金属离子胁迫海洋真菌桔青霉合成多样性次生代谢产物的研究

摘要

从我国东海海水和海泥中分离到6株霉菌，对获得的菌株进行了抗肿瘤细胞活性的筛选，选择了一株抗肿瘤活性较好的菌株，对其进行金属离子胁迫培养，分析胁迫培养下其代谢产物的多样性，在对胁迫培养条件下新合成的次生代谢产物进行分离纯化，利用核磁共振法对它们的结构进行鉴定，最后对分离得到的单体化合物做抗肿瘤活性评价，得到结果如下：
　　（1）采用稀释平板分离法，从我国东海海域的海水和海泥样品分离到5株菌落形态有明显差别的海洋真菌。利用体外抗肿瘤模型对上述5株霉菌和1株实验前期研究分离的桔青霉（Penicillium citrinum）MNP12010101进行活性筛选，结果表明：桔青霉菌株MNP12010101发酵总浸膏对人肺腺癌细胞（A549）有较好的抑制活性，200μg·mL-1浓度时对A549的抑制率为55.37％，IC50为141.12μg·mL-1，其次是菌株JHBL-1，其发酵浸膏在200μg·mL-1时，对A549的抑制率为33.46%。依据形态学特征和18S rDNA序列分析，确定JHBL-1菌株是一株毛霉（Mucor sp.）。
　　（2）对桔青霉MNP12010101进行金属离子胁迫培养，采用HPLC指纹图谱法分析代谢产物的多样性，结果表明：在人工海水培养基中，添加10 mmoL·L-1的 Co2+胁迫培养后，MNP12010101菌株的代谢产物种类与常规培养产物差异较大，有较多的新化合物出现，且活性检测结果显示其总浸膏抗肿瘤活性明显增强，IC50值由胁迫前的141.12μg·mL-1降低至61.23μg·mL-1，说明桔青霉MNP1201010在10 mmol·mL-1Co2+的胁迫培养下，原有的活性代谢产物的浓度提高，或合成了新的活性代谢产物。
　　（3）对桔青霉MNP12010101进行大批量培养，获得80 L培养液，制备得到发酵液和菌体混合总浸膏16 g。通过柱层析方法分离出11个化合物，经过核磁共振分析，确定了其中7个化合物的结构，它们分别为：十八烯酸（1）、cladospolide E（2）、过氧麦角甾醇(3)、环(甘-脯)二肽（4）、环（丙-脯）二肽（5）、环(异亮-脯)二肽（6）和环（丙-缬）二肽（7）。化合物3，4，5，6，7首次从桔青霉中分离得到。抗肿瘤活性研究表明：化合物3具有较好的抗肿瘤活性，其对人前列腺癌(PC-3)细胞的IC50值为33.12μg·mL-1，化合物2和4具有弱的抗肿瘤活性，它们对PC-3肿瘤细胞的IC50值分别为199.34μg·mL-1和146.22μg·mL-1；对A549肿瘤细胞的IC50值分别为256.22μg·mL-1和178.56μg·mL-1。所有化合物均未发现对人结肠癌细胞（HCT116）细胞有抑制作用。除化合物3外，其他化合物对PC-3，A549和HCT116肿瘤细胞的活性的报道也属首次。

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第一章 绪论

1.1 海洋微生物研究概述

1.2 极端微生物的代谢产物及其生物活性研究概述

1.3海洋真菌化学成分及生物活性研究进展

1.4 环境胁迫提高次生代谢产物合成多样性的研究进展

1.5海洋真菌青霉（Penicillium）的代谢产物及其生物活性研究概述

1.6本课题立项背景、意义和研究内容

第二章 海洋真菌活性菌株的筛选

2.1引言

2.2 材料和方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第三章 金属离子胁迫培养桔青霉MNP12010101合成代谢产物多样性分析

3.1引言

3.2 材料和方法

3.3 结果与分析

3.4本章小结

第四章 桔青霉MNP12010101胁迫培养下次生代谢产物的分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性测定

4.1引言

4.2 材料和方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文和专利

致谢