一种还原刺激下快速释放乳香酸活性成分的聚合物的制备方法

摘要

本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种还原刺激下快速释放乳香酸活性成分的聚合物的制备方法。具体步骤是：在聚乙二醇的两端通过二硫键连接上乳香酸活性成分，在一般的体液环境中是稳定存在，乳香酸活性成分由于疏水性构成疏水内核，外壳为亲水性的聚乙二醇，一旦到达病变位置，由于还原环境的刺激，二硫键开始断裂，从而快速释放出内核中的乳香酸活性成分，从而提高了药物的治疗效果，减轻毒副作用。

说明书

技术领域

本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种还原刺激下快速释放乳香酸活性成分的聚合物的制备方法。

背景技术

被称为印度乳香的乳香树脂树胶酯已经在传统的印度草医药中被用作抗炎剂。古代印度草医药文献描述了其治疗用途。由印度CSIR实验室进行的临床跟踪试验已经清楚地显示在88%的患者中达到优良水平，而没有不良副作用（Singh，G.B.，Status report，anti-inflammatory drugs from plant sources，1982）。在患有膝盖骨干戒烟的患者上进行的随机、双盲、安慰剂对好的临床试验显示了统计学显著的疼痛改善、消肿和膝盖弯曲增加等（Kimmatkar，Phytomedicine，2003，10,3~7）。Boswellia serrata提取物对溃肠性结肠炎患者所显示的治疗效果可以与柳氮磺吡啶和美沙拉嗪的效果相比（Gupta，I，等人的，Eur）J.Med，Res.，1998，3，511-14和Gerhardt，H.，等人的，Gastroenterol，2001，39,11~17）。

而美国专利（专利号：WO 00/66111）报道，将其中的四种化合物（β-乳香酸、β-乳香酸乙酯、11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乳香酸乙酯）按一定比例混合，作为治疗自身免疫性疾病；专利（专利号：200810201528.X）表明11-羰基-β-乙酰乳香酸能够抑制肿瘤细胞的生长；专利（专利号为：200480017755.7）表明利用乳香酸活性成分能够有效地治疗关节炎。因此乳香酸活性成分由于其对治疗癌症、牛皮癣、关节炎等病症的潜在效果已经成为了集中研究的目标。

目前针对药物在体内代谢快，半衰期短，需频繁大量给药，且靶向性差的缺点，药物载体开始被广泛研究。药物与载体形成载药系统后，药物的吸收和分布受载体的理化性质的影响。根据临床要求选择适当的载体材料，不仅可以将药物输送到靶器官，而且对于药物载体性质和药理活性也起到有益的作用。而本发明的产物，不需要药物载体，即可在人体内接触到病变位置时，在还原环境的刺激下，可以释放出乳香酸活性成分，从而治疗疾病，这些都是基于二硫键的特性。 

巯基-二硫键交换反应快速、可逆，在保持活体细胞的诸多生物功能方面（如蛋白结构、酶活性、氧化-还原平衡等）发挥着非常重要的作用。谷胱甘肽是一种由三个氨基酸组成的含巯基的小分子肽，有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形式，它们是动物细胞内最主要的氧化-还原对，在生理条件下绝大多数以还原型谷胱甘肽的形式存在，谷胱甘肽还原酶催化两型间的互相转变。在线粒体、细胞质、细胞核、分泌途径和细胞外空间中，GSH/GSSG之间保持着一种独特的非平衡态。还原型谷胱甘肽（GSH）在人体各部位的浓度差别很大，例如在体液（如血液）和细胞外只有2~20uM，细胞内部却可以达到为0.5mM以上，而肿瘤细胞内部的浓度更是正常细胞的至少4倍以上。肿瘤细胞内高浓度GSH的存在，为其创造了一种独特的内部还原性环境，这就为二硫键连接的聚合物提供了相应的信号，因此针对细胞内药物传递的还原敏感性聚合物胶束的研究逐渐变得引人注意。例如， Zhong等人制备了以生物大分子葡聚糖（Dextran）作为亲水链的两嵌段共聚物（Dextran-S-S-PCL），（Biomacromolecules, 2010, 11(4): 848-854）； Li等人则制备了以聚亮氨酸为疏水链段的两嵌段共聚物（PEG-S-S-Pleu）（Polymer, 2011, 52(16): 3580-3586）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种还原刺激下快速释放乳香酸活性成分的聚合物的制备方法。

本发明的目的是在聚乙二醇的两端通过二硫键连接上乳香酸活性成分，使其具有良好的环境响应性，提高药物的治疗效果，减轻毒副作用。

本发明提供的一种还原刺激下快速释放乳香酸活性成分的聚合物的制备方法，具体步骤如下：

将分子量为1000~10000的聚乙二醇加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜中，加入重量百分数40%的苛性碱A水溶液，常温搅拌反应0.5~3小时后，加入聚乙二醇端羟基总摩尔数的5~10倍量的氯乙酸，反应温度为50~75℃，反应时间为24~48小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入聚乙二醇端羟基总摩尔数1~5倍量的N,N'-二环己基碳二亚胺，并按照N,N'-二环己基碳二亚胺摩尔数加入N-羟基琥珀酰亚胺，体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12~24小时后，将该溶液缓慢滴加至聚乙二醇端羟基总摩尔数的5~10倍量的胱胺的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为12~24小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将该含端氨基的聚乙二醇的氨基总数的1.5~3倍量的乳香酸活性成分加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜中，加入聚乙二醇的氨基总数的1~5倍量的N,N'-二环己基碳二亚胺，并按照N,N'-二环己基碳二亚胺摩尔数加入N-羟基琥珀酰亚胺，体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12~24小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为12~24小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

本发明中，所述的苛性碱A为氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或两种。

本发明中，所述的乳香酸活性成分为α-乳香酸、β-乳香酸、α-乳香酸乙酯、β-乳香酸乙酯、11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乳香酸乙酯、γ-乳香酸、2α、3α-双羟基-12-烯-24-羧酸、3α-羟基-9，12-双烯-24-羧酸、3-羰基-甘遂-8，24-二烯-21酸、3α-羟基甘遂-8，24-二烯-21酸、3β-羟基甘遂-8，24-二烯-21酸或3α-羧基甘遂-8,24-二烯-21酸中的一种。

本发明中，所述的产物是在聚乙二醇两端通过二硫键连接乳香酸活性成分，该产物可在还原环境中分解并脱落释放出乳香酸活性成分，该产物的分子量为1500~10000。

本发明的优点在于：本发明制备的一种还原刺激下快速释放乳香酸活性成分的聚合物，是在聚乙二醇的两端通过二硫键连接上乳香酸活性成分，在一般的体液环境中是稳定存在，乳香酸活性成分由于疏水性构成疏水内核，外壳为亲水性的聚乙二醇，一旦到达病变位置，由于还原环境的刺激，二硫键开始断裂，从而快速释放出内核中的乳香酸活性成分，从而提高了药物的治疗效果，减轻毒副作用。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。

实施例1

将聚乙二醇（分子量为1000）2g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的NaOH水溶液，常温搅拌反应0.5小时后，加入聚乙二醇端羟基总2g氯乙酸，反应温度为50℃，反应时间为24小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入1.65g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.92g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（1.2g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将4gα-乳香酸加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入1.65g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.92g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

实施例2

将聚乙二醇（分子量为2000）2g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的KOH水溶液，常温搅拌反应1小时后，加入聚乙二醇端羟基总1.5g氯乙酸，反应温度为55℃，反应时间为24小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入0.83g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.46g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应18小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（1.5g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为18小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将1.5g11-羰基-β-乳香酸加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入0.83g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），0.46 g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为18小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

实施例3

将聚乙二醇（分子量为4000）4g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的KOH水溶液，常温搅拌反应2小时后，加入聚乙二醇端羟基总2.5g氯乙酸，反应温度为60℃，反应时间为24小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入2.1g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），1.2g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应24小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（0.5g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为36小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将2.5g 3β-羟基甘遂-8加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入2.1g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），1.2g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应24小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为18小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

实施例4

将聚乙二醇（分子量为5000）10g加入反应釜，并分散溶解在溶剂二甲亚砜（DMSO）中，加入重量百分数40%的NaOH水溶液，常温搅拌反应3小时后，加入聚乙二醇端羟基总3g氯乙酸，反应温度为65℃，反应时间为48小时，调节PH至中性，抽滤，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到两端含有端羧基的聚乙二醇；将所得到的两端含有端羧基的聚乙二醇溶于溶剂无水二氯甲烷中，加入3g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），1.7g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应24小时后，将该溶液缓慢滴加至胱胺（3g）的二氯甲烷溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，在去离子水中透析，冻干，得到含端氨基的聚乙二醇；将4g 3α-羟基甘遂-8，24-二烯-21酸加入另一反应釜，并分散溶解在溶解二甲亚砜（DMSO）中，加入3g N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC），2g N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），体系在氩气或氮气保护下室温反应，反应12小时后，将含端氨基的聚乙二醇的二甲亚砜溶液缓慢滴加至上述溶液中，室温反应，反应时间为12小时，经抽滤，沉淀，浓缩溶剂，用在去离子水中透析，冻干，即得到所需产物。

实施例5  为了进一步理解本产物的药效作用，进行以下动物急性毒性试验和一般药理试验，以证明本发明所述药物的安全性。

动物急性毒性试验

将按本发明所提供的方法制得的产物，经大鼠及小鼠口服给药，发现结果如下：

1）对小鼠采用含乳香酸活性成分50毫克/公斤（相当于临床推荐剂量的250倍）时，未出现任何的毒性反应和死亡，证明该产物对小鼠无急性毒性。

2）对大鼠采用含乳香酸活性成分20毫克/公斤（相当于临床推荐剂量的100倍）时，未出现任何的毒性反应和死亡，证明该产物对大鼠无急性毒性。

一般药理试验

采用采用Beagle犬对该产物进行一般药理学研究。

Beagle犬口服含乳香酸活性成分分别为低（5毫克/公斤）、中（15毫克/公斤）、高（25毫克/公斤）三个剂量的该产物和蒸馏水（对照实验），共4个组, 对心血管系统、呼吸系统进行观察。   

结果：该产物对Beagle犬收缩压、舒张压、平均动脉压、心率、心律、ECG之P波电压、T波电压、QRS时间、PR间期、QT间期、ST段、呼吸频率、节律和幅度均无明显影响。

结果表明，该产物对Beagle犬心血管系统、呼吸系统无明显影响。

实施例6  下面的临床应用研究及结论进一步说明了本发明产物的有益药用效果。

试验共入选15例15~40岁的牛皮癣患者。患者就诊前一个月内未使用过任何口服及外用药物治疗。患者均口服用该产物，1个月后，观察效果。患者均无不良反应，且治疗后有显著效果。

典型案例

刘姓患者，男性，22岁。

就诊前，背部皮肤丘疹，反复发作3年，皮疹表现为肩部、背部皮肤米粒大小的红色丘疹50余个，鳞屑多且容易脱落，触摸时经常会有瘙痒的感觉，诊断为寻常型牛皮癣。就诊前1个月内未使用任何口服或外用药治疗。予口服该产物，早晚各用一次，两周后观察效果，发现无新疹出现，且丘疹数量减少到15个，颜色趋于淡色。继续用药至4周后，丘疹缩小，减少到4个，逐渐消失。至6周复诊，丘疹全部消退。本例患者疗效评价为治愈。用药期间未出现局部及全身不良反应。