尿液诊断膀胱癌患者复发危险性的方法和试剂盒

摘要

本发明涉及尿液诊断膀胱癌患者复发危险性的方法和试剂盒。本发明公开了2个甲基化敏感基因，它们是LMX1A、VAX1基因。在检测膀胱癌病人手术前留存尿样，上述基因特定CpG位点在随访确定的复发人群中发生高度甲基化。因此，这2个基因可以作为膀胱癌复发的生物标志物；可作为设计膀胱癌复发预后诊断试剂盒的基础，适用于医院膀胱癌症预后检测，术后随访，社区卫生中心对膀胱癌术后人群监测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学检测；更具体地，本发明涉及新的预测膀胱癌复发的 生物标志物(尿液标志物)，以及基于所述标志物的膀胱癌复发预后诊断试剂和 试剂盒。

背景技术

膀胱肿瘤以膀胱移行细胞癌多见，60～69岁为发病高峰，在中国的某些大 城市，随着工业化程度的加快和个人饮食，吸烟等生活习惯的改变，其发病率 具有明显上升趋势，且有发病的年轻化趋势。同时膀胱癌的术后复发率极高， 约为50-70％，复发时间为1～2年内，其中部分病例伴有肿瘤恶性程度增加或 浸润能力增强，严重影响患者的生存期将能够提高患者的治疗效果，延长其生 存期。目前医院预防复发的手段，普遍采取术后随访检查，其手段为：B超， 膀胱内窥镜和脱落细胞检查。B超易受膀胱其他疾病如膀胱息肉、膀胱粘膜下 出血等影响，并且容易漏检＜5mm的肿瘤或平铺在黏膜表面不向腔内突出的病 例；而膀胱内窥镜为侵入性检查，同时对操作者技术依赖较高，且价格较贵； 此外，尿脱落细胞形态学检查检出率较低，且对早期Ta、T1期膀胱癌检出率 为0。如果能发展一种新的膀胱癌复发的早期筛查手段或辅助检查技术，其在 患者膀胱癌发现后就能对患者膀胱癌复发的可能性提供早期判断，对膀胱癌复 发风险高的患者和低风险患者提供针对性的手术和化疗，并分别对不同患者进 行不同密度的跟踪随访，将对膀胱癌高复发患者人群，大大的提高其治疗效果， 减少其复发的可能性，延长其术后生存时间；对膀胱癌低复发患者人群，在提 高其治疗效果的同时，将减少某些不必的治疗步骤，减少其术后随访的密度， 大大降低其经济上的负担。

表观遗传学(Epigenomics)是研究基因在不发生DNA序列改变的情况下， 基因功能发生的可遗传的变化，并最终导致了表型的变化的一门学科。表观遗 传学主要包括DNA甲基化(DNA methylation)，组蛋白修饰(histone  modification)，microRNA水平变化等生化过程；DNA甲基化是研究较为深入 的表观遗传学机制，在包括诊断和治疗在内的肿瘤临床实践中有着重要的应用 前景。DNA甲基化是指生物体内在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase， DMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定 的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、 鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生 在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。

在基因组中98％以上的CpG二核苷酸散在的分布位于具有转录依赖性的 转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，这些CpG处于高度甲基化/转录沉默 的状态，而在肿瘤细胞中这些CpG发生了广泛的去甲基化，导致重复序列的转 录、转座子的活化，基因组的高度不稳定性和原癌基因转录增强。余下的占总 量2％左右的CpG密集地分布于较小的区域(CpG岛)。约40-50％的基因启动子 区域或其附近存在CpG岛，暗示DNA甲基化可能参与该类基因转录调控机制。 在肿瘤细胞中，这些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的CpG岛会发生高甲 基化而导致基因的转录失活。受影响的基因包括DNA修复基因，细胞周期控 制基因和抗凋亡基因等抑癌基因。因此这种肿瘤细胞DNA异常甲基化谱式， 已经成为一个新的肿瘤生物标志物研究领域。基因组DNA经亚硫酸氢盐处理 后，进行PCR(甲基化特异PCR，MSP)检测可有效地确定受试DNA片段的特 定位点的甲基化状态，作为一种定性分析手段，MSP可从含10000个正常细胞 的复杂临床样品中检出个位数的甲基化异常的肿瘤细胞，只要这两者受试DNA 特定区域的甲基化状态完全相反。这使其对体液中微量DNA进行甲基化分析 来诊断肿瘤的方法成为很有希望的肿瘤标记物：如支气管肺泡的冲洗液、粪便、 血清/血浆，以及尿沉淀DNA(如膀胱癌的检测)。

尿液中常见细胞为红细胞、白细胞、吞噬细胞、上皮细胞等，且总量可观， 大约每50毫升中有20万左右。膀胱癌病人的尿液中混有少量脱落的肿瘤细胞。 鉴于MSP的敏感性，其可以从10000个正常的alleles中检测出个位数的甲基 化allele的敏感性。所以抽提受检膀胱癌患者尿样中的细胞DNA以检测特定的， 与复发相关基因的甲基化状况，并以此判定膀胱癌患者复发的风险性是可行 的。

因此，有必要结合表观遗传学技术，筛选能够在早期阶段判断膀胱癌复发 危险性的新的标志物，从而为膀胱癌早期筛查试剂的开发提供途径。

发明内容

本发明的目的在于提供新的膀胱癌预后复发标志物(尿液标志物)。

本发明的另一目的在于提供基于所述标志物的膀胱癌预后复发诊断试剂 和试剂盒。

在本发明的第一方面，提供多核苷酸在制备预测膀胱癌复发危险性的试剂 中的用途，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：7(对应人类基因组LMX1A基因 启动子相关区域)或SEQ ID NO：12(对应人类基因组VAX1基因启动子相关区 域)所示的核苷酸序列。

在本发明的第一方面，提供多核苷酸在制备预测膀胱癌复发危险性的试剂 中的用途，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：20所示的核苷 酸序列。

在一个优选例中，所述的SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的多核苷酸是 SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处 理后获得的多核苷酸；所述的SEQ ID NO：20所示核苷酸序列的多核苷酸是 SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处 理后获得的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的试剂是引物对，选自：

SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示核苷酸序列的引物构成的引物对； 或SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示核苷酸序列的引物构成的引物对。

在本发明的另一方面，提供一种用于预测膀胱癌复发危险性的试剂组合， 所述的试剂组合由以下两组引物对组成：

(1)特异性扩增SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的多核苷酸的引物对；

(2)特异性扩增SEQ ID NO：20所示核苷酸序列的多核苷酸的引物对。

在一个优选例中，引物对(1)的核苷酸序列如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO： 26所示；引物对(2)的核苷酸序列如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂组合的用途，用于制备预测膀胱癌 复发危险性的试剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于预测膀胱癌复发危险性的检测试剂 盒，由以下组件组成：

容器，以及位于容器中的特异性扩增SEQ ID NO：15所示核苷酸序列的多 核苷酸的引物对(每一条引物位于一个独立的容器中)；和

容器，以及位于容器中的特异性扩增SEQ ID NO：20所示核苷酸序列的多 核苷酸的引物对(每一条引物位于一个独立的容器中)。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐， DNA纯化试剂，DNA提取试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书(标明检测操 作步骤和结果判定标准)。

在本发明的另一方面，提供一种体外预测膀胱癌复发危险性的方法，包括：

(a)提供受试者尿液样品，提取基因组DNA；

(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而 基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

(c)分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在所述的多核苷酸；

若是存在所述的多核苷酸，则表明该受试者膀胱癌复发危险性高。

在另一优选例中，步骤(c)中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的引物对或采用核苷酸序列如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所 示所述的引物对，通过PCR扩增的方式来确定基因组DNA中是否存在所述的 多核苷酸。

在另一优选例中，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理的用量为300±200ul/μg 基因组DNA；较佳地，用量为300±100ul/μg基因组DNA；更佳地，用量为 300±50ul/μg基因组DNA。

在另一优选例中，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理的时间是30±20分钟； 较佳地为30±10分钟；更佳地为30±5分钟。

在另一优选例中，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，还包括：将DNA 进行脱盐纯化。

在另一优选例中，步骤(c)中，采用所述的至少一组试剂，通过PCR扩增 的方式来确定基因组DNA中是否存在所述的多核苷酸(经过亚硫酸氢盐或重亚 硫酸氢盐处理后的多核苷酸)。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性的方法。

在另一优选例中，所述的尿液样品为尿沉淀样品，如尿沉渣。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。

附图说明

图1、145例膀胱癌患者随访信息总结统计，基因LMX1A和VAX1甲基 化与复发的相关性，经log rank分析，运用kaplan-meier模型。

A：VAX1；

B：LMX1A。

具体实施方式

本发明人致力于膀胱癌预后复发的标志物的研究，经过广泛的研究筛选， 鉴定到2个甲基化敏感基因，它们是LMX1A、VAX1基因。在尿液样品中， 这2个基因启动子相关区域的甲基化状态在膀胱癌未复发的患者和膀胱癌复发 患者之间存在显著的差异，即在膀胱癌患者的尿液样品中这2个基因的特定 CpG位点发生高度甲基化。因此，这2个基因是膀胱癌预后(预测膀胱癌复发危 险性)的标志物；可作为设计膀胱癌预后复发诊断试剂的基础。

术语

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的 物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽 是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物 质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“样本”或“样品”包括从任何个体(如有泌尿系统症状受检 者的样本)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。所述的样品较佳地 为尿液样品或经过加工的尿液样品(特别是尿沉淀)。

如本文所用，“尿(液)沉淀”、“尿(液)沉渣”可互换使用，其是指尿液 去除液体成分后收集获得的物质，其中包含了从尿道脱落的上皮细胞等。尿沉 淀的收集是本领域技术人员熟知的。膀胱癌患者中，由于尿液的流过或储存， 癌细胞会发生脱落而存在于尿液中，并可被收集于尿沉淀中。

如本文所用，“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中(通常在启动子 中)CpG存在和高度甲基化。以甲基化特异PCR(MSP)分析手段而言，以甲基化 特异性引物所进行的PCR反应可获得阳性的PCR结果即可认为该受试的 DNA(基因)区处于高甲基化状态。以实时定量甲基化特异性PCR而言，高甲基 化状态的判定可随其对照样品的甲基化状态的相对值的统计学差异。

基因标志物

为了寻找对于诊断膀胱癌有用的靶标，本发明人经过了广泛而深入的研 究，最终找到了一组靶标基因，经过在膀胱癌临床标本中的筛选，得到LMX1A 和VAX1这2个基因。这2个靶标基因的启动子相关区域的甲基化状态在膀胱 癌未复发的患者和膀胱癌复发患者之间存在显著的差异，只要检测到其中一个 上述基因的启动子区域发生异常的甲基化状态(高度甲基化)，即可判定该受检 膀胱癌患者为预后较差的、膀胱癌复发危险性高的人员。

因此，本发明提供了分离的多核苷酸，所述的多核苷酸来自于LMX1A， VAX1基因的启动子区域；且在膀胱癌患者的癌细胞内，该多核苷酸序列中， 多处5’-CpG-3’的碱基C位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。

作为本发明的优选方式，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：7(对应LMX1A 基因启动子相关区域)或SEQ ID NO：12(对应VAX1基因启动子相关区域)所 示核苷酸序列。

上述的多核苷酸可以作为基因组中人们分析甲基化状态的关键区域，通过 各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态。任何可用于分析甲基化状态 的技术均可被应用于本发明。另外，上述的多核苷酸也可以应用于设计检测试 剂或检测试剂盒。

上述的多核苷酸在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲 基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。

因此，本发明还提供了上述多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理 后获得的多核苷酸，包括：SEQ ID NO：15(是SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的 多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸)或SEQ ID NO：20(是SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚 硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸)所示核苷酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸可 以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。

检测试剂及试剂盒

基于本发明的新发现，还提供了基于所述的多核苷酸序列设计的检测试 剂，用于体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式，从而判断受试者的膀胱癌复 发危险性。所述的试剂例如是引物对，在得知了多核苷酸的序列后，设计引物 是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包 含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中TpG 互补为针对原为去甲基化的基因区)。

所述的引物是可特异性扩增选自SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：20的多核 苷酸。所述的试剂也可以是试剂组合(引物组合)，包括多于一组的引物，从而 可分别扩增上述的多条多核苷酸。

作为本发明的优选方式，所述的引物对核苷酸序列如SEQ ID NO：25和 SEQ ID NO：26所示；或核苷酸序列如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示。 上述引物对扩增获得的扩增产物具有合适的长度，且特异性高，对于复杂体系的扩 增也具有良好的特异性，特别适合用于甲基化特异性PCR。

本发明还提供了体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂 盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等 所需的各种试剂。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结 果判定标准，以便于本领域技术人员应用。

检测方法

测定多核苷酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP) 或实时定量甲基化特异性PCR，Methylite)来进行，或其它仍在发展中和将被开 发出来的技术来进行。

检测甲基化水平时也可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法。这种 方法是基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其 通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。

其他可用的技术还有：通过甲基化特异性限制性内切酶消化，亚硫酸氢盐 (bisulphite)DNA测序，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)，限制酶界 标基因组扫描(RLGS)，差异性甲基化杂交(DMH)，BeadArray平台技术(Illumina， USA)，和碱基特异性切割/质谱分析(Sequenom，USA)方法。

作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中多核苷酸的甲基化 谱式的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未 甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫 酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理多核苷酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的 多核苷酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中多核苷酸的甲基化谱 式，进而分析受试者的膀胱癌复发危险性。

本发明所述的方法包括：包括：(a)提供样品，提取基因组DNA；(b)利 用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组 DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组DNA 中是否存在甲基化谱式异常，若存在高度甲基化(甲基化阳性)，则受试者膀胱 癌潜在复发危险性高。

对大样品分析(包括与正常和/或非肿瘤对象的比较)将会获得膀胱癌复发 相关性基因的甲基化模式，即可通过检测该组基因的甲基化状态来判断受检对 象是否为膀胱癌预后较差患者即膀胱癌复发高危人群。

本发明的检测方法只需要50ml尿液(较佳地为晨尿)，为无损伤性检测，不 给受试者带来痛苦，易于被人们接受和推广。

本发明的检测方法操作过程简单，快速，3到4个工作日内可得到结果， 非常适合医院膀胱癌辅助检测，术后随访，社区卫生中心对膀胱癌高危人群筛 查，体检中心对膀胱癌高危职业从业者筛查。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版 社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则 百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明共采用膀胱癌临床尿样标本212例；其中157例为原发病例，55例 为复发病例，复发病例占25.94％；157例原发病例去除12例无法联系的病例， 对剩余145例病例进行随访后，有37例病人复发，占25.5％。尿路其他疾病患 者尿样样本41例，其中腺性膀胱炎17例，肾结石5例，尿路感染12例，前 列腺炎2例，肾炎3例，炎症性肌纤维母细胞瘤2例，上述所有病例采集于复 旦大学医学院附属中山医院泌尿外科。同年龄正常对照人群尿样样本149例采 集自石门二路社区卫生中心。本发明所有进行试验的临床标本，其采集过程符 合医学伦理规范，并经伦理委员会同意。膀胱癌病人和对照组临床病理资料整 理如表1。

膀胱癌组织病理分级和临床分期(TNM)严格按照UICC第7版TNM分期 系统。

表1、膀胱癌病人和对照组临床病理资料

实施例1、膀胱癌细胞系和正常膀胱粘膜在基因组层面的高通量甲基化谱 式建立

本发明通过对2例正常人膀胱粘膜(获自中山医院泌尿外科)和2例膀胱癌 细胞系(5637(ATCC：HTB-9)，T24(ATCC-4))，进行基因组层面的高通量甲基化 谱式的建立。

步骤1：抽提上述膀胱癌细胞和正常组织的DNA，并用MBD(甲基化结合 蛋白结构域)亲和层析柱分别分步富集高中低甲基化DNA片段；步骤2：对收 集到的高甲基化DNA片段加SOLEXA接头，送上海博豪生物技术有限公司进 行SOLEXA高通量测序。膀胱癌肿瘤细胞组和正常膀胱组织组分别得到300 万个reads，经生物信息分析，基因组定位，并将定位信息上传UCSC建立数据 库，最终得到1627个在膀胱癌肿瘤细胞系中高甲基化且与基因启动子相关的 区域。

实施例2、膀胱癌相关基因甲基化谱式确定

步骤1：大基因群在小规模临床样本中初筛

从上述1627个在肿瘤细胞系高甲基化且与基因启动子相关的区域中进一 步筛选，获得甲基化差异值最大的前104个基因的启动子相关的区域(按照P值 排序，选择与正常膀胱组织相比甲基化程度最高的前104个基因)。

将上述甲基化差异值最大的前104个基因的启动子相关的区域在膀胱癌细 胞系与正常人群尿液样本(尿沉渣)中甲基化差异进行初筛。

基因组DNA抽提方法为常用的蛋白酶裂解，酚/氯仿抽提法。重亚硫酸盐 (bisulphite)处理如下：1ug基因组DNA经300μl的重亚硫酸氢氨化学修饰，处 理的时间是30分钟，用DNA纯化柱脱盐纯化后溶解于200ul TE缓冲液中， -20℃保存，待进行甲基化特异PCR(MSP)检测。

甲基化特异性PCR分析的具体方法如下：

引物设计：基因检测区域序列确定为按照上传UCSC中甲基化数据库差异 DNA片段序列，PCR引物设计为在线引物设计软件(http://www.urogene.org /methprimer/index1.html)和(http://www.embnet.sk/cgi-bin/primer3_www.cgi)。

PCR的体系和条件如表2。

被检测样本为膀胱癌细胞系5637(ATCC：HTB-9)和T24(ATCC-4)；以及正 常膀胱组织2例，正常人尿液样本8例。正常人尿液样本随机选取，选入标准 为基因组DNA量较多，本实验选取晨尿50ml(获取其中的尿沉渣)。足够应对 多基因的筛选。

将在正常对照中的甲基化水平设为2，即能接受每个基因特定区域20％以 下的甲基化事件，高于20％则认为该基因甲基化谱式特异不高。根据结果，104 个基因启动子位点分为2组。结果有50个基因在肿瘤细胞系和正常组织样品、 正常人尿液样品中有甲基化差异。

步骤2：上述差异基因在中等规模的临床样品中进一步筛选。

被检测样本为膀胱癌细胞系5637(ATCC：HTB-9)和T24(ATCC-4)，正常膀 胱组织2例，正常人尿样标本尿液样本(获取其中的尿沉渣)8例，膀胱癌病人尿 液样本17例，该批尿液样本随机选取，选入标准为基因组DNA量较多，足够 应对多基因的筛选。

用甲基化特异PCR(MSP)方法检测步骤1所筛选出的50个基因启动子特定 区域。对样品的重亚硫酸氢氨化学修饰以及甲基化特异性PCR分析方法同步骤 1。

结果，本发明人将筛选标准定为4，即17例膀胱癌病人尿样中至少有4例 甲基化，甲基化率大于20％的靶点为大样本待筛选基因。最终得到符合标准的 基因共8个：ECEL1(SEQ ID NO：5)，KCNV1(SEQ ID NO：6)，LMX1A(SEQ ID NO：7)，PROX1(SEQ ID NO：8)，SLC6A20(SEQ ID NO：9)，TAL1(SEQ ID NO： 10)，TMEM26(SEQ ID NO：11)，VAX1(SEQ ID NO：12)。它们经重亚硫酸氢盐 处理后，形成的序列为ECEL1(SEQ ID NO：13)，KCNV1(SEQ ID NO：14)， LMX1A(SEQ ID NO：15)，PROX1(SEQ ID NO：16)，SLC6A20(SEQ ID NO：17)， TAL1(SEQ ID NO：18)，TMEM26(SEQ ID NO：19)，VAX1(SEQ ID NO：20)。

步骤3：对膀胱癌高甲基化基因在大样本中验证

尿液样本所采集的临床膀胱癌病人，正常对照人群，其它尿路疾病(前列腺 炎，腺性膀胱炎，肾炎，该批标本为确诊治疗过程中收集)对照的信息见表1。

检测8个膀胱癌高甲基化基因时，以NOS1基因作为阳性质控，其核苷酸 序列为SEQ ID NO：1；经重亚硫酸氢盐处理后，形成的序列为SEQ ID NO：2。

所有实验数据结果，即基因靶点甲基化率与临床病理参数之间的相关性用 SPSS13.0检测，并计算甲基化率的95％可信限(alpha＝0.05)。膀胱癌与对照组尿 沉渣DNA甲基化率的差别是用GraphPad Prism 5中2×2的Fisher exact test处 理的。由2到8个基因靶点甲基化组成的Panel的诊断灵敏度和特异性的ROC 特性也做了分析。

样品的重亚硫酸氢氨化学修饰处理同实施例2。所有样品用MSP方法对8 个膀胱癌甲基化敏感基因位点进行检测，优化的PCR系统和条件见表2，其中 A为反应体系；B为反应条件；C为两种基因在PCR反应中的退火温度。

表2

8个基因以及阳性质控的PCR引物如表3。

表3

针对LMX1A和VAX1，基于PCR检测结果对膀胱癌病人样本与各对照组 基因甲基化率和相关性统计见表4。

表4

AUC表示：ROC曲线下的面积，ROC是人工受试着工作特征曲线。

PPV表示阳性预测值，即真阳性/(真阳性+假阳性))。

NPV表示阴性预测值，即真阴性/(真阴性+假阴性))。

阳性：采用LMX1A或VAX1的MSP引物能够扩增出产物。

阴性：采用LMX1A或VAX1的MSP引物不能够扩增出产物。

其中，“真阳性”定义为膀胱癌样本在该组位点中发生至少1次甲基化事 件；“真阴性”定义为正常对照样本中该组位点的甲基化事件为0；“假阳性” 定义为正常对照样本中在该组位点中发生至少1次甲基化事件；“假阴性”定 义为膀胱癌样本在该组位点中甲基化事件为0。

结果表明，在95％的可信区间(CI)内，膀胱癌病人尿液样本中的LMX1A 和VAX1与对照的正常人群尿液样本和非肿瘤泌尿系统疾病的中的敏感性(甲 基化率)和特异性有极其显著的差异。

实施例3、临床和随访分析及信息统计

前期收集的212例膀胱癌患者的临床尿样标本，该批标本取自经膀胱镜和 病理检查确诊的未经治疗的膀胱癌患者；其中157例为原发病例，55例为复发 病例，占25.94％；该批患者已经手术(全膀胱切除，部分膀胱切除，膀胱肿瘤 电除术，合并化疗或放疗等手段)治疗，并经膀胱镜检查，膀胱内无局部残留 肿瘤病灶。157例原发病例去除12例无法联系的病例，对剩余145例病例进行 随访后，有37例病人复发，占25.5％。

对212例膀胱癌病例的性别，临床分期，病例分级，肌层侵犯，原发复发 与LMX1A和VAX1的甲基化相关性，运用单变量和多变量逻辑回归分析。结 果见表5。

表5

结果显示，经multivariate logistic-regression分析，在膀胱癌原发组(157例) 和膀胱癌复发组(55例)中LMX1A与VAX1的甲基化有显著差异。针对LMX1A， 在212例(其中55例为复发患者)中，甲基化检测为阴性的有192例(其中46例 复发，占23.96％)，阳性的有20例(其中9例复发，占45.00％)；可见在膀胱癌 患者中，LMX1A甲基化检测阳性的患者复发的可能性显著提高。针对VAX1， 在212例(其中55例为复发患者)中，甲基化检测为阴性的有122例(其中23例 复发，占18.85％)，阳性的有90例(其中32例复发，占35.56％)。可见，在膀 胱癌患者中，LMX1A甲基化或VAX1甲基化检测阳性的患者复发的可能性显 著提高(约提高1倍)。且这种甲基化的显著变化与其他临床因素无协同作用， 为独立影响因子。

进一步对有随访信息的145例原发膀胱癌病例进行分析，对性别，临床分 期，病例分级，肌层侵犯，治疗方法与LMX1A和VAX1的甲基化相关性，运 用单变量和多变量Cox proportional hazards models分析。结果见表6。

表6

治疗方法中，TURBT为尿道膀胱肿瘤电除术；IC：膀胱化疗药物灌注； PC：膀胱内窥镜部分切除术。

结果显示，运用单变量和多变量Cox proportional hazards models分析，在 原发膀胱癌经随访复发组(37例)和原发膀胱癌经随访未复发组(108例)中 LMX1A与VAX1的甲基化有显著差异。针对LMX1A，在145例原发膀胱癌病 例中，甲基化检测为阴性的有93例(其中18例复发，占19.4％)，阳性的有52 例(其中19例复发，占36.5％)；可见在原发膀胱癌患者中，LMX1A甲基化检 测阳性的患者复发的可能性显著提高。针对VAX1，在145例原发膀胱癌病例 中，甲基化检测为阴性的有136例(其中32例复发，占23.5％)，阳性的有9例 (其中5例复发，占55.6％)。可见，在膀胱癌患者中，LMX1A甲基化或VAX1 甲基化检测阳性的患者复发的可能性显著提高(约提高1倍)。且这种甲基化的 显著变化与其他临床因素无协同作用，为独立影响因子。

进一步运用kaplan-meier分析法，进行log-rank检验，绘制生存曲线，见 图1。结果显示，在LMX1A和VAX1的甲基化和未甲基化组间，膀胱癌复发 病例与未复发病例的数量有显著性差异(LMX1A p＝0.013；VAX1 P＝0.034)。

实施例4、应用LMX1A和VAX1甲基化状态预测临床患者复发风险

采用的试剂是：SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的检测VAX1甲基化的 引物；以及SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的检测LMX1A甲基化的引物。

患者在临床确诊为膀胱癌后，收集患者的尿液沉渣，提取DNA后分别利 用上述引物对进行扩增，若扩增阳性则说明LMX1A或VAX1甲基化，该患者 临床治疗后复发的可能性较高，将之列为高复发风险者，提示其更频繁地进行 临床随访。

采用上述方法，目前已经确定了多个高复发风险者，通过频繁的随访，使 得这些患者得到及时地治疗。

综上，鉴于在膀胱癌预后差和良好的患者组别中(复发和不复发)，基因 LMX1A和VAX1在其特定的CpG位点的甲基化谱式呈现明显的差异，能用于 早期鉴别这2种人群。

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