三维网络状壳聚糖-碳酸钙复合纳米材料及制备和细胞相容性

摘要

本发明公开了三维网络状壳聚糖-碳酸钙复合纳米材料及制备和细胞相容性。制备方法以壳聚糖为碳源，以二水氯化钙，碳酸氢铵，二次蒸馏水为原料，通过一步共电沉积的方法，在不锈钢表面得到壳聚糖-碳酸钙复合纳米材料。通过体外细胞培养，研究壳聚糖-碳酸钙复合纳米网状结构的生物兼容性。本发明不仅在于电化学沉积的方法简单可控，还有壳聚糖-碳酸钙纤维网状结构与基底结合牢固，机械性能强，生物兼容性良好，将壳聚糖-碳酸钙三维纤维网状结构做为细胞支架材料，取得了很好的实验结果。本发明工艺简单，成本低廉，对环境友好，符合作为组织工程细胞培养基质的生物材料的标准，可应用到骨修复中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种三维网络状壳聚糖与碳酸钙纳米复合材料的制备方法，特别涉及在以 不锈钢片为工作电极上构筑壳聚糖-碳酸钙纤维网状复合纳米材料的制备方法，以及该复合 材料在细胞培养方面的应用。

背景技术

严重外伤、肿瘤切除、骨感染、先天性缺陷等骨缺损现象十分常见，所导致的骨骼损 伤和骨质流失是主要的健康问题，极大地影响一个人的生存能力和生活质量。因此，制定 有效的骨再生治疗是临床上研究矿化组织的一个重要的长期的目标。骨组织的修复、脊柱 融合、人工假体置换等对骨移植材料的需求量巨大。目前骨重建手术治疗选择自体骨移植， 异体骨移植和使用生物材料。自体骨移植是目前临床治疗骨缺损较有效的方法，但来源有 限且会造成供区新的创伤，对患者造成新的生理和心理创伤；异体骨移植因异体骨本身存 在感染，传播疾病和抗原性问题等不足。而作为永久植体的各种金属、陶瓷或者其他人工 材料，多数使用效果也不尽人意。近20年来，骨的仿生制备已成为修复缺损骨骼的重要研 究方向。优异的生物矿化材料都采取有机分子调控无机相生长的策略，因此从生物分子调 控的水平上去理解骨的形成和矿化过程，并在此基础上研究骨生物材料的合成是突破和取 得发展的关键。

优良的骨组织工程支架材料在组织和器官的培养过程中起暂时性的支架作用。作为组 织工程细胞培养基质的生物材料应该具备良好的生物相容性；具有三维立体多孔结构；良 好的材料细胞-界面；具有一定的可塑性和良好的机械强度。因此，支架材料的研发是组织 工程学领域的研究热点。

壳聚糖(Chitosan简称CS)，学名是聚氨基葡萄糖，化学名为(1，4)-2-胺基-2 -脱氧-β-D-葡聚糖。由于分子内、分子间的氢键作用，使其呈紧密的晶态结构，不 溶于水和大多数有机溶剂，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸。壳聚糖分子 链段中含有大量的氨基、羟基和N-乙酰基。分子中的氨基能够提供与多种金属离子反应的 活性位点，能通过许多途径来键合金属离子，包括化学作用的螯合、静电作用的离子交换 或是形成离子对。由于壳聚糖具有无毒、良好的生物相容性、生物的可降解性、抗菌性， 以及抗微生物性等等许多独特的性能，壳聚糖已经在组织工程、药物释放、术后防粘连膜、 骨科修复材料等上有广泛的应用。但是壳聚糖吸水性强，形成的纤维或者膜材料的湿态机 械强度差，作为医用材料的应用受到了限制。提高其机械性能，对其在生物医疗领域的应 用有重要意义。

碳酸钙是天然骨的主要成分，因此在骨组织的修复和替代、组织工程药物载体以及非 病毒基因传递中被广泛地应用。但是由于其较差的可降解性和机械性能，单独使用碳酸钙 会带来一系列问题。然而基于碳酸钙的一些生物复合材料，特别是碳酸钙-聚合物复合材料 则可以克服这些缺点，因而引起了科学家的广泛关注。通过生物矿化作用可以方便地制备 此类碳酸钙-聚合物复合材料。因为碳酸钙是自然界中广泛存在的一种无机矿物质，它的晶 体易于表征，并且在生物矿化过程中适合于控制晶体的形态，从而使其成为实验室研究中 常用的模型矿物质。利用生物矿化的方式，合成壳聚糖-碳酸钙复合材料既能保持壳聚糖所 特有的生物兼容性等优异性能，而且能得到壳聚糖单纯使用时所没有的优异性能。其在细 胞培植，骨组织修复，骨细胞的三维支撑支架和种子细胞或活性生长因子的生物载体材料 方面得到广泛应用。曾有报道称在双膜扩散系统中，碳酸钙可以在壳聚糖溶胶薄膜上成核 结晶。此类矿化的机理是基于成核后，碳酸钙晶体在壳聚糖表面继续结晶生长。Takashi Kato在壳聚糖膜表面通过可溶性高分子诱导不同晶型的碳酸钙生长，同时控制碳酸钙层的 厚度，制备出层状复合薄膜。Takashi Sasaki等利用层层沉积的方式形成壳聚糖-碳酸钙 核壳结构。Linghao He等将制备好的壳聚糖薄膜浸入CaCl₂溶液中，在CO₂氛围下，形成 层状壳聚糖-碳酸钙薄膜。但上述方法中所制备的复合材料力学性能不高，其作为细胞支架 材料使用方面有一定的局限性。

本发明通过一步共电沉积的方法，在不锈钢表面得到壳聚糖-碳酸钙复合纳米材料。通 过体外细胞培养，研究壳聚糖-碳酸钙复合纳米网状结构的生物兼容性。发明的创新点不仅 在于电化学沉积的方法简单可控，还有壳聚糖-碳酸钙纤维网状结构与基底结合牢固(即使 在水或者乙醇溶液中超声清洗处理2h，仍只有少部分脱落)，机械性能强，生物兼容性良 好，而且将壳聚糖-碳酸钙三维纤维网状结构做为细胞支架材料，并取得了很好的实验结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三维网络状壳聚糖-碳酸钙复合纳米材料及制备方法。该制 备方法简单，制备的三维网络状复合材料具有良好的生物相容性。

实现本发明目的的技术方案：

本发明的一种壳聚糖-碳酸钙复合材料，其特征在于：该复合材料具有完整，致密的三 维的纤维状网络结构，由直径25～40纳米，长度为5～30微米的纳米纤维结构交错在一 起组成，并具有孔径为100-1000nm纳米的相互贯通的孔隙，此三维网络状结构复合材料 的抗拉能力达1319.2兆帕，比裸的不锈钢基底721.4兆帕增强82.9％。

本发明的复合材料三维的纤维状网络结构由多个纳米小颗粒的聚合而成，纳米小颗粒 沿着纤维的表面排列，构建一个三维交错的网络，为成骨细胞的粘附，生长，分化提供一 个良好的平台。

本发明的壳聚糖-碳酸钙复合材料中，壳聚糖与碳酸钙质量比为5～5.5∶1，优选5.25∶ 1。

本发明的壳聚糖-碳酸钙复合材料的制备方法，包括以下步骤：

1)、称取壳聚糖溶于去离子水中，配成819～901mg/200ml溶液，用2M HCl溶液调 节pH＝5.0，搅拌12h后，再调pH＝5.0；

2)、取50ml上述溶液，先加入0.0660g二水合氯化钙，终浓度为9mM，磁力搅拌， 再加入0.0711g碳酸氢氨，终浓度为18mM，继续搅拌，然后调节溶液pH＝5.5；

3)、联机打开CHI-660工作站，将上述溶液作为母液，于三电极体系中用i-t法进行电 化学沉积，参数设定为沉积电位E＝-3；沉积时间t＝30min；

4)、电沉积过程后，将不锈钢片在蒸馏水中轻轻洗涤，室温下晾干，即得到壳聚糖- 碳酸钙复合材料。

上述制备壳聚糖-碳酸钙复合材料步骤1)中，称取壳聚糖溶于去离子水中，配成200ml 水中含860mg壳聚糖溶液。

上述制备壳聚糖-碳酸钙复合材料步骤3)中，其三电极系统为参比电极：Ag-AgCl电 极；对电极：Pt丝电极；工作电极：不锈钢片。

本发明的效果和优点：

1.本发明方法得到的壳聚糖-碳酸钙复合材料，具有三维的纤维网络状结构，其结构 致密且分布均匀，并具有孔径为100-1000nm纳米的相互贯通的孔隙。

2.整个制备过程简单易控制，耗能少，成本低，符合实际生产需要。

3.本方法得到的壳聚糖-碳酸钙复合材料具备良好的生物相容性；具有三维立体多孔 结构；良好的材料细胞-界面；具有良好的机械强度。为其实际应用到骨修复中提供了基础。

以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明。

附图说明

图1是实施例1所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料的XRD图

X射线衍射分析证实衍射角为29.6，39.8，47.8，48.8，50.9和65.2度是对应于碳酸钙 六角形的晶体结构(JCPDS no.81-2027)，结果表明复合材料碳酸钙以方解石的形式存 在。(图中在XRD中2θ＝43.8，74.8两处有很强的峰，系不锈钢基底产生的峰)。

图2是实施例1所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料的XPS图谱

XPS测量结果表明壳聚糖-碳酸钙复合材料的组成。峰值出现在347.4eV和350.9eV 的对应Ca₂P_3/2和Ca₂P_1/2，表明Ca²⁺存在。N 1S峰在398.8eV和的C 1s在284.6eV 的峰可归结纳入壳聚糖复合膜峰。因此可以确认该纤维网状材料是由壳聚糖和碳酸钙组成 的。

图3是实施例1所得壳聚糖-碳酸钙复合材料样品与以相同浓度的单纯壳聚糖和碳酸钙 溶液为电解质，电沉积所得的SEM对照图(插图为高放大倍率的SEM照)。

图4是实施例1所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料的SEM图

由图4清楚地表明壳聚糖-碳酸钙复合材料由直径25～40纳米，长度为5～30微米的 纳米纤维结构交错在一起组成结构致密且分布均匀的纤维网络状结构，并具有孔径为 100-1000nm纳米的相互贯通的孔隙。明显的可以看出，纤维网络状结构由多个纳米小 颗粒的聚合而成。这些均匀的纳米粒子(NPS)，沿着那些纤维的表面排列，构建一个三 维交错的网络。

图5是实施例1所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料的TEM图

从图可以看出，纤维网络状结构由平均直径约25nm的纳米小颗粒的聚合而成，与 SEM的结果一致。

图6是实施例1所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料的接触角照片

实验结果表明复合材料有更好的亲水性能。

图7是实施例1所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料样品与单纯不锈钢片为基底，在不同 培养时间条件下进行细胞培植所得的荧光照片对比图

从图7不同时间条件下细胞生长的密度可以看出，纤维网状复合材料上细胞生长迅速， 所以该材料具有较好的生物相容性。

图8是实施例1所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料样品与单纯不锈钢片为基底，在不同 培养时间条件下进行细胞培植所得的MTT对比图

实验结果表明，在该实验时间范围内，纤维网状复合材料上细胞生长很快，随时间的 延长复合材料的促进效果越来越明显，说明该材料具有较好的生物相容性。

具体实施方式

实施例1

壳聚糖-碳酸钙纤维网络状复合材料的制备

按壳聚糖与碳酸钙质量比为5～5.5∶1配料，本实施例取此比例范围的上、中、下三 点作代表进行实验，其壳聚糖与碳酸钙质量比为5.00∶1，5.25∶1，5.50∶1，制备步骤依 次如下：

1)、分别称取0.8190g，0.8600g，0.9010g壳聚糖溶于200ml去离子水中，用2M HCl 溶液调节pH＝5.0，磁力搅拌过夜后，再调pH＝5.0；

2)、分别取50ml上述三种不同浓度溶液，先各加入0.0660g二水合氯化钙，终浓度 为9mM，磁力搅拌，再各加入0.0711g碳酸氢氨，终浓度为18mM，继续搅拌，然后调 节溶液pH＝5.5；

3)、联机打开CHI-660工作站，分别将上述三种溶液作为母液，于三电极体系中用i-t 法进行电化学沉积，其三电极系统为参比电极：Ag-AgCl电极；对电极：Pt丝电极；工作 电极：不锈钢片，参数设定为沉积电位E＝-3；沉积时间t＝30min；

4)、电沉积过程后，将不锈钢片在蒸馏水中轻轻洗涤，室温下晾干，即可得到三个壳 聚糖-碳酸钙复合材料样品。

本实施例制备的壳聚糖-碳酸钙纤维网络状复合材料的XRD图见图1，XPS图谱见图 2，SEM图见图4，TEM图见图5，接触角照片见图6。

所制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料样品与单纯不锈钢片拉力强度值对比列于表1。此纤 维网状复合材料的抗拉能力(1319.2兆帕)比裸的不锈钢基底(721.4兆帕)有82.9％的 增强效果。结果表明，纳米纤维壳聚糖碳酸钙涂层有着很好的机械性能。

表1

实施例2

实施例1 制备的壳聚糖-碳酸钙复合材料细胞相容性实验

(取壳聚糖与碳酸钙质量比为5.25∶1的复合材料作实验)

制备步骤依次如下：

1)、将裸的不锈钢片和以不锈钢片为基底制备所得的壳聚糖-碳酸钙复合材料裁剪成边 长为0.8厘米的正方形。

2)、将裁剪好的样品两面进行酒精和紫外灭菌，然后置于24孔培养板中，将培养瓶中 已经长满的细胞进行消化，稀释至密度为1×10⁴/ml个。将细胞接种于24孔培养板中， 每孔加入200ul细胞，800ul培养基。于37℃，5％ CO₂培养箱中进行培养(测荧光时每 组样品设3个对照孔，测MTT时每组样品设6个对照孔)。

3)分别在1、3、5、7、9天进行荧光测试。将培养基吸出，用PBS润洗三次，然后 加入2.5wt％的戊二醛在4℃冰箱中固定30分钟。接着每孔加入1000μl PBS和50μl 0.1 mg/ml的DAPI染料的，继续在培养箱中培养2h。然后在荧光显微镜下进行细胞的荧 光测试。

4)分别在1、3、5、7、9天进行MTT测试。将片子取出置于新的24孔培养板中，加 入1000μl培养基，然后每孔加入MTT试液100μl，继续培养4h。吸出培养液后，加入 DMSO液(1000μl/孔)，室温下于微孔板振荡嚣上振荡30min，使紫色结晶物完全溶解。 然后每孔吸取150μl溶液于96孔板中，选择波长490nm，在酶标仪上检测各孔的A值。 应用统计学方法对所测数据进行方差统计分析。

实验结果如图7、图8所示。