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法律状态
2013-07-24
授权
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2012-05-23
实质审查的生效 IPC(主分类):C08B31/12 申请日:20110831
实质审查的生效
2012-04-11
公开
公开
技术领域
本发明涉及天然高分子材料在医药领域的研究与开发领域,特别是淀粉载 体材料在基因的控制释放领域中的应用。
背景技术
基因治疗过程中,基因药物必须顺利地进入病灶部位受体细胞的细胞核中 参与调控或表达,才能体现基因治疗的疗效。但基因药物大多为DNA或RNA 等核酸类物质,裸露的核酸类物质很容易被外界环境和人体中的核酸酶所降 解,即使是能够避免接触核酸酶,也会因为核酸类物质本身在一般情况下带负 电荷,与细胞膜所带电荷相同而产生同性相斥,所以很难顺利通过受体细胞的 外膜进入细胞核。因此基因药物的输送需要借助一定的传递系统,目前进行研 究的基因药物给药系统包括病毒载体介导的传递系统和非病毒载体介导的传 递系统。
病毒载体介导的系统表达效率高,但存在着基因装载量有限、病毒危险性 等局限性;非病毒载体介导的系统在无病毒性和免疫原性方面具有优势,但是 其在体内的不稳定性限制了临床应用。目前认为理想的基因载体材料应具备 (1)非侵袭性的给药方式;(2)作用靶点包括原发灶和转移病灶,特别是远 隔部位的微小转移灶及特殊部位病灶;(3)使治疗基因作用具有特异性和时间 可调控性并能持续表达。此外,还应具备容量大、生物安全性好、稳定及易于 大量生产等特点。
目前,非病毒类基因载体材料的研究较多集中在脂质体、阳离子合成高分 子材料、磁性材料等方面。近年来,由于“生态环境生产”和“绿色消费”意识的 萌发和兴起,可生物降解的可再生天然高分子材料已成为药物给药系统设计、 开发的基础。伴随着纳米技术的发展,天然多糖类材料以良好的生物相容性、 低毒性,易于修饰的表面结构,可明显延长纳米粒在体内的保留时间,减少被 吞噬细胞吞噬,增加药物疗效等特性,而越来越得到人们的青睐。常用于基因 载体的天然生物多糖有普鲁蓝多糖、壳聚糖、葡聚糖等。淀粉是一种重要的天 然多糖,具有良好的生物相容性、可生物降解性、易于结构改性,具有价廉、 来源广泛、稳定性高、安全、无毒及易于形成凝胶等优良特性,已成为很有潜 力的药物传递系统载体。目前采用淀粉作为非病毒载体的研究较少,Hiroaki 等(Hiroaki S.,Tomoyoshi O.,Yasuro F.,et.al.,Adenovirus vector-mediated gene transfer using degradable starch microspheres for hepatocellular carcinoma in rats. J.Surgical Res.2006,133,193-196.)以粒径为45μm的淀粉微球与重组腺病毒 AxCALacZ同时作用于肺癌细胞,结果发现半乳糖的表达要比单一的重组腺病 毒AxCALacZ作用肺癌细胞的表达率要高。肖苏尧等(肖苏尧,刘选明,童春 义等.多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的研制及应用.中国科学B辑化学. 2004,34(6):473-477)利用反相乳液法制备淀粉纳米颗粒StNP,在StNP上通 过静电吸附作用吸附上多聚赖氨酸(PLL),制备出阳离子型PLL-StNP,利用 PLL的阳离子特性提高DNA的结合量,同时降低载体的细胞毒性。但由于 DNA吸附于纳米微球表面,形式上与一般的质粒载体相似,因此在转染过程 中无法逃避网状内皮系统的识别和清除。因而存在DNA低转染率和易被细胞 内限制性内切酶降解和被机体免疫系统俘获等缺点。刘俊等(刘俊,刘选明,肖 苏尧等.基于超声波下淀粉纳米颗粒作载体的基因转导.高等学校化学学 报.2005,26:634-637)基于超声波能使细胞壁、细胞膜以至细胞核膜产生瞬间 通道,外源DNA可借此进入细胞并进行表达的功能,建立了一种超声波介导 淀粉纳米颗粒,进行外源基因转染效率的方法,但实质上并未解决淀粉载体本 身对基因转染效率低的难题。
由于淀粉分子链的长短不同,其形成的三维网络结构不同,而且淀粉分子 可以经过化学改性后使分子链带有正电荷,因此,通过控制淀粉分子的分子量 及所带正电荷,能够使其与DNA通过静电吸引和氢键相互作用而形成纳米粒, 从而更加有效的保护DNA和调节DNA的释放。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明所要解决的技术问题之一是提供一 种季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。该载体材料对基因具有良好的装载能 力、无毒副作用,带正电,材料易得、成本低廉。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种工艺简单,适用可靠,成本低 廉的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三是季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料 作为基因药物载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案来实现:
一种季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料,是由淀粉分子与季铵型阳离子 醚化试剂经干法发生高取代度阳离子化反应而得,该载体材料的季铵型阳离子 取代度为0.19-0.43。具体制备方法如下:
将含水量为4.7-13.5%、重均分子质量(Mw)为13000-64000Da的淀粉在 捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的固碱、水和季铵型阳离子醚化剂的混合体系, 于温度25-30℃,转速为40-100转/min的条件下,干法混合反应12h-48h;反 应完全后经洗涤、干燥、粉碎后即得到季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。
优选地,所述混合体系中的固碱为质量百分比为11.2-18.5%的氢氧化钠或 氢氧化钾,水的质量百分比为11.5-20.3%,季铵型阳离子醚化剂为质量百分比 为52.7%-87.0%的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵;所述碱、水和季铵型阳离子 醚化剂的加入量均以淀粉干基计。
本发明得到的上述载体材料作为基因治疗中非病毒载体材料的应用,实现 基因药物的控制释放,提高药物的生物利用度和降低药物及载体的毒副作用。 具体按下述方法进行:将淀粉基因控释载体材料与治疗用基因(DNA或RNA) 在水溶液中混合,控制N/P摩尔比为0.5~30,经过涡旋振荡1-5min,室温静 置1-2h,形成季铵型阳离子淀粉载体/基因纳米控释传输系统,通过该纳米控 释传输系统将外源基因转导入细胞中从而发挥治疗作用。季铵型阳离子淀粉可 通过静电吸附作用吸附带负电荷的基因(DNA或RNA)形成表面带正电荷的 纳米粒,能够促进传递系统与带负电的细胞膜结合,从而提高纳米颗粒的转染 效率。
上述制备淀粉载体与治疗用基因的纳米传递系统中的N/P摩尔比中的N指 的是阳离子淀粉中季胺基中的氮,P指的是DNA中三磷酸结构中第三个磷酸 中的磷,每个N代表一个正电荷,每个P代表一个负电荷。
所述载体材料与治疗用基因的N/P摩尔比为0.5-30,zeta-电位为 3.95-35.6mV,所形成的纳米传输系统的尺寸为98.53-337.1nm。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和有益效果:
(1)本发明首次通过利用不同分子量的淀粉分子与季铵型阳离子醚化试 剂经干法发生高取代度阳离子化反应而得的淀粉载体与基因治疗药物DNA的 静电吸附反应,将季铵型阳离子化淀粉载体与基因药物DNA共混,成功地制 备出适合基因药物DNA控制释放的淀粉类基因治疗纳米控释系统,作为该控 释系统的淀粉载体材料具有价廉易得,生物相容性好、本身安全无毒等特点。
(2)通过zeta-电位的测定得出这种淀粉载体与DNA形成的纳米粒表面 带有一定量的正电荷,这有助于纳米粒在转染过程中与表面带负电的细胞膜快 速结合,能够有效的促进细胞对复合物的内吞作用。
附图说明
图1为Mw为64000,DS为0.19(a)、Mw为17000,DS为0.27(b)和 Mw为13000,DS为0.43(c)的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料分别在 不同N/P比的条件下(泳道从左至右依次为裸DNA、N/P=0.5、1、2、5、10、 30、季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料的溶液)与DNA形成的纳米传递系 统对DNA的保护与泄漏情况的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作进一步地详细说明,但本发明实施方式并不 仅限于此。
实施例1
将含水量为4.7%、重均分子质量(Mw)为13000Da的淀粉100g(干基) 在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5%的NaOH(18.5g), 20.3%的水(20.3g)和87.0%的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)的混合 体系,于温度25℃,转速为100转/min的条件下,干法混合反应48h;反应 完全后经无水乙醇沉淀样品,抽滤后,用无水乙醇洗涤直到用AgNO3检验无 Cl-为止,60℃烘干,粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.43的季铵型阳 离子淀粉基因控释载体材料(表1)。其他条件不变,改变淀粉的重均分子量 和NaOH与3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵的用量(表1),所得不同取代度的季 铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。
表1
实施例2
将含水量为13.5%、重均分子质量(Mw)为64000Da的淀粉100g(干基) 在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5%的KOH(18.5g),11.5% 的水(11.5g)和87.0%的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)混合体系,于 温度30℃,转速为40转/min的条件下,干法混合反应48h;反应完全后经无 水乙醇沉淀样品,抽滤后,用无水乙醇洗涤直到用AgNO3检验无Cl-为止,60℃ 烘干,粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.19的季铵型阳离子淀粉基因控 释载体材料(表2)。其他条件不变,改变淀粉的重均分子量和NaOH与3-氯- 二羟丙基三甲基氯化铵的用量(表9),所得不同取代度的季铵型阳离子淀粉 基因控释载体材料。
表2
实施例3
将含水量为4.7%、重均分子质量(Mw)为17000Da的淀粉100g(干基) 在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5%的NaOH(18.5g), 20.3%的水(20.3g)和87.0%的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)混合体 系,于温度30℃,转速为75转/min的条件下,干法混合反应48h;反应完全 后经无水乙醇沉淀样品,抽滤后,用无水乙醇洗涤直到用AgNO3检验无Cl-为止,60℃烘干,粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.35的季铵型阳离子 淀粉基因控释载体材料(表3)。其他条件不变,改变淀粉的重均分子量和NaOH 与3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵的用量(表3),所得不同取代度的季铵型阳离 子淀粉基因控释载体材料。
表3
实施例4
将含水量为4.7%、重均分子质量(Mw)为13000Da的淀粉100g(干基) 在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5%的NaOH(18.5g), 20.3%的水(20.3g)和87.0%的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)混合体 系,于温度25℃,转速为75转/min的条件下,干法混合反应36h;反应完全 后经无水乙醇沉淀样品,抽滤后,用无水乙醇洗涤直到用AgNO3检验无Cl-为止,60℃烘干,粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.37的季铵型阳离子 淀粉基因控释载体材料(表4)。其他条件不变,改变淀粉的重均分子量、NaOH、 3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵的用量和反应时间(表4),所得不同取代度的季 铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。
表4
实施例5
(1)利用实施例2中样品10制备出的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料 (Mw=64000,DS=0.19)配成浓度为2.33mg/ml的水溶液。
(2)提取pAcGFP1-C1质粒(4.7kb,购自美国科隆泰科实验有限公司,Clontech Laboratory,Inc.USA),浓度为255ng/μl。
(3)按照N/P=0.5、1、2、5、10、30的比例将步骤(1)和步骤(2)中的溶 液按体积混合,控制每种N/P下DNA浓度均为100ng/μl,加入适量超纯水使 终体积为50μl,涡旋震荡1min,室温静置2h。
(4)取不同N/P的样品5μl与2μl的6×上样缓冲液(loading buffer)混合 后用微量移液器转移到1%的琼脂糖加样孔中,用裸DNA和季铵型阳离子淀 粉基因控释载体材料水溶液做对照,在TAE缓冲溶液(0.5×)中100V电压 下电泳20min。电泳结束将琼脂糖在EB(溴化锭)溶液中浸泡10min,转移 至干净蒸馏水中清洗干净,用凝胶成像仪拍摄出紫外光照片(图1a)。
实施例6
(1)利用实施例3中样品19制备出的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料 (Mw=17000,DS=0.27)配成浓度为1.82mg/ml的水溶液。
(2)提取pAcGFP1-C1质粒,浓度为255ng/μl。
(3)按照N/P=0.5、1、2、5、10、30的比例将步骤(1)和步骤(2)中的溶 液按体积混合,控制每种N/P下DNA浓度均为100ng/μl,加入适量超纯水使 终体积为50μl,涡旋震荡1min,室温静置2h。
(4)取不同N/P的样品5μl与2μl的6×上样缓冲液(loading buffer)混合 后用微量移液器转移到1%的琼脂糖加样孔中,用裸DNA和季铵型阳离子淀 粉基因控释载体材料水溶液做对照,在TAE缓冲溶液(0.5×)中100V电压 下电泳20min。电泳结束将琼脂糖在EB(溴化锭)溶液中浸泡10min,转移 至干净蒸馏水中清洗干净,用凝胶成像仪拍摄出紫外光照片(图1b)。
实施例7
(1)利用实施例1中样品3制备出的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料 (Mw=13000,DS=0.43)配成浓度为1.28mg/ml的水溶液。
(2)提取pAcGFP1-C1质粒,浓度为255ng/μl。
(3)按照N/P=0.5、1、2、5、10、30的比例将步骤(1)和步骤(2)中的溶 液按体积混合,控制每种N/P下DNA浓度均为100ng/μl,加入适量超纯水使 终体积为50μl,涡旋震荡1min,室温静置2h。
(4)取不同N/P的样品5μl与2μl的6×上样缓冲液(loading buffer)混合 后用微量移液器转移到1%的琼脂糖加样孔中,用裸DNA和季铵型阳离子淀 粉基因控释载体材料水溶液做对照,在TAE缓冲溶液(0.5×)中100V电压 下电泳20min。电泳结束将琼脂糖在EB(溴化锭)溶液中浸泡10min,转移 至干净的蒸馏水中清洗干净,用凝胶成像仪拍摄出紫外光照片(图1c)。
实施例8
利用马尔文激光粒度分布仪测定实施例5、6、7中制备的不同N/P下的 季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料与DNA形成的纳米复合物的zeta-电位进 行测定。结果显示(表5),不论季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料取代度 高低,与DNA形成的纳米复合物表面均带正电;随着N/P增加,电荷呈现逐 渐增加的趋势,zeta-电位为3.95-35.6mV。纳米复合物带正电表明它能与带负 电荷的质粒DNA络合更紧密,且在转染过程中能与表面带负电的细胞膜快 速结合促进细胞对复合物的内吞作用。
表5
实施例9
利用马尔文激光粒度分布仪测定实施例5、6、7中制备的不同N/P季铵型 阳离子淀粉基因控释载体材料与DNA形成的纳米复合物的粒度进行测定(表 6),所形成的纳米传输系统的尺寸为98.53-337.1nm。
表6
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
机译: 季萘铵铵动蛋白基因的制备方法及其在纺织材料整理中的应用
机译: 季萘铵铵动蛋白基因的制备方法及其在纺织材料整理中的应用
机译: 使用季铵型阳离子淀粉破乳