一种评价注射剂临床配伍相容性的方法

摘要

本发明公开了一种评价注射剂临床配伍相容性的方法，该方法包括以下主要内容：样品液的制备；滴定；反应活性谱的生成；计算相应的热力学参数焓变ΔH、反应常数K和熵变ΔS等；根据ΔH与TΔS的关系，这里T为反应温度，判断反应类型是焓驱动反应还是熵驱动反应，进而判断注射剂临床配伍的相容性。该发明方法与已有的检测方法相比，其优势在于普适性强、灵敏度高、操作简便、干扰因素少、重现性好，通过仪器等温功率补偿系统，体系在线滴定时可以快速达到基线平衡，以适应连续滴定，增加测量准确性；无需知道溶液中全部成分即可通过参数判断反应类型，对物质基础不明确的如中药注射剂尤其适用；可以有效的弥补无对照品、成分特征吸收谱或吸收波长难以确定而导致常规化学分析方法无法检测的局限，且具有较好的普适性及反应活性指纹谱特征。

说明书

技术领域

本发明涉及一种评价注射剂临床配伍相容性的方法，属于临床用 药安全性评价技术领域。

背景技术

注射剂在临床中广泛使用，为满足基础疾病及并发症等治疗需要，经 常需要联合用药。但由于不同药物性质的差异，药物合用可能会导致原有 物质基础的改变、药效降低，甚至发生不良反应。现用于检测联合用药安 全性的方法主要有肉眼观察、不溶性微粒、pH值、渗透压、高效液相色 谱(HPLC)等。运用这些方法对药物合用前后理化性质进行检测，给临 床安全用药提供参考价值，但这些方法操作复杂，不能实时在线进行监控， 不能同时兼顾物理、化学信息，且灵敏度不高、普适性不强，因此限制了 其在药物临床配伍相容性检测中的应用。故亟待建立一种同时兼顾物理、 化学特征信息变化的方法，以实时在线、灵敏快速地评价注射剂临床配伍 相容性。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有注射剂临床配伍相容性的检测方 法，操作复杂，不能实时在线进行监控，不能同时兼顾物理、化学信息， 且灵敏度不高、普适性不强的局限，引入物理化学领域的等温滴定量热法 (Isothermal Titration Calorimetry，ITC)尝试应用评价注射剂临床配伍相容 性，以期建立一种快速灵敏、普适性强的检测方法。

ITC是一种微量热方法，以参加反应物质总浓度的变化和反应的热量 变化为函数，结合一定的数学模型，获取热力学参数。ITC可以在线监测 快反应，目前主要应用于大分子和/或小分间的相互作用，环境对反应的 影响以及酶动力学等研究领域，但尚未见将此法用于评价注射剂临床配伍 相容性的相关报道。

为实现上述目的，本发明的技术方案为一种评价注射剂临床配伍 相容性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)制备待检测相容性的模式药和联合用药的样品液；

(2)将(1)步制备的样品液在等温滴定量热仪上进行滴定；

(3)利用等温滴定量热仪实时记录滴定反应过程中产生的热量变 化，生成反应活性谱；

(4)根据(3)步得到的热量变化的反应活性谱，分析计算热力学参 数焓变ΔH和反应常数K；

(5)根据(4)步的热力学参数焓变ΔH和反应常数K，计算反应的 熵变ΔS；

(6)根据(4)、(5)步的热力学参数，判断反应类型，若|ΔH|＞T|ΔS|， 为焓驱动反应，说明这两种注射剂溶合后发生了化学反应，不相容，不能 联合用药，其中T为温度；若|ΔH|＜T|ΔS|，为熵驱动反应，说明这两种注 射剂的溶合只发生物理反应，化学相容性良好。

步骤(1)中，如果待检测的模式药与联合用药是注射液，则步骤(1) 的样品液可以直接从模式药与联合用药的注射液量取配置；如果待检测的 模式药与联合用药为冻干粉针，则分别取适量的模式药与联合用药，配成 临床使用浓度的模式药溶液与联合用药溶液。

步骤(2)在等温滴定量热仪上进行的滴定操作包括以下几个步骤：

(1)在样品池中注入被滴定液，滴定液可以是模式药样品液或联合用 药样品液，或两者交换；

(2)被滴定液恒温至25℃，搅拌速率为100～300r·min^-1下搅拌至仪器 自动平衡后，记录仪器的输出功率曲线作为基线，记录时间为30～60s；

(3)用滴定液对被滴定液进行滴定，连续滴定20～50滴，每滴2～10μL， 间隔时间为200～300s；

(4)滴定过程中，采用Launch ITCRun软件进行数据采集。

步骤(3)中根据滴定过程中的热量变化生成的反应活性谱是由反应 过程谱和热量变化谱组成，其中反应过程谱是通过记录每一次滴定反应产 生的热量变化得到两种注射液滴定过程的功率-时间谱，热量变化谱是通 过对反应过程谱的滴定峰进行积分得到的热量-滴定次数谱。

步骤(4)中的热力学参数焓变ΔH和反应常数K是根据反应活性谱， 通过下述公式计算得到的：

$Q=V·\mathrm{\Delta H}·C_M^b---\left(1\right)$

$\frac{Q}{n_L}={\Delta }_r{H}_M^{\theta }·\frac{C_M^b}{C_L^0}---\left(2\right)$

$\frac{\left[\mathrm{ML}\right]}{C_L^f·C_M^f}=K---\left(4\right)$

其中Q为每一次的热量变化，V是体积，是摩尔反应焓，n_L为 样品池中反应物总物质的量，和分别代表样品池中和滴定池中两种 注射剂的总浓度，是已经与样品池中样品反应的滴定液浓度，和分别代表样品池中和滴定液未反应的浓度，K是该反应的平衡常数；[ML] 为反应生成物的总浓度，

由公式(4)可得：

$\frac{C_M^b}{(C_M^0-C_M^b)·(C_L^0-C_M^b)}=K---\left(5\right)$

由公式(5)可得：

$K{\left(C_M^b\right)}^2-(C_L^{0}K+C_M^{0}K+1)C_M^b+K{C}_L^0{C}_M^0=0---\left(6\right)$

$C_M^b=\frac{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})-\sqrt{{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})}^2-4C_L^0{C}_M^0}}{2}---\left(7\right)$

将(6)式代入(2)式可得：

$\frac{Q}{n_L}={\Delta }_r{H}_m^{\theta }·\frac{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})-\sqrt{{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})}^2-4C_L^0{C}_M^0}}{2C_L^0}---\left(8\right)$

$=\frac{{\Delta }_r{H}_m^{\theta }}{2}·[(1+\frac{C_M^0}{C_L^0}+\frac{1}{C_L^{0}K})-\sqrt{{(1+\frac{C_M^0}{C_L^0}+\frac{1}{C_L^{0}K})}^2-4\frac{C_M^0}{C_L^0}}]---\left(9\right)$

步骤(5)中，熵变ΔS的计算是通过下列公式计算得到的：

ΔG＝-RTlnK                (10)

ΔG＝ΔH-TΔS              (11)

其中，ΔG为吉布斯自由能。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：(1)ITC具有灵敏度 高、实时在线等特点，并且具有差热功率补偿系统，可以快速平衡以 适应连续滴定；(2)无需知道溶液中全部成分即可通过参数判断反 应类型，对物质基础不明确的(如中药注射剂)尤其适用；(3)ITC 法可以有效的弥补无对照品、成分特征吸收谱或吸收波长难以确定 而导致常规化学分析方法无法检测的局限，且具有较好的普适性及 反应活性指纹谱特征。

附图说明

图1为5％葡萄糖注射液与益气复脉冻干粉针溶合的功率-时间谱；

图2为5％葡萄糖注射液与益气复脉冻干粉针溶合的热量-滴定次数 谱；

图3为5％维生素C注射液与益气复脉冻干粉针溶合的功率-时间 谱；

图4为5％维生素C注射液与益气复脉冻干粉针溶合的热量-滴定次 数谱；

图5为热力学参数的比较；

图6为益气复脉冻干粉针的指纹图谱及益气复脉冻干粉针与葡萄 糖注射液混合后的化学指纹图谱；

图7为益气复脉冻干粉针与维生素C注射液混合后的化学指纹图 谱；

图8为图7的(a)部分图谱的放大图；

图9为图7的(b)部分图谱的放大图；

图10为图7(c)部分图谱的放大图；

图11为图7(d)部分图谱的放大图。

具体实施方式

为便于本发明技术方案的理解，下面结合具体的实施方式进行介 绍。

实验以益气复脉冻干粉针(YQFM)为模式药，根据其临床常用联 合用药选择维生素C注射液(Vc)及5％葡萄糖注射液(5％GS)为合 用注射剂，采用ITC方法对两种合用注射剂与益气复脉冻干粉针水溶 液溶合后热量特征信息进行采集，得到反应活性谱，获得相应的热力 学参数，判断反应的类型，以高效液相色谱法(HPLC)加以验证。

实验仪器与材料：

NANO ITC^2G等温滴定量热仪(美国TA公司)。仪器最低检测限为 0.1nJ，基线稳定性为20nW，25℃是温度稳定性为0.0002℃，工作温度为 2～80℃，相应时间12s。高效液相色谱仪1200(美国安捷伦科技有限公 司)。注射用益气复脉冻干粉针(批号：090702，天津天士力之骄药业有 限公司)，注射用灭菌水(批号：09110118，北京市永康药业有限公司)， 5％葡萄糖注射液(批号：091028257，石家庄四药有限公司)，维生素C 注射液(批号：1001301，天津金耀氨基酸有限公司)，乙腈(Fisher)。对 照品人参皂苷Rb₁(1110704-200420)购自中国药品生物制品检定所。

实验方法与结果

1.等温滴定量热法

1.1样品液的制备

取YQFM适量，加注射用灭菌水溶解，使其终浓度为0.052g·mL^-1。 5％GS、Vc开瓶即用。

1.2滴定

在样品池中注满被滴定溶液，恒温至25℃，控制搅拌速率为 300r·min^-1，待仪器自动平衡后，记录60s，开始滴定，连续滴定25滴， 每滴4μL，间隔时间为300s。Launch ITCRun软件进行数据采集。

1.3反应活性谱的生成

等温滴定量热仪通过记录每一次滴定反应产生的热量变化得到两种 注射液溶合的反应过程谱(功率-时间谱)，若图谱峰向上，则溶合过程中 放出热量变化图(热量-滴定次数谱)；若图谱峰向下，则溶合过程中吸收 热量。分别对每一个滴定峰进行积分，则得到连续滴定过程中热量变化的 图谱。反应过程谱和热量变化谱统称为反应活性谱。

应用ITC方法分别考察YQFM与5％GS、Vc的相容性，反应活性谱 如图1、图2、图3、图4所示。图1、图3中I曲线为两种注射剂滴定结 果；为扣除滴定液对样品池中溶媒的影响，考察了5％GS、Vc与无菌水 的滴定反应，如图1、图3中II曲线所示。扣除滴定液对溶媒的影响后， 对滴定峰进行积分，得到的滴定过程热量变化图谱如图2、图4所示。

1.4热力学参数焓变ΔH和反应常数K的计算

每一次滴定都会伴随着热量的变化，并达到平衡。假设每一次的热量 变化为Q，则得到相应的计算方程：

$Q=V·\mathrm{\Delta H}·C_M^b---\left(1\right)$

$\frac{Q}{n_L}={\Delta }_r{H}_M^{\theta }·\frac{C_M^b}{C_L^0}---\left(2\right)$

$\frac{\left[\mathrm{ML}\right]}{C_L^f·C_M^f}=K---\left(4\right)$

以上各式中，V是体积，是摩尔反应焓，n_L为样品池中反应物总 物质的量，和分别代表样品池中和滴定池中两种注射剂的总浓度， 是已经与样品池中样品反应的滴定液浓度，和分别代表样品池中 和滴定液未反应的浓度，K是该反应的平衡常数；[ML]为反应生成物的总 浓度，

由公式(4)可得：

$\frac{C_M^b}{(C_M^0-C_M^b)·(C_L^0-C_M^b)}=K---\left(5\right)$

由(5)式可得：

$K{\left(C_M^b\right)}^2-(C_L^{0}K+C_M^{0}K+1)C_M^b+K{C}_L^0{C}_M^0=0---\left(6\right)$

$C_M^b=\frac{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})-\sqrt{{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})}^2-4C_L^0{C}_M^0}}{2}---\left(7\right)$

将(7)式代入(2)式可得：

$\frac{Q}{n_L}={\Delta }_r{H}_m^{\theta }·\frac{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})-\sqrt{{(C_L^0+C_M^0+\frac{1}{K})}^2-4C_L^0{C}_M^0}}{2C_L^0}---\left(8\right)$

$=\frac{{\Delta }_r{H}_m^{\theta }}{2}·[(1+\frac{C_M^0}{C_L^0}+\frac{1}{C_L^{0}K})-\sqrt{{(1+\frac{C_M^0}{C_L^0}+\frac{1}{C_L^{0}K})}^2-4\frac{C_M^0}{C_L^0}}]---\left(9\right)$

Launch NanoAnalyze软件可运用上述公式对实验所得的数据进行分 析，将实验用样品浓度输入，其中以人参皂苷Rb₁浓度(见2.4项下浓度 计算)计量益气复脉冻干粉针水溶液的浓度。软件自动对反应活性谱进行 分析，经过拟合得到两种注射剂溶合的热力学参数反应焓变ΔH及反应常 数K。

1.5熵变ΔS的计算

根据热力学参数关系式(10)、(11)求得反应的吉布斯自由能ΔG及 熵变ΔS，其中R为8.314KJ/mol。

ΔG＝-RTlnK            公式(10)

ΔG＝ΔH-TΔS    公式(11)

反应焓变ΔH、反应常数K、吉布斯自由能ΔG及熵变ΔS的计算结果总结 如表1所示。

表1不同注射液溶合的热力学参数

1.6反应类型的判断

从反应活性谱可以看出YQFM与两种注射剂滴定产生的反应过程谱 的峰型有较大差异。其中与5％GS滴定产生的图谱渐变性不强，且热量 变化图谱中平均每滴放出的热量约为40μJ，且摩尔反应焓变(|ΔH|＝0.04 kJ/mol)小于20kJ/mol，提示YQFM与5％GS溶合过程中主要发生了物 理反应。YQFM与Vc滴定的反应过程谱渐变性强，规律明显，且热量变 化谱中每滴放出的热量均大于1800μJ，且摩尔反应焓变(|ΔH|＝50.00 kJ/mlo)大于40kJ/mol，提示YQFM与Vc滴定过程中，可能有化学键的 生成或断裂。

从表1中可以看出，扣除滴定注射剂对溶剂的作用后，5％GS、Vc 与YQFM反应的ΔG均为负值，由此可以判断出两种注射液与益气复脉 冻干粉针的溶合均发生了自发的反应。公式(11)显示ΔG由ΔH及-TΔS 两部分组成，这两部分对吉布斯自由能贡献的大小决定了反应的类型。

若|ΔH|＞T|ΔS|，则该反应为焓驱动反应，即为化学反应。

若|ΔH|＜T|ΔS|，则该反应为熵驱动反应，即为物理反应。

不同注射剂间滴定产生的ΔG、ΔH、-TΔS见图5。从图5中可以直观 判断出Vc与YQFM之间的溶合过程为化学反应，而5％GS与YQFM之 间的溶合过程为物理反应。可以推断：Vc与YQFM溶合后，物质基础发 生了转变。因此，GS可以跟益气复脉冻干粉针混合使用，但在阐明物质 基础改变对机体的影响前，临床用药中应避免Vc与益气复脉冻干粉针混 合使用。

2.高效液相色谱方法

2.1供试品制备

取YQFM内容物适量，溶于注射用灭菌水中，作为母液。取母液一 份加灭菌水稀释至0.026g·mL^-1。另取母液一份加无菌水稀释至0.052 g·mL^-1，分别取稀释后溶液与等体积5％GS、Vc混合，制备成混合溶液。

2.2标准品制备

精密称取人参皂苷Rb₁对照品6mg，甲醇定容于50mL容量瓶中，作 为标准品母液。将标准品母液稀释为10、20、30、40、50μg·mL^-1。

2.3液相条件

色谱柱HALO C18，(4.6mm×75mm，2.7μm)。流动相为A，水；B， 乙腈；A-B(85：15)。梯度洗脱：0-5min，15％B；5-10min，15％-17％B； 10-20min，17％-27％B；20-25min，27％-33.5％B；25-45min，33.5％-60％B； 45-50min，60％-50％B。流速0.25mL/min，检测波长203nm，柱温30℃， 进样量5μL。

2.4皂苷含量测定

按照2.3项下液相条件，测定样品的化学指纹图谱，如图6所示。求 得供试品中含有人参皂苷Rb₁浓度为24.8mg·mL^-1，根据公式(12)、(13) 求得供试品以人参皂苷Rb₁计量的摩尔浓度为44.8mM。

摩尔数n＝含量(g)/分子量(g/mol)          公式(12)

摩尔浓度(M)＝摩尔数(mol)/体积(L)        公式(13)

2.5不同注射剂混合的高效液相图谱

5％GS与YQFM溶合的高效液相图谱，如图6所示。从图中可以看 到，两种注射剂溶合后，没有明显的色谱峰的变化。

Vc与益气复脉冻干粉针溶合的指纹图谱如图7所示。从图中可以看 到，两种注射剂溶合后，液相图谱发生了变化。

YQFM分别与Vc、5％GS混合后，肉眼观察无明显变化。经HPLC 测定后，分别对YQFM与5％GS、Vc溶合后的液相图谱与原图谱进行比 较，发现混合后的图谱有三种变化趋势，第一，峰的数目发生了变化，如 图8中色谱峰减少，图9中色谱峰增加；第二，保留时间发生了变化，如 图10所示；第三，相对峰面积发生了变化，如图11所示。应用夹角余弦 法进行相似度分析，结果显示，YQFM与5％GS溶合后与YQFM图谱相 似度为0.90而YQFM与Vc溶合后与YQFM图谱相似度为0.56。可见 YQFM与Vc溶合后，使YQFM图谱发生了显著的变化，而5％GS与 YQFM溶合后，图谱没有显著改变。由此提示：Vc可使YQFM化学成分 发生变化。

该项实验结果对ITC方法所得结果加以佐证，显示出ITC方法定性 判断的准确性及可靠性。