一种中药注射剂致敏原的综合检测方法

摘要

本发明涉及免疫学与中药学领域，公开了一种中药注射剂致敏原的综合检测方法。本发明是基于ELISA原理与指纹图谱差异性分析相结合技术，利用固相载体包埋抗原、IgE抗体或抗IgE抗体的免疫反应，分别采用中药注射剂成分抗原与标记抗IgE抗体、包埋IgE抗体与标记抗原、包埋IgE抗体与已知合成抗原，再与酶标抗体、包埋抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再与标记抗原或抗原与标记抗体等形式的标记免疫反应；捕获IgE抗体对中药注射剂GC/MS、HPLC/MS指纹图谱差异分析，综合多方面信息来确定中药注射剂致敏的人与动物血样中的特异IgE及对应的致敏原。本发明所述中药注射剂的检测方法具有高特异性、高灵敏度和高效性，操作简单方便的特点，适用于多成分的同时检测，可有效防治漏查。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学与中药学领域，具体涉及一种中药注射剂致敏 原的快速检测方法。

背景技术

中药注射剂系我国特有的现代化中药新剂型，在我国临床上已大 量使用。随着中药注射剂临床应用的日益广泛，有关中药注射剂不良反 应(ADR)及致死亡病例报道日益增多，过敏反应均为常见的不良反应之 一。

中药注射剂引起的过敏反应主要分为I型(速发型)、II型(细胞 毒型)、III型(免疫复合物型)、IV型(迟发型)过敏反应。其中，由 IgE介导的I型过敏反应是中药注射剂在临床上最常引起的一类过敏 反应，其发病急，可迅速出现皮肤潮红、瘙痒、腹痛甚至过敏性休克 等严重症状。I型超敏反应是致敏原刺激抗体的淋巴结、肝、脾等器 官的单核吞噬系统，触发浆细胞反应产生特异性IgE(sIgE)抗体。IgE 分子的Fc端附着在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体上，使机体处 于致敏状态。当机体再受同类型致敏原刺激时，致敏原与IgE分子交 联，引起肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒化，释放出组胺、白三烯及 细胞因子等化学物质产生过敏反应、导致机体的毛细血管扩张、水肿、 平滑肌痉挛、内分泌活动亢进，引发过敏性疾病的临床症状，严重时 可产生过敏性休克等危及生命。

由于中药注射剂成分复杂，也并不是所有的成分能致敏，而是一部 分能与体内蛋白自动结合的成分，可以与血液中蛋白结合，也可能与 组织中蛋白结合而致敏，并且中药注射剂的原成分与代谢成分都可能 是致敏性成分。

目前的致敏原检测方法主要有皮肤主动过敏试验、全身主动过敏试 验、皮肤被动过敏试验、小鼠耳廓肿胀试验(MEST)、啮齿类局部淋 巴结实验(LLNA)、Buehler分析法、豚鼠最大值法(GPMT)等，但 是这些检测方法仅适用于单成分制剂。怎样确定其中的致敏性成分和 测定与其对应的特异性IgE含量方法对于安全使用中药注射剂是大家 公认的国际性难题。

目前有人提出将中药注射剂的成分分离并固定，然后再与所产生 的抗体酶联免疫反应进行判断，一则小分子的半抗原不好固定，在进 行固相酶联免疫吸附法时会被洗脱液洗掉的，故难实现目标；同时中 药注射剂致敏原除了与血液中的IgE反应外，还与其它的IgG、IgA、 IgM、IgD反应，而后四者并非致敏性免疫球蛋白，因此会受其它的 干扰。现又改成单个成分逐个分析法，旨在将中药注射剂中单个成分 分离，然后按单成分的模式逐个来试，这对于中药注射剂致敏性动物 实验是允许的，但无法进行中药注射剂对人体致敏原研究，因为中药 注射剂是整体而不加佐剂使用的，不能将成分折分或加入免疫增强剂 来进行研究，这样的实验结果与中药注射剂临床使用的真实情况不一 致，因此该法也行不通。另外，如果是中药注射代谢产物产生致敏， 现有方法无法进行确定，且对于含量少的成分也可能存在漏查。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中药注射剂致敏原的快速 综合检测方法，本发明所述检测方法具有高特异性，适用于多成分的 同时检测，能够准确检测出中药注射剂中的致敏原成分，也可最大限 度地防止漏查。

本发明的基本思路采用已知成分抗原或抗体去套未知的致敏性多 克隆特异性抗体IgE，具体就是：

1)宏观上仍采用酶联免疫吸附反应，中药注射剂致敏是I型超敏 反应，标志性指标为免疫球蛋白IgE增加。

2)在采用本法时，要用已知的抗体(抗原)去套人或动物按注射 剂使用时所产生的IgE。

3)对于代谢产物或含量少的成分或可能漏查成分采用IgE与吸附 中药注射剂指纹图谱弥补；

4)对于与组织内的蛋白结合只能采用药物的半抗原决定簇，通过 交叉反应弥补；

5)多成分采用芯片同时测定；

本发明是基于ELISA原理与指纹图谱差异性分析相结合技术，利 用固相载体包埋抗原、IgE抗体、抗IgE抗体，分别采用中药注射剂成 分抗原与标记好的抗IgE抗体间接酶联免疫反应、包埋的IgE抗体与 血样中特异性的IgE竞争抗原的酶联免疫反应、包埋的抗IgE抗体捕 获血样中IgE抗体，再与标记的抗原，或抗原与标记抗体的酶联免疫 反应、抗IgE抗体捕获血样中IgE抗体，再结合中药注射剂成分，采 用GC/MS、HPLC/MS分析其指纹图谱差异来确定中药注射剂(拟) 使用者血样中的特异IgE。总体方法是用针对动物实验的抗原抗体去套 人或动物使用中药注射剂剂致敏所产生的特异性抗体IgE及成分。或 采用HPLC/MS、GC/MS来分析特异性抗体IgE所作用的特异性成分， 诸法联合确定中药注射剂剂致敏原。

首先将中药注射剂的成分尽可能分离出来，本发明可采用本领域 技术人员熟知的分离方法，如溶剂、水蒸气蒸馏、升化、分子蒸馏、 膜分离、超临界流体萃取、逆流液滴分配及各种层析法等，对中药注 射剂中各组分进行分离。

中药注射剂中大分子可直接作为全抗原，大部分为小分子化学物 质，属于半抗原，故需要用化学合成的方法，将分离的各组分修饰为 全抗原。根据分离的各组分的具体结构采用化学方法与丙种球蛋，人 血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、血蓝 蛋白以及人、牛和鸡γ-球蛋白、卵黄蛋白或人工合成的多聚赖氨酸、 多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等合成抗原；或分别注射到动物体内或 混合在一起注射到动物体内等偶联得到抗原，或用聚乙烯吡咯酮、羧 甲基纤维素、聚甲基丙酸酯微粒联接得抗原。

其中，对于含氨基的化学组分，可采用重氮化法、戊二醛法、多 元酸酐法、二异氰酸酯法、偶氮苯甲酸法、亚胺酸酯法来合成；对于 含糖基的化学组分，可以采用碘酸盐氧化法来合成；对于含羧基的化 学组分，可以采用混合酸酐法、碳二亚胺法、活泼酯法来合成；对于 含酮基的化学组分，可以采用O-羧甲基羟胺法、对-肼基苯甲酸法、 Mannich反应法来合成；对于羧酸甲酯衍生物，可以采用叠氮化法来合 成；对于含羟基的化学组分，可以采用氯乙酸钠法、三氯三嗪试剂法 来合成；对于含氨基、羟基、巯基的化学组分，可以采用卤代硝基苯 法、苯醌法来合成。

在中药注射剂的成分的全抗原合成时，载体蛋白的选择优选与注 射剂使用情况尽可能一致，如中药注射剂用于人，载体蛋白为人的血 清蛋白；如为动物，则为动物的血清蛋白，这样合成的抗原在动物体 内产生的已知抗体与使用者体内产生的抗体决定簇尽可能相似，注入 动物得到抗体，可能是IgG、IgA、IgD、IgM、IgE，以IgE最好，分 离出各抗原的特异性抗体。

本发明既先分离中药注射剂中各成分，制成全抗原，注入动物体 内产生抗体，分离出抗体；又同时对人或动物的血清中IgE进行分离， 注入动物体内产生二抗，标记抗IgE抗体，采用间接酶联免疫与已知 抗原、标记抗体敏联免疫反应来筛查中药注射剂中的致敏性成分，或 对已捕获的IgE抗体与中药注射剂成分抗原抗体反应，或对已捕获的 IgE抗体与中药注射剂指纹图谱分析方法，根据特征峰的缺失来确定致 敏性成分。

本发明所述中药注射剂致敏原的检测方法适用于所有中药注射 剂，如双黄连注射液、鹿茸精注射液、去感热注射液、肿节风注射液、 茵栀黄注射液、茶色素注射液、鸦胆子油乳注射液、复方苦参注射液、 健骨注射液、勒马回注射液、生脉注射液、消痔灵注射液、华蟾素注 射液、清开灵注射液、乌头注射液、正清风痛宁注射液、白花蛇舌草 注射液、伊痛舒注射液、补骨脂注射液、鱼金注射液、鱼腥草注射液、 冠心宁注射液、穿山龙注射液、香丹注射液、柴胡注射液、清热解毒 注射液、雪莲注射液、黄芪注射液、醒脑静注射液、蟾蜍注射液、肝 炎灵注射液、刺五加注射液、参附注射液、参麦注射液、脉络宁注射 液、夏天无注射液、猪苓多糖注射液、羚羊角注射液、黄瑞香注射液、 丁公藤注射液、血塞通注射液、穿心莲注射液、莲必治注射液、银黄 注射液、舒血宁注射液、丹参注射液、毛冬青注射液、板蓝根注射液、 注射用灯盏花素、苦木注射液、复方大青叶注射液、复方当归注射液、 复方蛤青注射液、复方蒲公英注射液、艾迪注射液、当归寄生注射液、 灯盏花素注射液、灯盏细辛注射液、红花注射液、红茴香注射液、血 栓通注射液、抗腮腺炎注射液、祖师麻注射液、退热解毒注射液、骨 痨敌注射液、射干抗病毒注射液、桑姜感冒注射液、热可平注射液、 益母草注射液、野木瓜注射液、雪上一支蒿总碱注射液、止喘灵注射 液、香菇多糖注射液、止咳灵注射液、注射用双黄连冻干粉、丹红注 射液、丹香冠心注射液、瓜蒌皮注射液、人参茎叶总皂苷注射液、苦 碟子注射液、注射用血塞通冻干粉、板蓝根注射液、板蓝解毒注射液、 肝净注射液、肝欣泰注射液、田基黄注射液、岩黄连注射液、清肝注 射液、舒肝宁注射液、复方半边莲注射液、薄芝菌注射液、地龙注射 液、康艾注射液、柴辛感冒注射液、柴胡注射液、野菊花注射液、胆 木注射液、喜炎平注射液、清热解毒注射液、人参多糖注射液、乌头 注射液、痛克宁注射液、消癌平注射液。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，包括：

步骤1：分离中药注射剂的各成分，制备全抗原；

步骤2：将中药注射剂的各个成分的全抗原按顺序固定于固体支持 物制成芯片，向每个检测孔加入待测血清，同时设立空白对照，加入 未致敏血清液；孵育，洗去未结合物质；

步骤3：加入酶标记的抗IgE抗体，孵育，洗去未结合物质；

步骤4：显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强 度强于空白对照时，则检测孔中对应的抗原为中药注射剂的致敏原。

本发明还提供一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，包括：

步骤1、中药注射剂的各成分的全抗原的特异性抗体按顺序固定于 固体支持物制成芯片，向每个检测孔加入中药注射剂的全抗原溶液； 同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；

步骤2：在检测孔中加入待测血清，孵育，洗去未结合物质；

步骤3：在检测孔中加入酶标抗IgE抗体，孵育，洗去未结合物质；

步骤4：显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强 于空白对照时，则检测孔中特异性抗体对应的抗原为致敏原

尤为优选，所述特异性抗体为IgG、IgA、IgD、IgM或IgE，最优 选为IgE。

本发明还提供一种中药注射剂致敏原的底芯片法检测方法，包括：

步骤1、中药注射剂使用致敏者的特异性抗体按顺序固定于固体支 持物制成芯片，向每个检测孔加入酶标记的对应抗原；同时设立空白 对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；

步骤2、显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔的吸光度强 于空白对照时，则检测孔中特异性抗体对应的抗原为致敏原。

尤为优选，所述特异性抗体为IgG、IgA、IgD、IgM或IgE，最优 选为IgE。

本发明提供的一种中药注射剂致敏原的底芯片检测方法，包括：

步骤1、中药注射剂使用致敏者的特异性抗体IgE按顺序固定于固 体支持物制成芯片，向每个检测孔加入中药注射剂成分的合成全抗原 溶液；同时设立空白对照，只加稀释液；孵育，洗去未结合物质；

步骤2、在检测孔中加入酶标抗体，孵育，洗去未结合物质；

步骤3、显色，与空白对照对比分析吸光度，当检测孔吸光度强于 空白对照为阳性，根据强弱程度确定致敏强度，根据所对应的IgE抗 体确定原注射剂中的致敏成分。

本发明提供的一种中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法检测方 法，包括：

步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成芯片，加待测血清液 至检测孔中，孵育，洗去未结合物质；

步骤2、加中药注射剂或含药血清孵育，洗去未结合物质；

步骤3、收集未结合物质，采用GC/MS或HPLC/MS对未结合物 质和中药注射剂进行指纹图谱分析，根据指纹图谱特征峰差异确定中 药注射剂中的致敏成分。

本发明提供的一种中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法检测方 法，包括：

步骤1、将中药注射剂使用致敏者的特异性抗体固定于固体支持物 制成芯片；

步骤2、加中药注射剂或含药血清孵育，洗去未结合物质；

步骤3、收集未结合物质，采用GC/MS或HPLC/MS对未结合物 质和中药注射剂进行指纹图谱分析，根据指纹图谱特征峰差异确定中 药注射剂中的致敏成分。

本发明提供的一种中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片对应检测 方法，包括：

步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成底芯片，加待测血清 液至检测孔中，孵育，洗去未结合物质；

步骤2、将中药注射剂的各成分的酶标全抗原进行做成盖芯片；

步骤3、底芯片与盖芯片的孔一一对应，使底芯片孔与盖芯片溶液 混合，孵育，洗去未结合物质；

步骤4、加底物显色，显色孔中对应的盖芯片标记抗原为致敏原。

本发明提供的一种中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片对应检测 方法，包括：

步骤1、将抗IgE抗体固定于固体支持物制成底芯片，加待测血清 液至检测孔中，孵育，洗去未结合物质；

步骤2、将中药注射剂的各成分的全抗原进行做成盖芯片；

步骤3、底芯片与盖芯片的孔一一对应，使底芯片孔与盖芯片溶液 混合，孵育，洗去未结合物质；

步骤4、加入对应的酶标抗体孵育，洗去未结合物质；

步骤5、加底物显色，显色孔中对应的盖芯片抗原为致敏原。

本发明最终提供的一种中药注射剂致敏原的综合检测方法，其特 征在于，包括：

需对底芯片法、底芯片与盖芯片对应法及免疫指纹图谱法信息信 息进行综合分析，最终得出中药注射剂对人或动物的的致敏性成分及 特异性IgE。

制作芯片的所述固体支持物为本领域技术人员所公知，优选为酶 标板。本发明对固体支持物的数量以及每个固体支持物上固定的抗原 的数量不做具体限制，可根据具体中药注射剂分离出的化学组分的数 量来调整。同时，本发明所述抗原可按照其对应的化学组分的英文字 母顺序、中文笔划、功效、功能团等分类方法来系统的排列成芯片点 阵。

所述的抗原、抗体的标记方法可采用荧光标记法、酶标记、放射 性核素及化学发光标记等。

由以上技术方案可知本发明所述一种检测中药注射剂的方法高特 异性，适用于多成分的同时检测，能够准确检测出中药注射剂中的致 敏原成分。本专利采用酶联免疫与指纹图谱双重分析，可以防止漏查。

本发明采用芯片技术，将中药注射剂成分分离制成全抗原，按一 定规律制成芯片；同时与使用过注射剂的人或动物的血清抗体反应， 再用IgE二抗反应显色(底芯片法)，同时采用包埋抗IgE抗体，捕获 人体或动物特异性IgE，再与已知中药注射剂成分的标记抗原或抗原与 标记抗体显色(底芯片、底芯片与盖芯片结合法)，同时包埋抗IgE抗 体，捕获人体或动物特异性IgE，采用指纹图谱分析(免疫指纹图谱法)， 多方面综合判定中药注射剂的致敏原。

因此，本发明所述方法具有高综合性、高特异性、高灵敏度和高 效性，能对中药注射剂已知结构成分、未知结构成分(经HPLC/MS、 GC/MS分析)、及代谢产物的致敏性进行分析，防止漏查，操作简单方 便，解决了检测中药注射剂多成分致敏原的国际性难题，对于中药注 射剂的安全性评价有突破性进展。

附图说明

图1所示为双黄连注射剂的HPLC谱图；

图2所示为双黄连注射剂吸附后的HPLC谱图。

具体实施方式：

本发明公开了一种中药注射剂致敏原的综合检测分析方法。本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指 出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的方法和芯片已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内 对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用 本发明技术。

以下以双黄连注射剂为例，就本发明提供的一种检测中药注射剂 致敏原的方法及芯片，进行详细阐述。

实施例1：分离双黄连注射剂的化学组分

用溶剂、酸碱、高效色谱等分离技术分离双黄连注射剂，分离成 分有绿原酸、异绿原酸、新绿原酸、黄芩素、黄芩新素、黄芩甙、汉 黄芩素、汉黄芩甙、白杨黄素、干层纸素、干层纸素A甙、连翘苷、 连翘苷元冷杉树脂酚、冷杉树脂酚-β-D-葡萄糖甙、连翘酯苷A、连翘 酯苷C、连翘酯苷D、齐墩果酸、白桦脂酸、熊果酸、芸香苷等，同 时分离出在双黄连注射剂制备时中的除去的大分子多糖与蛋白质等。

实施例2：已知组分的全抗原的制备

1、糖类或含糖基化合物抗原的制备

准确称取实施例1中任一糖类或含糖基化合物为0.01mmol，加2ml 的吡啶溶解，为A液。0.015mmol高碘酸钠加2ml水溶解，为B液。将溶 液B逐步加入A液，室温，搅拌反应0.5h，加1μl的乙二醇终止反应；准 确称取牛血清白蛋(BSA)65mg(0.001mmo1)，加入0.01mol/L、pH7.4 PBS 5ml，此溶液称为溶液C。

将反应好的溶液逐滴加入C溶液中，边加边搅拌，室温搅拌3h，然 后加0.01M的硼氢化钠新鲜水溶液1ml，室温搅拌反应1h，反应结束后， 在4℃冰箱中用0.01M、pH7.4PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析 后的溶液冷冻干燥，得到糖类或含糖基化合物抗原，-20℃保存。

2、含羧基类化合物抗原的制备

准确称取实施例1中任一含羧基类化合物为0.01mol、N-羟基琥珀酰 亚(NHS)0.015mmol、碳二亚胺(EDC)0.02mol，加入5ml的N-N二 甲基甲酰胺(DMF)溶解，此溶液称为溶液A。溶液A室温搅拌，遮光 反应24h；

准确称取牛血清白蛋白(BSA)65mg(0.001mmo1)，加入0.01mol/L pH7.4PBS 5ml，此溶液称为溶液B。将反应好的溶液A逐滴加入溶液B 中，边加边搅拌，室温搅拌3h，反应结束后，在4℃冰箱中用0.01M pH7.4 PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析后的溶液冷冻干燥，得到羧基 类化合物抗原，-20℃保存。

3、含羟基类化合物抗原的制备

准确称取实施例1中任一羟基类化合物为0.1mmol，加5ml二甲亚砜 (DMSO)溶解，此溶液称为溶液A。0.15mmol氯乙酸钠加1ml蒸馏水 溶解，为溶液B；pH为10的氢氧化钠溶液为C液。先将溶液B加入A液， 在70℃边加边搅拌，然后加入C液，调pH为9～10，反应10h；

准确称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.015mmol、碳二亚胺(EDC) 0.02mol、含上述反应物0.01mol，加入5ml的N-N二甲基甲酰胺(DMF) 溶解，此溶液称为溶液D。溶液D室温，搅拌，遮光反应24h；

准确称取牛血清白蛋白(BSA)65mg(0.001mmo1)，加入0.01mol/L pH7.4PBS 5ml，此溶液称为溶液E。将反应好的溶液D逐滴加入溶液E 中，边加边搅拌，室温搅拌3h，反应结束后，在4℃冰箱中用0.01M pH7.4 PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析后的溶液冷冻干燥，得到含羟 基类化合物抗原，-20℃保存。

4、含醛和酮类化合物抗原的制备

准确称取实施例1中任一含醛或酮类化合物0.1mmol，加5ml吡啶溶 解，加0.15mmol O-羧甲基羟胺溶液在50℃搅拌反应3h，挥干吡啶，加 水溶解过滤，得到沉淀物，干燥。

准确称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.015mmol、碳二亚胺 (EDC)0.02mol、上述反应物0.01mol，加入5ml的N-N二甲基甲酰胺溶 解，此溶液称为溶液A。溶液A室温搅拌，反应24h；

准确称取牛血清白蛋白(BSA)65mg(0.001mmol)，加入0.01mol/L pH7.4PBS 5ml，此溶液称为溶液B。将反应好的溶液A逐滴加入溶液 B中，边加边搅拌，室温搅拌3h，反应结束后，在4℃冰箱中用0.01M pH7.4PBS透析3d，每天换液3次。最后将透析后的溶液冷冻干燥， 得到羧基类化合物抗原，-20℃保存。

5、多糖与蛋白质：可直接作为抗原使用。

实施例3：IgE抗体的制备

将实施例2制备的双黄连注射剂各组分的全抗原分别注射新西兰 大白兔进行免疫。以黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连 翘酯苷D、绿原酸的抗原为例。选21只健康雄性新西兰大白兔，分为 7组，每组3只。1组注射生理盐水作为对照，另6组分别用上述抗原 进行免疫。取浓度1mg.ml^-1的上述抗原溶液(用生理盐水溶解)2ml， 加等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后进行基础免疫，即于兔背部多点 注射，每只兔注射2ml(1mg)。20d后，以上述抗原溶液加等量体积弗 氏不完全佐剂进行加强免疫，剂量与基础免疫相同。初次免疫后分别 于2、4、8、12周共加强免疫4次，第4次免疫后3d，对家兔的耳缘 静脉采血，于4℃冰箱中静置过夜。

IgG的分离与纯化：取动物血清采用(NH₄)₂SO₄饱和溶液盐析出粗 免疫蛋白，再用半透膜除去小分子，过DEAE-52纤维素层析柱，用 PH7.4的PBS洗脱得到纯化的IgG。

IgM的分离与纯化：继续过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-200Superfine 层析柱，以0.01Mol·L^-1pH7.4PBS洗脱，用A₂₈₀值确定IgM浓度，用 SDS还原聚丙烯酰胺凝胶鉴定IgM纯度。

IgA的分离与纯化：再用0.1Mol·L^-1pH6.4PBS液洗脱，收集蛋白 峰，即为IgA。再过SephadexG200柱，洗液为0.01Mol·L^-1pH7.4PBS (0.14Mol·L^-1NaCl)，收集洗脱液测OD₂₈₀值，取第一峰即为纯化IgA。

IgD的分离与纯化：采用GS-I凝集素交联琼脂糖凝胶层析柱，以 PBS-CA缓冲液洗柱，监测洗脱液A₂₈₀值，再用预冷的PBS-CA-GAL 缓冲液洗脱IgD，于4℃进行透析精制得IgD。

IgE的分离：取DEAE-5210g，加入约15倍量的0.5mol/L NaOH 溶液，浸泡1h，搅拌。用布氏漏斗抽滤，超纯水洗涤至滤液接近中性。 然后将其浸泡于15倍量的0.5mol/L HCl溶液中1h，再抽滤，超纯水 洗涤至滤液呈中性。再按前述方法用碱液处理，超纯水洗至中性后， 将DEAE-52浸泡于起始缓冲液(pH 8.00.005mol/L PB缓冲液)中 1h，不时搅拌，换几次缓冲液，抽滤，至倾出液的pH值与PB液的 pH值相近为止。平衡好后装柱。

将前述的纯化的血清免疫球蛋白液加入到用pH 8.00.005mol/L PB缓冲液平衡好的DEAE-52层析柱中，先用pH 8.0的0.005mol/L PB 缓冲液洗脱，洗脱液不要，再用pH 8.00.025mol/L PB缓冲液洗脱，用 20％磺基水杨酸检测蛋白质，呈阳性时，开始收集洗脱液，待检验呈 阴性，停止收集，洗脱液用PEG-2000进行浓缩。

血清IgE的凝胶层析Sephadex G-200提取

取1.0g Sephadex G-200于100mL超纯水中，在90℃水浴中充分 溶胀5h，装柱。注意在水浴溶胀过程中，及时补足超纯水，以免蒸干。

将用DEAE-52粗分离的IgE样品加入到用pH 8.00.01mol/L PBS 缓冲液平衡好的Sephadex G-200凝胶层析柱中，以pH 8.00.01mol/L PBS缓冲液进行洗脱，用20％磺基水杨酸检测蛋白质，呈阳性时，开 始分管收集洗脱液，待检验呈阴性，停止收集，洗脱液用PEG-2000进 行浓缩，于4℃保存或-20℃分装冻存。

实施例4：抗IgE抗体的制备

参照实施例2的方法，将双黄连注射剂注射新西兰大白兔获得的 的IgE以0.1mg/mL免疫大鼠，方法同免疫新西兰大白兔，达到所需效 价后，进行心脏采血。取20ml大鼠血清，加生理盐水20ml，再逐滴加 入(NH₄)₂SO₄饱和溶液10ml，使成20％(NH₄)₂SO₄溶液，边加边搅拌， 充分混合后，静置30min，3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去 纤维蛋白；

在上清液中再加(NH₄)₂SO₄饱和溶液30ml，使成50％(NH4)₂SO₄溶液，充分混合，静置30min，3000r/min离心20min，弃上清；于沉 淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)₂SO₄饱和溶液10ml，使 成33％(NH₄)₂SO₄溶液，充分混合后，静置30min，3000r/min离心20min， 弃上清，以除去白蛋白，重复此步骤2～3次；

用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透 析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。以1％BaCl₂检查透析液中的SO₄^2-或以纳氏试剂检查NH₄⁺(取3～4ml透析液，加试 剂1～2滴，出现砖红色即认为有NH₄⁺存在，直至无SO₄^2-或NH₄⁺出现 为止；离心去沉淀(去除杂蛋白)，上清液即为粗提抗IgE抗体(即γ 球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白， Euglobin，含γ球蛋白)；过DEAE-纤维素层析柱，以0.01mol/L pH7.4PBS 洗脱，收集洗脱液得到纯化的抗IgE抗体IgG；然后预先准备大鼠抗IgE 抗体IgG血清。将抗IgE抗体IgG血清进行双相双扩散，如抗IgE抗 体IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线；测定抗IgE抗 体的含量。

实施例5：酶标板的制备

1、固定已知抗原的酶标板的制备

用于固定的已知抗原的制备：制备方法同实施例2，只是将制备方 法中的“牛血清白蛋白(BSA)65mg(0.001mmol)”改为“卵清白蛋白 (OVA)90mg(0.002mmol)”。

用包被液(每升含159g碳酸钠、29.3g碳酸氢钠的水溶液，pH9.6 或根据致敏原蛋白的特性选择的活化包被液)适当稀释制备的已知抗 原(即用于固定的已知抗原)为50ng/ml-10ng/ml的浓度，混匀，向 侍固定的活化处理过的酶标板微孔内每孔加入100μl；酶标板封膜后 4℃下反应过夜；倒掉固定的抗原溶液，洗板，每孔加入250μl封闭液 (0.2％的OVA的PBS缓冲液)，4℃下封闭过夜；倒空封闭液，用洗 涤液洗板4次，拍干；将酶标板真空干燥后，密封入带干燥剂的金属 箔袋内，在4℃贮存。

根据实施例1分离的双黄连注射剂的化学组分，近20种，酶标板 为12×8规格，按已知成分化学成分的拼音字母顺序排列为：黄芩苷、 连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸。

2、固定IgE抗体(包括已知与未知)的酶标板的制备

方法同上，将已知抗原替换为IgE抗体。根据实施例1分离的双 黄连注射剂的化学组分制备特异性抗体，共近20种，以黄芩苷、连翘 苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸抗原为例，酶标板 为12×8规格。

3、固定抗IgE抗体的酶标板的制备

方法同上，将已知抗原替换为抗IgE抗体，酶标板为12×8规格。

4、合成抗原及标记物盖芯片板的制备

将已知抗原或标记抗原用稀释液溶解并按规律制成盖芯片板。根 据实施例1分离的双黄连注射剂的化学组分制备特异性抗体，共近20 种，以黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原 酸抗原为例，盖芯片板为12×8规格。

实施例6：辣根过氧化物酶标记已知抗原、抗体和抗IgE抗体

将实施例2制备的全抗原和实施例4制备的抗IgE抗体进行标记， 方法如下：

(1)称取HRP溶解于1ml蒸馏水中，然后加入0.2mI新配的0.1mol/L NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20min；

(2)将上述溶液装入透析袋中，用1mol/L pH4.4的醋酸钠缓冲液透 析，4℃过夜；

(3)加20μl 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，调节HRP溶液的pH 值升高到9.0-9.5，然后立即在1ml 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中加入已知 抗原(抗体或抗IgE抗体)，室温避光轻轻搅拌2小时；

(4)加0.1ml新配的4mg/mL NaBH₄，混匀，4℃下再静置2小时；

(5)将上述溶液装入透析袋中，对0.01mol/L pH7.4PBS透析，4℃ 过夜，如有沉淀离心弃去；

(6)色谱柱中装入2ml ProteinA-Sepharose 4B Fast Flow；用5ml pH3.0柠檬酸钠缓冲液清洗柱，接着用10ml pH8.0的磷酸缓冲液清洗；

(7)用Tris调节上述制备的酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)溶液的pH 值至8.0，以约5ml/h的速度将酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)溶液上柱；

(8)用pH8.0的磷酸缓冲液清洗色谱柱，清洗流出液含非免疫球蛋 白等杂蛋白质；

(9)用10ml 0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液洗酶-抗原(抗体或抗IgE 抗体)，酶-抗原(抗体或抗IgE抗体)洗脱后柱用10ml磷酸缓冲液清 洗；

(10)在280nm处监控洗脱液的吸光度，收集大于基线的馏份，收 集的馏份迅速用2mol·L-1Tris溶液中和；

(11)收集的馏份过PDIO(SephadexG25)柱并用PBS交换洗脱馏份 的介质溶液；

(12)灭菌后，加入载体蛋白冷冻千燥，收集的酶-抗原(抗体或抗 IgE抗体)，贮存在4C以下的暗处。

实施例7：本发明所述芯片

固定有实施例2制备的全抗原的酶标板(即实施例5制备的已知 抗原酶标板)，规格为12×8，已知抗原的排列按其对应的化学组分英文 字母顺序排列。

辣根过氧化物酶标记的抗IgE抗体(即实施例6制备的辣根过氧 化物酶标记的抗IgE抗体)

洗涤液：含有占总体积0.05％的吐温20、pH值为7.4、浓度为 0.1mol/L的磷酸缓冲液

抗体稀释液：含有占总体积0.1％的明胶、pH值为7.4-7.6、浓度 为0.1mol/L的磷酸缓冲液

TMB显色液：每10ml包含4.2mgTMB的乙二醇溶液

终止液：2M的硫酸溶液。

实施例8：本发明所述芯片

固定有实施例3制备的IgE抗体(已知)的酶标板(即实施例5 制备的IgE抗体酶标板)，规格为12×8。

辣根过氧化物酶标记的抗IgE抗体(即实施例6制备的辣根过氧 化物酶标记的抗IgE抗体)。

洗涤液：含有占总体积0.05％的吐温20、pH值为7.4、浓度为 0.1mol/L的磷酸缓冲液

抗体稀释液：含有占总体积0.1％的明胶、pH值为7.4-7.6、浓度 为0.1mol/L的磷酸缓冲液

TMB显色液：每10ml包含4.2mgTMB的乙二醇溶液

终止液：2M的硫酸溶液。

实施例9：本发明所述芯片

固定有实施例3制备的IgE抗体(未知)的酶标板(即实施例5 制备的IgE抗体酶标板)，规格为12×8。

辣根过氧化物酶标记的已知抗原(即实施例6制备的辣根过氧化 物酶标记的已知抗原)。

洗涤液：含有占总体积0.05％的吐温20、pH值为7.4、浓度为 0.1mol/L的磷酸缓冲液

抗体稀释液：含有占总体积0.1％的明胶、pH值为7.4-7.6、浓度 为0.1mol/L的磷酸缓冲液，

TMB显色液：每10ml包含4.2mgTMB的乙二醇溶液

终止液：2M的硫酸溶液。

实施例10：本发明所述芯片

固定有实施例3制备的IgE抗体(未知)的酶标板(即实施例5 制备的IgE抗体酶标板)，规格为为12×8。

辣根过氧化物酶标记的抗体(即实施例6制备的辣根过氧化物酶 标记的抗体)

洗涤液：含有占总体积0.05％的吐温20、pH值为7.4、浓度为 0.1mol/L的磷酸缓冲液

抗体稀释液：含有占总体积0.1％的明胶、pH值为7.4-7.6、浓度 为0.1mol/L的磷酸缓冲液

TMB显色液：每10ml包含4.2mgTMB的乙二醇溶液

终止液：2M的硫酸溶液。

实施例11：本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法

用实施例7所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下：

将双黄连注射剂引起的致敏血清分别加入到固定有已知抗原的各 个检测孔中，每孔100μl，同时以相同加入量将稀释液加入到空白对照 中，然后在37℃下孵育45分钟。

③加样：向芯片板中每孔加入50μL的稀释成1∶20～4000的待测 血样液，室温恒温孵育1.5h；④洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔 加入250μL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑤向芯片板中每 孔加入酶标抗IgE抗体工作液100μL，室温恒温孵育1.5h；⑥洗涤：倾 出孔中液体，向芯片板中每孔加入250μL的洗涤液，静置5min后拍干， 重复三次；⑦加底物量：每孔加100uL四甲替联苯胺；⑧终止：每孔 加2mol·L-1硫酸50μl终止反应；⑨检测：用酶标仪测定每孔的吸光度， 算得致敏率进行判断。向各个检测孔以及空白对照中分别加入100μl 终止液，20分钟内在酶标仪的450nm波长下测出每孔的吸光度值，并 与空白对照吸光度值对比，当强度强于空白对照时，则已知抗原对应 的双黄连注射剂的化学组分为致敏原。

3)结果分析：

芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸的孔呈阳性反应，显 色；而连翘苷等成分的孔呈阴性反应，不显色。运用此方法筛选出双 黄连注射液中黄芩苷、绿原酸具致敏原性。

实施例12：本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法

用实施例8所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下：

①分别向芯片板中每孔加入50μL的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、 连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸全抗原溶液，室温恒温孵育1.5h； ②洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250uL的洗涤液，静置 5min后拍干，重复三次；③加样：向芯片板中每孔加入50μL的稀释 成1∶20～4000的待测血样液，室温恒温孵育1.5h；④洗涤：倾出孔中液 体，向芯片板中每孔加入250μL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三 次；⑤向芯片板中每孔加入酶标抗IgE抗体工作液100μL，室温恒温孵 育1.5h；⑥洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250μL的洗涤液， 静置5min后拍干，重复三次；⑦加底物量：每孔加100uL四甲替联苯 胺；⑧终止：每孔加2mol·L^-1硫酸50μl终止反应；⑨检测：用酶标仪测 定每孔的吸光度，算得致敏率进行判断。

3)结果分析：

芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸抗体的孔呈阳性反应， 显色；而连翘苷等的抗体孔呈阴性反应，不显色。运用此方法筛选出 双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸具致敏原性。

实施例13：本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法

用实施例9所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下：

①加样：分别向芯片板每孔加入含50μL的黄芩苷、连翘苷、连翘 酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸酶标记的全抗原溶液，室温 恒温孵育1.5h；②并设立空白对照，向芯片板每孔只加入50μL稀释液， 室温恒温孵育1.5h；③洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250μL 的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；④加底物量：每孔加100μL 四甲替联苯胺；⑤终止：每孔加2mol·L^-1硫酸50μl终止反应；⑥检测： 用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者进行判断，同时读 出致敏成分。

3)结果分析：

芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸抗体的孔颜色强于空 白对照的孔，而连翘苷等成分的抗体孔颜色弱于空白对照孔，运用此 方法筛选出双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸具致敏原性。

实施例14：本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片法方法

用实施例10所述芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方法如下：

①分别向芯片板中每孔加入含50μL的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷 A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸的全抗原溶液，室温恒温孵育1.5h； ②并设立空白对照，向芯片板每孔只加入含50μL稀释液，室温恒温孵 育1.5h；③洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250μL的洗涤液， 静置5min后拍干，重复三次；④向芯片板中每孔加入酶标抗体工作液 100μL，室温恒温孵育1.5h；⑤洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔加 入250μL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑥加底物量：每孔 加100μL四甲替联苯胺；⑦终止：每孔加2mol·L^-1硫酸50μl终止反应； ⑧检测：用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者进行判断， 同时读出致敏成分。

3)结果分析：

芯片中加入致敏者血样，已知黄芩苷、绿原酸抗体的孔颜色强于空 白对照的孔；而连翘苷等成分的抗体孔颜色弱于空白对照孔，运用此 方法筛选出双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸具致敏原性。

实施例15：本发明所述检测中药注射剂致敏原的底芯片与盖芯片 法方法

(1)筛选致敏原成分盖芯片产品的组成：

第一种方案：a.包被特异性抗IgE抗体的固相载体底芯片；b.黄 芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、连翘酯苷D、绿原酸的全抗 原溶液的盖芯片；c.辣根过氧化物酶标记过的抗体工作液5ml；d.浓缩 磷酸盐缓冲液(PBS)20ml；e.浓底物缓冲液5ml；f.底物储存液2ml：含 10mg·ml^-1四甲替联苯胺(TMB)的乙醇液；g.终止液2ml：2mol·L^-1硫 酸。h.3种化合物的致敏者IgE液各1瓶，按浓度需要分别配制系列 标准品液。

第二种方案：a.包被特异性抗IgE抗体的固相载体底芯片；b.辣 根过氧化物酶标记过的抗原溶液的盖芯片；c.浓缩磷酸盐缓冲液 (PBS)20ml；d.浓底物缓冲液5ml；e.底物储存液2ml，含10mg·ml^-1四甲替联苯胺(TMB)的乙醇液；f.终止液2ml：2mol·L^-1硫酸；g.3种 化合物的致敏者IgE液各1瓶，按浓度需要分别配制系列标准品液。

第一种方案：①加样：向底芯片板中每孔加入50μL的按1∶20～2000 稀释的待测血样溶液，室温恒温孵育1.5h；②洗涤：倾出孔中液体， 向芯片板中每孔加入250uL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次； ③向芯片板加入含50μL的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、 连翘酯苷D、绿原酸的全抗原盖芯片，底芯片与盖芯片每孔一一对应， 压紧，扎破盖芯孔，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，室温恒温孵育1.5h， 去掉盖芯片；④洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入250μL的洗 涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑤向芯片板中每孔加入酶标抗体 工作液100μL，室温恒温孵育1.5h；⑥洗涤：倾出孔中液体，向芯片板 中每孔加入250μL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑦加底物 量：每孔加100μL四甲替联苯胺；⑧终止：每孔加2mol·L^-1硫酸50μl 终止反应；⑨检测：用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者 进行判断，同时读出致敏成分。

第二种方案：①加样：向底芯片板中每孔加入50μL的按1∶20～2000 稀释的待测血样溶液，室温恒温孵育1.5h；②洗涤：倾出孔中液体， 向芯片板中每孔加入250uL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次； ③向芯片板加入含50μL的黄芩苷、连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷C、 连翘酯苷D、绿原酸的标记抗原盖芯片，底芯片与盖芯片每孔一一对 应，压紧，扎破盖芯孔，使底芯片孔与盖芯片溶液混合，室温恒温孵 育1.5h，去掉盖芯片；④洗涤：倾出孔中液体，向芯片板中每孔加入 250μL的洗涤液，静置5min后拍干，重复三次；⑤加底物量：每孔加 100μL四甲替联苯胺；⑥终止：每孔加2mol·L^-1硫酸50μl终止反应； ⑦检测：用酶标仪测定每孔的吸光度，根据致敏率对使用者进行判断， 同时读出致敏成分。

3)结果分析

芯片中加入血样，黄芩苷、绿原酸标记抗原(抗体)孔呈阳性反应， 显色；而连翘苷等成分标记抗原(抗体)的孔呈阴性反应，不显色。 故双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸为致敏原。

实施例16：本发明所述检测中药注射剂致敏原的免疫指纹图谱法 方法

为了避免中药注射剂化学组分分离的遗漏，本实施例用实施例5 包被的特异性抗IgE抗体的芯片进行双黄连注射剂致敏原的检测，方 法如下：

检测步骤：①按中药注射剂成分建立指纹图谱分析条件，并进行 方法学分析，用已知标准成分建立成分标准曲线；

②加样：向孔中加入50μL的按1∶20～2000稀释的待测血样溶液， 室温恒温孵育1.5h；③洗涤：倾出孔中液体，向孔加入250uL的洗涤 液，静置5min后拍干，重复三次；④加入中药注射剂液，室温恒温孵 育1.5h；⑤测定：吸出孔中未吸附成分液体，采用HPLC、HPLC/MS等 技术测定指纹图谱进行特征峰面积。

3)结果分析：根据中药注射剂指纹图谱特征峰前后变化作出是否为 致敏成分的判断。采用本方法对双黄连注射剂的致敏成分进行筛查， 其结果如下：

①HPLC检测条件：C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈∶ 1％醋酸水溶液；梯度洗脱：0min(8∶92)→15min(15∶85)→25 min(25∶75)→35min(70∶30)→40min(80∶20)→45min(8∶92)；UV检测波 长：0min-15min，324nm；15min-45min，274nm；流速1mL·min^-1； 柱温：25℃；进样量：10μL。将收集到的未结合液体与双黄连注射剂 分别进行HPLC检测，根据与双黄连注射剂指纹图谱特征峰差异确定 其致敏成分；

未结合液体与双黄连注射剂的谱图见图1、图2，具体结果见表1。

表1特异性IgE对双黄连注射剂中特征峰(成分)吸附影响

注：

A是双黄连注射剂指纹图谱峰面积，B是未结合液体指纹图谱峰面积。

④结论：通过采用指纹图谱分析方法，根据双黄连注射剂加入前 后对比特征峰的缺失来确定了致敏性成分。根据黄芩苷、绿原酸、连 翘苷的标准图谱可以看出双黄连注射剂32.147min出现的黄芩苷致敏 率为77.892％，31.552min出现的连翘苷的峰面积几乎不变，致敏率为 -1.981％，32.416min、33.564min、34.182min、37.758min、28.736min 出现的峰峰面积致敏率分别为19.9902％、29.0814％、41.6782％、 61.6244％、64.8356％，另外，18.971min、28.51min、29.962min、 31.773min、33.848min、35.139min出现的峰都消失了，所以峰面积致 敏率为1。根据致敏率的大小可以判定被抗体IgE吸附的特征成分为 35.139、33.848、31.773、29.962、28.51、18.971、32.147、28.736、37.758、 34.182、33.564min所对应的特征成分，这样就初步筛查出了双黄连注 射剂中可能的致敏原成分。结合实施例11、12可以判定双黄连注射剂 中黄芩苷、绿原酸具致敏性。其它特征峰成分用HPLC/MS确定结构， 再进行分离，补充制成芯片，按实施例11、12方法确定是否有致敏性， 这样芯片与指纹图谱相互补充可准确确定中药注射剂及代谢产物中的 致敏性成分。

本法还可以加入含药血样进行中药注射剂代谢产物的致敏原成分 筛查。

综合分析本芯片实验，双黄连注射液中黄芩苷、绿原酸具致敏原； 其它经HPLC确定指纹特征峰有差异的成分需进一步确认结构、分离 并按芯片法测定其致敏性。

上述实验表明本发明所述方法和芯片能够准确检测到中药注射剂 中的致敏原成分，可防止漏查。

值得指出的是：以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。