用于数字基因表达谱的标签及其使用方法

摘要

本发明基于目前illumina公司提供的Solexa Single End测序平台，针对数字基因表达谱文库(DGE)样品建库方法，设计了独特的标签序列(index1-12)，通过接头将标签嵌DGE文库的3’接头中，成功的建立了数字基因表达谱标签文库(DGE标签文库)的建库方法，适合任何真核生物RNA样品的DGE标签文库构建，并成功用于solexa测序，不仅增大了DGE样品的测序通量，而且降低了solexa针对DGE测序的费用。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸测序技术领域，特别是数字基因表达谱技术领域。 另外，本发明还涉及标签及其使用方法，以及利用标签技术构建数字 基因表达谱文库的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术， 尤其是solexa测序技术。

背景技术

数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling，DGE)利用 新一代高通量测序技术和高性能计算分析技术，能够全面、经济、快 速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况。数字基因 表达谱已被广泛应用于基础科学研究、医学研究和药物研发等领域。

利用高通量测序能够得到数百万个基因的特异标签，而数字的序 列信号可以准确、特异地反映对应基因的真实表达情况。这种技术甚 至可以精确地检测低至一两个拷贝的稀有转录本，并精确定量高达十 万个拷贝的转录本的表达量变化。由于序列无需事先设计，DGE数据 具有极佳的实时性，DGE可以检测到许多未曾注释的基因和基因组部 位，为新基因的发现提供了良好的线索。这一技术进步允许科学家更 加全面、准确地把握全基因组的基因表达情况。

目前illumina公司的Solexa测序平台提供的DGE文库制备方法有 两种，分别为方法一[1]和方法二[2]。方法一，首先从总RNA样品中分 离mRNA，将mRNA反转录成cDNA，通过NlaIII酶酶切cDNA链，产 生特异性的粘性末端。连接反应过程中GEX接头1(也称为GEX  Adapter 1)与带有粘性末端的目的片段进行连接。随后通过限制性内 切酶MmeI酶切目的片段，该内切酶识别TCCRAC(N)₂₀，切成3’末端 序列为两个随机碱基的粘性末端，然后与GEX接头2(也称为GEX  adapter2)进行连接反应。目的片段连接GEX接头2之后，通过特定的 PCR引物对目的片段进行扩增，最后通过切胶回收目的片段文库，如 图1(A)。方法二，首先从总RNA样品中分离mRNA，将mRNA反转 录成cDNA，通过DpnII酶酶切cDNA链，产生特异性的粘性末端。连 接反应过程中GEX接头1与带有粘性末端的目的片段进行连接。随后 通过限制性内切酶MmeI酶切目的片段，该内切酶识别TCCRAC(N)₂₀， 切成3’末端序列为两个随机碱基的粘性末端，然后与GEX接头2进行连 接反应。目的片段连接GEX接头2之后，通过特定的PCR引物对目的 片段进行扩增，最后通过切胶回收目的片段文库，如图1(B)。

方法一和方法二这两种文库制备的方法不同之处：两种不同的建 库方法使用了不同的限制性内切酶NlaIII和DpnII，这两种酶识别的 剪切位点不一样：NlaIII酶切位点为5’-CATG-3’，DpnII酶切位点为 5’-GATC-3’，酶切产生的目的片段的5’末端序列不同，所以需要它们 的GEX接头1序列不同，最后构建所得文库所使用的测序引物也不 一样。这两种文库制备的方法存在着一些缺陷，即只能对单个文库样 品进行Solexa Single End(illumina)测序，不能将DGE文库样品混 合测序。因为随着solexa测序通量的增加，1个测序泳道(也称为lane) 所产出的数据远远大于目的片段所需求的数据，如果所构建的文库样 品不能进行混合测序，将在一定程度上“浪费测序资源”和影响到测 序通量。

发明内容

使用同样的RNA样品构建DGE文库，如果数据产出存在偏向性 的问题，将会导致数据结果不可信，不能真实的反映样品的相关信息， 同时也将导致实验结果重复性低。本发明基于目前illumina公司的 solexa测序平台提供的DGE文库制备方法[1，2]，将一段特定长度的 核苷酸序列(即标签，也称为index)嵌入接头(也称为adapter)中， 同时考虑PCR引物的扩增效率和数据产出的偏向性因素，筛选出合适 的标签及含该标签序列的接头，并将该接头用于混合样品测序，确保 数据的准确性和可重复性。

标签设计首先需要考虑标签序列之间的序列差异程度和碱基识别 率。在标签混合量少于12个样品的情况下，必须考虑到混合后的标签 上的每个碱基位点的GT含量。因为solexa测序过程中，碱基G和T 的激发荧光一样，碱基A和C的激发光是一样的，因此必须考虑碱基 “GT”含量与碱基“AC”含量的“平衡”，最后考虑数据产出的准 确性和可重复性。在设计标签的过程中，本发明充分考虑到以上几个 因素，同时避免了标签序列出现3或3个以上连续的碱基的出现，这 样可以降低序列在合成过程中或测序过程中的错误率。标签序列本身 嵌入接头中，也要尽可能的避免出现发夹结构或与测序引物及其反向 互补序列相同的现象。

在本发明的一个具体实施方式中，将特定长度的核苷酸序列嵌入 已有DGE文库的的3’接头(GEX adapter 2)的5’末端中形成GEX 标签接头2，使用不同的GEX标签接头2进行连接反应，构建DGE 标签文库。如图2所示，首先从总RNA样品中分离mRNA，将mRNA 反转录成cDNA，通过限制性内切酶NlaIII酶切cDNA链，产生特异 性的粘性末端。连接反应过程中，将GEX接头1与带有粘性末端的 目的片段进行连接。随后通过限制性内切酶MmeI酶切目的片段，该 内切酶识别TCCRAC(N)₂₀，切成3’末端序列为两个随机碱基的粘性 末端，然后与GEX标签接头2进行连接反应。目的片段连接GEX标 签接头2之后，通过特定的PCR引物对目的片段进行扩增，最后通过 切胶回收目的片段文库。

基于目前illumina公司的solexa测序平台提供的DGE文库制备方 法，本发明针对DGE样品建库方法，设计了独特的标签序列，通过接 头将标签嵌入DGE文库的3’接头中，成功的建立了数字基因表达谱标 签文库(DGE标签文库，DGE index library)的建库方法，适合任何 真核生物RNA样品的DGE标签文库构建，并成功用于solexa测序， 不仅增大了DGE样品的测序通量，而且降低了solexa针对DGE测序 的费用。

本发明基于目前illumina公司提供的Solexa Single End测序平台， 设计一段长度为10bp的特定标签序列，将标签序列嵌入接头序列中。 考虑到GEX标签接头2的连接效率，优化并筛选出12条GEX标签接 头，这些标签之间的差异在5个碱基以上，当标签的10个碱基中的任 意1个碱基出现测序错误或合成错误，都不影响到标签的最终识别。

表1为优化筛选出来的12条标签(index1-12)序列，及其对应的 GEX标签接头2序列(Gex IndexN adapter2 F和Gex IndexN adapter2  R，N＝1-12)信息。这些标签及其GEX标签接头2可以应用于任何 DGE标签文库的构建。这些标签应用于DGE样品的文库构建并通过 solexa测序的方法，目前尚未有报道。

表1DGE标签序列及GEX标签接头2序列，其中每一个GEX标 签接头2由有义序列Gex indexN adapter2 F和反义序列Gex indexN  adapter2 R经退火形成。

在本发明的一个具体实施方式中，将本发明的12条标签嵌入接头 中，构建的文库(参见实施例1，使用小鼠RNA为材料，基于方法二， 构建的12个小鼠表达谱标签文库)使用sanger测序法进行测序，结果 见实施例1(index1文库-index12文库)，斜体标记的为目的片段序 列，粗体标记的序列为标签序列，载体为pMD-18T载体(Takara，Code  No.：D103A)。这样在使用嵌入标签的3’接头的测序过程中，solexa 首先测出目的片段序列，随后测标签序列，如图3所示。

使用同样的标签(在实施例2中使用的是Gex Index11 adapter2) 针对同样的样品进行重复性试验(参见实施例2，其中使用水稻RNA 为材料，基于方法一，构建了2个水稻表达谱标签文库)，如图4结 果显示，两次测序结果中，发现的基因数量基本一致，且占的比例一 致。通过DGE标准分析方法[3]，对DGE标签文库的重复性进行分 析，其中表达量TPM(Transcripts Per Million clean reads)的算法 是：每个基因包含的原始Clean Tags数/该样本中总clean Tags数 ^＊1,000,000[4]。将结果标准化后，如果两次重复性高的话，相关性将 会越接近1。在实施例2中，使用本发明的标签构建DGE标签文库的 重复性结果理想，两次solexa测序结果的相关性为0.99，如图5，均 证明DGE标签文库进行测序的数据可重复性高。

在本发明的一个具体实施方式中，将本发明的12个GEX标签接 头2通过Lasergene软件(http://www.dnastar.com/)分析测试其结构 的稳定性，如实施例4所示。

本发明一方面提供了一组标签，其中所述标签为长度是10bp的核 酸序列，并且所述标签之间的差异在5个碱基以上，所述一组标签由如 下组成：表1所示12个标签或与其相差1个碱基的标签中的至少2个，或 至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少7个，或至少8 个，或至少9个，或至少10个，或至少11个，或全部12个，

根据本发明，所述一组标签优选地至少包括表1所示的12个标签中 的Index1和Index2，或Index3和Index4，或Index5和Index6，或Index7 和Index8，或Index9和Index10，或Index11和Index12，或者他们任何 两个或多个的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，其中所述相差1个碱基包括对表 1所示12个标签的序列中1个碱基的取代、添加或缺失。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供了所述标签用于数 字基因表达谱标签文库构建并测序的用途。在本发明提供的所述用途 中，所述标签包含在GEX接头2的5’末端中，从而构成各自相对应的 GEX标签接头2，其用作数字基因表达谱标签文库的3’接头。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供了所述标签用于数 字基因表达谱标签文库构建并测序的用途，其中所述标签包含在GEX 接头2的5’末端中，包括标签通过或不通过连接子与GEX接头1的5’末 端相连，或者插入GEX接头2的5’末端中。优选的是不通过连接子与 GEX接头1的5’末端相连。其中所述连接子是1-10个碱基的序列，优 选地1-5个碱基地序列，更优选1-3个碱基的序列。

本发明另一方提供了使用所述的标签构建的数字基因表达谱标签 文库。

本发明另一方面提供了含有本发明所提供标签的一组GEX标签 接头2，其在5’末端含有所述的标签，并且优选地用作数字基因表达谱 标签文库的3’接头，所述一组GEX标签接头2包括或由如下组成：表1 所示12个GEX标签接头2或与其中包含的标签序列相差1个碱基的接 头中的至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，至少6个，或至 少7个，或至少8个，或至少9个，或至少10个，或至少11个，或全部12 个，

根据本发明，所述一组GEX标签接头2优选地至少包括表2所示的 12个GEX标签接头2中的Gex Index1 adapter2F/R和Gex Index2  adapter2 F/R，或Gex Index3 adapter2 F/R和Gex Index4 adapter2  F/R，或Gex Index5 adapter2 F/R和Gex Index6 adapter2 F/R，或Gex  Index7 adapter2 F/R和Gex Index8 adapter2 F/R，或Gex Index9  adapter2 F/R和Gex Index10 adapter2 F/R，或Gex Index11 adapter2  F/R和Gex Index12 adapter2 F/R，或者他们任何两个或多个的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，其中所述相差1个碱基包括标签 序列中1个碱基的取代、添加或缺失。

在本发明的具体实施方式中，本发明所提供的GEX标签接头2用 于数字基因表达谱标签文库构建并测序的用途，所述GEX标签接头2 用作数字基因表达谱标签文库的3’接头。

本发明另一方面提供了使用上文所述的GEX标签接头2构建的数 字基因表达谱标签文库，其中所述GEX标签接头2用作数字基因表达 谱标签文库的3’接头。

本发明另一方面提供了一种构建数字基因表达谱标签文库并测序 的方法，所述方法的特征在于使用选自表1的GEX标签接头2用作 数字基因表达谱标签文库的3’接头，构建数字基因表达谱标签文库。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明所提供的方法包括：

1)提供n个总RNA样品，n为整数且1≤n≤12，优选地2≤n ≤12，所述RNA样品来自任何真核生物RNA样品，包括但不限于水 稻、小鼠和人的RNA样品，从总RNA样品中分离mRNA，将mRNA 反转录成cDNA；

2)添加GEX接头1：通过5’限制性内切酶酶切cDNA产生带有 5’粘性末端的cDNA片段，所述5’限制性内切酶包括但不限于NlaIII 和DpnII，然后通过连接反应将GEX接头1与带有5’粘性末端的cDNA 片段进行连接；

3)添加GEX标签接头2：通过3’限制性内切酶酶切上述步骤2) 所得的cDNA片段产生带有3’粘性末端的cDNA片段，所述3’限制性 内切酶包括但不限于MmeI，然后通过连接反应将GEX标签接头2与 带有3’粘性末端的cDNA片段进行连接，；

4)通过PCR对目的片段进行扩增，最后通过回收目的片段文库；

5)混合：当n＞1时，将各样品的PCR扩增产物混合在一起；当n ＝1时，直接进行步骤6)；

6)测序：将各样品的PCR扩增产物利用Solexa测序技术进行测 序。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法中使用的所述GEX 标签接头1是如下接头：

当所述5’限制性内切酶是DpnII时，GEX标签接头1是Gex Adapter 1A(也称为Gex接头1A)：

5′P-GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAAC

5’ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC；和

在本发明的另一个具体实施方式中，当所述5’限制性内切酶是 NlaIII时，GEX标签接头1是Gex Adapter 1B(也称为Gex接头1B)：

5′P-TCGGACTGTAGAACTCTGAAC

5′ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACATG。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法中使用的所述GEX 标签接头2包括或由如下组成：表1所示12个GEX标签接头2或与其中 包含的标签序列相差1个碱基的接头中的至少2个，或至少3个，或至少 4个，或至少5个，至少6个，或至少7个，或至少8个，或至少9个，或 至少10个，或至少11个，或全部12个，

所述一组GEX标签接头2优选地至少包括表2所示的12个GEX标 签接头2中的Gex Index1 adapter2 F/R和Gex Index2 adapter2 F/R，或 Gex Index3 adapter2 F/R和Gex Index4 adapter2 F/R，或Gex Index5  adapter2 F/R和Gex Index6 adapter2 F/R，或Gex Index7 adapter2 F/R 和Gex Index8 adapter2 F/R，或Gex Index9 adapter2 F/R和Gex  Index10 adapter2 F/R，或Gex Index11 adapter2 F/R和Gex Index12  adapter2 F/R，或者他们任何两个或多个的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，其中所述相差1个碱基包括标签 序列中1个碱基的取代、添加或缺失。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法中步骤4)的PCR 使用如下PCR引物：

当所述5’限制性内切酶是DpnII时，PCR引物是：

Gex PCR Primer 1

5′CAAGCAGAAGACGGCATACGA，和

Gex PCR Primer 2A

5′AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTAC AGTCCGA；以及

在本发明的另一个具体实施方式中，当所述5’限制性内切酶是 NlaIII时，PCR引物是：

Gex PCR Primer 1

5′CAAGCAGAAGACGGCATACGA，和

Gex PCR Primer 2B

5′AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTAC AGTCCGA。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法中利用Solexa测序 技术进行测序，其中使用的测序引物包括当所述5’限制性内切酶是 DpnII时，使用测序引物为Gex Sequencing Primer1A：5′ CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC；当所述5’限制 性内切酶是NlaIII时，使用测序引物为Gex Sequencing Primer1B： 5′CCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACATG。

本发明另一方面提供了通过所述方法构建的数字基因表达谱标签 文库。

附图说明

图1：数字表达谱建库流程示意图。A)：使用NlaIII酶建库流程 示意图，即方法一(Preparing Samples for Digital Gene Expression-Tag  Profiling with NlaIII)；B)：使用DpnII酶建库流程示意图，即方法 二(Preparing Samples for Digital Gene Expression-Tag Profiling with  DpnII)。

图2：DGE标签文库建库示意图。

图3：DGE标签文库测序示意图。其中Read1表示测序反应1所 测出来的序列，Read 1 Seq Primer表示测序引物。

图4：实施例2的DGE标签文库重复性建库测试。分别为水稻RNA 样品第一次建库后solexa测序结果和水稻RNA样品第二次建库后 solexa测序结果。使用水稻RNA样品，基于方法一构建了两个水稻表 达谱标签文库，参见实施例2。该图中显示了Tag Classification：标记分 类，Sense：正义链；Anti Sense：反义链；PM：完全匹配；MM：错配； Mitochondrion：线粒体；Chloroplast：叶绿体；Genome：基因组； Unknown Tag：未知标记；1 tag-＞1 gene表示测序检测出来的基因数大 于1。1 tag-＞1 position表示测序检测出来的标记能比对在基因组的多 个位置。

图5：实施例2的DGE标签文库重复性建库测试结果。使用DGE标 准分析方法，其中表达量TPM(Transcripts Per Million clean reads) 的算法是：每个基因包含的原始Clean Tags数/该样本中总clean Tags 数^＊1,000,000[4]，基因表达量分别以10为底取对数，然后计算两种基 因表达量的相关系数。如果两者重复性越高，其pearson系数越接近1。 该图显示两者重复性为0.99，说明两次实验重复性非常好。其中Gene  Expression表示：基因表达量

图6：DGE标签文库之间的数据相关性分析结果。横坐标显示的 是不同表达谱标签文库的基因表达量以10为底取对数，纵坐标显示的 是同一个标准表达谱文库的基因表达量以10为底取对数，然后计算两 种基因表达量的相关系数。如果两者重复性越高，其pearson系数越接 近1。该图显示两者重复性为0.99，说明4个标签构建的表达谱文库的 重复性非常好。其中Gene Expression表示：基因表达量Pearson r表示 相关系数

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。

在本申请的实施例中采用的核酸序列如下：

DpnII基因表达寡核苷酸序列(如实施例1)

Gex Adapter 1A(也称为Gex接头1A)

5′P-GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAAC

5’ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC

Gex PCR Primer 1(也称为Gex PCR引物1)

5′CAAGCAGAAGACGGCATACGA

Gex PCR Primer 2A(也称为Gex PCR引物2A)

5′AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTAC AGTCCGA

Gex Sequencing Primer1A(也称为Gex测序引物1A)

5′CGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC

NlaIII基因表达寡核苷酸序列(如实施例2、实施例3和实施例4)：

Gex Adapter 1B(也称为Gex接头1B)

5′P-TCGGACTGTAGAACTCTGAAC

5′ACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACATG

Gex PCR Primer 1(也称为Gex PCR引物1)

5′CAAGCAGAAGACGGCATACGA

Gex PCR Primer 2B(也称为Gex PCR引物2B)

5′AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTAC AGTCCGA

Gex Sequencing Primer1B(也称为Gex测序引物1B)

5′CCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACATG

Gex indexN adapter2序列(N＝1-12)，其中每一个GEX标签 接头2由有义序列Gex indexN adapter2 F和反义序列Gex indexN  adapter2 R经退火形成。

试剂(illumina公司)

实施例1，DGE标签文库的构建具体实例

以小鼠肝脏RNA为材料，分别使用上文所示的12种不同的DGE 标签接头2进行实验，共构建12个带不同标签的小鼠表达谱标签文库

A准备小鼠总RNA

1.取4ug小鼠肝脏总RNA于200ul PCR管中，使用DEPC水稀释 至50ul，混匀；

2.将样品置于PCR仪上65℃变性5分钟，打开二级结构；

3.将样品置于冰上。

B准备GEX Sera-mag Magnetic Oligo(dT)磁珠

1.使GEX Sera-mag Magnetic Oligo(dT)磁珠在漩涡混合器 (vortex)上混匀，吸取50ul于1.5ml不粘EP管中；

2.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

3.向EP管中加入100ul GEX Binding buffer，将磁珠小心混匀；

4.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

5.再取100ul GEX Binding buffer加入EP管中，将磁珠小心混 匀；

6.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

7.取50ul GEX Binding buffer加入EP管中，将磁珠小心混匀。

C分离mRNA

1.将变性后的50ul小鼠总RNA加入1.5ml装有磁珠的EP管中， 在常温下旋转孵育10分钟；

2.将EP管置于磁力架上2分钟，弃去上清；

3.向含有磁珠的EP管中加入200ul GEX Washing buffer，将磁 珠小心混匀，置于磁力架上2分钟，弃去上清；

4.重复以上步骤(3)；

5.向含有磁珠的EP管中加入100ul 1×first strand buffer，将磁 珠小心混匀，置于磁力架上2分钟，弃去上清；将磁珠保存在1×first  strand buffer中。

D合成cDNA第一链

1.取RNase free 1.5ml EP管按以下表格配制cDNA第一链合成 试剂混合物；

2.将装有磁珠的EP管置于磁力架上2分钟，弃去上清。加入48ul cDNA一链合成试剂混合物，将磁珠小心混匀；

3.将EP管置于Thermomixer(Eppendorf公司)上42℃孵育2分钟；

4.加入2ul SuperScript II Reverse Transcriptase(illumina公 司)，小心混匀，将EP管置于42℃ Thermomixer上1400rpm连续震动 1小时；

5.立刻将装有磁珠的EP管置于70℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共15分钟。完成后将EP管保存在 冰上。

E合成cDNA第二链

配制试剂

●1×DpnII Buffer(200ul/样品，考虑10％损耗)

●准备Working Cleaning Solution(磁珠清洗缓冲液)

1.在冰上向有磁珠的EP管中加入31ul纯水；

2.依次加入以下试剂：

10×DpnII Buffer     10ul

10mM dNTP mix        3ul

3.将磁珠和试剂混合均匀，置于冰上孵育5分钟；

4.依次加入以下试剂：

DNA Polymerase I     5ul

RNase H              1ul

5.将磁珠和试剂混合均匀，置于16℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共3小时；

6.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

7.使用750ul GEX buffer C重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

8.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

9.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

10.使用750ul GEX buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

11.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

12.再使用100ul 1×DpnII Buffer重悬磁珠，取一新1.5ml不粘 RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

F DpnII酶切反应

配置试剂：

●DpnII酶切混合液

●Working Cleaning Solution

1.将含有悬于1×DpnII Buffer的磁珠的EP管置于磁力架上2分 钟后，小心吸取弃去上清；

2.使用99ul DpnII酶切混合液将磁珠重悬；

3.加入1ul DpnII酶。

4.将磁珠和试剂混合均匀，置于37℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共1小时；

5.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

6.使用750ul GEX buffer C重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

7.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

8.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

9.使用750ul GEX buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

10.然后使用750ul GEX buffer D重悬磁珠后，将EP管置于4℃冰 箱中过夜；

G连接DpnII Adapter 1

配置试剂：

●1×T4 DNA ligase buffer

●1×DpnII Buffer

●Working Cleaning Solution

1.将含有悬于GEX buffer D的磁珠的EP管置于磁力架上2分钟 后，小心吸取弃去上清；

2.使用100ul 1×T4 DNA ligase buffer重悬磁珠，将EP管置于磁 力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

3.再使用100ul 1×T4 DNA ligase buffer重悬磁珠，取一新1.5ml 不粘RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

4.将装有磁珠的EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清。

5.依次小心加入以下试剂：

Ultra pure water           34ul

Gex Adapter 1A             5ul

5×T4 DNA ligase buffer    10ul

T4 DNA ligase              1ul

6.将磁珠和试剂混合均匀，置于20℃Thermomixer上保持 1400rpm连续震动2.5小时；

7.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

8.使用750ul GEX缓冲液C重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2分 钟后，小心吸取弃去上清；

9.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

10.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

11.使用750ul GEX buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

12.再使用100ul 1×DpnII Buffer重悬磁珠，取一新1.5mL不粘 RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

H MmeI酶切反应

●10×SAM(10ul/样品)

●MmeI酶切混合液

1.将含有悬于1×Restiction Buffer的磁珠的EP管置于磁力架上 2分钟后，小心吸取弃去上清；

2.使用100ul MmeI酶切混合液将磁珠重悬。将磁珠和试剂混合 均匀，置于37℃Thermomixer上保持1400rpm连续震动1.5小时；

3.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取上清转移至一新 1.5ml RNase-free管中，含有磁珠的EP管可丢弃；

4.向装有上清溶液的EP管中加入2ul CIAP，将溶液混合均匀， 37℃Thermomixer上孵育1小时去磷酸；

5.加入100ul苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1，v/v)，充分混匀，振 荡大约10秒后，14000rpm室温离心10分钟，吸取上层液体转移至新 1.5ml EP管中；

6.加入100ul氯仿/异戊醇(24/1，v/v)，充分混匀，振荡大约10秒 后，14000rpm室温离心10分钟，吸取上层液体转移至新1.5ml EP管中；

7.取1ul糖原，10ul 3M NaOAc，和325ul-20℃100％酒精于上 层液体中，混合均匀，-80℃放置30min，4℃，14000rpm离心30分钟；

8.弃去上层清液，使用500ul常温70％酒精进行洗涤沉淀， 14000rpm离心5分钟，弃上清，将酒精晾干；

9.加入6ul ultra pure water溶解沉淀，将EP管置于-20℃保存。

I连接GEX标签引物2的反应

向6ul MmeI酶切产物EP管中分别依次加入以下试剂：

GEX indexN Adapter 2            1ul

5×T4 DNA ligase buffer         2ul

T4 DNA ligase                   1ul

混合均匀后置于20℃Thermomixer上孵育2.5小时。

J PCR反应扩增文库

配置试剂：

●PCR反应液混合成分

取47.5ul PCR master mix分别加入0.2ml PCR管中。

取2.5ul连接完接头的cDNA产物，混合均匀。

置于PCR仪上进行扩增：

98℃30s

72℃10min

4℃静置

K扩增产物的纯化

配置试剂：

●1×NEbuffer 2(100ul/样品))

1.向50ul PCR产物中加入10ul 6×DNA loading dye(上样染 料)，混匀；取1.2ul 25bp ladder，向其中加入1.2ul 6×DNA loading dye， 混匀；

2.将样品于PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)中电泳分离；

3.电泳结束后，回收大约85bp位置的DNA条带；回收的碎胶中 加入100ul的1×Gel Elution Buffer 100ul，洗脱2小时；

4.将EP管中的溶液和碎胶全部转移至Spin-X管中，14000rpm 离心2分钟，去掉过滤管；

5.向剩余的澄清液体中加入1ul糖原，10ul 3M NaOAc，和325ul -20℃100％酒精，混合均匀，14000rpm离心30分钟；

6.弃去上清液，使用500ul常温70％酒精进行洗涤沉淀小块， 14000rpm离心5分钟，尽量弃去上清。打开EP管盖，在空气中晾干； 加入10ul Elution buffer(洗脱缓冲液)溶解沉淀小块，置于-20℃保存。

将溶解DNA溶液导入pMD-18T载体中，然后转染到大肠杆菌中， 通过过夜培养后，然后挑取单克隆，提取DNA后，使用sanger测序， 将其序列测序出来，其中使用BcaBEST Sequencing Primer M13-47 (takara，Code：D101A)作为测序引物。结果如下：

＞index1文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATTTCTTCC TCTTCCTACAGTCTGGAACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index2文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTAACTGACA ATAAAAGCACTACACATCACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index3文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGAAGTACA GATAGGACTGACCATTGTACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index4文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTGTCCCTAA TAAAGCTTGGACTACTGACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index5文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGTATATCAA AGAGAAACTTGATTCCACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index6文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGACCAAATC TTGCAGCTCTGTTACTCAGACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index7文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATTTCTTCC TCTTCCTTTAGATCAGGACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index8文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAAGACTCAG GACTCATCTTCATCGTGTAACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index9文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTGTCCCTAA TAAAGCTGCTCCTACTCTACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index10文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCACATCCACA GGAATCACCTATACATCCACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index11文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGCTGCCCTC CACCATATCCCAGTACTTCACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

＞index12文库

AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATATTAAAA CATCTCCTCTCAGAATACACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

实施例2，DGE标记文库的构建具体实施例

以水稻叶片RNA为材料，基于方法一，使用Gex Index11 adapter2 平行构建2个标签文库，检测标签文库的产出的数据稳定性。

A准备水稻总RNA

1.取4ug水稻叶片总RNA于200ul PCR管中，使用DEPC水稀释 至50ul，混匀；

2.将样品置于PCR仪上65℃变性5分钟，打开二级结构；

3.将样品置于冰上。

B准备Sera-mag Magnetic Oligo(dT)磁珠

1.使GEX Sera-mag Magnetic Oligo(dT)磁珠在漩涡混合器 (vortex)上混匀，吸取50ul于1.5ml不粘EP管中；

2.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

3.向EP管中加入100ul GEX Binding buffer，将磁珠小心混匀；

4.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

5.再取100ul GEX Binding buffer加入EP管中，将磁珠小心混 匀；

6.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

7.取50ul GEX Binding buffer加入EP管中，将磁珠小心混匀。

C分离mRNA

1.将变性后的50ul水稻总RNA加入1.5ml装有磁珠的EP管中， 在常温下旋转孵育10分钟；

2.将EP管置于磁力架上2分钟，弃去上清；

3.向含有磁珠的EP管中加入200ul GEX Washing buffer，将磁 珠小心混匀，置于磁力架上2分钟，弃去上清；

4.重复以上步骤(3)；

5.向含有磁珠的EP管中加入100ul 1×first strand buffer，将磁 珠小心混匀，置于磁力架上2分钟，弃去上清；将磁珠保存在1×first  strand buffer中。

D合成cDNA第一链

1.取RNase free 1.5ml EP管按以下表格配制cDNA第一链合成 试剂混合物；

2.将装有磁珠的EP管置于磁力架上2分钟，弃去上清。加入48ul cDNA一链合成试剂混合物，将磁珠小心混匀；

3.将EP管置于Thermomixer(Eppendorf公司)上42℃孵育2分 钟；

4.加入2ul SuperScript II Reverse Transcriptase(illumina公 司)，小心混匀，将EP管置于42℃Thermomixer上1400rpm连续震动 1小时；

5.立刻将装有磁珠的EP管置于70℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共15分钟。完成后将EP管保存在 冰上。

E合成cDNA第二链

配制试剂

●1×Nla III Buffer(200ul/样品，考虑10％损耗)

●准备Working Cleaning Solution

1.在冰上向有磁珠的EP管中加入31ul纯水；

2.依次加入以下试剂：

10X Nla III Buffer    10ul

10mM dNTP mix         3ul

3.将磁珠和试剂混合均匀，置于冰上孵育5分钟；

4.依次加入以下试剂：

DNA聚合酶I            5ul

RNase H酶             1ul

5.将磁珠和试剂混合均匀，置于16℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共3小时；

6.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

7.使用750ul GEX buffer C重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

8.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

9.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

10.使用750ul GEX buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

11.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

12.再使用100ul 1×Nla III Buffer重悬磁珠，取一新1.5ml不粘 RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

F NlaIII酶切反应

配置试剂：

●NlaIII酶切混合液

●Working Cleaning Solution

1.将含有悬于1×Nla III Buffer的磁珠的EP管置于磁力架上2分 钟后，小心吸取弃去上清；

2.使用99ul NlaIII酶切混合液将磁珠重悬；

3.加入1ul NlaIII酶。

4.将磁珠和试剂混合均匀，置于37℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共1小时；

5.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

6.使用750ul GEX Buffer C重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

7.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

8.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

9.使用750ul GEX Buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

10.然后使用750ul GEX Buffer D重悬磁珠后，将EP管置于4℃冰 箱中过夜；

G连接NlaIII Adapter 1

配置试剂：

●1×T4 DNA ligase buffer

●1×Nla III Buffer

●Working Cleaning Solution

1.将含有悬于GEX Buffer D的磁珠的EP管置于磁力架上2分钟 后，小心吸取弃去上清；

2.使用100ul 1×T4 DNA ligase buffer重悬磁珠，将EP管置于磁 力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

3.再使用100ul 1×T4 DNA ligase buffer重悬磁珠，取一新1.5ml 不粘RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

4.将装有磁珠的EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上 清。

5.依次小心加入以下试剂：

Ultra pure water    34ul

Gex Adapter 1B             5ul

5×T4 DNA ligase buffer    10ul

T4 DNA ligase              1ul

6.将磁珠和试剂混合均匀，置于20℃Thermomixer上保持 1400rpm连续震动2.5小时；

7.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

8.使用750ul GEX bufferC重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2分 钟后，小心吸取弃去上清；

9.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

10.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

11.使用750ul GEX buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

12.再使用100ul 1×Nla III Buffer重悬磁珠，取一新1.5mL不粘 RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

H MmeI酶切反应

●10×SAM(10ul/样品)

●MmeI酶切混合液

1.将含有悬于1×Restiction Buffer的磁珠的EP管置于磁力架上 2分钟后，小心吸取弃去上清；

2.使用100ul MmeI酶切混合液将磁珠重悬。将磁珠和试剂混合 均匀，置于37℃Thermomixer上保持1400rpm连续震动1.5小时；

3.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取上清转移至一新 1.5ml RNase-free管中，含有磁珠的EP管可丢弃；

4.向装有上清溶液的EP管中加入2ul CIAP，将溶液混合均匀， 37℃Thermomixer上孵育1小时去磷酸；

5.加入100ul苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1，v/v)，充分混匀，振 荡大约10秒后，14000rpm室温离心10分钟，吸取上层液体转移至新 1.5ml EP管中；

6.加入100ul氯仿/异戊醇(24/1，v/v)，充分混匀，振荡大约 10秒后，14000rpm室温离心10分钟，吸取上层液体转移至新1.5ml EP 管中；

7.取1ul糖原，10ul 3M NaOAc，和325ul-20℃100％酒精于上 层液体中，混合均匀，-80℃放置30min，4℃，14000rpm离心30分钟；

8.弃去上层清液，使用500ul常温70％酒精进行洗涤沉淀， 14000rpm离心5分钟，弃上清，将酒精晾干；

9.加入6ul ultra pure water溶解沉淀，将EP管置于-20℃保存。

I连接GEX标签接头2的反应

向6ul MmeI酶切产物EP管中分别依次加入以下试剂：

Gex Index11 adapter2            1ul

5×T4 DNA ligase buffer         2ul

T4 DNA ligase                   1ul

混合均匀后置于20℃Thermomixer上孵育2.5小时。

J PCR反应扩增文库

配置试剂：

●PCR反应液混合成分

取47.5ul PCR master mix分别加入0.2ml PCR管中。

取2.5ul连接完接头的cDNA产物，混合均匀。

置于PCR仪上进行扩增：

98℃30s

72℃10min

4℃静置

K扩增产物的纯化

配置试剂：

●1×Gel Elution Buffer(100ul/样品))

1.向50ul PCR产物中加入10ul 6×DNA loading dye，混匀；取 1.2ul 25bp ladder，向其中加入1.2ul 6×DNA loading dye，混匀；

2.将样品于PAGE胶中电泳分离；

3.电泳结束后，回收大约85bp位置的DNA条带；回收的碎胶中 加入100ul的1×Gel Elution Buffer100ul，洗脱2小时；

4.将EP管中的溶液和碎胶全部转移至Spin-X管中，14000rpm 离心2分钟，去掉过滤管；

5.向剩余的澄清液体中加入1ul糖原，10ul 3M NaOAc，和325ul -20℃100％酒精，混合均匀，14000rpm离心30分钟；

6.弃去上清液，使用500ul常温70％酒精进行洗涤沉淀小块， 14000rpm离心5分钟，尽量弃去上清。打开EP管盖，在空气中晾干； 加入10ul Elution Buffer溶解沉淀小块，置于-20℃保存。

7.最后检测浓度完毕后通过solexa测序将目的片段测序出来。 其中使用测序引物为Gex Sequencing Primer1B(Gex测序引物1B)。

实施例3，DGE标签文库的构建

以拟南芥叶片RNA为材料，基于方法一构建了4个标签文库，分 析标签文库之间数据的稳定性。

A准备拟南芥总RNA

1.取4ug拟南芥总RNA于200ul PCR管中，使用DEPC水稀释至 50ul，混匀；

2.将样品置于PCR仪上65℃变性5分钟，打开二级结构；

3.将样品置于冰上。

B准备GEX Sera-mag Magnetic Oligo(dT)磁珠

1.使GEX Sera-mag Magnetic Oligo(dT)磁珠在漩涡混合器 (vortex)上混匀，吸取50ul于1.5ml不粘EP管中；

2.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

3.向EP管中加入100ul GEX Binding buffer，将磁珠小心混匀；

4.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

5.再取100ul GEX Binding buffer加入EP管中，将磁珠小心混 匀；

6.将EP管置于磁力架上2分钟，小心吸出上清；

7.取50ul GEX Binding buffer加入EP管中，将磁珠小心混匀。

C分离mRNA

1.将变性后的50ul拟南芥总RNA加入1.5ml装有磁珠的EP管 中，在常温下旋转孵育10分钟；

2.将EP管置于磁力架上2分钟，弃去上清；

3.向含有磁珠的EP管中加入200ul GEX Washing buffer，将磁 珠小心混匀，置于磁力架上2分钟，弃去上清；

4.重复以上步骤(3)；

5.向含有磁珠的EP管中加入100ul 1×first strand buffer，将磁 珠小心混匀，置于磁力架上2分钟，弃去上清；将磁珠保存在1×first  strand buffer中。

D合成cDNA第一链

1.取RNase free 1.5ml EP管按以下表格配制cDNA第一链合成 试剂混合物；

2.将装有磁珠的EP管置于磁力架上2分钟，弃去上清。加入48ul cDNA一链合成试剂混合物，将磁珠小心混匀；

3.将EP管置于Thermomixer(Eppendorf公司)上42℃孵育2分 钟；

4.加入2ul SuperScript II Reverse Transcriptase(illumina公 司)，小心混匀，将EP管置于42℃Thermomixer上1400rpm连续震动 1小时；

5.立刻将装有磁珠的EP管置于70℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共15分钟。完成后将EP管保存在 冰上。

E合成cDNA第二链

配制试剂

●1×Nla III(200ul/样品，考虑10％损耗)

●准备Working Cleaning Solution

1.在冰上向有磁珠的EP管中加入31ul纯水；

2.依次加入以下试剂：

10X Nla III Buffer    10ul

10mM dNTP mix         3ul

3.将磁珠和试剂混合均匀，置于冰上孵育5分钟；

4.依次加入以下试剂：

DNA聚合酶I            5ul

RNase H酶             1ul

5.将磁珠和试剂混合均匀，置于16℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共3小时；

6.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

7.使用750ul GEX BufferC重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2分 钟后，小心吸取弃去上清；

8.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

9.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

10.使用750ul GEX buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

11.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

12.再使用100ul 1×Nla III Buffer重悬磁珠，取一新1.5ml不粘 RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

F NlaIII酶切反应

配置试剂：

●NlaIII酶切混合液

●Working Cleaning Solution

1.将含有悬于1×Nla III Buffer的磁珠的EP管置于磁力架上2分 钟后，小心吸取弃去上清；

2.使用99ul NlaIII酶切混合液将磁珠重悬；

3.加入1ul NlaIII酶。

4.将磁珠和试剂混合均匀，置于37℃Thermomixer上保持 1400rpm间歇震动15秒，静止2分钟共1小时；

5.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

6.使用750ul GEX Buffer C重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

7.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

8.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

9.使用750ul GEX Buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

10.然后使用750ul GEX Buffer D重悬磁珠后，将EP管置于4℃冰 箱中过夜；

G连接NlaIII Adapter 1

配置试剂：

●1×T4 DNA ligase buffer

●1×Nla III Buffer

●Working Cleaning Solution

1.将含有悬于GEX Buffer D的磁珠的EP管置于磁力架上2分钟 后，小心吸取弃去上清；

2.使用100ul 1×T4 DNA ligase buffer重悬磁珠，将EP管置于磁 力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

3.再使用100ul 1×T4 DNA ligase buffer重悬磁珠，取一新1.5ml 不粘RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

4.将装有磁珠的EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上 清。

5.依次小心加入以下试剂：

Ultra pure water           34ul

Gex Adapter 1B             5ul

5×T4 DNA ligase buffer    10ul

T4 DNA ligase              1ul

6.将磁珠和试剂混合均匀，置于20℃Thermomixer上保持 1400rpm连续震动2.5小时；

7.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

8.使用750ul GEX bufferC重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2分 钟后，小心吸取弃去上清；

9.使用100ul新鲜Working Cleaning Solution重悬磁珠，混合 均匀后，将EP置于37℃Thermomixer上保持1400rpm间歇震动15秒， 静止2分钟共15分钟；

10.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取弃去上清；

11.使用750ul GEX buffer D重悬磁珠，将EP管置于磁力架上2 分钟后，小心吸取弃去上清；

12.再使用100ul 1×Nla III Buffer重悬磁珠，取一新1.5mL不粘 RNase-free EP管，将磁珠转移至新管中。

H MmeI酶切反应

●10×SAM (10ul/样品)

●MmeI酶切混合液

1.将含有悬于1×Restiction Buffer的磁珠的EP管置于磁力架上 2分钟后，小心吸取弃去上清；

2.使用100ul MmeI酶切混合液将磁珠重悬。将磁珠和试剂混合 均匀，置于37℃Thermomixer上保持1400rpm连续震动1.5小时；

3.将EP管置于磁力架上2分钟后，小心吸取上清转移至一新 1.5ml RNase-free管中，含有磁珠的EP管可丢弃；

4.向装有上清溶液的EP管中加入2ul CIAP，将溶液混合均匀， 37℃Thermomixer上孵育1小时去磷酸；

5.加入100ul苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1，v/v)，充分混匀，振 荡大约10秒后，14000rpm室温离心10分钟，吸取上层液体转移至新 1.5ml EP管中；

6.加入100ul氯仿/异戊醇(24/1，v/v)，充分混匀，振荡大约 10秒后，14000rpm室温离心10分钟，吸取上层液体转移至新1.5ml EP 管中；

7.取1ul糖原，10ul 3M NaOAc，和325ul-20℃100％酒精于上 层液体中，混合均匀，-80℃放置30min，4℃，14000rpm离心30分钟；

8.弃去上层清液，使用500ul常温70％酒精进行洗涤沉淀， 14000rpm离心5分钟，弃上清，将酒精晾干；

9.加入6ul ultra pure water溶解沉淀，将EP管置于-20℃保存。

I连接GEX标签接头2的反应

向6ul MmeI酶切产物EP管中分别依次加入以下试剂：

GEX indexN Adapter 2            1ul

5×T4 DNA ligase buffer         2ul

T4 DNA ligase                1ul

混合均匀后置于20℃Thermomixer上孵育2.5小时。

J PCR反应扩增文库

配置试剂：

●PCR反应液混合成分

取47.5ul PCR反应混合液分别加入0.2ml PCR管中。

取2.5ul连接完接头的cDNA产物，混合均匀。

置于PCR仪上进行扩增：

98℃30s

72℃10min

4℃静置

K扩增产物的纯化

配置试剂：

●1×Gel Elution Buffer(100ul/样品))

1.向50ul PCR产物中加入10ul 6×DNA loading dye，混匀；取 1.2ul 25bp ladder，向其中加入1.2ul 6×DNA loading dye，混匀；

2.将样品于PAGE胶中电泳分离；

3.电泳结束后，回收大约85bp位置的DNA条带；回收的碎胶中 加入100ul的1×Gel Elution Buffer100ul，洗脱2小时；

4.将EP管中的溶液和碎胶全部转移至Spin-X管中，14000rpm 离心2分钟，去掉过滤管；

5.向剩余的澄清液体中加入1ul糖原，10ul 3M NaOAc，和 325ul-20℃100％酒精，混合均匀，14000rpm离心30分钟；

6.弃去上清液，使用500ul常温70％酒精进行洗涤沉淀小块， 14000rpm离心5分钟，尽量弃去上清。打开EP管盖，在空气中晾干； 加入10ul Elution Buffer溶解沉淀小块，置于-20℃保存。

7.最后检测浓度后通过solexa将目的片段测序出来，其中使用 测序引物为Gex Sequencing Primer1B(Gex测序引物1B)。

以实验方法构建的DGE标签文库，使用illumina公司的solexa测序 平台测序，数据分析结果如表2，数据产出正常，没有大的差异。通过 DGE标准分析方法对DGE标签文库的重复性进行分析，其中表达量 TPM(Transcripts Per Million clean reads)的算法是：每个基因包含 的原始Clean Tags数/该样本中总clean Tags数^＊1,000,000[4]。将结果 标准化后，如果两次重复性高的话，相关性将会越接近1。相关性分析 结果显示，pearson相关性系数为0.99左右，如图6所示，针对代表性 的标签1-4(index1-4)进行上述DGE标准分析，表明使用本发明的GEX 标签接头2构建DGE标签文库，数据可重复性好，不会导致数据偏差。

表2同个样品使用5个不同GEX标签(index1-5)接头构建的DGE 标签文库测序结果

实施例4

Gex标签接头2是由两条序列组成，分别为Gex IndexN adapter2  F和Gex IndexN adapter2 R两条序列构成，其中N表示标签(index) 的编号。使用Lasergene的PrimerSelect软件，例如分析Gex Index1  adapter 2，分别将Gex Index1 adapter2 F和Gex Index1 adapter2 R 分别输入“Enter New Primer”中，通过分析两条序列之间形成的能 量值来判断双链体之间的亲和力参数，能量值的绝对值越大表示双链 体的结果越稳定，以下分别为分析了12个Gex Index adapter2的亲和 力的能量值，均在在50kal/mol以上，得到最稳定双链结构(the most  stable)，说明这12条Gex IndexN adapter 2形成的结果非常稳定。

GEX index1 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-58.1kcal/mol

  5′ACAGTCTGGATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNTGTCAGACCTAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index2 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-55.7kcal/mol

  5′ACTACACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNTGATGTGTAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index3 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-59.0kcal/mol

  5′TGACCATTGTTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNACTGGTAACAAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index4 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-57.3kcal/mol

  5′TGGACTACTGTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNACCTGATGACAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index5 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-58.7kcal/mol

  5′ACTTGATTCCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNTGAACTAAGGAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index6  Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-56.1kcal/mol

  5′TGTTACTCAGTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNAC AAT GAG TCAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index7 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-57.8kcal/mol

  5′TTAGATCAGGTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNAATCTAGTCCAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index8 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-57.9kcal/mol

  5′TCATCGTGTATCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNAGTAGCACATAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index9 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-57.6kcal/mol

  5′CTCCTACTCTTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||   3′NNGAGGAT GAGAAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index10 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-56.8kcal/mol

  5′CTATACATCCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNGATATGTAGGAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index11 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-57.6kcal/mol

  5′CCAGTACTTCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNGGTCATGAAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

GEX index12 Adapter2

The most stable 3′-dimer：31bp，-56.3kcal/mol

  5′CTCAGAATACTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′

     |||||||||||||||||||||||||||||||

3′NNGAGTCTTATGAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5′

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。

参考文献

1.Preparing Samples for Digital Gene Expression-Tag Profiling  with NlaIII.2007 Illumina，Inc.Part# 11251702 Rev.A

2.Preparing Samples for Digital Gene Expression-Tag Profiling  with DpnII.2007 Illumina，Inc.Part#11251729 Rev.A

3.Audic S.et al.The significance of digital gene expression  profiles.Genome Res.19977(10)：986-995

4、t Hoen，P.A.，Y.Ariyurek，et al.(2008).″Deep  sequencing-based expression analysis shows major advances in  robustness，resolution and inter-lab portability over five microarray  platforms.″Nucleic Acids Res 36(21)：e141.