黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物

摘要

本发明公开了一种黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专用引物。本发明提供的引物对，由引物组1和引物2组成；上述引物对中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。本发明的实验证明，本发明根据斑皮蠹属种之间线粒体基因序列差异性，寻找斑皮蠹不同种的物种特异性变异位点，建立对这些斑皮蠹种的分子鉴定体系，最终实现检疫性斑皮蠹及其近缘种的快速、准确、高效鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定方法及其专 用引物。

背景技术

斑皮蠹属害虫是重要的仓储害虫。目前对斑皮蠹的鉴定，主要根据形态学特征进 行判别。但由于斑皮蠹类成虫个体一般都比较小，且种间的形态差异不明显，经常造 成鉴定中的种间混淆。

皮蠹个体小，成虫体长2.0-3.5mm，且形态酷似不易区分。对成虫的鉴定，主要根 据触角棒节数、触角窝深浅、鞘翅颜色及斑纹特点等来鉴别；幼虫体长4.0-6.0mm， 一般是根据着生的刚毛数量和类型、第8腹节背板前脊沟是否完整和上内唇感觉乳突 的个数等来鉴别。皮蠹的形态鉴别需要解剖后在显微镜下观察，例如两者幼虫最重要 的鉴别特征为触角和上内唇，只有0.1-0.2mm大小，而其上的特征，如刚毛和乳突就 更加细小，因此稍有不慎就可能将其破坏或丢失。这就不但需要鉴定工作者有丰富的 技术经验并且还得保证皮蠹害虫的完整性，从而使得皮蠹近缘种害虫的形态鉴定成为 了日益费时费事的难题。

COI基因是动物线粒体DNA中非常保守的编码蛋白基因，它具有相对的保守性同时 又有足够的变异，即使是亲缘关系很近的类群也存在几个百分比的差异，所以COI常被 用来反映种群遗传变异信息，分析亲缘关系较近的种、种下分类单元等。COI的序列差 异性分析在双翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、缨翅目等昆虫的鉴别中都被用来作为 重要的鉴别依据。而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，使序列比对更容易操作。 目前，COI序列差异性分析已经成为物种间分类最普遍的分子标记之一。

分子生物学技术手段已被用于昆虫的鉴定分类中，目前对皮蠹属近缘种的鉴定， 主要采用传统的形态分类学，尽管也有采用PCR扩增片段，通过测序来鉴定的方法， 但耗时且费用高，还没有相关的快速分子生物学检测方法。

因此如何能够快速准确的对斑皮蠹进行鉴定，已成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测皮蠹的引物对。

本发明提供的引物对，由引物1和引物2组成；

上述引物对中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列 表中序列2。

上述引物对中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的另一个目的是提供一种检测皮蠹的试剂。

本发明提供的试剂，由上述引物对和AflII组成。

在上述试剂中，所述引物对和所述AflII为独立包装；

在上述试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的第三个目的是提供一种检测皮蠹的PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，由上述的引物对、dNTP、DNA聚合酶及PCR缓冲液组成；

在上述PCR试剂中，所述引物对中的各引物在所述PCR试剂中的浓度均为0.5μM。

在上述PCR试剂中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的第四个目的是提供一种检测皮蠹的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的试剂或上述的PCR试剂；

在上述试剂盒中，所述皮蠹为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测皮蠹中的 应用也是本发明保护的范围；

上述应用中，所述皮蠹具体为黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测皮蠹的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用上述引物对或上述试剂或上述PCR试剂或上述试剂盒中的引物对对待测皮 蠹进行PCR扩增，得到扩增产物；

2)分别用AflII酶切步骤1)得到的扩增产物，得到酶切产物，

若所述酶切产物为535bp和347bp大小，则待测皮蠹为或候选为黑斑皮蠹；

若所述酶切产物仍为880bp大小，则待测皮蠹为或候选为花斑皮蠹。

在上述方法的PCR扩增中，以待测皮蠹的基因组DNA为模板；

在上述方法的PCR扩增中，退火温度为50℃-55℃，在本发明的实施例中采用的 退火温度为55℃。

在上述方法中，检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。

本发明的实验证明，本发明根据斑皮蠹属种之间线粒体基因序列差异性，寻找斑 皮蠹不同种的物种特异性变异位点，建立对这些斑皮蠹种的分子鉴定体系，最终实现 检疫性斑皮蠹及其近缘种的快速、准确、高效鉴定。本发明的优点在于：

1、缩短检测所需时间，从收集样品到检测完毕仅需1天。

2、所需样品量大大减少，同时检测精准度大大提高。甚至虫体不完全时也可以进 行检测鉴定，且结果可信度高。

3、成本大大降低。

此外，本方法还弥补了传统分类鉴定中需要提供完整虫体的要求，因为在实际检 疫工作中，斑皮蠹属害虫在生活过程中不断在粮粒或其他储藏物内穿行，身上的毛极易 脱落，尤其幼虫体表组织柔软，使得有些虫体不能保持完整，而本实验方法即使在虫 体不完全时也可以进行检测鉴定。

附图说明

图1为皮蠹的PCR扩增结果

图2为限制酶AflII酶切皮蠹PCR产物的电泳图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、引物的设计

根据已有的谷斑皮蠹的序列(基因序列号：FJ58973)，设计引物：

Tgla-F：5-CAACATTTATTTTGATTT-3(序列1)

Tgla-R：5-TCCAATGCACTAATCTGCCA-3(序列2)

实施例2、黑斑皮蠹与花斑皮蠹的鉴定

1、皮蠹样品DNA的提取

分别取编号为1和2的两头皮蠹分别由黄埔出入境检验检疫局(采集于广州黄埔) 和山东农业大学提供(采集于山东泰安)，采用Tiangen组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)，按照说明提取被测样品总DNA。具体为：将活虫在 200μl GA缓冲液中研磨碎，混匀后加入20ul蛋白酶K，37℃放置4hr。随后加入200μl GB 缓冲液，混匀后，在70℃放置10min。加入200ul无水乙醇，充分混匀15s。将所得溶液 转入CB3吸附柱中，离心，12,000rpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。向 吸附柱CB3中加入0.5mlGD缓冲液，离心，12,000rpm，30s，倒掉废液，将吸附柱放回 收集管中。向吸附柱CB3中加入0.7ml漂洗液PW，离心，12,000rpm，30s，倒掉废液， 将吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入0.5ml漂洗液PW，离心，12,000rpm，30s， 倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。离心，12,000rpm，2min，倒掉废液，将吸附柱 CB3置于室温几分钟，以彻底晾干残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入干净的离心管中， 向吸附膜中央滴加50ul洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12,000rpm离心2min，分别得到 1和2的总DNA。

2、PCR扩增

分别以上述1得到的1和2的总DNA为模板，以Tgla-F和Tgla-R为正反向引物，加入 PCR试剂盒提供试剂(Tiangen)，进行片断扩增，反应体系为20ul，其中：2μl 10×Taq Reaction Buffer缓冲液，1.25U Taq polymerase，1μl dNTP(终浓度125μM)，0.5μM/ 引物(终浓度0.5μM/引物)，20ng DNA。反应条件为：95℃，5min，1个循环；94℃， 30s，55℃，45s，72℃，1min，35个循环；最后72℃延伸10min，1个循环。

扩增后产物在2％琼脂糖胶中进行电泳，结果如图1所示，可以看出，其中：1为1 号皮蠹PCR产物，2为2号皮蠹PCR产物，3.200bp DNAladder(Tiangen)：从上到下依 次为：第一条带：4000bp；其它从2200bp开始，每条递减200bp，直至最低条带200bp； 可以看出，均得到大小约为880bp的PCR产物。

2、酶切及结果检测

将上述1号皮蠹PCR产物和2号皮蠹PCR产物分别采用特异性酶AflII进行酶切，

酶切体系：20μL反应体系如下：10U Afl II，2μL  10×NEBuffer，0.2μL 100×BSA，DNA的PCR产物17.3μL(终浓度约370ng/ul)。将混合体系在PCR仪37℃ 条件下孵育1小时后，各取10μL酶切产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物 并拍照。

酶切后产物在2％琼脂糖胶中进行电泳，电泳后EB染色，以检测酶切结果，具体 为：取10ulDNA扩增产物，与样品缓冲液混合均匀，点入2％琼脂糖胶中，进行电泳， 90V，35min。电泳后EB染色10min，在UV灯下检测结果。

若得到的PCR产物经过AflII酶切后得到535bp和347bp的片段，则待测样品为 黑斑皮蠹；

若得到的PCR产物经过AflII酶切后仍为880bp左右的片段，则待测样品为花斑 皮蠹。

结果如图2所示，其中：1.100bpDNAladder(Tiangen)，从上到下依次为：第一 条带：1500bp；其它从1000bp开始，每条递减100bp，直至最低条带100bp，2.1号皮 蠹PCR产物酶切后，3.2号皮蠹PCR产物酶切后，4.200bp DNAladder(Tiangen)： 从上到下依次为：第一条带：4000bp；其它从2200bp开始，每条递减200bp，直至最 低条带200bp。可以看出，1号皮蠹PCR产物酶切后得到535bp和347bp的产物，2 号皮蠹PCR产物酶切后，仍为880bp左右的片段，说明1号皮蠹为黑斑皮蠹，2号皮 蠹为花斑皮蠹。

将上述1号皮蠹PCR产物和2号皮蠹PCR产物分别送去测序，结果分别为序列 表中的序列4和序列表中的序列3，与genbank比对，序列4即为黑斑皮蠹的COI部 分序列，而序列3即为花斑皮蠹的COI部分序列，这个检测结果与本发明的检测结果 一致，证明本发明的方法正确。