霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其在制备免疫抑制药物中的应用

摘要

本发明公开了一种霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其在制备免疫抑制药物中的应用。Penicacids A、B，其具体结构如(I)所示，其中，Penicacids A：R

说明书

技术领域：

本发明属于医药技术领域，具体涉及一类霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其在制备免疫抑制药物中的应用。 

背景技术：

目前临床上，如果疾病无法用化学疗法治愈，则采用移植他人健康脏器来代替病体脏器或部分病体脏器的办法。对于肝脏、肾脏、心脏、角膜等移植的研究正在进行，器官移植的病例也在增加。然而，移植他人器官时最大的问题是自体的免疫排斥反应。因此，从20世纪70年代开始，科学家们进行了免疫抑制剂的研究，以防止被移植者的排斥反应。 

霉酚酸(MPA)是在短密青霉(Penicillium brevicompactum)的发酵液中发现的活性物质，具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等多种活性。在1968年，霉酚酸被首次发现具有IMPDH抑制活性，在20世纪80年代，科学家们发现霉酚酸对小鼠具有免疫抑制活性。1998年，其衍生物2-吗啉基乙酯由FDA批准作为临床药物，商品名骁悉(CellCept)，主要用于肾脏及心脏移植术后器官排斥的预防，并能与环孢霉素合用，降低后者的剂量和毒性。 

发明内容：

本发明的第一个目的是提供具有免疫抑制活性的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其药用盐。 

本发明的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C及其药用盐，其结构如式(I)和(II)所示： 

式(I) 

其中，Penicacids A：R₁＝CH₃，R₂＝OH；Penicacids B：R₁＝H，R₂＝OGlu； 

Penicacids C如式(II)所示： 

式(II)。 

本发明人在海洋真菌活性次级代谢产物筛选的基础上，发现真菌(Penicillium sp.)SOF07的发酵提取物采用HPLC-UV指导分离，分离纯化到3个活性化合物，经结构分析，3个活性化合物为霉酚酸的衍生物-Penicacids A、B、C，具体结构如式(I)和(II)所示。通过对Penicacids A、B、C进行免疫抑制活性评估，发现Penicacids A、B、C对次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)有明显抑制作用，尤其是化合物Penicacids B具有良好的抑制活性。由此可见，本发明的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C具有免疫抑制活性。 

因此本发明的第二个目的是提供霉酚酸衍生物Penicacids A、Penicacids B或Penicacids C，或其药用盐在制备免疫抑制药物中的应用。 

本发明的第三个目的是提供一种免疫抑制药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的Penicacids A、Penicacids B或Penicacids C，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。 

本发明的霉酚酸衍生物Penicacids A、B、C是新的化合物，具有免疫抑制活性，可以用 于制备免疫抑制药物，用于肾脏、肝脏等器官移植中作为抑制药物。因此本发明为开发新的免疫抑制药物提供了备选化合物，为用于肾脏、肝脏等器官移植提供了更多的免疫抑制药物选择。 

本发明使用到的海洋真菌(Penicillium sp.)SOF07，该菌株保存中国科学院应用微生物研究网络海洋微生物研究中心，地址：中国广东省广州市海珠区新港西路164号，邮编：510301，该菌株是对外销售的，公众可以从该保藏中心购买到该菌株。 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 

实施例1： 

Penicacids A、B、C的制备和结构鉴定 

一、Penicacids A、B、C的制备 

1.种子培养： 

(1)配制种子培养基：土豆(去皮)200g，葡萄糖20g，海盐30g，加水定容到1L，平均分装于10个500mL的锥形瓶中，121℃灭菌25分钟，获得灭菌的种子培养基。 

(2)种子的培养：将海洋真菌(Penicillium sp.)SOF07的菌株接入到上述种子培养基中，在28℃的温度下，置摇床上以150rpm的转速，培养48小时得种子培养液。 

2.固体发酵培养： 

(1)配制发酵培养基：大米2000g，海盐60g，水2000mL，平均分装于20个500mL的锥形瓶，121℃灭菌25分钟，获得灭菌的发酵培养基。 

(2)发酵培养： 

在超净工作台中，将10mL种子培养液接入装有发酵培养基的500mL锥形瓶中，置于25℃培养箱，静置培养21天，获得海洋真菌(Penicillium sp.)SOF07的发酵培养物。 

3.提取分离： 

待发酵完毕，在每个装有100ml的发酵培养物的500ml锥形瓶中加入200mL丁酮到发酵培养物中，室温提取3次，丁酮层减压旋转蒸干有机溶剂，得粗提物40.45g。 

将粗提物经硅胶(100-200目)柱层析分离，采用氯仿-甲醇(体积比为100∶0，95∶5，9∶1，8∶2，0∶100)梯度淋洗，经减压浓缩后，顺序得到馏分Fr.1～Fr.5。馏分Fr.2(体积比为95∶5的氯仿-甲醇洗脱的馏分)，再经硅胶(100-200目)柱层析分离，采用乙酸乙酯-石油醚(体积比10∶90→90∶10)梯度淋洗，获得馏分Fr.2-1～Fr.2-7。馏分Fr.2-4(体积比为1∶1的乙酸乙酯-石油醚洗脱的馏分)，再经反相中压柱层析，用ODS色谱柱(20×90mm，40-63μm，YMC)，以甲醇-水作为洗脱剂，流速15mL/min，0-60min，体积比20∶70→80∶20梯度洗脱，得到化合物1(t_R＝33min，11.0mg)和化合物3(t_R＝24min，42mg)。馏分Fr.3(体积比为9∶1的氯仿-甲醇洗脱的馏分)，再经反相制备液相，用ODS色谱柱(YMC-Pack ODS-A，250×10mm，5μ)，以CH₃CN-H₂O作为洗脱剂，流速2.5mL/min，0-30min，体积比55∶45恒梯度洗脱，得化合物2(t_R＝15.9，5.8mg)。 

二、化合物1、2和3的结构鉴定 

对上一步骤中分离得到的化合物1、2和3进行结构分析测试，得到以下理化性质数据： 

化合物1.无定形固体； 紫外：215，250，304nm；¹H-和 ¹³C-NMR，见表1；(-)ESI-MS(m/z)349.2([M-H]^-)，(+)ESI-MS(m/z)370.8([M+Na]⁺)；(-)HR-ESI-MS C₁₈H₂₂O₇，理论值349.1521. 

化合物2.无色油状物； 紫外：216，250，304nm；¹H-和 ¹³C-NMR，见表1；(-)ESI-MS(m/z)497.6([M-H]^-)，(+)ESI-MS(m/z)517.6([M+Na]⁺)；(-)HR-ESI-MS C₂₃H₃₀O₁₂，理论值497.1624. 

化合物3.无色油状物； 紫外：219，249，303nm.¹H-和 ¹³C-NMR，见表1；(-)ESI-MS(m/z)369.3([M-H]^-)，ESI-MS(pos.)：(m/z)375.2，([(M-H₂O)+Na]⁺)，([M+Na]⁺)；(-)HR-ESI-MS(m/z)351.1018，[(M-H₂O)-H]^-，理论值C₁₇H₂₂O₉. 

根据以上理化数据分析可知，化合物1、化合物2和化合物3的具体结构如式(I)和(II)所示，将化合物1命名为Penicacids A，将化合物2命名为Penicacids B，将化合物3命名为Penicacids C。 

式(I) 

其中，Penicacids A：R_i＝CH₃，R₂＝OH；Penicacids B：R₁＝H，R₂＝OGlu； 

Penicacids C如式(II)所示： 

式(II)。 

表1：PenicacidsA-C的NMR数据(500/125MHz，TMS为内标，ppm) 

^aRecorded in CDC1₃.^bRecorded in MeOH-d₄.^cRecorded in DMSO-d₆

实施例2 

对实施例1分离纯化得到的化合物Penicacids A、B、C进行IMPDH抑制活性和小鼠脾细胞增殖抑制活性的实验。 

具体步骤为：IMPDH(II型)酶抑制活性测试，采用Magasanik等报道的方法(Magasanik，B.；Moyed，H.；Gehring，L.J.Biol.Chem.1957，226，339-350.)，采用96孔板，在340nm下检测NADH的形成对IMPDH(II型)酶活性进行评估。Penicacids A、B、C溶解于DMSO中，再倍比稀释3次，然后添加到待测定混合物中预培养，酶的终浓度不超过2％(V/V)。以霉酚酸作为对照。 

小鼠脾细胞增殖抑制活性测试，具体操作为：取C57BL/6小鼠的脾脏，通过尼龙膜过滤获取无菌的单细胞悬液，然后将细胞1000rpm离心5分钟，再用0.83％氯化铵的Tris缓冲液悬浮颗粒细胞。用RPMI1640洗涤细胞二次，然后计算细胞总数，再将细胞悬浮于RPMI11640的完全培养基中(含HEPES 30nm，青霉素100U/毫升，链霉素100微克/毫升，谷氨酰胺2nm，和10％的FCS)。5×10⁵个细胞/孔接种于96孔平底板，再用2微克/毫升的刀豆素刺激细胞。化合物Penicacids A、B、C或0.5％DMSO孵育细胞72小时，然后用MTT法评估细胞增殖。以霉酚酸作为对照。 

实验结果见表2： 

表2：Penicacids A、B、C的免疫抑制活性 

上述实验结果表明Penicacids A、B、C对次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH)有明显抑制作用，尤其是化合物Penicacids B有良好的抑制活性。 

因此本发明为研制新的免疫抑制药物提供了新的先导化合物。