一种海洋真菌梅花状青霉及其提取物和应用

摘要

本发明公开了一种海洋真菌梅花状青霉及其提取物和应用。海洋真菌梅花状青霉(P enicillium herquei)FS83于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011415。其发酵提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)具有抑制效果，而且对绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)也具有抑制作用；同时，该发酵提取物对人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268具有抑制活性。因此，本发明的实现，为研究与开发新的抗菌、抗真菌、抗肿瘤药物提供了候选药物，为开发利用海洋真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。

说明书

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83，以及从该菌株的液体培养菌丝体中制备的发酵提取物，和该提取物在制备抗细菌、真菌药物和抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤又称为癌症，是一种危害人类生命和生活质量的主要疾病之一。据世界卫生组织统计，世界上每年有1000万人患上癌症，约有600万人死于癌症，占全球死亡人数的12％。而且由于吸烟人数增多，体育运动减少，饮食中缺少果蔬等不良习惯可能会导致患癌症的人数增多。我国卫生部在第21届世界抗癌大会上指出，中国每年癌症发病人数为260万，而死亡人数达180万，已成为中国城市和农村居民的第一位死亡原因，寻找有效的抗癌药物是世界上新药开发的重点领域。

随着环境污染的加剧，新的感染性疾病发生和耐药菌株的大量出现，正日益严重地威胁着人类健康，人们不得不寻求新的抗菌药物以应对不断产生的耐药菌株，因此，寻找新的抗菌药物也是世界上新药开发的重点领域。

由于陆栖微生物活性物质的大量开发和应用，寻找新种属或特殊性状的微生物及其代谢产生的新型抗菌、抗肿瘤药物越来越难，于是，人们将目光纷纷投向海洋。海洋真菌是海洋微生物的重要组成部分，这类真菌不但种类多，分布广，而且生存在低温、高压、高盐、高寒、寡营养等独特的环境中，必然会产生一些与陆地真菌不同的代谢系统和防御物质，包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒等活性物质，研究人员从中发现了一些具有生物活性的新天然产物，包括一些具有新颖骨架的化合物。因此，海洋真菌在发掘药物先导化合物方面有很大的潜力，从海洋真菌中寻找新的抗菌、抗肿瘤药物已成为当今世界新药的研发热点。

发明内容：

本发明的第一目是提供一种海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83，该菌株于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011415。

本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83是从南海(106°30.295′E，10°0.941′N)1675m深处的海泥中分离、纯化得到。其分离纯化方法为：将海泥样品用含30％粗海盐的无菌水稀释到10％，27℃振荡20min，取0.1mL均匀涂布在改良PDA固体培养基中，26～28℃恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。所述改良PDA固体培养基是在每升PDA培养基中加入KH₂PO₄3g、MgSO₄0.75g、维生素B₁10mg、粗海盐30g、琼脂20g。

通过形态学研究，并根据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，该菌株鉴定为梅花状青霉(Penicillium herquei)，命名为梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83，于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO：M 2011415。

其形态特征如下：在改良PDA固体培养基上菌落黄绿色，背面黄褐色至暗绿色，绒状或絮状，具不明显辐射状沟纹；分生孢子梗发生于基质和气生菌丝，壁粗糙，具疣状突起，黄绿色；帚状枝双轮生，梗基每轮5-9个，7.5～12×2.5～4.0μm。分生孢子球形，光滑，淡绿色，2.5～4.5×2.0～3.5μm。

根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区，其ITS区的碱基序列如下SEQ ID NO.1所示，提交GeneBank，其GenBank基因登录号为：JQ034358，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度最高的两条序列均为梅花状青霉(Penicilliumherquei)，相似度达99.1％，因此也确定该菌株为梅花状青霉(Penicillium herquei)。

本发明的第二个目的是提供一种具有抗菌、抗肿瘤作用的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物，其特征在于，以海洋真菌梅花状青霉(Penicilliumherquei)FS83作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体用石油醚或丙酮或无水乙醇或95％乙醇水溶液冷浸，优选是用无水乙醇冷浸，冷浸液经浓缩后即得海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物。

所述的液体发酵，优选是将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83菌接种到改良PDA液体培养基中，120r/min，26℃培养7d，获得海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵培养物，所述改良PDA液体培养基是在每升PDA培养基中加入KH₂PO₄ 3g、MgSO₄0.75g、维生素B110mg、粗海盐30g；所述的冷浸时间优选为24～28小时。

本发明通过实验发现，本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在500μg/片滤纸浓度下，对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌圈直径分别为12mm、11mm、2.6mm。选择25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.5625mg/mL，0.7812mg/mL，0.3906mg/mL 7个浓度下进行最低抑菌浓度(MIC值)试验，确定该发酵提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的MIC值分别为1.56mg/mL、1.56mg/mL、12.5mg/mL。由此可见，本发明海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物具有抗细菌活性，可用来制备抗细菌药物。

因此本发明的第三个目的是提供海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在制备抗细菌药物中的应用。

所述的抗细菌药物优选为抗枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)或绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)药物。

本发明的第四个目的是提供一种抗细菌药物，其特征在于，该抗细菌药物包含海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成分。

本发明通过实验发现，本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在50mg/mL浓度下，对绿色木霉(Trichoderma roseum)的抑制率为90～100％、对黑曲霉(Aspergillus niger)的抑制率为70～80％、对黄曲霉(Aspergillus flavus)的抑制率为70～80％。选择25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.5625mg/mL，0.7812mg/mL，0.3906mg/mL 7个浓度下进行最低抗菌浓度(MIC值)试验，确定该发酵提取物对绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)的MIC值分别为0.78mg/mL、1.56mg/mL、1.56mg/mL。结果表明本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对真菌具有抗真菌活性，可用来制备抗真菌药物。

本发明的第五个目的是提供海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在制备抗真菌药物中的应用。

所述的抗真菌药物优选为抗绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)或黄曲霉(Aspergillus flavus)药物。

本发明的第六个目的是提供一种抗真菌药物，其特征在于，该抗真菌药物包含海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成分。

本发明通过抗肿瘤活性评价发现，海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在100μg/mL浓度下，对人肺癌细胞NCI-H460的抑制率为70～80％、对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率为60～70％、人神经胶质瘤细胞SF-268的抑制率为50～60％。选择200μg/mL，100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL浓度下进行试验，确定该发酵提取物对人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268的IC50值分别为55.86μg/mL、62.50μg/mL、63.48μg/mL。结果表明本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicililumherquei)FS83发酵提取物具有抗肿瘤活性，可应用于制备抗肿瘤药物。

因此，本发明的第七个目的是提供海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物优选为抗肺癌、乳腺癌或神经瘤药物。

本发明的第八个目的是提供一种抗肿瘤药物，其特征在于，该抗肿瘤药物包含海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成份。

本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物具有广谱抗细菌、真菌活性和抗肿瘤活性，表明该发酵提取物具有很好的应用开发前景，因此本发明为研究与开发新的抗菌、抗肿瘤药物提供了候选药物，为开发利用海洋真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。

本发明的梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011415。

具体实施方式：

以下通过具体实施例来对本发明进一步说明，但并非限制本发明。

实施例1：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83的分离和鉴定

海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83是从南海(106°30.295′E，10°0.941′N)1675m深处的海泥中分离、纯化得到。

其分离纯化方法为：将海泥样品用含30％粗海盐的无菌水稀释到10％，27℃振荡20min，取0.1mL均匀涂布在改良PDA固体培养基中，26～28℃恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。所述改良PDA固体培养基是在每升PDA培养基中加入KH₂PO₄3g、MgSO₄0.75g、维生素B₁10mg、粗海盐30g，琼脂20g。

通过形态学研究，并根据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，该菌株鉴定为梅花状青霉(Penicillium herquei)，命名为梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83，于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO：M 2011415。

其形态特征如下：在改良PDA培养基上菌落黄绿色，背面黄褐色至暗绿色，绒状或絮状，具不明显辐射状沟纹；分生孢子梗发生于基质和气生菌丝，壁粗糙，具疣状突起，黄绿色；帚状枝双轮生，梗基每轮54-9个，7.5～12×2.5～4.0μm。分生孢子球形，光滑，淡绿色，2.5～4.5×2.0～3.5μm。

根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区，其ITS区的碱基序列如下SEQ IDNO.1所示，提交GeneBank，其GenBank基因登录号为：JQ034358，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度最高的两条序列均为梅花状青霉(Penicilliumherquei)，相似度达99.1％，因此也确定该菌株为梅花状青霉(Penicillium herquei)。

实施例2：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的制备

将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83菌接种到改良PDA液体培养基中，120r/min，26℃培养7d，获得海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83的液体培养物。将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83的液体培养物过滤，使菌丝体和发酵液分离，菌丝体用石油醚或丙酮或无水乙醇或95％乙醇水溶液冷浸，本实施例用无水乙醇冷浸48h，冷浸液再经减压浓缩得即得到绿色膏状的提取物，即为海洋真菌梅花状青霉(Penicilliumherquei)FS83发酵提取物。

所述的改良PDA培养基通过以下方法获得：用500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH₂PO₄3g、MgSO₄0.75g、维生素B₁10mg、粗海盐30g，用水补足至1L，灭菌制得。

实施例3：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的抗细菌活性

一、

采用滤纸片法测定海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的抗菌活性。

将实施例2得到的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物用DMSO溶解，并稀释至50mg/mL浓度。

将液体发酵获得的上述待测细菌菌液用生理盐水分别稀释至10⁶CFU/mL的浓度，吸取浓度为10⁶CFU/mL的细菌菌液200μL均匀涂布于含有LB培养基平板中，贴上直径为4mm的滤纸片，分别在滤纸片上滴加浓度为50mg/mL的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物稀释液10μL，以DMSO代替该发酵提取物稀释液作空白对照，以20μg/mL浓度的硫酸卡那霉素代替该发酵提取物稀释液作阳性对照，每个处理做3皿重复。37℃恒温箱中培养24～48h，然后测量抑菌圈直径，以抑菌圈直径大小来评价抗菌活性。实验结果如表1所示：

表1：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的抗细菌作用

二、

采用连续稀释法测定海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的最低抑菌浓度(MIC值)。

将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物按试管二倍稀释法，用LB液体培养基将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物分别稀释至25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.5625mg/mL，0.7812mg/mL，0.3906mg/mL。吸取不同浓度的该发酵提取物稀释液1mL于试管中，再分别加入1mL菌液，使菌液浓度为10⁶～10⁷CFU/mL，以LB液体培养基代替该发酵提取物稀释液为空白对照，置于37℃恒温箱培养24～48h后，于含LB培养基平皿上划线，再继续培养24～48h，观察生长情况，每个处理做3管重复。以试管澄清，划线培养不长菌的浓度为最低抑菌浓度(MIC值)。实验结果如表2所示：

表2：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对细菌的最低抑制浓度(MIC值)

注：“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长

由表1和表2可以看出，本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在500μg/片滤纸浓度下，对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌圈直径分别为12mm、11mm、2.6mm。选择25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.5625mg/mL，0.7812mg/mL，0.3906mg/mL 7个浓度下进行最低抑菌浓度(MIC值)试验，确定该发酵提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的MIC值分别为1.56mg/mL、1.56mg/mL、12.5mg/mL。由此可见，本发明海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83的提取物具有抗细菌活性，可用来制备抗细菌药物。

实施例4：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的抗真菌活性

一、

采用生长速率法测定海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对绿色木霉(Trichoderma roseum)或黑曲霉(Aspergillus mger)或黄曲霉(Aspergillus flavus)的抑制作用。

将实施例2得到的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物用DMSO溶解，并稀释至50mg/mL浓度。

分别取50mg/mL的发酵提取物稀释液0.1mL均匀涂布到含PDA固体培养基的培养皿中，在平皿中央分别接入直径为4mm的绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus mger)或黄曲霉(Aspergillus flavus)的菌饼，每处理重复3皿，以DMSO代替发酵提取物稀释液作空白对照。置于28℃恒温培养箱培养72～96h，记录菌饼生长直径，计算抑制率。

抑制率(％)＝(空白对照平均纯生长量-处理平均纯生长量)/空白对照平均纯生长量×100％，其中纯生长量(mm)＝菌饼生长直径-4。实验结果如表3所示：

表3：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对真菌的抑制率(％)

二、

采用连续稀释法测定海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉Aspergillus niger)或黄曲霉(Aspergillus flavus)的最低抑制浓度(MIC值)。

将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物按试管二倍稀释法，用PDA液体培养基将发酵提取物分别稀释至25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.5625mg/mL，0.7812mg/mL，0.3906mg/mL浓度。吸取不同浓度的发酵提取物稀释液1mL于试管中，再分别加入1mL菌液，使孢子含量达10⁶～10⁷个/mL，以PDA液体培养基代替该发酵提取物稀释液为空白对照，置于28℃恒温箱培养72～96h后，于含PDA培养基平皿上划线，再继续培养72～96h，观察生长情况，每个处理做3管重复。以试管澄清，划线培养不长菌的浓度为最低抑菌浓度(MIC值)。实验结果如表4所示：

表4：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对真菌的最低抑制浓度(MIC值)

注：“+”表示有菌生长，“-”表示无菌生长

由表3和表4可以看出，本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在50mg/mL浓度下，对绿色木霉(Trichoderma roseum)的抑制率为90～100％、对黑曲霉(Aspergillus niger)的抑制率为70～80％、对黄曲霉(Aspergillus flavus)的抑制率为70～80％。选择25mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.5625mg/mL，0.7812mg/mL，0.3906mg/mL 7个浓度下进行最低抗菌浓度(MIC值)试验，确定该提取物对绿色木霉(Trichodermaroseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)的MIC值分别为0.78mg/mL、1.56mg/mL、1.56mg/mL。结果表明本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对真菌具有抑制作用，可用来制备抗真菌药物。

实施例5：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的抗肿瘤活性

采用MTT法评价海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268的抑制作用。

将实施例2得到的的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配成10mg/mL浓度，用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。

分别取对数生长期的NCI-H460细胞、MCF-7细胞、SF-268细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜培养基调整细胞浓度为3×10⁴个/mL，将细胞分别接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并设3个空白调零孔，于37℃、5％CO2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔分别加入20μL适当浓度海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物稀释溶液，阴性对照加20μLRPMI-1640培养基，阳性对照加20μL适当浓度顺铂溶液，每孔设3个重复。置CO₂培养箱中培养72h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL MTT溶液，37℃培养4h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150μL，振荡10min使紫蓝色结晶完全溶解后，用酶标仪测定每孔490nm吸光值(OD₄₉₀)，取3孔平均吸光值按用以下公式计算所述提取物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-OD_样品组/OD_对照组)×100％。采用SigmaPolot10.0软件计算出IC₅₀值。实验结果如表5所示：

表5：海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对肿瘤细胞的抑制率(％)

综合所述，本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物不但对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)具有抑制效果；而且对绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)也具有抑制作用；同时，该发酵提取物对人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268具有抑制活性。因此，本发明的实现，为研究与开发新的抗细菌、抗真菌、抗肿瘤药物提供了候选药物，为开发利用海洋真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。