一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶活性的方法，该方法包括：（1）以磷含量为横坐标，吸光值为纵坐标，建立磷标准曲线；（2）将待检测样品中的植酸酶浸提出来，得到植酸酶的浸提液；（3）将植酸酶的浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的酶活性测定反应；（4）测定反应溶液的吸光值，对应磷标准曲线建立的直线回归方程计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据酶活计算公式计算出待检测样品的植酸酶活性。准确度和灵敏度试验结果表明，本发明方法测定结果准确性好、误差小、稳定性高、重复性好，变异系数也远低于现有的微板法。本发明检测方法具有高通量、检测效率高、操作简便、成本低、准确性高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植酸酶活性的测定方法，尤其涉及一种快速、高通量 的检测转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子的饲料中的植酸酶 活性方法，属于转基因作物种子植酸酶活性的测定领域。

背景技术

自1996至2010年，全球转基因作物的种植面积在十五年间增长了 87倍，截止2010年达到1.48亿公顷，且每年都以10％以上的速度增长。 迄今为止，共有59个国家批准种植或进口生物技术作物用于食物和饲料， 其中包括29个国家批准了生物技术作物的本地化种植，全世界75％的人 口居住在这59个国家。

截至目前所发展的转基因植物中，转基因玉米、大豆、棉花、油菜籽 和马铃薯等都与饲料有关，用于动物的日粮中，其中占转基因植物总种植 面积80％以上的玉米和大豆在饲料中广泛应用。世界上每年约有4000万 吨转基因玉米用于饲喂动物。大豆和豆粕是饲料中的主要蛋白原料，因此 用作饲料的转基因大豆也有约7400多万吨。加上棉籽粕和油菜籽粕，每 年用于饲料的转基因植物约为1.2亿吨以上。并且由于转基因技术的快速 发展，目前已有60～70％的饲料原料与转基因植物相关，例如抗虫的转基 因玉米和棉花，抗草甘膦的玉米和大豆等。正是由于转基因作物发展迅猛， 因此对转基因植物及其产品的检测方法也成为当今关注的技术。

玉米为中国的第一大粮食作物。2011年，中国玉米播种面积已达到 4.8亿亩，位居世界第二。中国玉米总需求量的近80％作为饲料，且这个 比例还在不断增加。转基因植酸酶玉米于2009年8月获中国农业部颁发 的《农业转基因生物安全证书》，获准进行生产应用，它是中国第一例批 准生产应用的转基因玉米。转基因植酸酶玉米是以玉米种子作为生物反应 器来生产植酸酶，通过生物技术和传统育种方法相结合，将具有自主知识 产权的植酸酶基因转化到玉米中，培育出具有高活性植酸酶并稳定遗传的 转基因玉米。植酸酶在动物的胃中释放出来而降解饲料中的植酸磷，从而 解决了饲料中植酸磷不能被动物吸收利用和导致环境污染等诸多问题。正 是由于植酸酶所具有的安全、环保、高效、经济等特点以及很好的社 会生态环境效益，因此，在欧洲大部分国家已强制在饲料中使用植酸酶， 目前中国市场上的单胃动物饲料中已经有90％添加了植酸酶，植酸酶的推 广应用可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷的排出量减少 40％，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便 造成的环境污染，还可降低植酸盐的抗营养作用，因此对提高畜牧生产效 益及降低其对环境的污染有重要意义。在转基因植酸酶玉米诞生之前，在 饲料中广泛使用的植酸酶是通过微生物发酵生产的，而转基因植酸酶玉米 使用将更为经济、方便、有效。按照目前的饲料工业发展现状，预计转植 酸酶基因玉米的市场需求量为每年5000万吨(1000单位植酸酶/公斤玉 米种子)，应用后可替代饲料中所添加的磷酸氢钙80万吨，减少动物粪 便中磷的排除量100万吨并降低饲料成本20亿元。

目前，国际上最常用的酶活性单位定义是在植酸钠浓度为5.0 mmol/L、温度37℃、pH值5.50的条件，每分钟从植酸钠中释放1μmol 无机磷即为一个植酸酶活性单位，国家标准GB/T 18634-2009也采用同样 的定义。植酸酶的活力测定原理是通过一些化学试剂与无机磷产生颜色反 应，从而确定无机磷的释放量。现有的测定转植酸酶作物种子中植酸酶活 性的方法有钼-钒酸铵法、硫酸亚铁-钼蓝法、Vc-钼蓝法和丙酮-磷钼酸铵 法。有研究发现，从灵敏度来说钼-钒酸铵法最好，硫酸亚铁-钼蓝法和 Vc-钼蓝法次之，丙酮-磷钼酸铵法最低(黄遵锡，章克昌，徐柔.植酸酶活 性测定不同方法的比较研究.饲料工业，1999，20(12)：20-22.)。但是， 丙酮-磷钼酸铵法的稳定性及抗干扰能力是最好的，常被用于测定饲料、 发酵产物中的植酸酶活性(陈琛.植酸酶活性测定方法的研究进展.中国饲 料，2010，2016-18.)。

公开号为CN 101914508A(发明名称：一种基于96孔板的植酸酶 高通量筛选方法)的中国发明专利公开了一种高通量的测定植酸酶活性的 方法，该方法在钼-钒酸铵法测定植酸酶活性的基础上建立微板法测定植 酸酶活性的方法，虽然该方法一次能检测较多数量的样品，具有高通量检 测的优点，但是该检测方法存在误差较大、稳定性低，变异系数高等缺陷， 有待改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的检测转植酸酶作物植酸酶 活性的方法所存在的缺陷，提供一种高通量测定转植酸酶作物种子或添加 有转植酸酶作物种子的饲料中植酸酶活性的方法，该方法具有检测效率 高，误差小，稳定性高，变异系数较小，重复性好等优点。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种高通量测定转植酸酶作物种子中植酸酶酶活性或添加有转植酸 酶作物种子的饲料中植酸酶酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)、以磷含量为横坐标，OD₄₁₅吸光值为纵坐标，建立标准曲线；

(2)、将待检测样品(转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种子 的饲料)中的植酸酶浸提出来，得到转植酸酶作物种子的植酸酶浸提液或 添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液；

(3)、将所提取得到的植酸酶浸提液在96孔微孔板中进行植酸酶的 酶活性测定反应；

(4)、酶活性测定反应结束后测定反应溶液的吸光值，对应标准曲线 建立的直线回归方程，计算出各个待测样品中的磷浓度，再依据下列公式 计算出待检测样品中的植酸酶活性：

$U/g=\frac{Y}{m\times 30}\times N;$

Y-样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应磷的浓度(mmol/L)；

N-样品溶液的稀释倍数；

m-样品质量(g)；

30-反应时间，min。

其中，所述的转植酸酶作物种子可以是转植酸酶玉米、转植酸酶大 豆、转植酸酶棉花种子、转植酸酶油菜籽或转植酸酶马铃薯，优选为转植 酸酶玉米。

优选的，步骤(1)中按照以下方法建立标准曲线：

(a)、制备磷标准溶液；

(b)、将磷标准溶液梯度稀释；优选的，所述的梯度稀释是将标准 溶液稀释成1.5625mmol/L、2.5000mmol/L、3.1250mmol/L、5.0000 mmol/L和6.2500mmol/L的溶液；

(c)、将梯度稀释液分别取40μl，先加入250mmol/L的40μl 乙酸缓冲液，37℃预热，再加入显色液80μl，37℃保温，最后加入15 mmol/L的40μl植酸钠溶液，室温静置后波长415nm处测定样品吸光值， 绘制标准曲线。

优选的，步骤(2)中按照以下步骤浸提得到植酸酶浸提液：(a) 将样品研磨后过筛，混匀备用；优选的，所述的过筛是过0.45mm的标准 筛；(b)样品浸提：向过筛后的样品中加入植酸酶提取缓冲液，震荡、 离心，取上清；将上清再次离心，弃沉淀，取上清液，得到转植酸酶作 物种子的植酸酶浸提液或添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提 液。

本发明人通过大量的实验发现，在测定添加有转植酸酶作物种子的 饲料样品时，采用以下步骤的处理能够有效降低了酶活性测定时的干扰， 从而有效提高植酸酶酶活测定的准确度：

将所得到的添加有转植酸酶作物种子的饲料的植酸酶浸提液稀释 后加入到超滤离心管(通过超滤离心管，在保证酶蛋白浓度不变的前提 下，可以将饲料样品浸提液中的无机磷等杂质进行充分稀释，大大降低 了其对测定结果的影响，从而显著提升了测定结果的准确性和可重复性) 中，离心，弃去下层液体，直到剩余的体积为与稀释前的饲料样品植酸 酶浸提液的体积相等为止；此时样品中的蛋白浓度没有变化，而无机盐 离子浓度被稀释了10倍，降低了酶活性测定时的干扰。

其中，所述的稀释优选用pH值为5.5的乙酸缓冲液进行稀释，所 加入的乙酸缓冲液与饲料样品植酸酶浸提液的体积比优选为10∶1；所 述的超滤离心管优选为截留量为3000道尔顿的超滤离心管。

优选的，步骤(3)中将所述酶活性测定反应的反应溶液总体积控 制为200μl；更优选的，所述酶活性测定反应包括以下步骤：

取40μl待检测样品的植酸酶提取上清液，加入40μl pH值为5.5 的250mmol/L乙酸缓冲液，37℃预热5min，再加入40μl的15mmol/L 植酸钠溶液，37℃保温30min，最后加入显色液80μl，室温静置10min； 其中，从加入植酸钠底物开始，每个孔加样时间间隔一致，控制每个反 应时间均为30min。

步骤(4)中酶活性测定反应完毕后，反应液如果出现浑浊，以 4000r/min离心10min，吸出上清液再测定吸光值读数；反应液如果没有 浑浊，直接将整块96孔微孔板放入微孔板连续波长生物测读仪内测定吸 光值读数；

其中，所述的测定吸光值读数是在415nm处测定吸光值读数。

本发明方法测定植酸酶活性体系总体积仅为200μl，小于现有的微 板法(公开号为CN 101914508A，发明名称：一种基于96孔板的植酸酶高 通量筛选方法)的300μl，使用的植酸钠(植酸钠底物很昂贵)更少，更 加节约实验成本。本发明方法测定时加入样品量为40μl，占反应体系的 1/3体积，这样可以减少由操作带来的系统误差。本发明方法可以同时测 定30组转植酸酶基因玉米种子或含植酸酶的饲料样品的植酸酶活性，实现 了大量转基因植株或饲料样品的同时测定。

准确度和灵敏度试验结果表明，本发明检测方法测定结果准确性好， 误差小，稳定性高，同一样品多次重复的重复性也很好，变异系数远低于 现有的微板法。

附图说明

图1磷的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围 构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和 范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改 和替换均落入本发明的保护范围内。

一、试剂与溶液

1.磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基 准磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液(250mmol/L)溶解并定 容后形成磷标准溶液。

2.乙酸缓冲液(250mmol/L)：称取20.52g无水乙酸钠，加水搅拌 溶解，用冰乙酸调节pH至5.5，再转移至1000ml容量瓶中定容，4℃存放。

3.植酸酶抽提缓冲液：称取20.52g无水乙酸钠，加水搅拌溶解，用 冰乙酸调节pH至5.5，再转移至1000ml容量瓶中定容，4℃存放。用前加 入0.075％的TritonX-100。

4.植酸钠(15mmol/L)：称取植酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂，相对分子量为923.8， 纯度为95％)1.38g，用乙酸缓冲液溶解，用冰乙酸调节pH至5.5，再转移 至1000ml容量瓶中定容，4℃存放。

5.硝酸溶液：1份浓硝酸加入2份水。

6.钼酸铵贮液(100g/L)：称取10g钼酸铵，加水溶解，定容至100 ml，置棕色瓶4℃保存。

7.偏钒酸铵(2.35g/L)：称取0.235g偏钒酸铵溶于水，加入2mL 硝酸溶液，必要时可微加热。然后定容至100mL，棕色试剂瓶，避光4℃保 存。

8.酶促反应终止液及显色液：取2份的硝酸溶液，1份的钼酸铵溶液， 1份偏钒酸铵溶液，混合后使用，现用现配。

二、仪器和设备

分析天平：感量0.1mg；

微孔板连续波长生物测读仪，微孔板恒温振荡器，圆周震荡摇床，磁 力搅拌器，涡流式混合器，pH计，离心机，研磨仪。

实施例1本发明高通量测定转植酸酶作物种子或添加有转植酸酶作物种 子的饲料中植酸酶酶活性方法的建立

一、标准曲线绘制

将磷标准溶液用乙酸缓冲液稀释成1.5625mmol/L、2.5000mmol/L、 3.1250mmol/L、5.0000mmol/L和6.2500mmol/L的溶液。按照表1的 操作步骤进行反应，然后室温静置10min后波长415nm处测定吸光值。以 磷含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

二、试样溶液的制备

1.样品研磨处理

研磨管中装样品(转植酸酶玉米或含有该转植酸酶玉米饲料)，加入 钢珠，放置在研磨仪中，速度定为1400strokes/min，每次30sec，每个样 品要至少进行两次研磨。两次进行完毕后，取出查看研磨程度，假如不能 达到要求，继续时每进行一次就要查看研磨程度是否达到要求。继续研磨时 速度酌情增加至1500strokes/min、1600strokes/min、1700strokes/min， 但最大不能超过1700strokes/min。研磨后的样品通过0.45mm的标准 筛，充分混匀。

对于饲料样品，使用分析研磨机进行研磨，研磨后的样品也通过 0.45mm的标准筛，充分混匀。

2.样品浸提

准确称取样品100mg，每个样品同时称取2管(平行样)，每管加入 1mL植酸酶提取缓冲液，在圆周震荡摇床上震荡60min，震荡速度为 720rpm/min。然后离心10min，4000r/min，吸取上清。将上清再次离心 10min，4000r/min，弃沉淀。

三、酶活性测定

酶活性测定反应均在96孔微孔板中进行，取40μl样品上清液(每 个待测样品同时测定3个孔为平行)，加入40μl的pH值为5.5的乙酸 缓冲液(250mmol/L)，在微孔板恒温振荡器上37℃预热5min，再加入 40μl植酸钠(15mmol/L)溶液，37℃保温30min，最后加入显色液80μ l，室温静置10min。所有操作程序按照表1所示，从加入植酸钠底物开始， 每个孔加样时间间隔要绝对一致，保证反应时间精确到30min。

表1

四、测定反应及计算

反应完毕后，试样如果出现浑浊则需要在离心机上以4000r/min离心 10min，吸出上清液读数。如果没有浑浊，直接将整块96孔微孔板放入微 孔板连续波长生物测读仪内，415nm处测定吸光值，对应标准曲线建立的 直线回归方程，计算出各个样品中的磷浓度，再依据下列公式计算出植酸 酶活性。

$U/g=\frac{Y}{m\times 30}\times N$

Y-样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应磷的浓度(mmol/L)

N-样品溶液的稀释倍数

m-样品质量(g)

30-反应时间，min；

试验例1本发明测定方法的评价试验

1、本发明方法样品检测的准确度

精确称取磷酸二氢钾，配成4.17mM溶液，采用本发明实施例1的方法， 重复测定3次，根据所建立的标准曲线计算出其无机磷的含量，并分析其 准确度。测定结果见表2。测定结果表明，本发明方法测定误差＜5％。

表2

  理论数值(mM)   4.17   4.17   4.17   测定数值(mM)   4.26   4.30   4.38   误差   2.12％   3.12％   4.9％

精确称取磷酸二氢钾，配成4.17mM溶液，按照公开号为CN 101914508 A(发明名称：一种基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法)的发明专利说 明书中所公开的微板法(即：公开号为CN 101914508A的专利公布说明书 第3页倒数第1-20行所公开的“微板法”)进行测定(注：微板法中的 “颜色/终点混合液”的配法和使用按照国标法(GB/T 18634-2009)中的 “颜色/终点混合液”的配制和使用)。重复测定3次，根据所建立的标准 曲线计算出其无机磷的含量，并分析其准确度。测定结果见表3，结果表 明，该方法测定的误差平均为9.29％左右(表3)。

表3

  理论数值(mM)   4.17   4.17   4.17   测定数值(mM)   4.51   4.56   4.60   误差   8.14％   9.45％   10.27％

2.本发明方法测定浓度的线性范围及最低检测浓度

配制浓度为25mM、12.5mM、8.33mM、6.25mM、5mM、3.125mM、 2.5mM、1.5625mM、1.25mM、0.78125mM、0.625mM和0.5mM的无机 磷，用本发明实施例1的方法测定吸光值，以OD₄₁₅值为纵坐标，无机磷浓 度为横坐标作出曲线，并作回归分析。结果只有8.33mM-0.5mM的浓度范 围内回归方程相关系数可以达到0.99(图1)，所以确定检测无机磷浓度 范围是8.33mM-0.5mM，且最低检出浓度为0.5mM。

试验例2采用本发明方法测定转植酸酶玉米样品中植酸酶酶活的试验

选取转植酸酶基因玉米种子分别采用实施例1的方法和在中国专利 CN101914508A(一种基于96孔板的植酸酶高通量筛选方法，公开日2010 年12月15日)中提到的微板法(即：说明书第3页倒数第1-20行所公开 的“微板法”)进行酶活性的测定，每个样品重复测定3次，测定结果如表 4所示。试验结果表明，本发明方法测定的结果稳定性较好，变异系数＜6％， 而用微板法测定的变异系数较大，有些样品变异系数＞10％。同时，应用本 方法测定时的变异系数也远小于常规国标法(GB/T 18634-2009)中标注的 相对偏差8％。

表4玉米样品测定结果

试验例3采用本发明方法测定饲料样品中植酸酶酶活的试验

选取添加了转基因玉米种子的不同动物饲料(肉鸡、猪和鱼)进行酶 活性的测定，本发明发现，由于动物饲料的配方中有多种无机盐，在进行 植酸酶活性测定的时候本底较高，影响测定结果。因此，本发明通过试验 发现在饲料样品的浸提之后，增加一步稀释替换缓冲液的处理步骤可以有 效降低干扰，进而提高检测的准确度；具体处理步骤如下：

将浸提得到的上清液500μl用乙酸缓冲液稀释到5ml，加入截留量为 3000道尔顿的超滤离心管，8000rpm/min离心，弃去下层液体，直到剩余 的体积为500μl。此时样品中的蛋白浓度没有变化，而无机盐离子浓度被 稀释了10倍，降低了酶活性测定时的干扰。

使用本发明的方法重复测定每个处理后(将饲料样品的植酸酶浸提液 按照上述步骤增加一步稀释替换缓冲液的处理步骤)和未处理(将饲料样品 的植酸酶浸提液没有增加一步稀释替换缓冲液的处理步骤)的样品3次，结 果如表5所示。发现通过样品浸提后的稀释替换缓冲液的处理，其测定结 果稳定性获得很大提高，变异系数＜13％，远低于未处理(没有增加一步稀释 替换缓冲液的处理步骤)的样品。符合常规国标法(GB/T 18634-2009)中 规定的不大于15％。

同时，采用微板法(CN101914508A中的微板法，即：说明书第3页倒数 第1-20行所公开的“微板法”)对处理后(将饲料样品的浸提液按照上述步 骤增加一步稀释替换缓冲液的处理步骤)的饲料样品按照CN101914508A中 的微板法进行酶活性测定，测定结果发现，采用微板法测定的变异系数较大 (表5)。

表5饲料样品酶活性测定结果

由上述实验结果可知，本发明方法利用96孔微孔板能够快速、高通量 的测定转基因玉米以及添加了转基因玉米饲料中的植酸酶活性。本发明检 测方法与常规国标法(GB/T 18634-2009)相比，降低了检测无机磷的最低 浓度，对玉米种子酶活性测定变异系数降低到8％以下。同时，在进行饲料 样品的测定时，通过缓冲液的替换，消除了饲料配方中无机磷对测定结果 的干扰，使变异系数CV％＜13％。