一种来源于苜蓿盲蝽的OBPs蛋白及其编码基因

摘要

本发明公开了一种来源于苜蓿盲蝽的气味结合蛋白及其编码基因，其是利用SMART技术构建触角cDNA文库和生物信息学方法从苜蓿盲蝽触角中有效分离鉴定出来的。鉴于气味结合蛋白在昆虫嗅觉识别中的重要作用，本发明所涉及的这些基因可以在昆虫的生物防治中发挥重要的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及利用昆虫的嗅觉系统来进行害虫生物防治的技术领 域；进一步，本发明涉及利用SMART技术构建触角cDNA文库以及结 合生物信息学方法分离鉴定昆虫气味结合蛋白OBPs的方法及分离出 来的苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因。

背景技术

盲蝽蟓隶属于半翅目盲蝽科，是我国棉花生产上的一类重要害 虫。1997年，我国开始商业化种植Bt棉花，到2007年Bt棉花的种 植面积达到了380万公顷，占全国棉花总种植面积的69％。种植Bt 棉花有效的控制了棉铃虫等主要鳞翅目害虫的危害，使化学农药使用 量因此大幅度减少，随之，棉田害虫地位发生了一系列演替，盲蝽蟓 种群数量剧增，危害加强，并且呈严重灾变趋势发生(Lu YH，Qiu F， Feng HQ，et al.Species composition and seasonal abundance of pestiferous plant bugs(Hemiptera：Miridae)on Bt Cotton in china.Crop Protection，2008，27：465-472)。据各地植保部门反映，近年来很多地 方盲蝽蟓为害导致的棉花产量损失约为20％-30％，严重地区高达 50％左右。棉田盲蝽蟓的严重发生还波及了枣、桃、苹果、樱桃、葡 萄、茶树等农作物，已经成为影响多种农作物生产的重大问题。由于 Bt棉抗盲蝽蟓效果较差，因此现在防治盲蝽蟓主要靠化学农药，这 不仅容易导致棉铃虫等鳞翅目害虫抗药性的产生，而且对环境造成了 巨大的破坏和污染，因此，有必要发展经济有效的、环境友好的防治 方法。

嗅觉对于许多昆虫的生存和繁衍至关重要。昆虫在长期的进化过 程中，发展演变了发达的触角系统(Field LM，Pickett JA and Wadhams LJ.Molecular studies in insect oltaction.Insect Mol.Biol.，2000，9(6)： 545-551)。昆虫的触角系统是一个高度专一和灵敏的化学检测器，可 以特异性识别环境中的化学气味分子，并依次觅食、寻偶、选择产卵 的信息。而昆虫气味结合蛋白与脂溶性的气味物质发生作用，是昆虫 专一性识别外界气味物质的第一步生化反应(Vogt RG and Riddiford LM.Pheromone Binding and inactivation by moth antennae.Nature， 1981，293：161-163)。

昆虫气味结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)是一类低分 子量(16KDa左右)、等电点偏酸性(为4.0-5.0)、球状的水溶性蛋白， 在昆虫识别外界气味物质中起着重要的作用，其主要存在于昆虫嗅觉 感器淋巴液中。其作用是结合并运输脂溶性的气味分子通过水溶性的 淋巴液到达嗅觉神经树突末梢(Pelosi P and Maida R.Odorant-binding proteins in insects.Comp.Biochem.Physiol.，1995，111(3)：503-514)。

因此，深入研究OBPs不仅具有重要的理论意义，而且在实践中 可以为害虫检测防治和益虫利用提供新途径、新方法，为研制开发无 污染、不杀伤天敌、与环境相容性较好的高效引诱剂提供理论依据。 也有利于阐明昆虫的嗅觉识别机制，同时对于研究脊椎动物的嗅觉识 别机制也具有重要的启示意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种经分离得到的昆虫气味结合蛋白，及其 编码基因；利用所发现的OBPs基因可以为害虫检测防治和益虫利用 提供新途径、新方法，为研制开发无污染、不杀伤天敌、与环境相容 性较好的高效引诱剂提供理论依据。

为达到上述目的，本发明的技术方案先提供一种从昆虫触角中分 离鉴定气味结合蛋白基因的方法，包括步骤：

(1)利用SMART技术获得触角全长cNDA序列；

(2)Sfi酶双酶切所述ds cDNA；

(3)利用凝胶层析柱对酶切产物按片段大小进行分离，收集片段 长度最长的ds cDNA；

(4)步骤(3)的ds cDNA和pDNR-LIB载体连接，得重组质粒；

(5)所述重组质粒转化ElectroMAX DH5α-E感受态细胞，得到 未扩增的初始化cDNA文库；

(6)采用生物信息学的方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋白基 因。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明的方法的具体技术方案 包括以下步骤：

(1)触角RNA的提取、反转录合成第一链cDNA及LD-PCR合 成ds cDNA

取200对触角在液氮中研磨，利用Trizol提取RNA，电泳检测 RNA的质量，分光光度计测定RNA的浓度。利用SMART技术和 LD-PCR方法反转录合成第一链cDNA和ds cDNA。1.5％琼脂糖电泳 检测LD-PCR产物条带大小分布。同时为了抑制DNA聚合酶的活性， 利用蛋白酶K消化LD-PCR产物。

(2)Sfi I酶切ds cDNA及CHROMA SPIN-400柱子分离ds CDNA

上述蛋白酶K消化好的ds cDNA 5’端和3’端含有Sfi I内切酶的 酶切位点，为了便于ds cDNA和pDNR-LIB载体的连接，用Sfi I内 切酶对ds cDNA进行酶切。酶切完之后，再利用CHROMA SPIN-400 柱子按ds CDNA的大小进行分离，1.5％电泳检测分离产物，收集片 段长度最长的ds cDNA。

(3)ds cDNA和pDNR-LIB载体的连接及重组质粒电转化DH5α 大肠杆菌细胞

为了得到最佳的连接效果，需要对ds cDNA和pDNR-LIB的连 接比例进行优化，ds cDNA和pDNR-LIB载体的连接比例分别为1∶2， 1∶1和3∶2，分别电转化DH5α大肠杆菌细胞，转化完成后，根据得到 的单克隆数量确定最佳的连接比例(ds cDNA∶pDNR-LIB载体＝1∶2)， 然后按照最佳的连接比例再进行重组质粒转化DH5α大肠杆菌细胞， 最终得到未扩增的初始化cDNA文库。

(4)初始化cDNA文库滴度的测定

在将原始cDNA文库冷冻或者扩增之前，应当检测原始cDNA 文库的滴度。一个好的有代表性的文库其滴度应当是独立克隆子数目 的10倍以上。通常情况下，为了便于长期保存，质粒文库的滴度应 该至少在10⁶pfu/ml.本文库测定滴度的方法如下：

分别取0.5μl，0.25μl，0.05μl，0.025μl，0.005μl原始文库涂于 200μl LB平板中，混匀，37℃共培养10h左右，待出现单克隆，计数。

(5)菌液PCR检测插入片段的大小和重组率

利用菌液PCR随机检测1000个单克隆插入片段的大小，并计算 重组率。菌液PCR引物序列如下：

M13-Forward primer(5’-3’)：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-Reverse primer(5’-3’)：AACAGCTATGACCATG

从电泳图谱可以看出，插入片段均＞500bp，平均大小在800bp 以上，重组率＞98％，说明所构建的cDNA文库质量较高，能够进行下 一步分析。

(6)利用生物信息学方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋白 OBPs基因

利用M13引物对从文库中挑选的单克隆进行测序，为了得到基 因的全长，测序方向为5’端测序。对通过测序得到的EST序列进行 生物学分析如下：

PHRED程序评估EST序列的质量，用Q20程序剔除EST序列 两端的低质量碱基。用PHRAP软件包中的Cross Match程序剔除 EST序列中的载体序列和引物序列。然后得到的高质量的EST序列 用CAP3软件进行聚类分析，聚类分析结果得到Unigenes，仅含有一 个EST的Unigenes称之为Singletons，含有两个以上的Unigenes称之 为contigs.本发明中共得到2915个EST序列，共计产生了1423个 Unigenes，其中包含1208个Singletons，占所有Unigenes的84.9％。根 据OBPs蛋白氨基酸序列中都含有6个保守的半胱氨酸的特征，设计 程序从1423个Unigenes中鉴定气味结合蛋白基因，同时结合 BLASTX和BLASTN比对结果对鉴定结果进行人工确认。气味结合 蛋白OBPs基因的鉴别程序如下：

其中“Classical OBPs”的鉴别程序为：

C1-X_20-66-C2-X₃-C3-X_21-43-C4-X_8-14-C5-X₈-C6；

C1-X_15-39-C2-X₃-C3-X_21-44-C4-X_7-12-C5-X₈-C6；

“Plus-C OBPs”的鉴别程序为：

C1-X_20-41-C2-X₃-C3-X_41-46-C4-X_19-29-C4a-X₉-C5-X₈-C6-P-X_9-10-C6 a-X_9-10；

C1-X_8-41-C2-X₃-C3-X_39-47-C4-X_17-29-C4a-X₉-C5-X₈-C6-P-X_9-11-C6a。

最终从苜蓿盲蝽触角cDNA文库中得到14个OBPs基因，所有 的OBPs基因都为全长，包含有完整的开放阅读框。其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14其中一项所示。编码的气味结合蛋白的 一级结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.28其中一项所 示。

本发明的方法利用SMART技术构建触角cDNA文库，同时结 合生物信息学方法从触角文库中鉴定昆虫气味结合蛋白基因，与通 过RACE设计兼并引物扩增得到基因全长的方法相比，本发明方法 具有成本低、时间快、易操作的优点，更为重要的是，利用本发明 方法可以同时鉴定多个气味结合蛋白基因，大大提高了鉴定气味结 合蛋白的效率。同时也为从其他昆虫种类中鉴定气味结合蛋白基因 提供了一条更为简便有效的方法。通过对鉴别的气味结合蛋白进行 生化特征、蛋白结构、生物功能方面的研究，无疑会有助于阐明昆 虫嗅觉的识别机制，同时为利用昆虫的嗅觉来进行害虫的生物防治 提供理论上的依据。

附图说明

图1为苜蓿盲蝽触角RNA电泳图；

图2为SMART技术的原理；

图3为LD-PCR产物电泳图，其中1代表LD-PCR的产物；2代 表DNA Marker 2000，自下向上依次为100bp，250bp，500bp，750bp， 1000bp，2000bp；

图4为CHROMA SPIN-400柱子对ds cDNA按大小进行片段的 分离电泳图，其中M代表Wide Range DNA Marker，自下向上依次为 100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp，2500bp，3000bp， 4000bp，6000bp，泳道1-16为按片段大小分离的ds cDNA；

图5为原始文库滴度的测定；

图6为菌液PCR鉴定文库重组率和插入片段的大小，其中M代 表DNA Marker 2000，自下向上依次为100bp，250bp，500bp，750bp， 1000bp，2000bp，泳道1-12代表随机挑选的单克隆；

图7为鉴定的12个“Classical OBPs”序列比对图，阴影标记的 为6个保守的半胱氨酸；

图8为鉴定的两个“Plus-C OBPs”和其他昆虫的“Plus-C OBPs” 序列比对图，阴影标记的为6个保守的半胱氨酸和脯氨酸。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细 描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了在苜蓿盲蝽中鉴 定气味结合蛋白的方法，然而这并不意味本发明的方法只限于苜蓿 盲蝽这一种昆虫，因此，使用本发明所描述的方法来鉴定其他昆虫 种类中的气味结合蛋白基因，均包括在本发明所要求的权利范围之 内。

实施例1：触角RNA的提取、反转录合成第一链cDNA及LD-PCR 合成ds cDNA

取刚羽化的苜蓿盲蝽触角200对，利用Trizol法进行RNA的提 取，电泳检测RNA质量(见图1)，同时分光光度计测定RNA的浓度 为618.8ng/μl。利用SMART技术和LD-PCR方法合成第一链cDNA 和ds cDNA。最后1.5％琼脂糖凝胶电泳检测LD-PCR产物的分布。 SMART的原理如图2。LD-PCR产物的电泳图如图3。分析结果表 明LD-PCR产物的大小从200bp-2000bp，分布范围比较广泛，说明 产物包括了不同基因的mRNA，其中有几条比较亮的条带，代表了 在触角中表达量比较高的基因。

实施例2：Sfi I酶切ds cDNA及CHROMA SPIN-400柱子分离 ds CDNA

为了将LD-PCR扩增得到的ds cDNA和pDNR-LIB载体连接， 用Sfi I内切酶对ds cDNA进行酶切，同时用CHROMA SPIN-400柱 子对ds cDNA按大小进行片段的分离，分别装在16个无菌离心管中， 每管一滴。最后1.5％琼脂糖电泳检测得到的ds cDNA片段的大小分 布，如图4，最后根据电泳结果取其中的7，8，9，10四管中的ds cDNA 和pDNR-LIB载体进行连接。

实施例3：重组质粒电转化DH5α大肠杆菌细胞

为了得到较高的转化效率，采用电转化。电转化仪为Bio-Rad公 司产品，电击参数设置为2000V，200Ω。电击时间为2-3秒。

实施例4：初始化cDNA文库滴度的测定

为了评估所建cDNA文库的质量，需要对文库进行滴度测定。方 法如下：分别取0.5μl，0.25μl，0.05μl，0.025μl，0.005μl原始文库涂 于200μl LB平板中，混匀，37℃共培养10h左右，待出现单克隆， 如图5，计数。

结果为：

0.5μl    ∞

0.25μl   1707    4.8×10⁶plaques/Library

0.05μl   295     4.1×10⁶plaques/Library

0.025μl  182     5.0×10⁶plaques/Library

0.005μl  47      6.6×10⁶plaques/Library

＞2.00×10⁶plaques/Library  平均为：5.1×10⁶plaques/Library

以上结果表明所建文库质量较高，比较有代表性。原始cDNA文 库不稳定，并且低丰度cDNA的数量极少，因此对初建成的原始cDNA 文库要立即进行扩增，以便长久保存。

实施例5：菌液PCR检测插入片段的大小和重组率

为了检测文库中单克隆插入片段的大小和文库重组率，利用菌液 PCR随机检测1000个单克隆插入片段的大小。菌液PCR引物序列如 下：

M13-Forward primer(5’-3’)：TGTAAAACGACGGCCAGT(如 SEQ ID NO.29所示)；

M13-Reverse primer(5’-3’)：AACAGCTATGACCATG(如SEQ ID NO.30所示)；

1.5％琼脂糖电泳检测PCR产物，如图6。结果表明，插入片段 都在500bp以上，重组率为98％，表明所建文库质量较高，可以进 行下一步分析。

实施例6：利用生物信息学方法从cDNA文库中鉴别气味结合蛋 白OBPs基因

利用M13引物对从文库中挑选的单克隆进行测序，为了得到基 因的全长，测序方向为5’端测序。共计得到EST序列2915个，通过 对这些EST序列进行载体序列的剔除，聚类分析，最终得到1423个 Unigenes。根据OBPs蛋白氨基酸序列中都含有6个保守的半胱氨酸 的特征，设计程序从1423个Unigenes中鉴定气味结合蛋白基因，同 时结合BLASTX和BLASTN比对结果对鉴定结果进行人工确认。气 味结合蛋白OBPs基因的鉴别程序如下：

其中“Classical OBPs”的鉴别程序为：

C1-X_20-66-C2-X₃-C3-X_21-43-C4-X_8-14-C5-X₈-C6；

C1-X_15-39-C2-X₃-C3-X_21-44-C4-X_7-12-C5-X₈-C6.

“Plus-C OBPs”的鉴别程序为：

C1-X_20-41-C2-X₃-C3-X_41-46-C4-X_19-29-C4a-X₉-C5-X₈-C6-P-X_9-10-C6 a-X_9-10；

C1-X_8-41-C2-X₃-C3-X_39-47-C4-X_17-29-C4a-X₉-C5-X₈-C6-P-X_9-11-C6a。

最终从苜蓿盲蝽触角cDNA文库中得到14个OBPs基因，所有 的OBPs基因都为全长，包含有完整的开放阅读框。所有的这14个 OBPs基因的氨基酸的同源性比较见表1。

表1 14个OBPs的氨基酸同源性比较

氨基酸同源性分析表明，这14个OBPs的同源性从8％-67％，说 明这些OBPs在进化上属于不同的类型。

进一步分析表明这14个气味结合蛋白基因可以分为两类，第一 类为典型的OBPs基因，命名为“Classical OBPs”，共计12个，核苷 酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12，编码蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.26。这12个“Classical OBPs”的序列比对 结果如图7，其特征是这些氨基酸序列中具有六个保守的半胱氨酸。

第二类为“Plus-C OBPs”，共计2个，核苷酸序列为SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.27～ SEQ ID NO.28。这两个“Plus-C OBPs”和在果蝇、冈比亚按蚊、埃及 伊蚊中鉴别的“Plus-C OBPs”的序列比对见图8。其典型特征为这些 氨基酸序列中有8个保守的半胱氨酸同时在第六个保守的半胱氨酸 位点之后紧接着为一个脯氨酸。

实施例7：Alin-OBP1蛋白的表达和纯化

取刚羽化的苜蓿盲蝽成虫触角150对(雌雄各75对)，用Trizol进 行总RNA的提取。第一链cDNA的合成由Invitrogen的SuperScript III 逆转录合成系统完成。

根据Alin-OBP1序列设计特异性引物，扩增AlinOBP1的编码框。 引物设计如下：

正向引物：5′GCGGATCCATGAACTCACTCATTCCCGT-3′

反向引物：5′-GCGCTCGAGTTAGAAGTCTGGAGGACGC-3′

为了便于将目的基因克隆到表达载体上，在正向、反向引物中分 别设计了BamH I、XhoI酶切位点(以下划线表示)。PCR反应条件：95 ℃预变性2min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延 伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。扩增完毕后用1.5％ 琼脂糖凝胶电泳检测。利用Axygen琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回 收PCR产物，PCR产物经胶回收后克隆于pGEM-T Easy载体上，重 组克隆载体pGEM/AlinOBP3转化JM109感受态细胞，然后涂布在 含有Ampicillin/X-gal/IPTG的LB平板上，37℃倒置培养15小时。 经蓝白斑筛选后，挑取6个阳性克隆在LB液体中(含Amp)培养 过夜，次日用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，采用菌液PCR和 Nco I、BamH I双酶切同时验证重组载体pGEM/AlinOBP1插入片段 的大小。

将重组质粒pGEM/AlinOBP1经BamH I和XhoI双酶切后，回收 400bp左右的目的片段，与经同样双酶切的原核表达载体PET-30a(+) 相连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取酶切和测序鉴 定正确的单克隆于5ml LB中(含100μg/ml的Kan)培养过夜，次 日以1∶100的比例转接到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至 OD600值达到0.4-0.6，此时加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，继续诱 导蛋白表达8-12小时。诱导表达完成后8000rpm，离心10min收 集菌体，然后用裂解液(80mmol/L Tris-HCl，200mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，4％glycerol，pH＝7.2，0.5mmol/L PMSF)裂解细胞沉 淀，经超声和高速离心后，分别收集上清和包涵体。SDS-PAGE 电泳分析PET/AlinOBP3在上清和包涵体中的表达情况。最后蛋白 用HisTrap亲和层析柱纯化蛋白。为避免融合蛋白PET/AlinOBP1上 His-tag对蛋白的功能研究产生影响，用重组肠激酶Recombinant Entherokinase(Novagen)切去His-tag，切割条件为20℃切割16h。 然后用EKapture Agarose(Novagen)除去残余的重组肠激酶。接着用 HisTrap亲和层析柱和HiTap Desalting脱盐柱对Alin-OBP1进行再纯 化和脱盐处理，最后得到不含His-tag的纯化蛋白Alin-OBP1。

实施例8：Alin-OBP1蛋白在引诱剂中的应用

实验室内通过荧光竞争结合测定发现，Alin-OBP1能够和数种 棉花挥发物(如：辛醛、壬醛、葵醛、异辛醇、β-石竹烯和β-紫罗兰 酮)或者盲蝽科性信息素类似物(如：丁酸乙酯和丁酸反-2-己烯酯)有 着很强的结合能力，表明这些化合物在苜蓿盲蝽识别寄主植物和性 信息素的过程中发挥关键作用，同时室内行为试验也证实这些化合 物对苜蓿盲蝽有着很强的行为学反应。进一步，利用筛选出的这些 气味物质制备引诱剂进行田间诱捕试验，结果表明这些气味物质能 够显著的引诱苜蓿盲蝽，具有较强的控制靶标害虫应用前景。上述 田间诱集效果表明，通过Alin-OBP1蛋白筛选出的的特异结合的气 味分子可用于制备无污染、不杀伤天敌、与环境相容性较好的高效 引诱剂。

目前防治农业害虫的方法主要以化学农药为主，这不仅容易导 致害虫抗药性的产生，而且对环境造成严重的污染，同时也危害着 人类的身体健康。昆虫OBPs具有特异性结合异性个体释放的性信 息素和寄主特定挥发物的功能，本发明可以利用所发现的OBPs系 统的研究其和苜蓿盲蝽性性信息素和棉花挥发物的结合能力图谱， 从而有效的筛选出能够特异性吸引苜蓿盲蝽的性信息素和特定棉花 挥发物，最终为害虫检测防治和益虫利用提供新途径、新方法，可 以研制开发出无污染、不杀伤天敌、与环境相容性较好的高效引诱 剂，同时有利于阐明昆虫嗅觉的识别机制。