提高甜高粱燃料乙醇废酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸和超氧化物歧化酶含量的方法

摘要

本发明公开了一种提高甜高粱燃料乙醇废酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸和超氧化物歧化酶含量的方法，包括如下步骤：取湿废酵母菌体，葡萄糖，甲硫氨酸，硫酸铜，硫酸锌，加入甜高粱茎秆汁至1L混匀；活化培养得到活化发酵液；离心，弃上清液，得到活化后湿酵母菌体；加入高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁，离心分离得到SAM上清液；或取活化湿酵母菌体，加入异丙醇水溶液，搅拌进行破壁，离心，弃去上清，得到沉淀；加入缓冲液，搅拌提取，离心得到SOD上清液，本发明提高甜高粱茎秆燃料乙醇生产中副产品酿酒酵母附加值，使酿酒酵母中SAM和SOD含量提高，降低成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高甜高粱燃料乙醇废酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸和超氧化物歧化酶含量的方法。

背景技术

利用甜高粱茎秆糖汁发酵生产燃料乙醇是促进非粮作物生产燃料乙醇产业化发展的主要方向。达到产业化要求的液态法甜高粱茎秆生产燃料乙醇工艺技术已经形成，并获得国家专利保护，其清醪发酵的工艺特点，可以得到高密度高活性的酿酒酵母。在现有技术条件下，副产品废酿酒酵母常用作饲料原料，附加值很低。已有的研究表明酿酒酵母胞内积累S-腺苷-L-甲硫氨酸的能力要比其它微生物高很多，是目前工业化发酵生产S-腺苷-L-甲硫氨酸的首选原料。酿酒酵母中超氧化物歧化酶的含量也远高于其它真菌，是未来发展工业化发酵生产超氧化物歧化酶的廉价原料。

S-腺苷甲硫氨酸，又称S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosylmethionine，简称SAM)，广泛存在于动物、植物和微生物体内，是人体内的一种重要生理活性物质，它主要作为转甲基和转硫基、转氨丙基三种代谢途径的前体，参与了人体内40多种生化反应。SAM可以预防肝癌发生，对治疗慢性肝炎及肝硬化效果非常好，是国内外公认的最佳治疗肝病的医药，可以显著降低肝病的死亡率。能促进软骨组织的形成和损伤愈合，可用于关节炎的治疗。还具有调节神经中枢系统的功能，治疗早老性痴呆症以及抑郁症，对各种抑郁症有特殊疗效，见效快、无成瘾性以及耐受性好等优点。此外，由于其具有修复纤维化皮肤细胞的作用，被广泛应用于多种化妆品。

SAM可以由化学合成、体外酶促合成或经微生物发酵生物合成三种途径得到，SAM的旋光性及其不稳定性大大降低了化学合成法的可能性。酶催化合成法是以ATP和L-甲硫氨酸为底物，在SAM合成酶的催化下合成SAM，但是ATP价格昂贵，而且生物细胞中SAM合成酶的浓度很低，造成生产水平不高，提取困难，生产效率很低，成为大规模酶催化生产SAM的限制因素。酿酒酵母属微生物(S.cerevisiae)具有较高的过量积累SAM的能力，上世纪六十年代末，国际上就开始研究利用酿酒酵母生产SAM的生产工艺，我国是从七十年代末开始进行此项技术的研发工作，但因发酵水平低、分离纯化成本过高，至今未能工业化，相关药物目前在国内还没有生产，完全依靠进口，开发利用酿酒酵母生产高产、高质、价廉的SAM生产工艺显得极为迫切。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶，能专一催化超氧阴离子自由基O^2-·发生歧化反应，从而清除O^2-·。这一功能，使它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，因此可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外，SOD对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也有疗效。

国内外目前商品SOD主要从动物血液及脏器中提取，容易受原料来源、得率、产品质量不稳定及安全性等方面的限制，欧盟从1997年1月起禁止使用动物SOD。植物SOD的制备和动物SOD的制备一样，具有工艺复杂，成本较高的劣势，限制其规模化生产。与动植物SOD的制备相比，用微生物为原料制取SOD具有原料便宜易得，可以规模化生产。酿酒酵母SOD的含量高于其它真菌，并且酵母细胞没有内毒素污染问题，从酵母中提取Cu/Zn-SOD较从其它动物血液中提取的最大特点是不存在抗原反应、成本低，酵母产SOD具有很好的使用价值。

国内对SOD的研究起步较晚。目前，国内生产商品SOD仍然主要是从猪血或牛血中提制的，对微生物SOD的研究还处于实验室阶段。

仅可查到《甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶的方法》一项专利(专利号：200710047685.5)，该专利中所述技术仅可提取SOD一项产品。

目前国内外未见到以提高SAM和SOD生物合成量为目的的甜高粱茎秆汁液发酵生产燃料乙醇的副产品酿酒酵母活化技术的相关报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高甜高粱燃料乙醇废酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸和超氧化物歧化酶含量的方法，通过优化废酿酒酵母活化培养基及活化培养条件，可同时提高废酿酒酵母中SAM和SOD的生物合成量。

本发明的技术方案概述如下：

提高甜高粱燃料乙醇废酿酒酵母中S-腺苷-L-甲硫氨酸和超氧化物歧化酶含量的方法，包括如下步骤：

(1)用酿酒酵母将甜高粱茎秆汁经20-38小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经3000-5000rpm，离心5-15分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)按比例取40-60g所述湿废酵母菌体，20-50g葡萄糖，0.5-4g甲硫氨酸，0.005-0.015g硫酸铜，0.03-0.06g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为13-20％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为0.8-1.5vvm、搅拌转速为120-160rpm及温度为30℃-34℃条件下，活化培养20-40小时，得到活化发酵液；

(3)将所述活化发酵液以3000-5000rpm，离心5-15分钟，弃上清液，得到活化后湿酵母菌体；

(4)取所述活化后湿酵母菌体，加入6-12倍体积的1.5mol/L高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁1-2小时，3000-5000rpm，离心5-15分钟，分离得到SAM上清液；

或取所述活化湿酵母菌体，加入8-10倍体积的体积浓度为70-90％的异丙醇水溶液，在冰浴中搅拌1-2小时进行破壁，以4000-6000rpm，离心5-15min，弃去上清，得到沉淀；加入2-4倍沉淀质量的pH＝7.8，浓度为0.05mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，搅拌提取1-3个小时，以4000-6000rpm，离心5-15min，得到SOD上清液，所述SAM为S-腺苷-L-甲硫氨酸，所述SOD为超氧化物歧化酶。

所述步骤(1)优选为：将甜高粱茎秆经24-30小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经4000rpm，离心10分钟，得到湿废酵母菌体。

所述步骤(2)优选为：按比例取50g所述湿废酵母菌体，30g葡萄糖，2g甲硫氨酸，0.010g硫酸铜，0.04g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为15％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.2vvm、搅拌转速为140rpm及32℃活化培养30小时，得到活化发酵液。

所述步骤(3)优选为：将所述活化发酵液以4000rpm，离心10分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体。

所述步骤(4)优选为：取所述活化湿酵母菌体，加入8倍体积的1.5mol/L高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁1.5小时，4000rpm，离心10分钟，分离得到SAM上清液，用高效液相色谱法检测湿酵母菌体中的SAM含量；

或取所述活化湿酵母菌体，加入9倍体积的体积浓度为80％的异丙醇水溶液，在冰浴中搅拌1.5小时进行破壁，以5000rpm，离心10min，弃去上清，得到沉淀；加入3倍沉淀质量的pH＝7.8，浓度为0.05mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，搅拌提取2个小时，以5000rpm，离心10min，得到SOD上清液，用邻苯三酚自氧化法检测湿酵母菌体中的SOD含量。

本发明优点：

1.本发明极大提高甜高粱茎秆燃料乙醇生产中副产品酿酒酵母附加值，促进了非粮燃料乙醇产业的健康发展；

2.本发明首次以提高SAM和SOD生物合成量为目的，对甜高粱茎秆燃料乙醇生产中的副产品酿酒酵母进行活化技术研究，使酿酒酵母中SAM(120mg/g干酵母)和SOD(2600U/g干酵母)含量超过国内外报道水平，为深度开发生物燃料乙醇产业副产品提供了技术支持；

3.国内商品SOD仍然主要是从猪血或牛血中提制的，对微生物SOD的研究还处于实验室阶段，我国尚未实现SAM产品产业化生产，本发明提高了酿酒酵母中SOD和SAM的生物合成量，为实现SOD和SAM的规模化工业生产提供了低成本原料支持；

4.本发明具有很大的经济效益，建设年消耗300吨酿酒酵母干基的SAM和SOD生产厂，总投资约2300万元，年总收入可达10680万元，投资利税率达300％以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

(1)将甜高粱茎秆汁经28小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经4000rpm，离心10分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取50g湿废酵母菌体，30g葡萄糖，2g甲硫氨酸，0.01g硫酸铜，0.04g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为15％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.2vvm、搅拌转速为140rpm及32℃活化培养30小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以4000rpm，离心10分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入8倍体积的1.5mol/L高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁1.5小时，4000rpm，离心10分钟，分离得到SAM上清液，用高效液相色谱法检测湿酵母菌体中的SAM含量为118mg/g干酵母，活化前SAM含量为1.1mg/g干酵母。

实施例2

(1)将甜高粱茎秆经24小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经4000rpm，离心10分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取40g湿废酵母菌体，50g葡萄糖，3g甲硫氨酸，0.01g硫酸铜，0.03g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为13％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为0.8vvm、搅拌转速为160rpm及32℃活化培养30小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以3000rpm，离心15分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入6倍体积的1.5mol/L高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁1小时，4000rpm，离心10分钟，分离得到SAM上清液，用高效液相色谱法检测湿酵母菌体中的SAM含量为122mg/g干酵母，活化前SAM含量为1.02mg/g干酵母。

实施例3

(1)将甜高粱茎秆经30小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经4000rpm，离心10分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取50g湿废酵母菌体，20g葡萄糖，4g甲硫氨酸，0.015g硫酸铜，0.04g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为15％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.0vvm、搅拌转速为120rpm及30℃活化培养40小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以5000rpm，离心5分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入8倍体积的1.5mol/L高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁2小时，3000rpm，离心5分钟，分离得到SAM上清液，用高效液相色谱法检测湿酵母菌体中的SAM含量为125mg/g干酵母，活化前SAM含量为1.08mg/g干酵母。

实施例4

(1)将甜高粱茎秆经20小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经3000rpm，离心15分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取55g湿废酵母菌体，30g葡萄糖，0.5g甲硫氨酸，0.015g硫酸铜，0.05g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为17％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.2vvm、搅拌转速为140rpm及34℃活化培养20小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以4000rpm，离心12分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入10倍体积的1.5mol/L高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁1小时，4000rpm，离心10分钟，分离得到SAM上清液，用高效液相色谱法检测湿酵母菌体中的SAM含量为116mg/g干酵母，活化前SAM含量为0.98mg/g干酵母。

实施例5

(1)将甜高粱茎秆经20-38小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经5000rpm，离心5分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取60g湿废酵母菌体，40g葡萄糖，1g甲硫氨酸，0.005g硫酸铜，0.06g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为20％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通气量为1.5vvm、搅拌转速为150rpm及32℃活化培养23小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以4000rpm，离心8分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入12倍体积的1.5mol/L高氯酸水溶液，冰浴条件下，搅拌破壁2小时，5000rpm，离心15分钟，分离得到SAM上清液，用高效液相色谱法检测湿酵母菌体中的SAM含量为120mg/g干酵母，活化前SAM含量为1.13mg/g干酵母。

实施例6

(1)将甜高粱茎秆经28小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经4000rpm，离心10分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取50g所述湿废酵母菌体，30g葡萄糖，2g甲硫氨酸，0.010g硫酸铜，0.04g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为15％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.2vvm、搅拌转速为140rpm及32℃活化培养30小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以4000rpm，离心10分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入9倍体积的体积浓度为80％的异丙醇水溶液，在冰浴中搅拌1.5小时进行破壁，以5000rpm，离心10min，弃去上清，得到沉淀；加入3倍沉淀质量的pH＝7.8，浓度为0.05mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，搅拌提取2个小时，以5000rpm，离心10min，得到SOD上清液，用邻苯三酚自氧化法检测湿酵母菌体中的SOD含量为2460U/g干酵母，活化前为150U/g干酵母。

实施例7

(1)将甜高粱茎秆经24小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经4000rpm，离心10分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)按比例取40g所述湿废酵母菌体，50g葡萄糖，3g甲硫氨酸，0.01g硫酸铜，0.03g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为13％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为0.8vvm、搅拌转速为160rpm及32℃活化培养30小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以3000rpm，离心15分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入8倍体积的体积浓度为80％的异丙醇水溶液，在冰浴中搅拌1小时进行破壁，以6000rpm，离心5min，弃去上清，得到沉淀；加入4倍沉淀质量的pH＝7.8，浓度为0.05mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，搅拌提取1个小时，以6000rpm，离心5-15min，得到SOD上清液，用邻苯三酚自氧化法检测湿酵母菌体中的SOD含量为2506U/g干酵母，活化前为153U/g干酵母。

实施例8

(1)将甜高粱茎秆经30小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经4000rpm，离心10分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取50g所述湿废酵母菌体，20g葡萄糖，4g甲硫氨酸，0.015g硫酸铜，0.04g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为15％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.0vvm、搅拌转速为120rpm及30℃活化培养40小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以5000rpm，离心5分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入9倍体积的体积浓度为70％的异丙醇水溶液，在冰浴中搅拌2小时进行破壁，以4000rpm，离心15min，弃去上清，得到沉淀；加入2倍沉淀质量的pH＝7.8，浓度为0.05mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，搅拌提取2个小时，以5000rpm，离心8min，得到SOD上清液，用邻苯三酚自氧化法检测湿酵母菌体中的SOD含量为2602U/g干酵母，活化前为156U/g干酵母。

实施例9

(1)将甜高粱茎秆经20小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经3000rpm，离心15分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取55g所述湿废酵母菌体，30g葡萄糖，0.5g甲硫氨酸，0.015g硫酸铜，0.05g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为17％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.2vvm、搅拌转速为140rpm及34℃活化培养20小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以4000rpm，离心12分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入9倍体积的体积浓度为90％的异丙醇水溶液，在冰浴中搅拌1小时进行破壁，以5000rpm，离心10min，弃去上清，得到沉淀；加入3倍沉淀质量的pH＝7.8，浓度为0.05mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，搅拌提取3个小时，以4000rpm，离心15min，得到SOD上清液，用邻苯三酚自氧化法检测湿酵母菌体中的SOD含量为2588U/g干酵母，活化前为154U/g干酵母。

实施例10

(1)将甜高粱茎秆经20-38小时发酵生产燃料乙醇后，取出废酿酒酵母液，经5000rpm，离心5分钟，得到湿废酵母菌体；

(2)取60g所述湿废酵母菌体，40g葡萄糖，1g甲硫氨酸，0.005g硫酸铜，0.06g硫酸锌，加入直接压榨的新鲜的总糖质量含量为20％的甜高粱茎秆汁至1L混匀；在pH＝5.0、通空气量为1.5vvm、搅拌转速为150rpm及32℃活化培养23小时，得到活化发酵液；

(3)将活化发酵液以4000rpm，离心8分钟，弃上清液，得到活化湿酵母菌体；

(4)取活化湿酵母菌体，加入10倍体积的体积浓度为80％的异丙醇水溶液，在冰浴中搅拌2小时进行破壁，以5000rpm，离心8min，弃去上清，得到沉淀；加入3倍沉淀质量的pH＝7.8，浓度为0.05mol/L的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液，搅拌提取1个小时，以6000rpm，离心5min，得到SOD上清液，用邻苯三酚自氧化法检测湿酵母菌体中的SOD含量为2600U/g干酵母，活化前为155U/g干酵母。