证 实，在存在R-spondin的条件下仅可以检测到β细胞祖细胞(图29F)。

实施例8人胰腺组织块的体外扩增

在胚胎胰腺发育过程中，在胰管网络中观察到表达神经发生素3+或 胰岛素的细胞，这提示胰管细胞产生内分泌腺祖细胞，并因此产生成熟 的内分泌细胞。已经证实，人胰管细胞在体外分化为葡萄糖响应的产胰 岛素细胞(Bonner-Weir，S et al 2000PNAS)，并且该发现使得胰管细胞成 为β细胞替代疗法的有吸引力的来源。然而，扩增导管细胞同时不丧失 内分泌腺分化能力是困难的。在之前所报道的培养体系中，人胰管细胞 丧失上皮特性或在2周直到5周之后经历衰老(Trautmann B et al，Pancreas  vol.8 248-254)。因此，没有完善的培养体系来扩增保留内分泌腺分化能 力的人胰管细胞。利用建立的小鼠胰腺的类器官培养体系，我们试图建 立人胰腺的类器官培养体系。

人胰腺祖细胞的体外生长

人胰腺获自荷兰的莱顿大学医学中心(Leiden University Medical  Center)。重要的是，在与上述的小鼠胰腺组织块相同的条件下(实施例7)， 人的新鲜分离的胰腺组织块也可以体外生长(图30)。

在这些扩增条件下，胰腺组织块的培养效率为大约80％，即新鲜分 离的胰腺组织块中的80％可在体外较长时间有效扩增。与小鼠胰腺相比， 腺泡组织更容易形成包囊结构，然而，这些结构在4周内停止增殖。来 自较大导管网络的胰管细胞能更有效地产生包囊结构，并最终形成具有 芽的类器官。以1∶5的比率每周1次对胰腺的类器官进行分种，并在体外 维持至少5周而不丧失增殖能力。

总之，我们建立了人胰腺的类器官培养体系，并成功地将胰管细胞 从初始体积扩增至少3000倍。我们正在优化人胰管细胞的内分泌腺分化 培养条件，并且该体外方法一旦经过优化，则可能对使β细胞替代疗法 可用于1型和2型糖尿病的大量人群具有重要的含义。

参考文献

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实施例9人小肠或结肠隐窝的体外培养

如实施例1和2所述，目前是首次使产生用于小鼠小肠和结肠上皮 的长期培养条件成为可能。通过补充一组极佳的生长因子和细胞外基质 而使隐窝-绒毛的类器官生长。该类器官含有肠干细胞，该干细胞活跃分 裂并产生肠中存在的所有主要分化的细胞谱系。在本实施例中，我们证 明，这些培养条件不是仅可用于小鼠肠上皮，而且可用于培养人肠上皮。

材料和方法

小鼠结肠的类器官培养物

如实施例1中所述培养小鼠的类器官培养物。Wnt产生的抑制剂 (IWP-2)用于抑制Wnt分泌(Chen et al，Nat Chem Biol.2009 Feb；5(2)：100-7)。

人结肠的类器官培养物

从切除的正常结肠样本分离人结肠隐窝，并用建立好的类器官培养 体系培养7天将其培养为类器官结构(Sato et al.，2009Nature May  14；459(7244)：262-5)。由于该方案针对小鼠来源的类器官培养物进行了优 化，所以我们通过添加Wnt3a条件培养基而作出小的改变，以确保人结 肠的类器官的最佳生长。为了获得该条件培养基，通过转染合适的编码 所述配体的表达构建体而在细胞系中表达Wnt3a。培养所述细胞系，并 在合适的时间间隔收获包含分泌的配体的培养基。例如，细胞在达到汇 合并停止生长时开始产生Wnt3a。将来自未转染或用空表达构建体感染 的细胞的培养基用作阴性对照。收集条件培养基并对其进行检测，例如 在由TCF响应元件控制荧光素酶表达的测定中，对诸如Wnt3a的Wnt 激动剂进行定量(Korinek et al.，1997.Science 275：1784-1787)。

结果

肠上皮的增殖依赖Wnt信号通路。然而，Wnt来源的精确位置是不 清楚的(Gregorieff and Clevers，2005，Genes Dev.Apr 15；19(8)：877-90)。由 于小鼠肠的类器官以非依赖于龛的方式生长(Sato et al.，2009 Nature May  14；459(7244)：262-5)，我们设想这些类器官可产生其自身的Wnt配体。为 了证实这个设想，我们通过与porcupine抑制剂一起孵育来抑制Wnt分泌。 Porcupine对Wnt分泌至关重要(示意图31A)。与1μM IWP的孵育(Chen  et al，Nat Chem Biol.2009Feb；5(2)：100-7)导致类器官死亡(图31B和C)。 通过添加Wnt3a条件培养基可以挽救类器官，这表明类器官确实产生Wnt 配体(图31D和E)。

接下来我们试图培养人肠的类器官。结果是：向培养基添加Wnt3a 是必需的，因为如果不添加Wnt3a，隐窝的类器官永远不会形成出芽结 构，并且对于小肠来说5-10天内就会死亡，对于结肠来说3-4天内就会 死亡(图32)。大体上，人肠隐窝的类器官以与小鼠的类器官培养物相似 的方式生长。通常，依靠Wnt-3a条件培养基的活性我们获得高达80％的 培养效率。将人肠培养物培养长达3个月。预期到Wnt3a在人结肠中的 效果，因为观察到Wnt3a增强小鼠结肠的类器官培养中的效果。人小肠 和结肠中对Wnt3a的需要可能由于人的类器官所产生的内源Wnt配体较 少，因为与小鼠肠相比，人肠中存在的帕内特细胞较少。目前还没有可 重复的长期人肠培养体系，并且我们的培养体系不仅可用来了解人肠干 细胞的生物学，而且还可用于临床定向检验，例如药物筛选。

实施例10胃的类器官生长的优化的培养条件

如实施例5中所述，已鉴定出可用于长期培养胃上皮的培养基。这 里我们描述这些胃的类器官培养的优化条件。

材料和方法

胃单元分离、单细胞解离和EGFP^阳性细胞分选

按之前所述并进行一些修改，从小鼠幽门部分离胃腺(Bjerknes and  Cheng，2002，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.Sep；283(3)：G767-77)。 简单而言，在显微镜下，沿较大的弯曲部分切开胃，用盐水溶液洗涤， 并分离幽门。去除胃的肌肉层，并将残余的上皮分成5mm的小块，并将 其在4℃下、在含有10mM EDTA(用于培养或染色)或5mM EGTA(用于 RNA分离)的缓冲盐溶液(Na₂HPO₄ 28mM、KH₂PO₄ 40mM、NaCl 480 mM、KCl 8mM、蔗糖220mM、D-山梨醇274mM、DL-二硫苏糖醇2.6 mM)中孵育3-5小时。去除螯合剂之后，用10ml移液管将组织块用力地 悬浮在缓冲溶液中。在悬浮并离心之后，沉淀物富集胃腺。腺体分离之 后，收集细胞，并重悬于补充有10mg/ml胰酶和0.8U/μl DNA酶I的无 钙SMEM培养基(Invitrogen)中(用于微阵列分析)，或重悬于补充有0.8 U/μl DNA酶的TrypleExpress(GIBCO)中(用于培养的目的)。对于以上两 种情况，于37℃孵育20-25分钟之后，将细胞离心，并过滤通过40μM 的网孔。利用流式细胞仪(MoFlo，Beckman Coulter)分选EGFP^高和EGFP ^低细胞。通过前向散射和脉冲宽度参数将单个活的上皮细胞进行画门。按 照所述，将细胞对于碘化丙啶的负染来画门，将细胞收集入Trizol LS (Invitrogen)中，并按照生产商的方案分离RNA，或将细胞收集入胃培养 基中，包埋进基质胶(BD Bioscience)中，并按以下详述的方案进行培养。

胃培养

为了培养，对分离的胃腺进行计数，并将总共100个腺体与50μl基 质胶(BD Bioscience)混合，并接种在24孔板中。在基质胶聚合之后，覆 盖含有生长因子(50ng/m EGF(Peprotech)、1μg/ml R-spondin 1、100ng/ml  Noggin(Peprotech)、100ng/ml FGF10(Preprotech)和Wnt3A条件培养基) 的胃培养基(补充有B27、N2和n乙酰半胱氨酸(Invitrogen)的改进 DMEM/F12)。对于单细胞培养，在胃培养基中收集共100个分选的EGFP ^高细胞/孔，并将其包埋入基质胶(BD Bioscience)中。在基质胶聚合之后， 覆盖胃培养基。对于接种后的最初2天，培养基还补充10μM ROCK抑 制剂Y-27632(Sigma Aldrich)，以避免失巢凋亡。每两天补充生长因子， 并且每4天更换全部培养基。对于传代，将胃的类器官从基质胶移出， 机械解离，并转移至新的基质胶中。每1-2周以1∶5-1∶8的分种率进行传 代。为了证实需要Wnt3A，补充小鼠Wnt3A重组蛋白(Stem cell  technologies)，而不补充Wnt3A条件培养基。对于体外追踪实验，将培养 2周的胃的类器官与100nM 4-羟基他莫西芬一起在胃培养基中孵育20小 时，以激活Lgr5-CreERT2。随后用共聚焦显微镜(Leica，SP5)观察并记录 活的类器官中的YFP。

Wnt3a条件培养基

按照他人所述的方案(Willert et al.，2003，Nature.May  22；423(6938)：448-52)制备Wnt3a培养基。如van de Wetering及其同事所 描述(van de Wetering et al.，2001 Cancer Res.Jan 1；61(1)：278-84)，用 TOP/FOP测定来检测Wnt3a条件培养基和对照条件培养基中的Wnt活 性。TOP/FOP比≥50被认为是高Wnt培养基，并将其与胃的类器官培养 基以1∶1进行稀释。该高Wnt3a培养基的1∶10稀释液(TOP/FOP比约为 5)被认为是低Wnt培养基并将其用于分化目的。

胃的类器官免疫组化

对于免疫组化，用PBS将胃的类器官洗涤一次，并立即用4％多聚甲 醛在室温下固定15-20分钟。将胃的类器官包埋入石蜡中，并用标准技术 进行加工。对于全包埋染色，用PBS 0.5％Triton-X100-1％BSA对样品进 行透化处理，并将其与一抗孵育。在PBS 0.3％Triton X100中洗涤数次之 后，将样品与二抗孵育。按照生产商的说明书(Click-IT；Invitrogen)进行 EdU染色。用TOPRO3碘或Hoescht33342对细胞核进行染色。用共聚焦 显微镜(Leica，SP5)获得胃腺和胃的类器官的图像。用Volocity软件 (Improvision)进行三维重建。

RT-PCR

用RNeasy Mini RNA提取试剂盒(Qiagen)从胃细胞培养物或新鲜分 离的组织提取RNA，并用莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(Promega)进行逆 转录。按之前所描述(Huch et al.，2009)在热循环仪(GeneAmp PCR System  9700；Applied Biosystems，London，UK)中扩增cDNA。所用的引物显示 如下(基因符号后为正向(5’-3’)和反向(5’-3’)引物)。

Lgr5：GGAAATGCTTTGACACACATTC，

GGAAGTCATCAAGGTTATTATAA

Gif：TGAATCCTCGGCCTTCTATG，

CAGTTAAAGTTGGTGGCACTTC

Pgc：CCAACCTGTGGGTGTCTTCT，

TTAGGGACCTGGATGCTTTG

Muc6：TGCATGCTCAATGGTATGGT，

TGTGGGCTCTGGAGAAGAGT

Muc5ac：CCATGAAGTGGGAGTGTGTG，

TTGGGATAGCATCCTTCCAG

Ghrl：GCCCAGCAGAGAAAGGAATCCA，

GCGCCTCTTTGACCTCTTCC

Gast：GCCAACTATTCCCCAGCTCT，

GGCTCTGGAAGAGTGTTGCT

Stt：GAGGCAAGGAAGATGCTGTC，

GGGCATCATTCTCTGTCTGG

Muc2：GAACGGGGCCATGGTCAGCA，

CATAATTGGTCTTGCATGCC

Cdx2：CTTGCTGCAGACGCTCAAC，

TCTGTGTACACCACCCGGTA

Hprt：AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA，

TTGCGCTCATCTTAGGCTTT

结果

为了确定胃单元在体外的最佳生长，我们分离出胃腺单元，并将其 悬浮于基质胶中并在不同的条件下进行培养。胃培养物的生长条件与小 肠培养物的生长条件(包含EGF、Noggin和R-spondin 1)相似，但是严格 依赖条件培养基形式的Wnt3A。利用纯化的Wnt3a蛋白来证实这个需求 (图33A)。此外，FGF10被证明是驱动出芽事件和将培养物扩增成为多单 元的类器官所必需的成分(图33B)。FGF10可用于替代在实施例5中使用 的FGF7(KGF)，并且替代后甚至能导致起始培养4天之后出芽的类器官 的百分比增加2倍(图33C)。新形成的胃的类器官经历连续的出芽事件， 同时保持其极性，使得胃腺结构芽分布在中央腔周围(图33D)。在不存在 Wnt3A条件培养基的条件下，胃的类器官快速恶化(图33E)。每周将类器 官机械解离，并分种为之前接种密度的1/5。如E-Cad染色所证实，培养 的幽门单元是单层上皮结构(图33F)。我们已经成功地将胃的类器官培养 了至少8个月，而没有检测到丧失任何上文所述的特征。

为了确定胃Lgr5^阳性细胞(图34A)是否能在体外产生和维持幽门胃腺 单元，我们分选出Lgr5-EGFP^高细胞(图34B)。当分选出单一Lgr5-EGFP ^高细胞时，平均8％的细胞长成类器官，而其它细胞在前24小时内死亡。 所分选的Lgr5-EGFP^高细胞快速开始分裂，并且5天之后就可以看见小的 包囊样结构。在接下来的时间，新形成的(包囊样)结构开始产生腺样结构 (图34C)。培养9-11天之后，将胃的类器官手动解离，并分种以产生新的 类器官。已成功地将来自单细胞的胃的类器官每周进行重新接种，持续 至少3个月，而没有丧失所述的特征(图34D)。从第7天开始，Lgr5-EGFP 表达局限于腺样结构的基部(图34E)。如EdU染色所证实，增殖性细胞位 于这些腺样结构的基部(图34F)，同时发现凋亡的半胱天冬酶3阳性细胞 被挤入腔中(数据未显示)。在从Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26-YFP报 告基因小鼠分离的单个Lgr5^阳性细胞所建立的类器官中研究谱系追踪。他 莫西芬诱导之后，腺样结构中单个Lgr5^阳性细胞中的YFP^阳性报告基因被 迅速激活。在接下来的几天内，生长的类器官中的YFP表达结构大量扩 增，这证明Lgr5^阳性干细胞有助于类器官的体外生长(图34G)。如E-钙粘 附蛋白染色所证实，来源于单细胞培养物的类器官是单层上皮结构(图 34I)。除了Lgr5之外，培养物还表达胃上皮标志物：胃固有因子、粘蛋 白6和胃蛋白酶原C。在这些培养条件下没有观察到分化为小凹或肠内 分泌细胞谱系(这与实施例5不同，在实施例5中观察到小凹细胞谱系。 但是在那个实施例中，使用了Wnt3a蛋白而不是活性较差的Wnt条件培 养基。降低Wnt条件培养基的浓度导致分化为小凹细胞谱系，参见以下)。 培养基中Wnt3A浓度的降低导致形成具有极化的小凹细胞的相似的胃结 构，这正如胃粘蛋白5AC(MUC5AC)的表达和高碘酸-雪夫(PAS)、以及 Tff2表达所证明的颈粘液细胞和某些分散的不成熟肠内分泌细胞(嗜铬粒 蛋白A)所证实(图34H，I)。添加诸如RA、IGF和Exendin4的其它生长因 子可以导致胃培养物向不同细胞谱系的更成熟的分化。总之，这些体内 和体外观察结果表明，Lgr5是胃幽门中以前未受关注的自我更新的多能 成体干细胞群的标志物。

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