致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒

摘要

本发明提供一种致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒，由荧光定量PCR反应液、O157标准品、H7标准品、O104标准品、H4标准品、对照品组成，其中荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、耐热TaqDNA聚合酶等）、特异性上下游引物和探针。本发明通过一个PCR反应，可以从标本中检测出致泻大肠杆菌O157：H7、和O104：H4型细菌的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、快速和准确，而且对检测的细菌进行实时准确定量，为临床上疑似该菌感染的患者早期明确诊断，以便及时制定治疗方案，减少死亡率。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种四重实时荧光定量PCR在同一个反应管内同时检测胃肠炎腹泻患者的粪便标本中致泻性大肠杆菌O157：H7、O104：H4血清型的核酸检测方法，可应用于致泻性大肠杆菌引起暴发疫情的实验室应急检测。

背景技术

引起腹泻的大肠杆菌称为致泻性大肠杆菌，根据毒力因子、致病机理和流行病学特征，通常将致泻性大肠杆菌分为5 类，分别为肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠集聚性大肠杆菌（EAEC）以及肠出血性大肠杆菌（EHEC）。EHEC感染后，患者往往会出现：出血性肠炎，表现为腹泻（血便，鲜血样）、腹痛和溶血性尿毒综合征（HUS）。HUS表现为肾功能衰竭、溶血性贫血、血小板减少、血栓性血小板减少紫癜（TTP），可因肾衰和多脏器受损而死亡，死亡率达3%-5%，近30%的患者会留下严重的后遗症。O157:H7是EHEC的主要血清型， 1999年我国苏皖等地暴发了大肠杆菌O157:H7感染性腹泻，估计2万人感染。2011年德国暴发的疫情是由EHEC O104：H4血清型引起，死亡病例24例，其中女性15例。除德国外，奥地利、捷克、丹麦、法国、荷兰、挪威、西班牙、瑞典、瑞士、英国、卢森堡、美国、加拿大等15个国家也报告了输入性EHEC感染病例，部分发展为溶血性尿毒综合征。

鉴于致泻性大肠杆菌在公共卫生中的重要性与日俱增，因而在胃肠炎和食物中毒监测中要进行多种腹泻细菌的检测，不仅费时费力而且浪费临床标本与试剂。常规检测以传统培养方法为主，不仅操作繁琐、耗时长、而且容易污染。因此，建立一种能够快速检测出致泻性大肠杆菌的技术对我国应对潜在的致泻性大肠杆菌疫情具有重要的意义。

随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，特别是最近几年兴起的荧光定量PCR技术，该方法具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析及基因分型等诸多领域。该方法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，并加强了结果的可靠性。随着荧光定量技术、仪器以及材料科学的发展，荧光定量技术不仅仅在定量上发挥它的优势，而且运用TaqMan或TaqMan－MGB探针的5`末端标记上不同的荧光染料（FAM、HEX等）技术可以进行基因分型、基因突变检测和SNP分析等方面研究。因此，建立关于O104：H4和O157：H7致泻性大肠杆菌的多重荧光定量PCR的快速、准确、灵敏、特异的基因诊断分子生物学方法与诊断试剂盒尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对致泻大肠杆菌O157：H7、O104：H4四重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。该试剂盒由荧光定量PCR反应液、O157标准品、H7标准品、O104标准品、H4标准品、对照品组成，其中荧光定量PCR反应液包含有PCR反应缓冲液（含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、耐热Taq DNA聚合酶等）、特异性上下游引物和探针，其中特异性上下游引物、特异性探针和基因标准品序列分别如下： 

O157上游引物-F: 5’- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3’

O157下游引物-R: 5’- AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3’

O157特异性探针-P: 5’- FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3’

H7上游引物-F: 5’-GGCGCAGGCTGCTGATT -3’

H7下游引物-R: 5’-AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3’

H7特异性探针-P: 5’- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3’

O104上游引物-F: 5’- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3’   

O104下游引物-R: 5’- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3’     

O104特异性探针-P : 5’- ROX-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3’

H4上游引物-F: 5’- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3’   

H4下游引物-R: 5’- CAGAATCAACGACCGCATATT -3’     

H4特异性探针-P : 5’- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ3 -3’

O157基因标准品：

TGGCATGACG TTATAGGCTA CAATTATAGG ATGACAAATA TCTGCGCTGC TATAGGATTA  GCCCAGTTAG  AACAAGCT

H7基因标准品：

GGCGCAGGCT GCTGATTCAG CTTCAAAACG TGATGCGTTA GCTGCCACCC TTCATGCTGA  TGTGGGTAAA  TCTGTT

O104基因标准品：

TGTCGCGCAA  AGAATTTCAA CTTTACTTGG  TTTTTTTGTA  TTAGCAATAA  GTGGTGTCAT  TTCAAGTCAG  GTTTCTAGGG  CGTATAGTTT AAAGGATTTT

H4基因标准品：

GCTGGGGGTA AACAAGTCAA TTTACTGTCT TACACTGACA CCGCGTCTAA CAGTACTAAA  TATGCGGTCG  TTGATTCTG

标准品分阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为高压灭菌的DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水，阳性对照品为O157、H7、O104和H4的阳性质粒样品。

本发明提供的定量试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明试剂盒使用方法如下：

1.    待测样品核酸提取：可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的DNA Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取；

2.    核酸的检测：以待测样品DNA为模板，PCR 缓冲液为HR Qpcr Master Mix 缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×HR Qpcr Master Mix缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2×HR Qpcr Master Mix缓冲液。1×HR Qpcr Master Mix缓冲液的组成参见上海辉睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix，Code：HR-RT01-50。

反应总体积为50                                                ，其中2×qPCR Master Mix25 ，四种引物(20μmol/L)各1，四种探针(20μmol/L) 1 , 模板DNA 2-3，DEPC水补足50 。在四色荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：95℃ 5min热启动，然后95℃ 10s，55℃ 45s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。

3. 荧光定量结果报告：

①致泻大肠杆菌O157、H7、O104和H4探针各自CT值（threshold cycle,每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数）均等于40.0的标本为阴性，②致泻大肠杆菌O157、H7、O104和H4各探针CT值≤35的标本，检测结果为相应细菌阳性，则待测样品含有致泻大肠杆菌O157、H7、O104和H4型，如其中一个出现荧光检测结果呈阳性，则待检样本中含有阳性荧光对应的靶细菌。③CT值在35～40之间为灰值区域，重做后大于37值为阴性。根据所获得的标准曲线,计算待测标本中细菌量值(拷贝数/ml)。

本发明的创新之处是：运用实时荧光定量PCR技术，采用细菌特异引物和特异荧光探针，开发研制用于致泻大肠杆菌O157：H7、O104：H4群细菌四重荧光定量检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从标本中检测出致泻大肠杆菌O157：H7、和O104：H4型细菌的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、快速和准确，而且对检测的细菌进行实时准确定量，为临床上疑似该菌感染的患者早期明确诊断，以便及时制定治疗方案，减少死亡率。

附图说明

图1、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌O157的灵敏度；从1至5依次为1000000、100000、10000、1000、100copy。

图2、致泻大肠杆菌O157标准品荧光定量PCR标准曲线。

图3、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌H7的灵敏度；从1至5依次为1000000、100000、10000、1000、100copy。

图4、致泻大肠杆菌H7标准品荧光定量PCR标准曲线。

图5、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌O104的灵敏度；从1至5依次为1000000、100000、10000、1000、100copy。

图6、致泻大肠杆菌O104标准品荧光定量PCR标准曲线。

图7、荧光PCR法检测致泻大肠杆菌H4的灵敏度；从1至5依次为1000000、100000、10000、1000、100copy。

图8、致泻大肠杆菌H4标准品荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例一

1  材料与方法

1.1 菌株与临床标本：

致泻大肠杆菌O157:H7、O104:H4型细菌（菌株经全自动生化仪鉴定及日本生研、丹麦血清凝集）购于中国疾病预防控制中心。临床样本来源于近期患者的粪便标本，样本采集后低温保存并及时运送到实验室。

1.2  引物与探针  

从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的致泻大肠杆菌O157:H7、O104:H4型细菌基因序列。对其进行了同源性比较，在对应基因组的保守基因区设计特异性引物与Taqman探针，序列如下： 

O157上游引物-F: 5’- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3’

O157下游引物-R: 5’- AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3’

O157特异性探针-P: 5’- FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3’

H7上游引物-F: 5’-GGCGCAGGCTGCTGATT -3’

H7下游引物-R: 5’-AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3’

H7特异性探针-P: 5’- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3’

O104上游引物-F: 5’- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3’   

O104下游引物-R: 5’- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3’     

O104特异性探针-P : 5’- ROX-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3’

H4上游引物-F: 5’- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3’   

H4下游引物-R: 5’- CAGAATCAACGACCGCATATT -3’     

H4特异性探针-P : 5’- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACABHQ3 -3’

引物和探针委托上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.3  细菌定量标准与细菌DNA的提取：

细菌DNA的提取采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到细菌DNA，利用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 在260nm测量细菌DNA的浓度，从而确定DNA的拷贝数以备用。

1.4  荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

试剂盒：选用上海辉睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix，Code：HR-RT01-50，按说明书操作，反应体系为50 ，其中2×HR Qpcr Master Mix 25ul，上游与下游引物(20μmol/L)各1 ，探针(20μmol/L) 1 , 模板DNA 2-3，DEPC水补足50 。反应条件为：95℃ 5min，然后95℃ 10s，55℃ 40s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。结果判断：选择荧光检测模式FAM、HEX、ROX、CY5，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。

1.5  荧光PCR特异性、敏感性和重复性试验  

选择致泻大肠杆菌O157:H7和O104:H4型细菌，提取核酸，用O157、H7、O104和H4多重荧光PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定拷贝数的O157:H7（2×10⁷Copies/ml）和O104:H4型（2×10⁷Copies/ml）大肠杆菌梯度稀释后，平行进行荧光PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的细菌DNA稀释液作4次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。

2  结果

2.1 荧光PCR反应体系及条件 

选用上海辉睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix，Code：HR-RT01-50，按说明书操作，反应体系为50 ，其中2×HR Qpcr Master Mix 25 ul，四种引物(20μmol/L)各1，四种探针(20μmol/L) 1 , 模板DNA 2-3，DEPC水补足50 。在四色荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：95℃ 5min热启动，然后95℃ 10s，55℃ 45s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。

2.2特异性试验   

本发明建立的多重荧光 PCR方法对致泻性大肠杆菌O157:H7和O104:H4型具有较好的特异性，近期采集的腹泻患者的粪便标本也检测出阳性反应。而与其他肠道细菌如其它血清型大肠杆菌、阴沟肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、副溶血弧菌、河流弧菌等均无交叉反应。

2.3  敏感性试验   

对已标定拷贝数的致泻性大肠杆菌O157:H7（1×10⁷Copies/ml）和O104:H4 （1×10⁷Copies/ml）核酸分别稀释10、100、1000、10000、100000倍，用荧光PCR方法进行检测，结果荧光PCR方法检测敏感性分别达到1×100、 1×100、1×100和1×100 Copies/ml。结果参见图1-8。

2.4   重复性试验  

致泻性大肠杆菌O157:H7（终浓度为1×10⁷Copies/ml）和O104:H4（1×10⁷Copies/ml）混合后按10倍梯度稀释成5个不同的浓度，对每一个浓度的样本作4个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.10～0.35之间，具有较好的重复性（参见表1）。

实施例二   临床样本的检测   

采用“十一五”重大专项-传染病病原监测技术平台的腹泻症候群调查表，对2011年1月到2011年9月从浙江大学医学院附属第一医院收集的门诊800份腹泻标本（每日排便3次或以上、且大便呈稀便、水样便、粘脓便或脓血便等性状有改变）进行检测。从收集的腹泻临床样本中直接提取细菌DNA，用本发明荧光PCR方法检测目的病原菌；同时采用常规培养方法进行平行试验。结果荧光PCR方法检测出O157:H7一份和O104:H4二份，本发明荧光PCR方法比常规培养法检测阳性率高，操作简便。本发明荧光PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得满意的结果。

<110> 浙江大学

<120> 致泻大肠杆菌四重荧光定量PCR检测试剂盒

<160> 16

 

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O157抗原基因设计的PCR上游引物序列

<400> 1

        TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT 24

 

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O157抗原基因设计的PCR下游引物序列

<400> 2

         AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT 25

 

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O157抗原基因设计的TaqMan荧光定量探针序列

<400> 3

         ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT 26

 

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O157抗原基因设计的荧光定量标准品序列

<400> 4

         TGGCATGACG TTATAGGCTA CAATTATAGG ATGACAAATA TCTGCGCTGC   TATAGGATTA   GCCCAGTTAG  AACAAGCT  78

 

 

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌Flic基因（H7）设计的PCR上游引物序列

<400> 5

     GGCGCAGGCTGCTGATT 17

 

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌Flic基因（H7）设计的PCR下游引物序列

<400> 6

     AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG 26

 

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌Flic基因（H7）设计的TaqMan荧光定量探针序列

<400> 7

     CAGATTTACCCACATCAGCATG 22

 

<210> 8

<211> 76

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据志贺氏菌ipaH基因设计的荧光定量标准品序列

<400> 8

         GGCGCAGGCT GCTGATTCAG CTTCAAAACG TGATGCGTTA GCTGCCACCC    TTCATGCTGA    TGTGGGTAAA    TCTGTT  76

 

 

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O104抗原基因设计的PCR上游引物序列

<400> 9

     AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC 24

 

 

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O104抗原基因设计的PCR下游引物序列

<400> 10

     AAAATCCTTTAAACTATACGCCC 23

 

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O104抗原基因设计的TaqMan荧光定量探针序列

<400> 11

          ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG 32

 

<210> 12

<211> 100

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌O104抗原基因设计的荧光定量标准品序列

<400> 12

         TGTCGCGCAA AGAATTTCAA CTTTACTTGG TTTTTTTGTA  TTAGCAATAA GTGGTGTCAT  TTCAAGTCAG GTTTCTAGGG  CGTATAGTTT    AAAGGATTTT  100

 

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌Flic基因（H4）设计的PCR上游引物序列

<400> 13

     GCTGGGGGTAAACAAGTCAA 20

 

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌Flic基因（H4）基因设计的PCR下游引物序列

<400> 14

     CAGAATCAACGACCGCATATT 21

 

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据大肠杆菌Flic基因（H4）基因设计的TaqMan荧光定量探针序列

<400> 15

     TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA 27

 

<210> 16

<211> 79

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据霍乱弧菌O139群糖基转移酶基因设计的荧光定量标准品序列

<400> 16

          GCTGGGGGTA AACAAGTCAA TTTACTGTCT TACACTGACA CCGCGTCTAA    CAGTACTAAA  TATGCGGTCG  TTGATTCTG  79