荧光磁性双功能树状分子微球及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学、分析化学、纳米材料科学、合成化学技术领域， 具体涉及一种荧光磁性双功能树状分子微球及其制备方法。

背景技术

随着医学技术的进步，对生物材料的要求的提高，具有分离功能的纳米 磁性材料和优异荧光标记功能的量子点是研究较多的两类材料。

纳米磁性材料因具有良好的生物活性、超顺磁性和表面易功能化等特点 而十分引人注意，它可结合各种功能分子如酶、抗体、细胞、DNA或RNA 等，在磁场的作用下进行采集和分离。因而在靶向药物、酶的固定化、免疫 测定、细胞的分离与分类等领域有广泛的应用。

量子点(quantumdots，又称半导体纳米晶体)，它是由II-VI族和III-V 族元素组成的无机纳米颗粒，其尺度约为2～10纳米，由于量子尺寸效应和 介电限域效应使它们表现具有独特的光致发光性能。量子点的发射光强是常 规有机荧光染料的20倍，稳定性比常规的有机荧光染料强100倍以上，且 可以经受多次激发，实现一元激发多元发射，进行不同靶向目标的多色标记。 这些鲜明的特性和独特的应用功能使量子点广泛应用于免疫分析，基因分 析，药物筛选，活体及细胞荧光成像等领域。

标记和分离已经成为现代生物医学工程领域中的重要工作，如果标记和 分离的工作能一步完成，必将极大地推动生物科学技术的发展。本发明因此 而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种荧光磁性双功能树状分子微球，由在磁性纳米 粒子表面修饰树状大分子，通过大分子末端的功能氨基连接巯基乙酸修饰后 的荧光纳米材料量子点，得到既有优异荧光性能又能通过磁场来分离的双功 能的树状分子微球。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种荧光磁性双功能树状分子微球，其特征在于所述微球具有以下组 成：

磁性纳米粒子，其球形表面经修饰形成具有作为连接荧光量子点的氨基 为末端的树状大分子；

荧光量子点，其粒径在2～10nm，表面修饰带有羧基基团；

所述磁性纳米粒子与荧光量子点通过树状大分子末端的氨基与荧光量 子点的羧基连接。

优选的，所述荧光磁性双功能树状分子微球的粒径在20～100nm范围内。

优选的，所述的荧光磁性双功能树状分子微球为规则或不规则的球形、 方形以及椭圆形的颗粒。

优选的，所述荧光量子点选自纳米级的CdTe、CdSe、InP、InAs、 CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/ZnS、CdHgTe/ZnS、HgTe/HgCdS 量子点。

优选的，所述荧光量子点的粒径在2～10nm范围内。

优选的，所述磁性纳米粒子为超顺磁、顺磁或铁磁性的金属、金属合金 或金属氧化物纳米粒子。

优选的，所述磁性纳米粒子选自Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃、MeFe₂O₃、NiCoFe、 FeCo和NiFe的纳米磁性粒子，其中Me为Co、Mn、Ni。

本发明还提供了一种荧光磁性双功能树状分子微球的制备方法，其特征 在于所述方法包括以下步骤：

(1)制备磁性纳米粒子；

(2)磁性纳米粒子浸泡于四甲基氢氧化氨(TMAOH)溶液中，使其表 面充分修饰上羟基，然后再与3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应，得到 氨基为末端的零代磁性微粒；

(3)零代磁性微粒依次反复经丙烯酸酯类、乙二胺修饰连接后形成带氨 基末端的衍生代磁性微粒；

(4)制备荧光量子点，控制粒径在2～10nm范围内，并用巯基乙酸修饰， 使其表面带有羧基基团；

(5)使零代磁性微粒和/或衍生代磁性微粒连接上带羧基的荧光量子点， 得到荧光磁性双功能树状分子微球。

优选的，所述方法步骤(3)中丙烯酸酯类选自丙烯酸甲酯、丙烯酸丁 酯，采用的溶剂选用甲醇。

优选的，所述修饰后的荧光量子点为水溶性的，与表面修饰后的磁性纳 米粒子连接所用体系为水相。

衍生代磁性微粒可以是一代磁性微粒、二代磁性微粒甚至更多代磁性微 粒。每代磁性微粒末端都带氨基，都可以与带羧基基团的荧光量子点连接形 成本发明的荧光磁性双功能树状分子微球。

作为典型的，磁性纳米粒子选用Fe₃O₄，与四甲基氢氧化氨(TMAOH) 反应在磁性纳米粒子形成丰富的羟基，然后与3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)反应，得到末端带有氨基的零代磁性微粒；将零代磁性微粒溶于 甲醇溶液中，加入丙烯酸丁酯反应，提纯后加入乙二胺反应，得到一代磁性 微粒；将一代磁性微粒提纯后再溶于甲醇溶液中，再加丙烯酸丁酯反应，提 纯后加入乙二胺，继续反应，得到二代磁性微粒。

本发明将磁性纳米粒子和量子点结合形成磁性荧光微球，使一次完成对 体内生物分子的选择、采集和分析等的过程成为可能，广泛应用于免疫检测、 靶向治疗、细胞分离等领域，展现了其在生物、化学、医学等交叉科学领域 良好的应用前景。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明提供了一种荧光磁性双功能树状分子微球及其制备方法，首次在 磁性纳米粒子表面修饰上树状大分子，通过末端带有丰富功能氨基的树状大 分子经吸附、键合与大量的荧光纳米材料量子点连接，得到了具有荧光磁性 双功能的纳米微球。本发明的荧光磁性双功能树状分子微球物既保留了量子 点优异的荧光特性，又具有磁性粒子的超顺磁性，通过简单的外加磁场即可 进行采集和分离。这种双功能荧光磁性微粒可应用于免疫检测、荧光追踪、 磁性分离等领域。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为制备零代、一代、二代磁性微粒的合成原理图；

图2为零代磁性微粒和量子点连接的合成原理图；

图3为二代荧光磁性双功能树状分子微球的分子结构图；

图4为量子点和三代荧光磁性双功能树状分子微球的透射电镜照片；其 中a为巯基乙酸修饰的CdSe/CdS QDs；b为G0F-零代荧光磁性双功能树状 分子微球；c为G1F-一代荧光磁性双功能树状分子微球；d、e均为G2F- 二代荧光磁性双功能树状分子微球；

图5为量子点和三代荧光磁性双功能树状分子微球的荧光光谱；其中a 为CdSe/CdS QDs；b为G0F-零代荧光磁性双功能树状分子微球；c为G1F- 一代荧光磁性双功能树状分子微球；d为G2F-二代荧光磁性双功能树状分 子微球；

图6为室温下由振动样品磁强计得到的磁化率曲线；其中a为Fe₃O₄； b为G0F-零代荧光磁性双功能树状分子微球；c为G1F-一代荧光磁性双功 能树状分子微球；d为G2F-二代荧光磁性双功能树状分子微球。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是 用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以 根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的 条件。

实施例1Fe₃O₄/CdSe/CdS荧光磁性双功能树状分子微球的制备

如图1所示，Fe₃O₄/CdSe/CdS荧光磁性双功能树状分子微球的制备步 骤如下：

1、制备荧光量子点，控制粒径为2～10nm。

硒化镉外包裹硫化镉(CdSe/CdS)的合成及修饰，具体制备方法如下：

通过文献方法(Diao，X.L.；Xia，Y.S.；Zhang，T.L.；Li，Y.； Zhu，C.Q.J.Anal.Bioanal.Chem.2007，388，1191)，采用油相合成CdSe 量子点。将20mmol的CdO，9.6mL油酸和40mL的液体石蜡依次加入三 颈瓶中加热搅拌，在150℃时候CdO溶解生成均匀的淡黄色的Cd溶液。 将1mmol Se粉与50mL液体石蜡加入另一个三口烧瓶中快速搅拌，加热到 240℃，溶液先淡黄色变成橘红色然后变成红色。将大约5mL的Cd溶液 (含有约2mmol Cd)轻轻地注射到Se溶液中，同时快速搅拌得到红色的 CdSe。当注射完后温度下降到210℃，最后维持在220℃。同时称取0.0352 g的S粉，0.1157g NaBH₄固体和30mL的无水乙醇混合均匀，加热搅拌。 将生成的H₂S气体通入CdSe溶液中，继续加热搅拌0.5h后即生成核壳 CdSe/CdS QDs。

取1mL上述量子点于小烧杯中，加入30mL正己烷，置于磁力搅拌器 上搅拌，至CdSe/CdS全部溶解。将溶液用高速离心机进行离心分离，留取 上层清液。取过量的巯基乙酸加入清液中，继续搅拌30min。静置得到红色 巯基乙酸稳定的CdSe/CdS沉淀，移去上清，并用正己烷洗涤2～3次。将沉 淀风干后溶于乙醇溶液，即得到水溶性的红色透明CdSe/CdS溶液。

2、制备磁性纳米粒子。

用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子，具体方法如下：

通过文献方法(Hong，R.-Y.；Wang，J.；Li，J.-H.；Li，H.-Z.Chin. J.Process Eng.2004，4，472)。分别配制浓度为0.5mol/L的FeCl₃和FeSO₄溶液，按Fe³⁺与Fe²⁺物质的量比约为1.75∶1将两种盐溶液混合均匀倒入三 口瓶，边搅拌边通氮气，同时滴加氢氧化钠水溶液(1mol/L)，调节pH值为 11，至黑色胶状物质生产，继续反应30min后停止.将产品静置一周，在 80℃熟化30min后，用无水乙醇和去离子水交替洗涤至中性，即得到Fe₃O₄纳米颗粒.

3、磁性纳米颗粒修饰上树状大分子

如图1所示，将Fe₃O₄纳米颗粒沉入TMAOH(7％)水溶液中静置两小 时，然后水洗2次乙醇洗2次。将其溶于150mL乙醇/水(体积比1∶1)溶 液，加入一定量的APTES，超声20min使颗粒分散均匀。将溶液室温搅拌 反应7h，使磁性纳米表面带上了功能性的氨基。最后利用磁性将其分离出 来。水洗2次，乙醇洗3次，风干。即获得零代磁性微粒(G0)。

(StepA)将零代磁性微粒(G0)溶于100mL甲醇溶液中，加入1mL的 丙烯酸甲酯(或丙烯酸丁酯)，密封下超声分散30min后在室温下反应48h； (StepB)磁场中分离提纯后加入100mL甲醇和2mL乙二胺，密封下超声分 散30min后在室温下反应48h，磁场中分离提纯获得一代磁性微粒(G1)。

重复上述步骤，用双倍量的丙烯酸丁酯和无水乙二胺，得到二代磁性微 粒(G2)。将G0、G1、G2分别分散中乙醇中备用。

4、三代荧光磁性树状分子微球(G0F、G1F和G2F)的合成

如图2所示，取15μL的G0磁性微粒放入小瓶，以乙醇为溶剂，在超 声中分散30min，然后加入过量的巯基乙酸修饰的CdSe/CdS量子点。将混 合溶液放入恒温摇床反应20h，磁场分离提纯，得到零代荧光磁性的树状分 子微球(G0F)。G1F和G2F的合成与G0F的合成相似。

实施例2Fe₃O₄/CdTe荧光磁性双功能树状分子微球的制备

具体步骤大致类似实施例1，所用的量子点为巯基乙酸修饰后的CdTe。 具体的制备方法步骤如下：

1、Te前体的制备

分别取80mg Te粉、50mg NaBH₄加入到小瓶中，封闭瓶口，用针筒 注入1mL蒸馏水。用生胶带密封瓶口，然后在瓶塞上插入一个针头使反应 产生的H₂排出去。将小瓶在0℃反应8h，可以观察到黑色Te粉消失，上 层为无色NaHTe溶液，下层为Na₂B₄O₇白色沉淀。

2、Cd前体的制备

取0.2854g(1.25×10^-3mo1)CdCl₂·2.5H₂O溶于100mL蒸馏水加入三 口烧瓶中，快速搅拌下加入219μL巯基乙酸(TGA)。混合均匀后用1mol/L NaOH调节调节溶液PH值至8-11。用N₂将溶液在密闭体系中脱氧30min。

3、CdTe量子点的制备

在适当的搅拌速度下，向溶液中加入新制备的无氧NaHTe溶液，将反 应液加热到96℃，冷凝回流。各反应物的摩尔比为Cd²⁺∶NaHTe∶TGA＝1 ∶2.4∶0.5。反应120min后停止加热。将得到的产品冷却，然后加入无水 乙醇使量子点絮凝出来，过滤，将固体溶于水即得到纯净的CdTe QDs。

实施例3Fe₃O₄/ZnO荧光磁性双功能树状分子微球的制备

具体其他步骤大致类似实施例1，不同的是本实施例所用的量子点为巯 基乙酸修饰后的ZnO量子点。

ZnO量子点具体的制备方法步骤如下：

(1)ZnO量子点的制备

取22g(10mmo1)ZnAc₂·2H₂O置于100mL无水乙醇中，在80℃回 流3h(冷凝管上部接有CaCl₂干燥管，防止水蒸气进入反应体系中)。回流 后的溶液为无色透明液体。用移液管量取此溶液10mL置于100mL烧杯中， 而后加入表面活性剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，使体系的质量浓度达到4g/L， 溶解，制成ZnO前驱体溶液；同时称取0.118g LiOH加入到10mL乙醇溶 液中，超声振荡10min使之加速溶解。将上述LiOH溶液逐滴加到剧烈搅 拌的前驱体溶液中，制得ZnO量子点(反应温度为50℃)。

(2)纯化和干燥

将大约20mL正己烷加入至ZnO溶胶中，静置1h。离心10min(5000 r/min)，移取上层清液，加入20mL无水乙醇溶解沉淀。反复2次。将沉淀 物于室温下真空干燥，避光下保存在干燥器中。

(3)巯基乙酸对ZnO量子点的表面修饰

移取一定量的ZnO量子点溶液，在剧烈搅拌下加入足量的巯基乙酸， 在20℃下反应10min。

实施例4本实施例采用改进的共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子，获 得荧光磁性双功能树状分子微球。

其制备过程为：将硫酸亚铁胺、氨水和水合肼按一定的比例加入到反应 器中，均匀分散后，80℃反应2小时，沉淀物经去离子水和无水乙醇反复洗 涤，真空干燥后得Fe₃O₄纳米粒。

反应过程如下所示：

反应过程中，水合肼一方面能与氧气反应，消耗体系中的氧气，起到保 护亚铁离子的作用；另一反面，水合肼也能直接沉淀出Fe₃O₄纳米粒。该方 法制备得到的Fe₃O₄纳米粒分散性好、磁性强。

其他步骤大致类似实施例1，不同的是本实施例所用的Fe₃O₄的制备为 改进共沉淀法制备。

实施例5采用不同方法制备的磁性纳米颗粒获得荧光磁性双功能树 状分子微球

具体制备方法步骤如下：

将干燥的2-吡咯烷酮加入装有10mmol乙酰丙酮铁Fe(acac)₃的三颈瓶 中，除去空气，在氩气(Ar)保护下磁力搅拌，控制反应温度245℃，沸腾回 流一定时间.停止加热，继续通氩气并冷却至室温.加入大量甲醇，得到乌 黑亮泽的磁流体，用丙酮洗涤3次，于60℃真空干燥得到产物。

其他步骤大致类似实施例1，不同的是本实施例所用的Fe₃O₄为油相制 备的磁性纳米粒子。

实施例6Fe₃O₄/CdSe/CdS荧光磁性双功能树状分子微球的性能研究

本实施例以实施例1得到的Fe₃O₄/CdSe/CdS荧光磁性双功能树状分子 微球为例研究获得的树状分子微球的一些性能。

经透射电镜、荧光光谱分析、荧光量子产率计算、磁性能测定研究了三 代荧光磁性双功能微球的发光性能与磁性能等。

如图4所示为量子点和三代荧光磁性双功能树状分子微球的透射电镜 照片，其中a为巯基乙酸修饰的CdSe/CdS QDs；b为G0F(零代荧光磁性 双功能树状分子微球)；c为G1F(一代荧光磁性双功能树状分子微球)；d、 e均为G2F(二代荧光磁性双功能树状分子微球)。用TEM对CdSe/CdS QDs 和三代复合后的荧光磁性双功能树状分子微球的表观形貌以及颗粒大小进 行分析。由图4a可见，CdSe/CdS QDs在水中的分散性较好，形状近似为 球形且平均尺寸在3nm左右。图b，c和d、e分别为三代复合后的荧光磁 性双功能树状分子微球的TEM图像，可以观察到在树状分子修饰后的Fe₃O₄表面均匀的连接了一层CdSe/CdS QDs，其平均粒径依次为15nm、34nm 和49nm。

图5为CdSe/CdS QDs和三代荧光磁性双功能树状分子微球的荧光光 谱。量子点与磁性粒子复合前后的荧光发射光谱均呈对称分布且半峰宽较 窄，当激发波长为400nm时，CdSe/Cd SQDs溶液的发射峰在569nm处， 而与三代磁性粒子连接后，其溶液的发射峰都发生了约10nm红移。

样品的荧光量子产率测定采用罗丹明B(乙醇中QY＝95％)作为标准物， 经计算得到CdSe/CdS QDs的荧光量子点产率为30.2％，而结合磁性纳米粒 子后的三代树状分子微球的荧光量子产率分别为10.1％(G0F)，24.1％ (G1F)，19.7％(G2F)。由此可见，并不是磁性微球上连接的量子点的量 愈多量子产率愈高，当量子点的量达到一定值后，荧光磁性双功能树状分子 微球的荧光量子产率反而降低，这主要与发光量子点的浓度猝灭效应有关。

用振动样品磁强计(VSM)测定了三代产品的磁性能。室温下Fe₃O₄和三代复合后的荧光磁性双功能树状分子微球的磁化曲线如图6所示。由曲 线可以看出，样品无剩磁和矫顽力，展现出了典型的超顺磁性。Fe₃O₄纳米 颗粒的饱和磁化强度为56.54emu/g，而三代荧光磁性双功能树状分子微球 的饱和磁化强度分别为15.96emu/g、8.72emu/g和1.24emu/g。其磁性能逐 渐减弱，这是由于随着Fe₃O₄表面树状分子的生长，和结合量子点相对数量 的增加，其形成的磁屏蔽作用也将增大，阻碍了磁强计对样品的检测。同时， 这些无磁性的功能性基团本身对样品的磁性也有一定的影响。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技 术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护 范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。