启动子元件中AT(n)插入在控制植物编码序列的表达水平中的用途

摘要

本发明涉及启动子元件中的AT(n)插入在控制植物编码序列表达水平中的用途。当比较群体中的抗性个体和易感个体时，热休克蛋白(Gmhsp17.6-L)的表达水平证明，根据定量PCR的最大表达水平存在于在启动子区中含最大AT插入的个体。本发明还涉及用于转化大豆胚的含与GUS蛋白融合、带有不同数目AT插入的基因启动子区的基因表达盒。

说明书

发明领域

本发明涉及在启动子区序列中特定位点的AT_(n)插入在控制植 物编码序列的表达水平中的用途，所述表达水平在某些限度内可 被人工上调(上游)或下调(下游)。

发明背景

基因的启动子区由基因转录起始位点上游的通常1-100和 1-200个碱基对的DNA序列组成，并且一般包含和/或邻接一个或 多个转录因子结合位点。所有基因具有转录起始位点上游(在上) 和下游(在下)的转录调节。转录因子识别并结合这些调节序列，以 控制转录的信使RNA的合成。这些序列包括启动子、增强子和调 节序列。启动子可用于基因构建体，通过基因工程操纵以按组成 性模式过量表达、抑制或调节基因的表达或者通过某些环境诱导。

在生物技术领域中目前可利用多种过量表达基因的技术，其 中主要技术包括构建含分离自花椰菜花叶病毒(CaMV-Cauliflower  Mosaic Virus)的组成性启动子35S的表达盒。然而存在一些在基因 构建体中使用该启动子的例外。使用小序列病毒DNA及将其插入 到植物基因组中已在实验上被证明在感染植物的病毒基因组和转 基因植物的基因组之间存在遗传重组的潜在风险，或者更准确地 说，在信使RNA转录物之间存在遗传重组的潜在风险。该风险相 当于产生可能是毒性更强类型的新病毒株。

启动子35S CaMV被认为是泛宿主性的，在所有植物以及绿 藻、酵母和大肠杆菌中起有效作用。它具有模块结构，后者带有 与其它植物和动物病毒的启动子共同且可互换的部分。它还具有 重组热点，其侧翼是参与重组过程的多个模体，与其它重组热点 类似，包括农杆菌(Agrobacterium sp.)的T-DNA载体的边界，常用 于转基因植物。该热点易于分开并结合其它DNA，因此增加了水 平基因转移和重组过程的可能性。因此，由于将侵袭性外源DNA 插入基因组中、再活化休眠病毒(viros)和产生新病毒，新病毒仅在 相对野生型病毒有一些选择性优势时才是稳定的，因此潜在风险 在于诱变和癌变。

利用启动子35S CaMV观察部分或完整的转基因事件和/或外 源同源物表达的抑制(Napoli等(1990)The Plant Cell 2：279-289； Van der Krol等(1990)Plant Cell 2 291-299)。该失活发生是由于涉 及甲基化和外遗改变的复杂机制(Renckens等(1992)Mol.Gen. Genet.233：53-64；Neuhuber等(1994)Mol.Gen.Genet.244： 230-241；Meyer和Heidmann(1994)Mol.Gen.Genet.243：390-399； Thierry和Vaucheret(1996)Plant Mol.Biol.32：1075-1083。尽管将 某些序列指示给甲基转移酶或负责外遗改变的其它酶的实际机制 仍然未知，但已存在假说表明涉及DNA-DNA、DNA-RNA和 RNA-RNA之间的依赖性同源物的相互作用(Grierson等.(1991) Trends in Biotechnology 9：122-123)；Matzke和Matzke(1995)Plant  Physiology 107：679-685。

文献中有数据证明，整合至油菜染色体中的CaMV基因与感 染病毒的基因组重组并产生新的毒性更强的病毒。CaMV病毒之间 的这些重组涉及启动子区(Vaden和Melcher(1992)Virology 177： 717)，可发生在DNA和DNA之间或RNA和RNA之间并且往往 产生比亲本复本更严重的感染(Mol.Plant-Microbe Interactions 5： 48，1992)。

启动子35S CaMV的使用还往往导致外源基因产物按低于总 蛋白1％的比率表达。该启动子的一些改进(例如一些序列的重复和 增强子的加入)提高了其表达，但对于一些应用，外源基因产物的 表达水平需要进一步提高。

通常，在已进行的、利用组成性启动子35S CaMV得到具有耐 受生物胁迫和非生物胁迫特性的遗传修饰植物的实验中，据报道 尽管耐受性在一些情况下增加，但使用该启动子引起的不希望的 作用之一是减小植物大小，其生长和发育通常受到影响，导致小 的植株而不论被转化的植物种类(Kasuga等.(1999)Nature America  Inc.287-291)。

因此，尽管可能发生一些负面作用例如植物生长延迟，但是 例如使用胁迫诱导型启动子以控制基因表达等策略可防止或减轻 这样的作用。

在另一项研究中，Gelvin等(Plant Molecular Biology Manual. Norwell，MA：Kluwer Acedemic Publishers，1995)分析了一些启动 子指导的GUS表达，这些启动子由根癌农杆菌(Agrobacterium  tumefaciens)的两个基因即冠瘿碱合成酶(ocs)和甘露碱合成酶(mas) 的调节序列的不同组合构建。在所述不同组合中，由ocs基因激活 序列的三联重复序列融合mas激活元件和mas启动子区而形成的 杂合启动子称为“(Aocs)3AmasPmas”，其在转化的烟草细胞中 表现出的GUS标记基因的表达水平是相对于包含启动子CaMV  35S的细胞的10倍。该新型启动子并不影响转化效率，但标记基 因的高水平表达有利于鉴定更大比例的转化细胞。表达水平在叶、 根和多种细胞类型中高。该启动子还在木薯植物和豌豆植物中非 常有效，这是两种使用农杆菌(agrobacterium sp.)难以转化的农作 物。该小组还使用该启动子“(Aocs)3AmasPmas”描述了在研究被 引入(在18小时后)烟草和玉米植物中的基因快速转录方面的成功， 这不同于由启动子CaMV35S控制的表达，后者活性弱且不能够在 该时间间隔内检测到任何基因表达。

另一种选择是使用胁迫诱导型启动子用于基因构建体中基因 的过量表达，并且在这方面分离自拟南芥(Arabdopsis thaliana)的启 动子rd29最常用于寻找非生物胁迫耐受性更好的植物。通常，这 些基因构建体总与DREB(脱水应答元件结合(Dehydration  Responsive Element Binding))家族的基因融合，该家族基因控制响 应环境胁迫例如干旱、盐度以及低温和高温的基因的表达。在一 些利用不同植物种类的研究中，据报道用诱导胁迫型启动子进行 遗传转化导致植物对非生物胁迫更耐受(Oono等(2003)The Plant  Journal，34：868-887；Kasuga等(2004)Plant Cell Physiol  45(3)：346-350。

Fuganti等(2004)使用了对孢囊线虫有抗性和易感的大豆基因 型。该文献含有关于分子标记物的原始数据，该分子标记物可用 于帮助选择有孢囊线虫抗性的大豆基因型。然而，在已检测个体 之间没有检测到与DNA序列或由该基因编码的mRNA表达的水 平相关的任何类型的分子差异。

Fuganti(硕士论文，State University of Londrina[Universidade  Estadual de Londrina]，2004)提出利用分子标记物选择抗性株，这些 分子标记物与抗性基因和包含那些目标基因在内的基因组区的分 子表征基因相关。在该研究中，没有公开定性或定量数据表明基 因启动子区中AT(n)插入的大小与得到的其mRNA或蛋白的表达 水平之间可能关联。本发明提出在启动子区内插入一定数目的 AT_(n)插入情况下控制和/或上调或下调任何基因表达水平的能力。 这样的提议在该研究中既未提出也未试验。

Fuganti(博士论文，State University of Maringa[Universidade  Estadual de Maringa]，2007)提出了定性和定量数据，这些数据表明 Gmhsp17.6-L基因的启动子区内不同大小的AT_(n)插入和其响应各 种生物和非生物胁迫(冷、热、干旱、盐度、线虫幼虫感染)的表达 水平之间可能关联。然而，在生物和非生物胁迫存在和/或不存在 的情况下上调或下调任何基因的表达水平的可能性既未被提出也 未被讨论，所述基因的编码区可与包含不同大小的AT_(n)融合的启 动子区。

专利文件号US2005059623提供了通过受控的超声应用使用 局部热控制在选定细胞中表达的与热休克蛋白(HSP)启动子融合 的治疗基因表达的方法。该提出的发明旨在控制和上调或下调在 所有转化细胞中表达的与热休克蛋白的启动子区融合的任何基因 的表达水平，所述启动子区在其基因序列中具有不同大小的AT_(n)插入。生物或非生物胁迫可作用于整株植物。没有公开在AT插入 被插入到其启动子区中的情况下其在控制基因表达中的作用或其 用作调节任何基因表达的工具的可能性的任何表示。

专利文件US2003190706涉及与表现出启动子活性的DNA序 列融合的外源基因，该活性可促进基因产物(蛋白)总量的增加。该 具有启动子活性的区域产生自包括氮化碱基的取代和缺失在内的 诱变改变。本发明需要使用包含诱导mRNA合成所需的所有基因 元件的完整的基因启动子。在本发明中清楚的是，对基因表达的 控制根据AT_(n)插入的大小而非基因启动子区中的随机突变将导致 水平差异。

专利文件EP1930423公开了分开成不同最终大小的热休克蛋 白的启动子区，其用于产生异源蛋白的系统，异源蛋白的表达水 平不受其它常规启动子控制。为了激活表达，使用特定的非生物 或化学胁迫。本发明使用在Gmhsp17.6-L基因的启动子区中研究 和检测到的基因型中之前存在的变异，其小于EP1930423文献中 所用的1000bp片段。该变异由启动子的特定区内不同数目的AT_(n)插入来提供，视AT_(n)插入而定导致312bp(AT₉)和358bp(AT₃₃) 之间的大小变化。

专利文件US5929302使用时序性和组织特异性的启动子，其 调节成熟期的例如叶和花托等组织中的基因表达。该启动子分离 自覆盆子的dru基因本身或其同源物，以表达嵌合基因。提出了该 启动子与特定基因的组合，这些基因例如调节颜色和气味变化的 基因、改变植物细胞过程的酶或分解代谢产物的基因、其产物影 响乙烯合成的基因、替代性真菌控制基因和蔗糖积累基因。本发 明提出在任何基因的启动子区中进行改变，以便改变其在所有细 胞中和贯穿植物的整个生命周期的表达。基因产物表达水平的改 变与启动子内不同数目的AT_(n)插入相关，并因此与不同大小的启 动子相关。本发明提出控制包括这些改变的任何基因的表达。

因此，本发明是创新的，因为其不同于用于过量表达基因的 科学文献中可用的所有现有方法。为此，本发明使用了具有较大 和较小数目重复的AT序列的插入，使得能够调节基因表达水平， 从而提高或降低基因表达水平。

发明简述

本发明涉及启动子元件中的AT_(n)插入在控制植物编码序列的 表达水平中的用途。本发明还涉及含与GUS蛋白融合并带有不同 数目AT插入的基因启动子区的基因表达盒，用于转化大豆胚。

本发明提供一种调节植物编码序列的表达水平的方法，所述 方法包括：

(i)用在与目标基因有效连接的启动子元件内携带AT_(n)插入 的表达盒稳定转化植物细胞；

(ii)将稳定转化的植物细胞于植物细胞生长条件下培养；

(iii)再生将(i)的盒稳定整合至其基因组中的转基因植物；

其中所述转基因植物与对照植物相比显示出不同的基因表达 水平。

本发明还提供了表达盒，所述表达盒包含具有与Gmhsp17.6-L 基因的启动子区连接的不同数目的AT-插入的两个启动子区。

本发明另一个实施方案提供用于获得包含AT_(n)-插入的遗传 修饰植物的方法，其中所述方法包括：

(i)用在与目标基因有效连接的启动子元件内携带AT_(n)插入 的表达盒稳定转化植物细胞；

(ii)将稳定转化的植物细胞于植物细胞生长条件下培养；

(iii)再生稳定遗传修饰的植物。

结果表明，通过借助基因工程工具将AT_(n)重复碱基插入启动 子区内，特定基因的表达水平在某些限度内可被人工上调(上游) 或下调(下游)。

附图简述

图1显示抗性亲本样品PI595099、易感亲本BRS 133以及抗 性群体的个体(样品_01-样品_05)和易感群体的个体(样品_06-样品 _10)中微卫星标记物SOYHSP 176扩增的琼脂糖凝胶。箭头表示由 易感亲本中标记物的扩增产生的带，其在易感群体中也出现。

图2显示Gmhsp17.6-L基因的序列，获自GenBank(登记号： M11317)。下划线的引物pSoyHspPstI_F和pSoyHspBamHI_R限定 了启动子区的扩增片段。虚线框内为AT_(n)插入，阴影框内为编码 区的起始(ATG)和终止(TAA)密码子。

图3显示Gmhsp17.6-L基因(GenBank登记号：M11317)的 序列。阴影框内为限定编码区的起始(ATG)和终止(TAA)密码子， 虚线框内突出启动子区内的AT_(n)插入，而加下划线的是设计用于 基因的完整测序的引物pSoyHsp_F和SoyHSP Cl_R。

图4显示用引物pSoyHSP_AleI_F和pSoyHSP_NcoI_R对 Gmhsp17.6-L基因启动子区的扩增，引物设计基于获自GenBank 的基因(登记号：M11317)的完整序列。梯度100pb和500pb。

图5显示用引物pSoyHSP_PstI_F和pSoyHSP_Cl_R对完整 的Gmhsp17.6-L基因的扩增，引物设计基于获自GenBank的基因 (登记号：M11317)的完整序列。梯100pb和500pb。

图6显示由用限定启动子区的pSoyHSP_PstI_F和 pSoyHSPBamHI_R引物组对以下个体的扩增产生的Gmhsp17.6-L 基因启动子区序列的比对：抗性亲本个体PI595099、易感亲本 BRS133、易感群体的个体256-S、259-S和266-S以及抗性群体的 个体JF7002、JF7027和JF7056。引物设计基于Gmhsp17.6-L基因 (GenBank登记号：M11317)的完整序列。虚线框内为AT_(n)插入。框 内是可能的TATA盒。带白色字母的黑框内是一种热休克元件 (HSE)共有序列5′AGAAnnTTCT3′。带白色字母的阴影框内是另一 类HSE的另一种共有序列5′cTTCtaGAAgcTTCtaGAAg3′，其核心 是5′CTnGAAnnTTCnAG3′。

图7显示以下研究材料中Gmhsp17.6-L基因启动子区终点和 编码区起点之间存在的基因序列与获自GenBank的基因(登记号： M11317)序列的比对：易感亲本(BRS133)和抗性亲本(PI595099)， 以及易感群体的个体256-S、259-S和266-S和抗性群体的个体 JF7002、JF7027和JF7056。阴影框内的核苷酸突出编码区转录起 始位点的ATG密码子。

图8显示来自所有以下研究材料的Gmhsp17.6-L基因编码序 列与获自GenBank的基因(登记号：M11317)序列的比对：易感亲 本BRS133和抗性亲本PI595099，易感群体的个体256-S、259-S 和266-S以及抗性群体的个体JF7002、JF7027和JF7056。阴影框 内的核苷酸突出限定编码区的ATG起始密码子和TAA热转录密 码子。

图9显示来自所有以下研究材料的Gmhsp17.6-L基因编码区 编码的氨基酸序列与获自GenBank的基因(登记号：M11317)序列 的比对：易感亲本BRS133和抗性亲本PI595099，易感群体的个 体256-S、259-S和266-S以及抗性群体的个体JF7002、JF7027和 JF7056。

图10显示用构建自Gmhsp17.6-L基因(GenBank登记号： M11317)片段的探针(326bp)进行的核糖核酸酶保护试验，该试验利 用对爪哇根结线虫(M.javanica)有抗性和易感的样品。上方数字对 应于所用样品：未用爪哇根结线虫卵接种处理(1和3)和爪哇根结 线虫接种处理(2和4)的易感亲本(BRS133)和抗性亲本(PI595099)， 试剂盒的阳性对照(5-箭头所示)、RNA酶消化的探针对照(6)和未 用RNA酶消化的探针对照(7)。

图11显示在用孢囊线虫爪哇根结线虫接种和未接种的处理中 抗性(PI595099)和易感(BRS133)亲本Gmhsp17.6-L基因的相对定量 测定。数据通过用引物SoyHSP PSC F和SoyHSP PSC R进行的实 时PCR得到，引物通过Primer ExpressSoftware v20程序利用获 自GenBank的基因(登记号：M11317)完整序列设计。定量测定利用 2^-ΔΔCt法进行。基因rRNA 18S用作标准化分子并将未接种样品作 为标准。在三个独立运行中，利用SYBR方法将样品扩增三个重 复。

图12显示在用孢囊线虫爪哇根结线虫接种和未接种的处理中 易感群体的个体256-S、259-S和266-S以及抗性群体的个体 JF7002、JF7027和JF7056的Gmhsp17.6-L基因的相对定量测定(x)。 数据通过用引物SoyHSP PSC F和SoyHSP PSC R进行的实时PCR 得到，引物通过Primer ExpressSoftware v20程序利用获自 GenBank的基因(登记号：M11317)完整序列设计。定量分析利用2^-ΔΔCt法进行。基因rRNA 18S用作标准化分子并将未接种256-S样 品作为标准。在三个独立运行中，利用SYBR方法将样品扩增三 个重复。

图13显示质粒pAGl的示意模型，说明编码β-葡糖醛酸酶的 Gus报告基因、Ahas基因和act2启动子。还示出限制性酶切图谱。

图14显示由以下研究材料获得的所有表达盒构建体中 Gmhsp17.6-L基因启动子区经PCR的扩增：BRS133、PI595099、 256-S、259-S和266-S以及JF7002、JF7027和JF7056。反应利用 引物pSoyHSPPstI_F和pSoyHSPBamHI_R进行，其扩增363pb的 片段并随后通过在1.0％琼脂糖凝胶中电泳分离。BRS133和JF7056 样品的扩增反应物在PCR期间蒸发了。

图15显示由以下研究材料获得的所有表达盒构建体的存在于 pAG1质粒中部分Ahas基因经PCR的扩增：BRS 133、PI595099、 256-S、259-S、266-S、JF7002、JF7027和JF7056。反应利用引物 Ahas1_F和Ahas2_R进行，其扩增654pb的片段并随后通过在1.0％ 琼脂糖凝胶中电泳分离。

图16显示由以下研究材料获得的所有表达盒构建体的存在于 pAG1质粒中的末端Nos区经PCR的扩增：BRS133、PI595099、 256-S、259-S、266-S、JF7002、JF7027和JF7056。反应利用引物 Nos1_F和Nos3_R进行，其扩增约200pb的片段并随后通过在 1.0％琼脂糖凝胶中电泳分离。

图17显示说明转化了不同表达盒的对孢囊线虫易感的大豆栽 培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚所接受的非生物和生物胁迫 的测试板(test plaque)结构的示意模型。CN-阴性对照，未转化的 胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1的胚；S-用来自易感亲本 的启动子区构建的表达盒pAG1/启动子GmHSP_BRS133转化的 胚；R-用来自抗性群体的个体的启动子区构建的表达盒pAG1/启 动子GmHSP_JF7027转化的胚。

图18显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚用表达盒 pAG1/启动子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过 生物弹道学方法(biobalistics)转化，并在25℃温度下接受热胁迫， 时间为2小时、4小时和24小时。蓝点表示阳性反应。CN-阴性 对照，未转化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1的胚；S- 易感的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的胚；R-有 抗性的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的胚。

图19显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚用表达盒 pAG1/启动子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过 生物弹道学方法转化，并在35℃温度下接受热胁迫，时间为2小 时、4小时和24小时。蓝点表示阳性反应。CN-阴性对照，未转 化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1的胚；S-易感的，转 化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的胚；R-有抗性的，转 化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的胚。

图20显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚用表达盒 pAG1/启动子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过 生物弹道学方法转化，并在45℃温度下接受热胁迫，时间为2小 时、4小时和24小时。蓝点表示阳性反应。CN-阴性对照，未转 化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1的胚；S-易感的，转 化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的胚；R-有抗性的，转 化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的胚。

图21显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚用表达盒 pAG1/启动子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过 生物弹道学方法转化，并在冰箱中于4℃温度下接受热胁迫，时 间为2小时、4小时和24小时。蓝点表示阳性反应。CN-阴性对 照，未转化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1的胚；S-易 感的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的胚；R-有抗 性的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的胚。

图22显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚用表达盒 pAG1/启动子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过 生物弹道学方法转化，并在15℃温度下接受热胁迫，时间为2小 时、4小时和24小时。蓝点表示阳性反应。CN-阴性对照，未转 化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1的胚；S-易感的，转 化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的胚；R-有抗性的，转 化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的胚。

图23显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚用表达盒 pAG1/启动子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过 生物弹道学方法转化，并接受200mM、400mM浓度的NaCl的 盐胁迫，时间为24小时。蓝点表示阳性反应。CN-阴性对照，未 转化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1的胚；S-易感的， 转化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的胚；R-有抗性的， 转化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的胚。

图24显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado(混杂的)的胚用表达盒 pAG1/启动子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过 生物弹道学方法转化，并接受干旱胁迫，将胚在温室中保持在37℃ 下的滤纸上，时间为2小时、4小时和6小时。蓝点表示阳性反应。 CN-阴性对照，未转化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1 的胚；S-易感的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的 胚；R-有抗性的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的 胚。

图25显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种BRS133的胚用表达盒pAG1/启动子 Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过生物弹道学方 法转化，并接受生物胁迫，接种2000-3000J₂/mL。将样品保持与 病原体接触24小时、48小时和72小时的时间。蓝点表示阳性反 应。CN-阴性对照，未转化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒pAG1 的胚；S-易感的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表达盒的 胚；R-有抗性的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表达盒的 胚。

图26显示如下进行的组织化学测试：将对孢囊线虫爪哇根结 线虫易感的大豆栽培种Pintado(混杂的)的胚用表达盒pAG1/启动 子Gmhsp_BRS133和pAG1/启动子Gmhsp_JF7027通过生物弹道学 方法转化，并接受生物胁迫，接种2000-3000J₂/mL。将样品保持 与病原体接触24小时、48小时和72小时的时间。蓝点表示阳性 反应。CN-阴性对照，未转化的胚；CP-阳性对照，转化了质粒 pAG1的胚；S-易感的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_BRS133表 达盒的胚；R-有抗性的，转化了pAG1/启动子Gmhsp_JF7027表 达盒的胚。

发明详述

本发明涉及启动子元件中的AT_(n)插入在控制植物编码序列的 表达水平中的用途。对群体中抗性个体和易感个体中热休克蛋白 (Gmhsp17.6-L)的表达水平作对比，注意到按照定量PCR的最大表 达水平存在于启动子区中含最大AT插入的个体。构建包含与GUS 蛋白融合、具有不同数目AT插入的基因启动子区的基因表达盒， 用于转化大豆胚。本发明的实验结果表明，通过借助基因工程工 具将AT_(n)重复碱基插入启动子区内，特定基因的表达水平在某些 限度内被人工上调(上游)或下调(下游)。因此，本发明开发的技术 允许控制基因的表达水平，前提是将AT_(n)重复插入序列插入启动 子区序列中的特定位点中。

基于此前试图鉴定用于辅助选择线虫爪哇根结线虫 (Meloidogyne javanaica)抗性的大豆基因型的分子标记物的研究，F 结合群中的微卫星标记物SOYHSP 176表现出对受试群体的高显 著性，解释了根中孢囊的特征数目、43％的表型变异和描述比例 70％变异的记录。有必要指出，由该标记物扩增的片段仅存在于易 感个体中，而不存在于抗性个体中。

将该标记物测序并在检索与基因库中存放的其它核酸序列的 相似性后，该序列显示出与存放于GenBank(登记号：M11317)中、 存在于大豆中的低分子量热休克蛋白(Gmhsp17.6-L)的启动子区的 高度同源性。利用可获自GenBank的该基因的完整序列，设计新 的引物对，以试图扩增两种基因型的片段。

该策略是成功的并且从易感个体和抗性个体中均得到片段。 将所有所得片段克隆并测序，也显示出与Gmhsp17.6-L基因的相 同启动子区的同源性。然而，序列比对显示，当与易感植株对比 时，抗性植株在基因的启动子区内有更大的以AT_(n)重复为特征的 微卫星插入。因此，当与获自GenBank的Gmhsp17.6-L基因序列 比较时，源自抗性亲本PI595099的片段呈现15和13个AT额外 重复。另一方面，源自易感亲本BRS 133的片段比获自GenBank 的序列少6个AT重复。这些结果在来自该杂交育种的群体的抗性 个体和易感个体(也经测序)中重复。

比对还表明，所有扩增的片段对微卫星标记物SOYHSP 176 的引物具有序列互补性。在将其证实后，于是问题产生：尽管微 卫星引物的退火区可能存在，但是为何扩增不在最初的抗性植物 中发生？一种可能性是，抗性个体中较大数目的AT重复可形成某 种三级结构(例如发夹)，导致引物在扩增DNA聚合酶的过程中难 以退火，因此抑制了这些植物中扩增子的形成。

据信，在该基因的启动子区内插入微卫星将在易感植物中使 其失活，因为在这些个体中仅扩增了标记物SOYHSP 176。然而， 研究表明所有样品显示出微卫星的插入，或许正是启动子区内AT 重复的数目可干扰大豆对线虫的应答。基因启动子区内重复序列 较多或较少的插入的存在可使由该启动子控制的蛋白失活、活化， 乃至改变其表达水平。

根据文献，在热休克蛋白的基因表达控制区中重复的这些AT- 元件的主要功能之一是有利于RNA聚合酶进入转录起始位点，并 且还排除组蛋白以有助于负责诱导转录的热激因子(HSF)的结合。 根据文献，热休克蛋白在细胞内作为分子伴侣起作用，以建立新 生多肽链并辅助其正确折叠、重建蛋白和/或变性的膜和还在信号 转导中起重要作用。

因此，使用核糖核酸酶保护试验来检验该假说：在爪哇根结 线虫感染的抗性个体和易感个体中Gmhsp17.6-L基因的启动子区 内的插入长度改变Gmhsp17.6-L蛋白的表达水平。结果显示所有 个体(抗性的或易感的，不论接种或不接种线虫的处理)，均表达蛋 白。根据AT序列在基因调节中的生物学功能和个体之间在启动子 内重复数目上存在的差异，相信核糖核酸酶保护试验将揭示 Gmhsp17.6-L基因在不同个体中的表达差异，然而结果显示在理论 上该基因响应线虫感染的表达没有差异，至少在所用技术可检测 的水平上没有差异。

在证实这些结果的尝试中，利用定量测定基因表达水平更为 精确和准确的技术实时PCR(RT-PCR)设计了新的研究。用线虫接 种BRS 133(易感)和PI595099(抗性)亲本以及源自该杂交育种的易 感群体的三个个体(256-S、259-S和266-S)以及抗性群体的三个个 体(JF7002、JF7027和JF7056)。将接种和未接种爪哇根结线虫处理 的根收集提取用于总cDNA合成的RNA，其随后在RT-PCR反应中 用于相关定量测定。

结果显示，抗性亲本个体PI595099以及抗性群体的个体 JF7002、JF7027和JF7056均在用孢囊线虫爪哇根结线虫 (Meloidogyne javanica)接种的处理中均表现出Gmhsp17.6-L基因的 较高表达。通过测序，群体中的这些个体相同之处在于，基因启 动子区内存在的较高的AT_(n)插入。我们的假说是，当被线虫感染 时，植物产生一些与抗性植物的Gmhsp17.6-L基因启动子的富含 AT区相互作用以激活其转录的因子，其在细胞内具有分子伴侣的 功能。在对因子例如AT区的相互作用敏感的植物中，其不以如此 强烈的方式发生，即Gmhsp17.6-L蛋白的表达水平在对线虫敏感 的植物中较低。

通过本发明的技术，可以调节在启动子区的特定位点含有不 同大小的AT插入的不同基因的表达水平。还可以开发与启动子区 中存在的AT插入的大小成比例地过量表达或低表达基因的GM植 物。

实施例

生物材料

利用大豆基因型即分别对瘿线虫(gall nematode)爪哇根结线虫 有抗性和易感的亲本PI595099和BRS133开发构建体。从该杂交 中，在F4代中，从易感群体选出个体256-S、259-S和266-S以及 从抗性群体选出个体JF7002、JF7027和JF7056，并用于研究。

对线虫易感的栽培种Pintado也用于大豆胚的转化步骤，该转 化通过粒子轰击并利用构建自不同样品并在Gmhsp17.6-L基因 (GenBank登记号：M11317)的启动子区中包含不同AT_(n)插入的表 达盒进行。

实施例1：启动子和完整基因的分离和表征

利用对利用微卫星标记物SOYHSP 176引物扩增的易感材料 的片段首先测序获得的Gmhsp17.6-L基因完整序列，设计新的引 物组以便在被分析的所有基因型中得到带，假定最初仅易感基因 型扩增微卫星标记物SOYHSP 176(图1)。

在Gmhsp17.6-L基因的启动子区的起始位置合成引物 (pSoyHsp_AleI F 5′CAC CGC GGT G GAA TTC TGA AAT TGG  GTC TTT TTG3′；pSoyHsp_NcoI R 5′CCA TGG AAT GGG GAC  ACT CGA GGT ATT3′)，并加入限制性酶切位点用于将来的克隆。 图2表明了可获自GenBank的Gmhsp17.6-L基因序列中的引物退 火位点。

设计更多新的引物组(pSoyHSP_PstI_F 5′GGG CTG CAG GAA  TTC TGA AAT TGG GTC TTT TTG3′；SoyHSPCL_R 5′CCC CCC  GGG TTA ACC AGA GAT TTC TAT AGC CT3′)，以便扩增整个基 因(从启动子的起始位点至编码区的终止密码子)，并随后检验对瘿 线虫爪哇根结线虫易感和有抗性的基因型之间除启动子区的AT_(n)插 入之外的基因序列的其它差异的存在情况。图3表明获自GenBank 的Gmhsp17.6-L基因序列中的引物退火位点，设计用于扩增完整 基因和对其测序。

从全部分析样品提取种子的基因组DNA。用刀片将来自各分 析样品的约50mg种子切成的薄切片，收集到1.5mL微量管中， 并加入300μL提取缓冲液。将材料磨碎并加入另外的700μL提取 缓冲液。按照下表所示的方案制备提取缓冲液：

表1：制备基因组DNA提取缓冲液所用试剂：

用涡旋将溶液匀化30秒-1分钟，并在室温下16.000x g离心 4分钟。将上清液转移至新的1.5mL管中，进行与之前条件相同 的新的离心步骤，并再次将上清液转移至新的1.5mL管中。

为除去蛋白，将0.1mg蛋白酶K和0.01mM CaCl₂加入样品 中并将其在37℃水浴中孵育90分钟。加入900μL冷的异丙醇并 在孵育2分钟后进行7分钟的16.000x g离心。弃掉上清液并将沉 淀干燥90分钟。将沉淀重悬于含40μg/μL的RNA酶A的300μL TE缓冲液(Tris-HCl 1M pH 8.0，EDTA 0.5M pH 8.0)中，并将样品 再次在37℃水浴中孵育90分钟以除去RNA。接着，进行新的沉 淀步骤，最后将DNA沉淀重悬于300μL TE缓冲液中，使用分光 光度法定量测定并在0.8％琼脂糖凝胶中验证其质量和完整性。

使用Perkin Elmer 9600循环变温器进行PCR反应以扩增所有 抗性和易感样品的启动子区和完整基因序列，反应组成为：30ng 模板DNA、10x反应缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl 和400μL超纯水)、1.5mM MgCl₂、1.3mM dNTP、1U Taq DNA 聚合酶和各5μM的F引物和R引物，用超纯水将终体积补齐至 10μL。

用于扩增DNA样品的热循环程序由以下步骤组成：94℃下7 分钟的起始变性步骤，接着是在94℃下变性1分钟、在60℃下 退火1分钟和在72℃下延伸2分钟的30个循环。最后进行72℃7 分钟的循环。在1％琼脂糖凝胶中分离扩增产物，凝胶制备利用1x TBE缓冲液(108g Tris碱、55g硼酸、40mL EDTA 0.5M pH 8.0， 并用蒸馏水将终体积补齐至1L)，并用溴化乙锭(10mg/mL)染色。 利用Kodak Digital DC 290 System获得图像。

依照生产商的说明书用PureLink^TM Quick Gel Extraction (Invitrogen)试剂盒对扩增片段(图4和图5)进行凝胶提取。将纯化 的DNA储存于-20℃。之后，将DNA定量并用TOPOTA克隆试 剂盒(Invitrogen)进行片段和质粒载体之间的连接反应。连接反应组 成如下：2μL超纯水；1μL Salt Solution(7μL Salt Solution：21μL 超纯水的稀释液)；1μL TOPO载体和2μL(约10ng)的纯化带。 将样品在室温下孵育5分钟。

所得载体用于大肠杆菌(DH10 B菌株)细胞通过电穿孔的转 化。制备电感受态细胞，通过平板划线从甘油储存液中得到分离 的克隆。接着，将单菌落在37℃、200rpm(预接种)的条件下于10 mL LB培养基-Luria Bertani(1L蒸馏水含20g胰蛋白胨、酵母提取 物和NaOH的混合物)中培养过夜。将5mL预接种物加入500mL 的LB培养基中，于37℃、300rpm旋转条件下直至OD₆₀₀达到 0.5-0.7。该时期后，将细胞于冰上孵育20分钟并以无菌方式转移 至用冰预冷的250mL离心管中。在4℃下进行15分钟的4.278x g离心步骤，弃掉上清液并将沉淀重悬于500mL冷的10％甘油中。 在相同条件下进行新的离心步骤，弃掉上清液并将沉淀重悬于250 mL冷的10％甘油中。再次进行离心步骤并将沉淀重悬于20mL冷 的10％甘油中。将溶液转移至50mL无菌管中并在4℃、3997x g 下离心15分钟。作为最后的步骤，将沉淀重悬于1-2mL冷的10％ 甘油中。将电感受态细胞分装于500μL微量管中并储存于-80度 的冰箱中。

利用设定在2.5kV、25μF的MicroPulser(BioRad)电穿孔仪和 设定在200或400欧姆的脉冲控制器进行电穿孔。使用2μL连接 反应物和100μL电感受态细胞。细胞的拯救通过将细菌悬液在 37℃孵育的15mL无菌Falcon管中的1mL SOC培养基(0.5g酵 母提取物、2g胰蛋白胨、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl₂、 10mM MgSO₄、20mM葡萄糖和96mL蒸馏水)中于200rpm下培 养1h实现细胞的复苏。该时期后，将300μL电穿孔细胞铺板至补 充有氨苄青霉素(100μg/30mL)、含IPTG/X-Gal(每个平板50μl 的0.1M IPTG(异丙基-β-硫代吡喃型半乳糖苷)和10μL的50 mg/mL X-Gal(溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷))的固体LB培养基 上。将平板在37℃下孵育过夜用于菌落生长。重组克隆的选择用 lac Z系统进行，其中重组菌落呈现白色而非重组菌落为蓝色，这 是由于lac Z基因产物和底物(X-Gal)之间反应的所得产物。

接下来，为了证实克隆和片段的大小，质粒DNA的提取通过 在96-孔微孔板中接种单个白色菌落进行，微量培养板中含1mL  CG培养基-Circle Grow(含4g市售混合物的100mL水)和100 μL/mL的氨苄青霉素(对于50mL CG培养基100mg/mL即50μL 氨苄青霉素)。将平板密封并将材料在37℃、320rpm下孵育22小 时。

在进行质粒提取前，获得已生长细菌的永久培养物，其在无 菌平板中含生长过夜的75μL CG培养基和75μL 50％无菌甘油。 将该培养物储存于-80℃的超低温冰箱中作为贮备。

进行小量制备，将微量培养板在10℃下1.310x g离心6分钟 以得到细胞的沉淀。将上清液弃掉并将平板快速倒置于吸水纸上。 之后，将200μL GET(20％葡萄糖、0.5M EDTA pH 8.0、1M  Tris-HCl pH 7.4并用水补齐至500mL)加至各孔中，将平板密封并 用涡旋振荡2分钟以重悬细胞。在10℃、1.310x g下进行9分钟 新的离心，将上清液弃掉并将平板倒置于吸水纸上干燥。

将含RNA酶A(10mg/mL)的65μLGET加入微量培养板的各 孔中。使用涡旋将所有物质重悬并转移至带有“U”形底部的平板。 接着向各孔中加入65μL NaOH 0.2N/SDS 1％(0.5mL NaOH 4M+ 1mL SDS 10％+超纯水补齐至10mL的体积)。该溶液在其即将被 使用的步骤开始前制备。将平板密封；通过颠倒5-10次混合材料 并在室温下孵育10分钟。进行快速离心数秒直至没有溶液留在粘 性封膜上。

向各孔中加入60μL储存于4℃的3M醋酸钾(KOAc)，将平 板密封，通过颠倒10次混合物质并在冰上孵育10分钟。在4℃ 下进行15分钟、1.310x g的离心步骤，将80μL上清液转移至事 先固定在“V”底的聚丙烯微量培养板顶部的Millipore(MAGV N22)平板中。将平板在4℃、1.310x g下离心5分钟，或者直至总 体积转移至平板底部(V底)。将Millipore平板移走并弃掉，将80 μL异丙醇加入已转移至“V”底平板的滤液。

将“V”底平板使用抗乙醇粘合剂密封并通过颠倒混合材料。在 4℃下进行45分钟、1.310x g的离心步骤，通过倒置平板将上清 液弃掉并将150μL冷的70％乙醇加入各样品中。将平板在4℃下 1.310x g再次离心5分钟，在弃掉上清液后，将平板倒置于吸水 纸上并简单地在4℃下82x g甩下。将平板在室温下用纸巾覆盖 干燥60分钟，最后将DNA重悬于30μL超纯水中。将平板密封 并室温孵育过夜以完全洗脱质粒DNA。该时期后，将含质粒DNA 的平板储存于-20℃的冰箱中。

在制备用于测序前，利用限制性内切酶对样品进行消化反应， 以便证实插入的存在及其大小。消化反应组成如下：1.5μL React 3 酶缓冲液；0.5μL EcoRI(10U/μL)；5μL质粒DNA(约10ng)和8 μL超纯水，并在37℃下孵育2小时。该时期之后，将等分反应 产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

片段通过ABI Prism 3100(Applied Biosystems)毛细管测序仪， 用ABI Prism BigDyeterminator cycle sequencing(Applied  Biosystems)试剂盒在DNA双链的两个方向上测序，在不同反应和 不同测序实验中利用M13R和F引物。测序反应如下进行：将各 样品的1.5μL DNA和按照下表所述方案制备的8.5μL反应混合物 置于平板上。

表2：制备用于测序反应的反应混合物所用试剂

用Applied Biosystem循环变温器在以下条件下进行测序反应： 96℃2分钟；96℃15秒、50℃15秒和60℃4分钟的30个循环。 最后，向各个样品加入80μL 75％异丙醇进行用于DNA沉淀的反 应，然后在室温避光条件下孵育15分钟，和1.310x g下45分钟 的离心步骤。

将上清液弃掉并将沉淀用100μL 70％乙醇洗涤，随后是1.310 x g下15分钟的离心步骤。将上清液弃掉并在室温避光条件下干 燥沉淀。对于测序仪的样品应用，将沉淀重悬于10μL hi-甲酰胺 中，然后将样品在95℃的循环变温器上孵育5分钟，以使DNA 变性。将平板立即转移至冰上以避免DNA复性并在接下来将其放 入测序仪。在启动子区和整个基因区的测序后，进行生物序列的 序列数据库检索以证实所得片段和已知DNA序列和蛋白序列的相 似性(图6)。为了实现此目的，使用BLASTn和BLASTx程序(Altschul 等(1997)，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。也利用合适的软件 例如Vector NTI Advanced 10.0.1(Invitrogen Corp.)、BioEdit  Sequence Alignment Editor和Clustal W进行核苷酸序列(图7和图 8)和氨基酸序列(图9)的比对。

实施例2：基因表达的控制研究-RPA

选择亲本基因型PI595099(有抗性的)和BRS133(易感的)用于 RPA实验。根据大豆中存在的热休克蛋白基因Gmhsp17.6-L (GenBank登记号：M11317)的完整序列，设计用于编码区的引物 组(RPA2_F 5′GAC ATC ATC AAA CAA GAG AA3′和RPA2_R  5′TCT CTC CGC TAA TCT GAA3′)。

按照前述各项中已详细说明的方案，从分析的亲本样品提取 种子DNA，通过PCR进行扩增片段，克隆和测序PCR产生的产 物。

从大豆根提取亲本PI595099(有抗性的)和BRS 133(易感的)的 总RNA，大豆根接受两种不同处理：接种或不接种爪哇根结线虫线 虫卵。提取用Trizol Reagent(Life Technologies)试剂盒进行。将根 在液氮中用研钵和研杵研磨并转移至储存于通风橱中、含20mL Trizol的高压灭菌falcon管中。在匀化后，将样品在室温(15-30℃) 下孵育5分钟。每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，在剧烈振荡15 秒后，将溶液在室温下再孵育另外的3分钟。接着是在4℃下 12.240x g离心15分钟的步骤。将含RNA的液相转移至新的falcon 管中并按每1mL最初使用的Trizol使用0.5mL的异丙醇进行沉 淀。将溶液在室温(15-30℃)下孵育10分钟。新的离心步骤在4℃， 12.240x g下进行10分钟。管底形成的沉淀含已沉淀的RNA。将 全部上清液弃掉并将RNA沉淀用75％乙醇(每1mL Trizol用1mL 乙醇)洗涤。将溶液在4℃，4.285x g下离心5分钟，并再次将全 部上清液(乙醇)弃掉。将400μL DEPC水加入沉淀中以将其溶解 (视需要，可升温至50-60℃以便溶解沉淀)。在提取后，总RNA 通过分光光度法定量；在2％琼脂糖凝胶中证实其完整性，最后将 其储存于-80℃的超低温冰箱中。

最初，将含目标片段的质粒线性化。使用循环变温器在37℃ 下孵育含有30.6μL DEPC水、4μL缓冲液、1μg纯化质粒、0.4 μL BSA和1μL的限制性内切酶ApaI的反应物2小时。在该时期 后，将质粒用1体积的苯酚纯化、用涡旋混合2分钟，并在4℃、 11.750x g下进行10分钟的离心步骤。随后，收集水相并加入醋 酸铵(NH₄OAc)至终浓度为0.5M。加入3倍体积的冷的95％乙醇 并将溶液在-20℃下孵育1小时。在4℃、11.750x g下进行15分 钟新的离心步骤并小心地将上清液弃掉。打开管子；将沉淀干燥5 分钟，并随后重悬于30μL DEPC水中并储存于-20℃的冰箱中。

获得探针

用于获得探针的转录反应利用MAXIScript^TM In Vitro  Transcription(Ambion Inc.)试剂盒进行。使用RNA聚合酶T7和P³²- 标记的磷酸双脱氧核苷酸(CTP)。开始，将所有的试剂盒试剂融化 并保持于冰上，除必须储存于室温的Transcripton buffer之外。按 照下表所述方案在室温的1.5mL微量管中进行总终体积20μL的 转录反应。

表3：放射性探针的转录反应中所用试剂

接着，将所有试剂在微量管中轻轻混合，并使用循环变温器 将反应在37℃下孵育1小时。加入2U无RNA酶的DNase I并将 反应在37℃下孵育15分钟。将1体积的凝胶上样缓冲液(95％甲 酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯腈蓝、0.5mM EDTA、0.025 SDS)加入反应中，将管在85-95℃加热3-5分钟，并将全部样品上 样到5％聚丙烯酰胺凝胶、尿素8M、1X TBE缓冲液上。

制备终体积为25mL的凝胶，使用12.01g尿素、接着是3.12 mL的40％丙烯酰胺∶双丙烯酰胺(19∶1)和2.5mL的10X TBE。还 加入少量水，避免超过凝胶的终体积。为了溶解尿素，将溶液保 持于带加热器的磁力搅拌系统中并在冷却后，转移至量筒中并用 DEPC水将凝胶的终体积补齐。然后加入12.5μL TEMED并最后 加入156.2μL 10％过硫酸铵。

将该溶液立即加至玻璃板上并放置孔梳，使其聚合而不移动 板。可进行这些物质的预处理，即用RNase AWAY(Invitrogen-Life  Technologies)洗涤和处理玻璃板和电泳槽。可在通风橱下将1-3mL  Repel加到小板上使板干燥5-10分钟。该处理促进电泳后凝胶的移 除。

在电泳进行前，将板清洗以清除多余的尿素，并在移除孔梳 后借助注射器用电泳缓冲液洗涤孔。用槽的指示电压对凝胶进行 20-30分钟预电泳，并接着上样。根据探针的大小以200-300伏特 进行约2小时的电泳。

仅对全长探针进行凝胶纯化。为此，在电泳后将板打开，用 塑料胶片覆盖凝胶，并将标记以指导条带位置鉴定的放射自显影 胶片曝光约1小时。接着将胶片在暗室中显影：将其浸于显影液 中5分钟，移出多余液体并将其浸于水中约3分钟以洗涤并最后 在固定液中5分钟。然后将胶片在水中洗涤并风干。进行胶片与 凝胶的比对以便定位全长转录物的位置。移出凝胶的目标区域并 转移至含350mL洗脱缓冲液(0.5M醋酸铵、1mM EDTA、2％SDS) 的微量管中。将含探针的管在4℃孵育过夜以最大化储存于20℃ 的探针的回收，直至杂交时间。用于标记探针的试剂盒提供用于 监测其质量的阳性对照。

从对照DNA(含250bp的大鼠β肌动蛋白基因插入的线性化 pTRIPLEscript质粒)合成探针并与也提供于该试剂盒中的大鼠肝 总RNA杂交。两个仅含酵母总RNA的对照管用于检验RNA酶酶 作用。这样，酶阳性对照管含RNA酶和缓冲液，而阴性对照管仅 含无酶的缓冲液。

样品杂交和消化

利用HySpeedTM RPA-Hygh-Speed Hybridization Ribonuclease  Protection Assay(Ambion Inc.)试剂盒进行核糖核酸酶保护试验 (RPA)。对于各微量管，将标记的探针加入(约100-800pg的250nt 或1-10fmol或2-8x10 4cpm具有高比活)至总RNA(20mg)中。还 向样品中加入30mg的酵母总RNA以得到终浓度为50mg/样品。 得到含10mL的酵母总RNA(50mg)两个其它的酶对照管和一个 含大鼠肝总RNA的管作为探针阳性对照。为了将探针+样品共沉 淀，加入0.5M NH₄Oac和3倍体积冷的95％乙醇并在匀化后将管 在-20℃下孵育15分钟。在4℃下最高转速(最低8.160x g)进行5 分钟的离心步骤。将上清液移除并将沉淀干燥。将10mL HySpeed  Hybridization buffer(在95℃预热)加入各样品中并将管立即在 95℃下(水浴或循环变温器)孵育。为了溶解沉淀，将样品涡旋数 秒并回到95℃。当沉淀完全溶解时，将管在95℃下孵育3分钟并 在68℃下孵育10分钟。温度必须保持在68℃并且转移步骤必须 低于30秒。最开始，融化HySpeed RNase digestion buffer，为各 样品制备100mL适当体积的RNA酶A/T1和缓冲液的混合物 (1∶100的稀释液：含1mL RNA酶的99mL缓冲液)并储存于室温 下。将100mL的RNA酶A/T1+缓冲液混合物加入各样品中，对 于仅含酵母总RNA的对照管，将不含酶的100mL HySpeed RNase  digestion缓冲液加入一个管中，并将含酶的完全混合物加入另一 个对照管中。将样品涡旋并在37℃下孵育30分钟用于消化。将 150mL的HybSpeed inactivation/precipitation buffer加入简单涡 旋的样品中，并将管在-20℃的冰箱中孵育15分钟。消化后，将 样品在4℃下以最高转速离心15分钟，将上清液移除并将沉淀重 悬于通常体积为9-10mL的凝胶上样缓冲液中。在用移液管匀化 后，将管在90-95℃下加热3-4分钟，并快速转移至冰上以避免复 性。将样品上样到稀释于1X TBE缓冲液中的5％聚丙烯酰胺凝胶、 8M尿素，并在200-300伏特下进行电泳约2小时，以使受保护的 片段分离。在电泳后，进行前述方案中详细说明的胶片曝光和显 影的标准步骤(图10)。

实施例3：基因表达的研究-RT-PCR-温室中的实验设置

为利用RT-PCR技术进行基因Gmhsp17.6-L启动子的表达研 究，将PI595099、BRS133、256-S、259-S、266-S、JF7002、JF7027 和JF7056材料的种子放置于生长室的萌发纸上，并在八天后将幼 苗转移至塑料容器中。在温室中，用感染发育期J2的爪哇根结线 虫幼虫感染这些幼苗。使用的线虫群体来自Centro Nacional de  Pesquisa de Soja(Embrapa Soja)，并在Doko栽培种的大豆植物上 繁殖。通过使用捣碎机在0.5％的次氯酸盐溶液中研磨材料来从根 提取线虫卵。将根在水中洗涤并用排除尺寸500的微筛收集虫卵。 之后，将游离的虫卵悬浮液转移至设定在26℃的孵化箱中，每24 小时收集幼虫(J2)并储存于冰箱中。将幼虫J2在Peters Chamber 中定量。在移液管的协助下，每株植物接种664只J2/mL，并在感 染后的第1、3和6天，对于接种和未接种(对照处理)幼虫的植物， 批量收集八种研究材料中每种三株大豆植物的根并转移至液氮 中。将根储存于-80℃的超低温冰箱中，直至开始RNA提取实验。

RT-qPCR引物设计

在Primer Express 2.0(Applied Biosystems)程序的协助下，使 用Gmhsp 17.6-L基因(GenBank登记号：M11317)的序列位置终止 密码子(TAA-核苷酸884位)设计用于实时PCR的引物 (SoyHspPSC_F 5′GCT GTG TGT CAT TGT CAT CGA A3′； SoyHspPSC_R 5′CAC GGT CTA TTT CTT GCC TAC ATC3′)。这些 引物用于扩增约80bp的片段。应用于Primer Express程序设计引 物的选择参数为：50bp-150bp的扩增子长度(推荐120bp用于 RT-PCR)、CG含量为40％-60％、最多4个串联G碱基、引物Tm(解 链温度)在58-60℃之间、F引物和R引物的Tm之间的最大差异在 1摄氏度，并且应避免多至4个相同碱基的串联。之后，为了分析 引物二聚体的形成，使用OMIGA程序观察3′端最小6个游离bp 的存在情况。

获得总RNA用于cDNA合成

为了进行实时PCR实验，用Trizol试剂(Invitrogen-Life  Technologies)提取总RNA。最初将每个样品1mL的Trizol分装于 Falcon管中并在55℃下加热。将样品植物组织在液氮中匀化并按 0.1g分装于保持在氮中的管中。之后，将1mL加热的Trizol加入 样品中，将其涡旋1分钟，并快速甩下并在55℃下孵育2分钟， 随后在冰上孵育1.5小时。将样品在4℃下16.000x g离心20分钟， 将上清液转移至含有200μL氯仿的管中并将残留物弃掉。将样品 振荡并在室温(22-25℃)下孵育2分钟，然后是在4℃下16.000x g 离心30分钟的步骤。将上清液转移至新的管中并向其加入1/3体 积的8M LiCl。在振荡后将管在-80℃的冰箱中孵育1小时。为了 使溶液解冻，将管在40℃的水浴中保持1-3分钟，并在4℃下 16.000x g离心30分钟。将上清液移除并弃掉，避免干扰含RNA 的沉淀。向各样品中加入400μL的75％乙醇并轻轻颠倒管。在4℃ 下进行5分钟的16.000x g离心步骤并将上清液移除并完全弃掉。 将100μL的超纯水加入沉淀中，并通过轻弹管使沉淀溶解(在沉淀 未快速溶解的情况下，可加入额外的100μL超纯水，但下一步应 将醋酸钠和异丙醇的体积加倍)。接下来，加入10μL醋酸钠(3M) 和100μL异丙醇并将管轻轻颠倒。将样品在-80℃下孵育30分钟 并转移至37℃的水浴中1-3分钟，并在4℃下进行16.000x g离 心15分钟。将上清液移走，加入400μL的70％乙醇，并将管再 次在4℃下进行16.000x g离心15分钟。将上清液移除并弃掉， 并将沉淀在工作台上干燥10分钟。最后，加入50μL超纯水(或 100μL，若沉淀未快速溶解)，并在37℃下将沉淀和溶液加热10 分钟以促进沉淀的溶解。将RNA定量并储存于-80℃的冰箱中。 对于逆转录反应，将RNA稀释并利用逆转录酶(Moloney Murine  Leukemia Virus-M-MLV)进行cDNA合成。这样，将1.5mg的总 RNA分装于微量管中，加入DEPC水至终体积为9mL，将6mM 的随机引物加入反应，随后在80℃孵育3分钟。该时期后，将管 在冰上冷却并将14mL的混合物加入样品中。按照下表所述方案 制备混合物。

表4：用于cDNA合成的混合物制备中所用试剂

用循环变温器在37℃下孵育反应1小时，随后是在65℃下 10分钟的步骤。将cDNA储存于-20℃。

RT-qPCR

按照生产商说明书利用循环变温器7300 Real Time System (Applied Biosystem)和利用PlatinumSYBERGreen qPCR  SuperMix UDG(Invitrogen-Life Technologies)试剂盒进行PCR反 应。如Applied Biosystems推荐的，针对靶基因Gmhsp17.6-L和用 于样品标准化的内源对照基因rRNA 18S(GenBank登记号： X02623.1)的引物组完成扩增效率曲线。在实验平板上放置两种基 因的三份样品。曲线提供斜率，用于计算引物的扩增效率，其对 两种基因必须是相似的并接近100％(值1)。用于相对定量的扩增 反应使用一批三天收集的各分析样品的cDNA进行。在独立的实 验中进行亲本样品的两个实时PCR实验和群体样品的两个实时 PCR实验。对亲本品系BRS133和PI595099和六个所得个体(易感 群体256-S、259-S和266-S和抗性群体JF7002、JF7027和JF7056) 进行线虫接种处理和未接种处理的分析。进行反应三次，反应组 成为：8.0μL的超纯水、0.5μL ROX、12.5μL SYBERGreen qPCR  SuperMix UDG和2μL的批量cDNA(约1.5μg)。扩增反应的循环 参数为：50℃2分钟；95℃2分钟，随后45个循环的95℃15秒、 60℃30秒和72℃30秒，在延伸步骤(72℃)收集数据。在结束相对 定量后，为了证实引物二聚体形成、非特异性扩增以及可能的错 误和污染，完成解离曲线。RT-PCR生成数据的解释使用 SDS-Sequence Detection Systems(Applied Biosystems)软件进行。

在这些分析中，对于线虫接种和非接种的处理，分别进行相 对基因表达(RQ)的计算，分别对比样品，利用非接种样品作为标 准品(值1)。RQ值利用ΔCt法计算。这样，基因表达(RQ)的水平 通过将各个处理的靶样品的Ct减去内源对照Ct，得到ΔCt。从对 照样品的ΔCt中减去该值(标准品-值1)，得到ΔΔCt值。RQ通过 式子2-ΔΔCt得到，其中2等于在100％效率曲线所得靶基因效率 (100％＝1)和内源对照效率(100％＝1)之和(Livak和Schmittgen(2001)， Methods 25：402-408)。靶基因和内源基因的效率必须接近100％， 但这并非必需的，它们可稍低，但它们必需接近。在这种情况下， 式2-ΔΔCt中的值2替换为靶基因和内源基因的效率之和。对于 亲本品系BRS133和PI595099在用瘿线虫爪哇根结线虫接种和不接 种处理中的分析(图11)，非接种样品PI595099用作标准品(值IX)， 并且对于易感群体(256-S、259-S和266-S)和抗性个体(JF7002、 JF2027和JF7056)的分析(图12)，非接种易感样品256-S用作标准 样品。选择该材料是因为，在对Gmhsp17.6-L基因启动子区的测 序中，其呈现出较小数目的AT_(n)插入。

实施例4：在Gmhsp17.6-L基因的启动子区中含不同大小的 AT(n)插入的表达盒构建体

一旦证实在抗性个体在Gmhsp17.6-L基因的启动子区存在较 高数目的AT(n)插入，且其在进行RT-PCR时表现出高水平的该基 因表达，那么当接种瘿线虫爪哇根结线虫时，决定构建在 Gmhsp17.6-L基因的启动子区中含不同数目的AT插入的表达盒。 使用这些构建体的目的是，观察这些含AT(n)插入的启动子是否能 够诱导其它基因的表达，并评价那些基因的应答、它们在不同胁 迫下是否激活。利用粒子轰击将盒用于转化线虫易感栽培种 BRS133和Pintado的大豆胚。在获得的构建体中，使Gmhsp17.6-L 基因启动子位于Gus基因之前，在胚接受不同胁迫后，通过组织 化学测定检测其表达。

得到含八种分析样品BRS133、PI595099、256-S、259-S和266- S、JF7002、JF7027和JF7056的启动子区的表达盒，总共96个盒 (每种材料12个)。然而，仅两个构建体用于下一步研究：含易感 亲本BRS133的扩增启动子区、含有较少数目的AT插入(AT(9)) 的盒pAG1/启动子Gmhsp_BRS133，和含来自抗体群体的个体 JF7027的扩增的启动子区、带有AT(32)的盒pAG1/启动子 Gmhsp_JF7027。选择质粒pAG1用作构建表达盒的模板。设计策 略移除质粒中存在的肌动蛋白基因的act2启动子并插入扩增的待 分析材料的启动子，待分析材料是易感亲本品系BRS133和抗性群 体的个体JF7027。该质粒还存在编码β-葡糖醛酸酶的报告基因 Gus，如果利用这些盒的转化过程成功的话，则β-葡糖醛酸酶允许 通过组织化学测定在转基因胚中的可视化。质粒pAG1还包含编码 拟南芥的酶乙酰乳酸丙酮酸酯裂解酶(AHAS)-乙酰乳酸合酶(ALS) 的als/ahas基因的启动子(ahas 5)、编码序列(ahas)和终止子(ahas t)， 该基因由于第653位的突变而赋予对除草剂咪唑啉酮的抗性，除 草剂Imazapyr(2-[4，5-dihydr-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧代-1H-咪 唑-2-基]-3-吡啶甲酸)属于该类(Tu等(2004)，Weed control methods  handbook；London：Academic)。这样，在转化后，该基因使得能够 在含除草剂的培养基中选择阳性小植株。图13呈现了质粒图谱。 为了开发该策略，使用Wizard Plus Maxipreps DNA Purification  System(Promega)试剂盒进行质粒DNA的提取。这样，将单菌落 接种于含抗生素氨苄青霉素(0.5mg)的2-5mL LB培养基中并在 37℃、200rpm摇转下孵育8小时(预接种物)。将1mL预接种物 转移至500mL的LB/氨苄青霉素培养基中，并将其在37℃、200 rpm摇转下孵育12-20小时。将细胞分装于250mL管中并在室温 下5.000x g离心10分钟，将上清液弃掉并将沉淀完全重悬于15 mL的Cell Ressuspension Solution(50mM Tris-HCl pH 7.5、10mM 的EDTA、100μg/mL RNA酶A)中。加入15mL的Cell Lysis  Solution(0,2M NaOH、1％SDS)，通过颠倒混合并将溶液在室温下 孵育20分钟。接着，加入15mL的Neutralization Solution(1.32M 醋酸钾，pH 4.8)，通过颠倒混合溶液，导致白色絮片的形成和裂 解液粘度下降。沉淀物质含有基因组DNA、蛋白、细胞碎片和SDS。 在室温下进行15分钟14.000x g离心步骤，并将上清液过滤到含 Whatman 1滤纸的量筒中。测量体积并转移至50mL的离心管中， 并在室温下加入0.5体积的异丙醇，通过颠倒混合。在室温下进行 14.000x g、15分钟的新的离心步骤，将上清液弃掉并将沉淀重悬 于2mL的TE缓冲液中。向含DNA的溶液中加入10mL的Wizard  Maxipreps DNA Purification Resin，并将树脂+DNA的混合物转移 至与真空泵连接的Maxicolumn。应用真空，加入25mL的Column  Wash Solution(80mM醋酸钾、8.3mM Tris-HCl pH 7.5、40μM  EDTA、55％乙醇)，并再次应用真空。将5mL的80％乙醇上样于 Maxicolumn，应用真空，并在所有体积的乙醇通过柱后，将真空 保持另外的1分钟。然后将Maxicolumn转移至50mL falcon管中， 并在1.300x g下离心5分钟。应用真空另外的5分钟以便干燥树 脂。最后将Maxicolumn转移至试剂盒提供的管中，并将65-70℃ 的1.5mL预热的水加入柱中。在通过1分钟之后，在室温下进行 1.300x g、5分钟的离心步骤以洗脱DNA。在提取后，将质粒DNA 定量并在1％琼脂糖凝胶中验证其完整性。对于act2启动子的切 除(约1000bp)，进行两种限制性内切酶的消化。在第一步，pAG1 接受酶PstI和NotI的双消化。该消化导致约5.500bp(对应于 als/ahas基因的启动子-ahas 5、编码序列-ahas和终止子-ahas t)和 6.500bp(对应于Gus基因、act2启动子和质粒骨架Ori和Nos)的 两个片段。消化反应组成如下：10μL质粒DNA(约1.5μg)、2μL  React 2缓冲液、5.0μL PstI酶(10U/μL)和3μL的超纯水。使用循 环变温器在37℃下将管孵育2小时。该时期后，将另外的2μL PstI 酶(10U/μL)加入溶液中并使用循环变温器将其在37℃下孵育2小 时。在同一微量管中，通过加入3.5μL NotI酶(10U/μL)、1.5μL React 2缓冲液和2μL NaCl 1M进行使用NotI的反应。随后在37 下再孵育2小时，在该时期后，加入额外的2μL的NotI酶。使用 循环变温器将反应在37℃下保持过夜。将pAG1消化片段在0.8％ 琼脂糖凝胶中分离，依照前项中所述方案利用PureLinkTM Quick  Gel Extraction(Invitrogen)试剂盒提取凝胶。在消化的第二步中， 将较大的6.500bp片段用限制性内切酶BamHI消化，以切除act2 启动子。反应组成如下：0.5μL BamHI酶、15μL React 3缓冲液、 12μL DNA消化片段和1μL超纯水。使用循环变温器将微量管在 37℃下孵育2小时。在该时期后，加入另外的0.5μL BamHI酶， 并将反应在37℃下再次孵育过夜。在0.8％琼脂糖凝胶中分离各片 段，并依照生产商说明书使用PureLinkTM Quick Gel Extraction (Invitrogen)试剂盒凝胶纯化较大的片段(对应于Gus基因、质粒骨 架Ori和Nos)。为了得到包含亲本品系BRS133和抗性个体JF7027 的不同扩增的启动子的表达盒构建体，通过混合11μL的超纯水、 2μL(约10ng)Ahas片段、1μL(约10ng)的Gus片段、1μL(约 10ng)各试样的Gmhsp17.6-L启动子的纯化条带、4μL的连接酶缓 冲液和1μL的T4连接酶，进行连接反应。反应在14℃下孵育过 夜。利用引物pSoyHspPstI_F(5′GGG CTG CAG GAA TTC TGA  AAT TGG GTC TTT TTG3′)和pSoyHspBamHI_R(5′CCC GGA  TCC AAT GGG GAC ACT CGA GGT ATT3′)从基因组DNA扩增两 个选择样品的启动子区片段。在引物中设计并合成的限制性位点 允许在act2启动子之前所处相同位置以正确方向克隆 Gmhsp17.6-L基因的启动子。依照前述方案，利用盒的连接反应电 穿孔DH10B株大肠杆菌细胞，并在37℃下在LB培养基中生长过 夜。从所得菌落，利用特异性引物进行一系列PCR扩增并使用限 制性内切酶进行消化反应，以便证实构建体克隆成功。在该用于 证明成功获得表达盒的步骤后，利用所有得到的样品进行利用以 下特异引物的PCR反应：Gmhsp 17.6-L基因启动子区的特异性引 物，Ahas基因的特异性引物(654bp)(Ahas1_F 5′ACT AGA GAT  TCC AGC GTC AC3′；Ahas2_R 5′GTG GCT ATA CAG ATA CCT  GG3′)和pAG1质粒的Nos终止子的特异性引物(Nos1_F 5′GAA  TCC TGT TGC CGG TCT TG3′；Nos3_R 5′TTA TCC TAG TTT  GCG CGC TA3′)。图14、15和16分别显示各种所得表达盒的12 个样品中Gmhsp17.6-L基因启动子区、Ahas基因的部分和Nos区 的部分的扩增。

实施例5：瞬时表达或GUS(β-葡糖醛酸酶)活性的研究 通过粒子轰击得到转基因植物

为了得到转化了表达盒pAG1/启动子GmHSP_BRS133和 pAG1/启动子GmHSP_JF7027的转基因植物，首先依据前述方案 进行质粒DNA的提取。该步骤产生大量的质粒DNA，足以用于 通过生物弹道学方法、基因枪法或粒子轰击进行的转化方法。在 该方法中，将遗传物质引入植物利用微粒进行，微粒通常由金或 钨制成、具有0.4-2.0mm直径并包被有外源DNA。用目标DNA 分子包被颗粒，并由于在高压下氦气放电导致的冲击波将其加速 高速射出。当它们击中靶细胞或靶组织时，穿透细胞壁和细胞质 膜而不破坏它们(Klein等(1987)，Nature 327：70-73)，外源DNA必 须通过细胞液的作用与微粒分离开，并被整合至植物基因组中。 在体外培养并再生后，这些转基因的组织或细胞将产生遗传修饰 植物(Brasileiro和(2001)，Plant Biotechnol J.3(3)：113-121； Rech等(2008)，Nat Protoc 3：410-418)。

种子净化

使用均对瘿线虫易感的栽培种BRS133和Pintado大豆种子。 在称重后，将种子在70％乙醇中净化10分钟，然后浸入1％钠(V/V) 20分钟。在层流超净台中，将种子用高压灭菌的蒸馏水洗涤三次， 并浸入两倍种子体积的水中，保持浸没状态以水合约16-18小时的 时间。

分离胚和制备支持板用于轰击

将除湿器和空调打开以降低室内湿度，从水化的种子中分离 胚。在无菌镊子和手术刀的协助下，将种子切开并将胚轴移出， 并转移至含蒸馏水的培养皿中以避免干燥。之后，在解剖显微镜 的协助下，切除叶原基，露出顶端分生组织区。将胚转移至层流 超净台中的滤纸上以移除过量的水，其可作为对颗粒的屏障降低 转化效率，颗粒将折射。对于轰击，在含MS培养基(Murashige 和Skoog Salt)，3％蔗糖和0.8％phytagel，pH 5.7的小培养皿中设计 16mm直径的中心圆周(死区)，使用无菌镊子在死区外产生沟。在 解剖显微镜的协助下将胚放置于平板的沟中，使顶端分生组织区 朝上。将载膜支持体和支持圆筒用火消毒，将四个破裂膜组分离 并保持浸于异丙醇中直至使用。在其支持体中装配载膜。

钨微粒的灭菌和洗涤

在微量离心管中，称取60mg M 10钨微粒，其是足够约100 次射击的材料。向微粒加入10mL 70％乙醇；将溶液剧烈匀化并 以足以保持该运动的速度在搅拌器上保持15分钟。进行15.000g、 5分钟的离心步骤，为避免干扰微粒沉积，在微量移液管的协助下 将上清液移出并弃掉。将1mL的无菌蒸馏水加入管中，使用振荡 器将混合物剧烈匀化并在15.000g再次离心5分钟。将上清液弃 掉并将洗涤步骤重复两次。在最后洗涤并弃掉上清液后，将微粒 重悬于1mL 50％甘油(V/V)中。

钨微粒的DNA包被

在1.5mL微量离心管中分装50μL的微粒悬浮液，并进行15 分钟的超声处理以匀化，通过这种方式避免了微粒的聚团并且能 够使沉淀均一。在微量移液管的协助下将等同于最小6μg的DNA 加入已温和匀化的悬浮液中。将50μL的CaCl₂(2.5M)加入溶液中 并在温和匀化后，加入20μL亚精胺。在再次匀化后，在室温下将 溶液在合适的管振荡器中温和旋转条件下孵育10分钟。将管以最 大转速向下甩10秒，将上清液小心地移除并弃掉，以避免微粒重 悬。加入150μL的100％乙醇；将溶液剧烈匀化并再以最大速度(旋 转)离心10秒。将上清液移除并再次重复洗涤步骤。在弃掉上清液 后，在最后一次洗涤中，将24μL 100％乙醇加入样品中，剧烈匀 化。最后，将3.2μL等份悬浮液应用于事先置于膜支持体上的各 载膜的中心区域。每次沉淀足以制备6个含包被有DNA的微粒的 载膜。在微粒应用后，将膜立即储存于含硅胶的板上并保持在隔 分室(dissecting chamber)中，这是由于包被了DNA的微粒暴露于 超过50％的相对空气湿度的条件下能够使其聚团，导致外源基因 表达频率降低。

基因枪和轰击实验的应用

依照由等(Crop.Sci.42：1298-1302(2002))开发的方案 几乎无改动地，将射击靶向均对瘿线虫易感的栽培种BR133和 Pintado的大豆种子胚的分生组织区。在轰击前，将层流超净台用 70％的乙醇清洁，并用紫外线消毒15分钟。将停留屏障(retention  screen)、含胚的培养皿、一套4个并浸于异丙醇中的破裂膜以及含 外源DNA的载膜保持接近操作人员。打开氦气罐的阀门，将压强 设置在1.200psi。之后，将破裂膜组(300psi/膜)放置于高压氦气室 的远端，将密封螺丝旋紧并将高压室倒置以适合真空室。放置待 轰击的含材料的板，并在支持圆筒上还放置含DNA包被微粒的停 留屏障和载膜支持体。小心地放置支持圆筒并关闭真空室。缓慢 打开阀门使室内成真空，直到压强达到27pol/Hg，此时关闭阀门。 打开阀门使氦气进入高压室，当破裂膜由于氦气的存在呈现出弯 曲时，通过按下触发器进行射击。在射击后，关闭该阀门，而打 开从高压室释放氦气的阀门。之后，将释放真空的阀门缓慢打开， 并将含轰击的胚的板从仪器中移出。在各次轰击时，重复这些步 骤。在各次轰击后，将大部分胚转移至不同平板并接受非生物胁 迫和生物胁迫。然而，将某些胚转移至含补充BAP 5mg/mL(苯偶 酰氨基嘌呤(benzilaminopurine))、3％蔗糖、0.6％琼脂和pH 5.7的 MS培养基的板中，并在其中在28℃下避光保持约18小时，以诱 导再生。

转基因胚的选择

转基因细胞和非转基因组胞的区分可通过在植物基因组中引 入单独或在同一转化载体中与目标基因连接选择基因，该选择基 因表达具有酶活性的蛋白。依照作用模式，标记基因可归类为赋 予抗生素抗性的基因、赋予除草剂抗性的基因和带阳性选择的标 记基因(Brasileiro和Dusi(1999)，载于：TORRES，A.C；CALDAS， L.S.；BUSO，J.A.主编Cultura de tecidos.andgenética de Plantas.Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH，1999. 第679-735页第2版)。ahas基因属于赋予除草剂抗性的那类基因。 该基因编码乙酰羟酸合酶(AHAS)的修饰形式，该酶也称作乙酰乳 酸合酶(ALS)。序列第653位的突变导致丝氨酸被天冬酰胺取代， 得到不被咪唑啉酮类除草剂识别的修饰酶。在基于选择分子系统 易位至分生组织区和内源AHAS酶失活的过程中，在除草剂 Imazapyr的存在下选择转化有该基因的分生细胞。由于选择药物 位于顶端分生组织，所以非转基因细胞死亡，而有利于将发育成 植株的转基因细胞的存活(和Brasileiro(2002)，J.P.Physio， 14(1))。这样，在再生后，将一些胚转移至含有选择培养基MS、 3％蔗糖、0.15μM Imazapyr除草剂、0.8％琼脂和B5维生素、pH 5.7 的塑料杯中，并使其在生长室上生长约45天，生长条件：28℃， 16小时光照时间，光强度在50μmol m-2s-1和大于80％的相对湿 度。然后将新生小植株转移至含高压灭菌并用pH 6.6的营养溶液 润湿的沙∶蛭石(1∶1)的塑料杯中。随后，将杯用塑料袋盖住以驯 化，并视需要用营养溶液灌溉，在生长箱上生长另外的28-30天。 在该驯化期后，移去塑料袋使植株能够正常发育，直至可以收集 样品，以通过PCR技术利用特异性引物进行分子分析和鉴定阳性 植株。

利用转基因胚接受不同胁迫的实验

使来自均对瘿线虫易感的大豆栽培种BRS133和Pintado并用 包含扩增自亲本易感品系BRS133(S-pAG1/启动子 GmHSP_BRS133)和抗性群体的个体JF7027(R-pAG1/启动子 GmHSP_JF7027)的Gmhsp17.6-L基因启动子区的不同表达盒转化 的胚接受生物胁迫(在该例中接种爪哇根结线虫的J2幼虫)和非生 物胁迫(例如热、冷、盐度和脱水(干旱))。非转基因胚(CN-阴性对 照)和仅转化了pAG1质粒的胚(CP-阳性对照)接受相同的处理。施 加热胁迫，将胚保持在25℃(室温)、35℃和45℃(在温室中)。4 ℃(冰箱)和15℃(温室)的温度用于冷胁迫。以2小时、4小时和24 小时的时间点将这些胁迫应用到溶液中的胚。脱水(干旱)在37℃的 温室中进行，将胚保持在滤纸上2小时、4小时和6小时的时间点。 对于盐胁迫，将胚保持在浓度为200mM和400mM的NaCl中24 小时。通过将胚在含J2发育期线虫的溶液(2.000-3.000 J2每mL) 中保持24小时、48小时和72小时的时间进行生物胁迫。图17说 明如何应用胁迫。

转化了不同表达盒并接受不同胁迫的胚的组织化学测定

通过组织化学测定检测其在植物组织中的酶活性，Gus基因的 表达产物可用作选择的标记报告分子。该定量方法是基于：通过 b-葡糖醛酸糖苷酶在氧存在下切割5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-葡糖苷 酸(X-gluc)底物生成导致不溶性蓝色沉淀的二聚体。该方法有助于 组织特异性、启动子分离、转基因植物鉴定和转移条件优化相关 的基因表达调节研究(Brasileiro(1998)，载于：Brasileiro，A.C.M.； Carneiro，V.T.C.(编者)-Manual degenética de  plantas.Embrapa-SPI/Embrapa-Cenargen，1998，第143- 154页；等(2000)，Theor.Appl.Gen，101：1-6)。这样，转化 了不同盒的两种基因型BRS133和Pintado的胚在接受不同胁迫 后，转移至平板上并加入足够体积的X-gluc反应缓冲液以覆盖样 品。该缓冲液通过将8.5mg X-gluc稀释于85mL二甲基甲酰胺 (dimetilformamide)中来制备。加入17mL体积的磷酸盐缓冲液 (NaH₂PO₄-50mM pH 7.0)，最后加入17mL Triton X-100。将溶液 在制备后储存于冰箱中。含胚和缓冲液的板密封，并在37℃的黑 暗温室中孵育约16小时。之后移去缓冲液并加入1mL 70％乙醇以 终止反应。将样品在型号SQZ-DS4-BI(Tecnival)的解剖显微镜下 分析，并获取图像以证明结果。在接受胁迫后，组织化学测定的 结果表明，栽培种BRS133在进行试剂X-Gluc时表现出更强的应 答，因为在代表转化细胞的限制区中明显可见蓝点。该不溶的蓝 色沉淀是存在于构建盒中的Gus基因的反应产物，该基因编码与 X-Gluc底物反应的β-葡糖醛酸酶，X-Gluc底物在O2存在下形成 沉淀的二聚物。当分析来自栽培种Pintado的胚试验结果时，在大 部分胁迫下未检测到阳性蓝点。在该栽培种中，内源GUS表达较 高，导致干扰分析的完全蓝色的胚结果。大豆胚中本底内源GUS 活性在之前的研究中有报道。Hu及其同事(Plant Cell Reports，9： 1-5，1990)通过检验叶、果实部分、种子和胚中的内在GUS活性分 析了52种不同的植物种类。在该研究中，大豆在新鲜果实的成熟 胚和脱水种子的成熟胚中呈现出强的阳性染色，这是内源GUS活 性的结果。这样，通过在温室中使转基因胚接受25℃、35℃和45 ℃的温度2小时、4小时和24小时的时间来施加热胁迫。图18、 19和20分别显示两种受试栽培种的这些处理。通过在冰箱和温室 中使转基因胚接受4℃和15℃的温度2小时、4小时和24小时来 施加冷胁迫(图21和22)。对于该胁迫，在栽培种之间观察到的组 织化学反应阳性蓝点上的差异在Pintado胚中显著得多，为组成性 蓝色并且是由于内源GUS活性，之前在文献中有述(Hu等(1990)， Plant Cell Reports，9：1-5)。再次地，来自栽培种BRS133的胚表现 出对组织化学测定较好的应答，这表明该栽培种必定是要选择的 那种并且被用于后续研究步骤。盐胁迫实验通过将转基因胚保持 在水中作为对照和保持在200mM、400mM浓度的NaCl中24小 时来进行。栽培种BRS133的胚持续对测定具有阳性反应，在限制 区内出现蓝点，并且不同于之前的胁迫，栽培种Pintado并不表现 出明显的或可检测到的应答。图23显示了结果。通过将胚放置于 37℃的滤纸上并将其保持在温室中2小时、4小时和6小时的时间 来施加干旱胁迫。再次地，栽培种BRS133表现出对组织化学测定 的阳性反应，而栽培种Pintado再次表现出阴性反应，由于内源 GUS表达而无特异性蓝色染色，如图24所示。用瘿线虫爪哇根结 线虫感染期的J2幼虫感染栽培种BRS133和Pintado的胚，造成生 物胁迫。将约2000-3000只/mL的J2与转基因样品孵育并保持24 小时、48小时和72小时的时间。该结果证明栽培种BRS133(图 25)表现出组织化学测定的阳性蓝点，表明该盒表达以令人满意的 方式发生。随着时间的推移，包括对照样品在内，胚外表改变， 表现出红-褐色的颜色。这一变化在72小时后更加可见，可能是由 于线虫感染形式对胚的攻击所致，在感染时，该线虫感染形式以 在宿主植物根部中发生的相同形式注射能够进行细胞改变的激素 和物质。然而，转化有抗性表达盒pAG1/启动子Gmhsp JF7027、 称为R的胚，外观受影响较少，而在72小时接种的样品保持其白 色原始外观，这在表明，在一定程度上，含带较高数目的AT(n) 重复的来自抗性群体个体JF7027的Gmhsp17.6-L基因启动子区的 盒表现出对病原体攻击的更好应答，可能是由于伴侣分子的较高 表达水平。除了对组织化学测定为组成性蓝色-染色的阴性应答外， 来自Pintado的胚在通过接种J2线虫接受生物胁迫时也表现出颜 色改变的应答，从48小时开始更明显，特别是在72小时。图26 显示了结果。

从在接受生物和非生物胁迫后栽培种BRS133和Pintado的所 示结果可得出结论：组织化学测定检测到标记基因Gus的存在， 然而，也观察到高的内源活性，特别是在栽培种Pintado中，表明 不同材料表现出对转化过程的不同应答。

值得提及的是，仅作为转化证据考虑Gus表达，其不足以作 为将Gus基因整合至植物基因组中的确切证据(Potrykus(1990)， Physiologia Plantarum 79：129-134)。任何外源DNA序列整合的确 切证据是通过通过分子生物学技术进行的利用特异性探针的基因 组DNA染交来提供。