侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯

摘要

本发明公开了一种侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯，所述侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯由具有生物相容性和生物可降解性的环酯类单体和环状磷酸酯单体构成。本发明通过制备一种环状磷酸酯单体，与其它环酯单体进行开环共聚反应，制备得到含有（甲基）丙烯酸酯类基团的嵌段或无规聚酯，无需保护和脱保护过程；并且由于所述含有（甲基）丙烯酸酯类基团的嵌段或无规聚酯侧链含有（甲基）丙烯酸酯类基团，可进一步利用迈克尔加成反应对其进行功能化修饰，最终制得侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料科学领域，具体涉及一类生物相容、生物可降解性的含聚磷酸酯两亲性嵌段共聚物和无规共聚物的制备方法和功能化修饰。 

背景技术

随着医学和材料科学的的发展，生物可降解高分子材料越来越受到人们的关注。目前研究和应用较多的生物可降解高分子材料包括胶原、明胶、甲壳素、淀粉等天然生物降解材料和聚原酸酯、聚碳酸酯、聚磷酸酯、脂肪族聚酯等合成生物可降解高分子 [Prog. Polym. Sci., 2007, 32, 762-798.]。与天然可降解材料相比，生物可降解高分子材料具有制备灵活、结构多样、降解性能和机械性能等均可以较为方便得到控制而尤其受到关注。生物可降解高分子材料一般由可以发生水解或者被微生物和酶降解的结构单元构成，其降解产物可以随着生物体新陈代谢而被排出体外。因此，它们在药物、基因载体和组织工程等领域得到广泛的应用。脂肪族聚酯如聚己内酯（PCL）、聚丙交酯（PLA）、丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）和聚碳酸酯如聚三亚甲基环碳酸酯（PTMC）等是最常用的合成生物可降解高分子。然而，传统的生物可降解聚合物也有一些自身的不足，例如：过强的疏水性、结构比较单一、缺乏可修饰的官能团或反应位点等；另一方面，生物医学技术的发展需要多功能性的、具有生物活性的合成生物材料 [Nat. Mater., 2009, 8, 457-470.]。因此，对已有的合成生物可降解材料进行改性、赋予其多种功能性是一项非常有意义的研究。近年来，已有一些文献报道合成含丙烯酰氧基、烯丙基、或者炔基/叠氮基功能基团的生物可降解聚合物，并通过聚合后修饰的方法可以很容易地进一步对这些功能性基团进行各种修饰 [Angew. Chem., Int. Ed., 2009, 48, 48-58.]。 

然而，许多有关生物可降解聚合物修饰的研究主要集中在疏水性聚酯，如聚己内酯、聚碳酸酯等，而对于可生物降解的两亲性聚酯进行修饰的研究相对较少。两亲性聚合物是指在同一高分子链中同时含有亲水和亲油两种化学性质不同链段的聚合物。由于存在两种不同化学结构的链段，其溶液性质往往有不同于一般共聚物的表现，两亲性聚合物在选择性介质中可以组装成各种形态，如胶束、囊泡等。尤其在生物医学领域，由于两亲性共聚物在水相中组装成内核疏水、外壳亲水的聚合纳米粒子，这些纳米粒子的高效药物给药系统引起科学工作者的广泛兴趣。其中，将生物可降解高分子引入两亲性聚合物结构中并用于构建给药系统的研究具有潜在的应用价值，因为生物可降解材料的使用可以避免药物释放后载体材料在人体器官组织内积聚，产生毒副作用。此外，在这些共聚物的亲水性链段中可引入羟基、羧基、氨基等基团，进一步与其它有机化合物反应并赋予其新的功能。然而，尽管目前常使用的亲水性链段都具备良好的生物相容性，如聚乙二醇（PEG）、聚甲基丙烯酸羟丙酯（PHPMA）等，但它们的生物降解性能一般都比较差；此外，能够对它们进行的功能化修饰的方法也比较单一、并且步骤较为繁琐。因此，寻求一种既兼备良好的生物相容性和生物可降解性能、又能简便易行进行功能化修饰的高分子材料来解决上述问题，显得尤为重要，并且具有重要的理论意义和潜在的应用价值。 

聚磷酸酯 (Polyphosphoester)是一类由磷酸酯键连接主链结构单元的生物可降解高分子材料，其结构类似于天然含磷大分子，具有较强的生物相容性、细胞亲和性和细胞膜的通透能力，在生物医学领域中愈来愈受到关注 [Macromol. Biosci., 2009, 9, 1154-1164.]。而且由于聚磷酸酯主链上含有五价的磷原子，侧链更容易被功能化，可以很方便地修饰上各种功能基团。公开号为CN 101633730的中国发明专利申请公开了一种聚磷酸酯和聚乳酸的三嵌段共聚物的制备方法，并将其制成纳米颗粒用做药物载体。公开号为CN 101205302的中国发明专利申请公开了一种聚磷酸酯和聚己内酯的三嵌段共聚物，以及由该嵌段共聚物制得的纳米颗粒。公开号为CN 101585919的中国发明专利申请公开了一种具有生物相容性的超支化聚磷酸酯及其制备方法。 

但是，这些报道都是制备得到含有某一特定官能团的聚磷酸酯共聚物。据我们所知，至今还未有文献或专利报道这类可以方便地进行功能基团调控、完全可以生物降解的两亲性共聚物模型。 

发明内容

本发明的发明目的是提供一种生物可降解型的两亲性聚酯的合成方法以及对亲水性聚磷酸酯侧基进行功能化修饰的方法。 

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯，由具有生物相容性和生物可降解性的环酯类单体和环状磷酸酯单体构成，所述侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯的结构式选自以下两种结构式中的一种： 

嵌段共聚物 ，

或无规共聚物；

式中，其中，R₁选自：甲基或氢原子中的一种；R₂选自：、 或中的一种；R₃选自：、、、或中的一种；共聚物的数均分子量为8000～50000 g/mol，m=30～100，n=4～50，y/(x+y)=10%～60%。

上述所述侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯的制备方法包括以下步骤： 

(1) 制备含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的环状磷酸酯单体：以四氢呋喃（THF）为溶剂、三乙胺（TEA）为缚酸剂，以丙烯酸羟乙酯（HEA）或甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）中的一种与2-氯-2-氧代-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（COP） 为反应物，制备得到含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的环状磷酸酯单体2-丙烯酸乙酯氧基-2-氧代-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（OPEA）或2-甲基丙烯酸乙酯氧基-2-氧代-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（OPEMA），其化学结构式为：

；式中，R₁选自：甲基或氢原子中的一种；

(2) 制备侧链含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的两亲性聚酯：以苄醇为引发剂、甲苯作溶剂、辛酸亚锡为催化剂，以步骤(1)制得的（甲基）丙烯酸酯类功能基团的环状磷酸酯单体与其它环酯单体进行嵌段共聚反应或无规共聚反应，获得侧链含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的两亲性聚酯，其化学结构式为：

嵌段共聚物，

或无规共聚物；

所述其它环酯单体可以选自但不限于：己内酯（ε-CL）、丙交酯（LA）或三甲基环碳酸酯（TMC）中的一种。

上述技术方案中，以步骤(1)制得的（甲基）丙烯酸酯类功能基团的环状磷酸酯单体与其它环酯单体进行嵌段共聚反应的具体过程为： 

(a) 在甲苯溶液中，以辛酸亚锡为催化剂，90 ℃条件下，苄醇引发环酯单体开环聚合，反应24小时，产物用冰乙醚沉淀2次，得到末端带羟基的大分子引发剂；

(b) 将上述(a)得到的大分子引发剂在甲苯溶液中进一步引发步骤（1）中制备的环状聚酯开环聚合，制备得到侧链含有（甲基）丙烯酸酯类功能基团的嵌段共聚物。

上述技术方案中，以步骤(1)制得的（甲基）丙烯酸酯类功能基团的环状磷酸酯单体与其它环酯单体进行无规共聚反应的具体过程为：采用开环聚合的方法，以辛酸亚锡为催化剂，将苄醇、步骤（1）中制备的环状聚酯、另一类环酯单体以及辛酸亚锡依次加入甲苯溶液，90 ℃条件下，反应24小时，产物用冰乙醚/甲醇=10/1（v/v）混合溶液沉淀2次，得到侧链含有（甲基）丙烯酸酯类功能基团的无规共聚物。 

由于上述侧链含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的两亲性聚酯均含有（甲基）丙烯酸酯类功能性基团，可以利用迈克尔加成反应对聚合物进行侧链修饰，选择性键接-COOH、-OH、-NH₂、-RGD等基团，优选的技术方案中，进一步地对步骤(2)所得侧链含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的两亲性聚酯的侧链功能化修饰：利用迈克尔加成反应，用含巯基（-SH）的有机化合物与上述侧链含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的两亲性聚酯中的聚磷酸酯的侧链双键进行反应，对两亲性聚酯进行功能化修饰，获侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯；所述含巯基（-SH）的有机化合物选自：巯基丙酸、3-巯基-1, 2-丙二醇、半胱胺盐酸盐或半胱氨酸盐酸盐中的一种； 

所述侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯的结构式选自以下两种结构式中的一种：

嵌段共聚物，

或无规共聚物；

式中，其中，R₁选自：甲基或氢原子中的一种；R₂选自：、 或中的一种；R₃选自：、、、或中的一种；共聚物的数均分子量为8000～50000 g/mol，m=30～100，n=4～50，y/(x+y)=10%～60%。

上述技术方案中，对步骤(2)所得侧链含（甲基）丙烯酸酯类功能基团的两亲性聚酯的侧链功能化修饰的具体方法为：以DMF为溶剂，以弱碱为催化剂，按摩尔比，[（甲基）丙烯酸酯]∶[-SH]=1∶1～20，[-SH]∶[弱碱]=1∶1，于室温下搅拌72 小时，获得侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯；所述弱碱催化剂可以选自但不限于：吡啶、三乙胺或四丁基氟化铵中的一种。 

本发明同时要求保护上述侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯在制备生物组织工程支架和药物释放体系中的应用。 

本发明的主要思路为：首先制备一种含有（甲基）丙烯酸酯类功能基团的环状磷酸酯单体，这类单体与其它环酯单体可以发生嵌段共聚或者无规共聚，得到侧链带有（甲基）丙烯酸酯类功能基团的嵌段共聚物或无规共聚物，最后通过迈克尔加成反应，用含巯基（-SH）的有机化合物与上述共聚物中聚磷酸酯的侧链双键进行反应，选择性地在该生物可降解型两亲性聚酯分子侧基上键接-COOH、-OH、-NH₂、-RGD等功能基团。 

由于上述技术方案的运用，本发明相对于现有技术具有如下特点： 

1. 本发明通过制备一种环状磷酸酯单体，与其它环酯单体进行开环共聚反应，制备得到含有（甲基）丙烯酸酯类基团的嵌段或无规聚酯，无需保护和脱保护过程；并且由于所述含有（甲基）丙烯酸酯类基团的嵌段或无规聚酯侧链含有（甲基）丙烯酸酯类基团，可进一步利用迈克尔加成反应对其进行功能化修饰，最终制得侧链功能化修饰的生物可降解型两亲性聚酯。

附图说明

图1为实施例一中制备的磷酸酯单体OPEA的核磁共振氢谱（¹H NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）； 

图2为实施例一中制备的磷酸酯单体OPEA的核磁共振碳谱（¹³C NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图3为实施例二中制备的大分子引发剂PCL₄₀的核磁共振氢谱（¹H NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

表1为实施例二、三和四中制备的大分子引发剂PCL的分子量及其分布；

图4为实施例五、六和七中制备的不同比例的聚己内酯与聚磷酸酯的嵌段共聚物PCL-b-POPEA的核磁共振氢谱（¹H NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图5为实施例五中嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀的核磁共振碳谱（¹³C NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图6为实施例八中制备的己内酯与磷酸酯无规共聚物PCL-co-OPEA的核磁共振氢谱（¹H NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图7为实施例一中制备的磷酸酯单体OPEA（图7（A））和实施例五中制备聚磷酸酯类嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀（图7（B））的核磁共振磷谱（³¹P NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图8为实施例九、十、十一和十二中嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀经迈克尔加成反应，修饰产物的核磁共振氢谱（¹H NMR）谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图9为实施例十三中嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀的荧光测试图；

图10为实施例十三中嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀的扫描电镜(TEM)照片；

表2为实施例五、六和七中嵌段共聚物的临界胶束浓度（CMC）、粒径大小及其分布；

图11为实施例五、九、十、十一和十二中嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀及其迈克尔加成产物的细胞毒性测试图；

图12 为实施例十五嵌段聚合物PCL₇₀-b-POPEA₅₀包载阿霉素的药物释放曲线；

图13 为实施例十六嵌段聚合物PCL₇₀-b-POPEA₅₀在A549肿瘤细胞中的内吞作用的荧光跟踪照片。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 

实施例一描述磷酸酯单体2-丙烯酸乙酯氧基-2-氧代-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（OPEA）的制备方法。

实施例一：OPEA（HEA:TEA:COP=1:1:1）的合成方法 

预先将反应装置和针筒放在120 ℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，放在保干器中冷却至室温。

在带有恒压滴液漏斗的250 mL三颈烧瓶中，在氩气气氛中，先加入10.2915 g 丙烯酸羟基乙酯（HEA，0.0886 mol），用针筒注入100 mL 干燥THF充分溶解后，再注入8.7910 g 缚酸剂三乙胺（TEA，0.0886 mol），搅拌均匀。用针筒向恒压滴液漏斗中注入11.4861 g 2-氯-2-氧代-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（COP，0.0886 mol），再加入25 mL干燥THF溶解。通入氩气约5 分钟，将反应装置移至-20 ℃低温反应浴中，开启搅拌，冷却半小时后，边搅拌边开始慢慢滴加恒压滴液漏斗中的COP与THF的混合物，约半小时滴完，继续反应12小时。反应过程中产生的大量白色沉淀为三乙胺盐酸盐。

反应结束后，将反应装置移出低温反应浴，静置至达到室温，过滤除去三乙胺盐酸盐，滤液经旋蒸除去THF，得到粗产物。将粗产物加入到50 mL干燥的无水乙醚中沉淀，过滤除去少量三乙胺盐酸盐，收集滤液，旋蒸除去乙醚，得到的无色透明黏状液体即为产物OPEA，产率约为67%。产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）、核磁共振碳谱（¹³C NMR）及核磁共振磷谱（³¹P NMR）验证其结构，磷酸酯单体OPEA的核磁共振氢谱谱图（¹H NMR）见图1所示，核磁共振碳谱谱图（¹³C NMR）见图2所示，核磁共振磷谱谱图（³¹P NMR）见图7（A）所示。 

实施例二～四描述大分子引发剂PCL-OH的制备方法。 

实施例二： PCL₄₀-OH（BzOH: ε-CL:Sn(Oct)₂=2:80:1）的制备方法 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入4.9038 g 己内酯（ε-CL，0.043 mol）,针筒注入10 mL的甲苯搅拌溶解，用微量注射器注入0.1161 g 苄醇（BzOH，1.075 mmol），充放气驱除支管瓶中空气和氧气，将反应瓶移至90 ℃油浴，搅拌反应30 分钟后迅速加入0.1740 g 辛酸亚锡（Sn(Oct)₂，5.375 mmol），在90 ℃下反应24小时。加入两滴醋酸终止反应，旋蒸除去部分溶剂，将粗产物溶于氯仿中，用80 ml冰乙醚沉淀2次，过滤所得产品为白色粉末状物，置于真空干燥箱中干燥至恒重。称重，计算产率约为73.3 %。采用核磁共振氢谱（¹H NMR）验证聚己内酯（PCL）的结构，（见图3），凝胶渗透色谱（GPC）验证其数均分子量（）和分子量分布（/）。分子量及其分布见表1。 

表1  PCL大分子引发剂的分子量及其分布 

^a由¹H NMR决定. ^b 由GPC决定. 

获得的聚己内酯（PCL_n-OH），分子链末端含有羟基（-OH），可以作为下一步磷酸酯单体开环聚合的引发剂，其下标n表示聚己内酯的聚合度。

实施例三： PCL₇₀-OH（BzOH: ε-CL:Sn(Oct)₂=2:140:1）的制备方法 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120 ℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入5.80 g己内酯（ε-CL，0.0509 mol）,针筒注入10 mL的甲苯搅拌溶解，用微量注射器注入0.0785 g 苄醇（BzOH，7.268 mmol），充放气驱除支管瓶中空气和氧气，将反应瓶移至90 ℃油浴，搅拌反应30 分钟后迅速加入0.13 g 辛酸亚锡（Sn(Oct)₂，3.643 mmol），在90 ℃下反应24小时。反应由两滴醋酸终止，旋蒸除去部分溶剂，将粗产物溶于氯仿中，用80 mL冰乙醚沉淀2次，过滤所得产品为白色粉末状物，置于真空干燥箱中干燥至恒重。称重，计算产率约为85.6 %。采用核磁共振氢谱（¹H NMR）验证聚己内酯的结构，聚合物的核磁氢谱谱图的化学位移峰与实施例2的图3类似；凝胶渗透色谱（GPC）验证其数均分子量（）和分子量分布（/）。分子量及其分布见表1。 

实施例四： PCL₉₆-OH（BzOH: ε-CL:Sn(Oct)₂=2:200:1）的制备方法 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入4.159 g 己内酯（ε-CL，0.03648 mol）,针筒注入10 mL的甲苯搅拌溶解，用微量注射器注入0.0394 g 苄醇（BzOH，3.648 mmol），充放气驱除支管瓶中空气和氧气，将反应瓶移至90 ℃油浴，搅拌反应30 分钟后迅速加入0.07 g 辛酸亚锡（Sn(Oct)₂，1.824 mmol），在90 ℃下反应24小时。加入2滴醋酸终止反应，旋蒸除去部分溶剂，将粗产物溶于氯仿中，用80 mL冰乙醚沉淀2次，过滤所得产品为白色粉末状物，置于真空干燥箱中干燥至恒重。称重，计算产率约为70%。采用核磁共振氢谱（¹H NMR）验证聚己内酯的结构，聚合物的核磁氢谱谱图的各位移峰与实施例2的图3类似，凝胶渗透色谱（GPC）验证其数均分子量（）和分子量分布（/）。分子量及其分布见表1。 

实施例五～七描述聚磷酸酯嵌段共聚物PCL-b-POPEA的制备方法。 

实施例五： PCL₄₀-b-POPEA₂₃（PCL₄₀:OPEA:Sn(Oct)₂=2:80:1）的制备 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120 ℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL支管瓶中加入1.0438 g大分子引发剂 PCL40（0.226 mmol），充放气3次后，用针筒注入1.97 g OPEA（9.06 mmol），再注入10 mL的甲苯，搅拌溶解，充放气驱除支管瓶中空气和氧气，将反应瓶移至80 ℃油浴，搅拌反应30 分钟后迅速加入0.04 g Sn(Oct)₂（0.113 mmol），在80 ℃下反应24小时。加入2滴醋酸终止反应，旋蒸除去部分溶剂，将粗产物溶于氯仿中，用100 mL冰乙醚/甲醇=10/1 (v/v)混合溶液沉淀2次，过滤，所得产品为白色黏状粉末状物，置于真空干燥箱中干燥至恒重。称重，计算产率约为41%。嵌段共聚物的核磁共振氢谱（¹H NMR）谱图见图4（A），核磁共振碳谱（¹³C NMR）见图5，嵌段共聚物的核磁共振磷谱（³¹P NMR）谱图见图7（B）。 

实施例六： PCL₇₀-b-POPEA₅₀（PCL₇₀:OPEA:Sn(Oct)₂=2:140:1）的制备 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120 ℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL支管瓶中加入1.2192 g 大分子引发剂PCL70（0.153 mmol），充放气3次后，用针筒注入2.38 g OPEA（10.71 mmol），再用针筒注入10 mL的甲苯搅拌溶解，充放气驱除支管瓶中空气和氧气，将反应瓶移至80 ℃油浴，搅拌反应30 分钟后迅速加入0.03 g Sn(Oct)₂（0.076 mmol），在80℃下反应24小时。加入2滴醋酸终止反应，旋蒸除去部分溶剂，将粗产物溶于氯仿中，用100 mL冰乙醚/甲醇=10/1 (v/v)的混合溶液沉淀2次，过滤所得产品为白色黏状粉末状物，置于真空干燥箱中干燥至恒重。称重，计算产率约为36%。嵌段共聚物的核磁共振氢谱谱图见图4（B），嵌段共聚物的核磁共振碳谱和磷谱谱图与实施例5中的谱图类似。 

实施例七： PCL₉₆-b-POPEA₄（PCL₉₆:OPEA:Sn(Oct)₂=2:80:1）的制备 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120 ℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入1.0538 g 大分子引发剂PCL96（0.096 mmol）,充放气3次后，用针筒注入0.85 g OPEA（3.83 mmol），再用针筒注入10 ml的甲苯搅拌溶解，充放气驱除支管瓶中空气和氧气，将反应瓶移至80 ℃油浴，搅拌反应30 min后迅速加入0.02 g Sn(Oct)₂（0.048 mmol），在80 ℃下反应24小时。反应由两滴醋酸终止，旋蒸除去部分溶剂，将粗产物溶于氯仿中，用100 mL冰乙醚/甲醇=10/1 (v/v)的混合溶液沉淀2次，过滤所得产品为白色黏状粉末状物，置于真空干燥箱中干燥至恒重。称重，计算产率约为16%。嵌段共聚物的核磁共振氢谱谱图见图4（C），嵌段共聚物的核磁共振碳谱和磷谱谱图与实施例5中的类似。 

实施例八描述聚磷酸酯无规共聚物PCL-co-OPEA的制备方法 

实施例八：P（CL-co-OPEA）10%（BzOH: ε-CL:OPEA:Sn(Oct)₂=1:7:0.7:0.5）的制备

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中用针筒依次注入0.1052 g引发剂BzOH（0.01 mol）, 8.007 gε-CL（0.07 mol）以及1.56 g OPEA（0.007 mol），再用针筒注入10 mL的甲苯搅拌溶解，充放气驱除支管瓶中空气和氧气，将反应瓶移至80 ℃油浴，搅拌反应30 min后迅速加入0.19 g Sn(Oct)₂（0.005 mol），在80 ℃下反应24小时。反应由两滴醋酸终止，旋蒸除去部分溶剂，将粗产物溶于氯仿中，用100 mL冰乙醚/甲醇=10/1 (v/v)的混合溶液沉淀2次，过滤所得产品为白色黏状粉末状物，置于真空干燥箱中干燥至恒重。称重，计算产率约为60%。无规共聚物的核磁共振氢谱谱图见图6。 

四、实施例九～十二描述含有巯基（-SH）的有机化合物对聚磷酸酯嵌段共聚物进行迈克尔加成反应修饰。 

以PCL₇₀-b-POPEA₅₀为例，分别与巯基丙酸、3-巯基-1, 2-丙二醇、半胱胺盐酸盐以及半胱氨酸盐酸盐进行迈克尔加成反应，其余嵌段共聚物和无规共聚物的迈克尔修饰与此类似。 

实施例九：聚磷酸酯侧基修饰的嵌段共聚物 的制备（[丙烯酸酯]:[-SH]:[吡啶]=1:10:10） 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入充放气3次后，依次加入嵌段共聚物 50 mg PCL₇₀-b-POPEA₅₀（0.004 mmol）、0.09 g巯基丙酸（0.88 mmol ）以及0.07 g催化剂吡啶（0.88 mmol），再用针筒注入3 mL的DMF搅拌溶解，充放气赶走支管瓶中空气和氧气，在室温下搅拌反应72小时。反应产物用50 mL冰乙醚沉淀2次，收集沉淀物，用DMF溶解后转移到透析袋中，透析除去未反应掉的巯基小分子及DMF，透析3天，每12小时更换一次去离子水，最后冷冻干燥，得到白色粉末状的产物，即羧基修饰聚磷酸酯侧基的嵌段共聚物，产率约为：30%。产物经核磁共振（¹H NMR）验证，聚合物的核磁氢谱谱图见图8（B）。 

实施例十：聚磷酸酯侧基修饰的嵌段共聚物的制备（[丙烯酸酯]:[-SH]:[吡啶]=1:10:10） 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入充放气3次后，依次加入嵌段共聚物50 mg PCL70-b-POPEA50（0.004 mmol）、0.096 g 3-巯基-1, 2-丙二醇（0.89 mmol），以及0.07 g催化剂吡啶（0.88 mmol），再用针筒注入3 mL的DMF搅拌溶解，充放气赶走支管瓶中空气和氧气，在室温下搅拌反应72小时。反应产物用50 mL冰乙醚沉淀2次，收集沉淀物，用DMF溶解后转移到透析袋中，透析除去未反应掉的巯基小分子及DMF，透析3天，每12小时更换一次去离子水，最后冷冻干燥，得到白色粉末状的产物，即二羟基修饰聚磷酸酯侧基的嵌段共聚物，产率约为：27%。产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）验证，证明已获得目标产物。聚合物的核磁谱图见图8（C）。 

实施例十一：聚磷酸酯侧基修饰的嵌段共聚物的制备 （[丙烯酸酯]:[-SH]:[吡啶]=1:10:10） 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120 ℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入充放气3次后，依次加入嵌段共聚物50 mg PCL₇₀-b-POPEA₅₀（0.004 mmol）、0.1 g半胱胺盐酸盐（0.88 mmol）以及0.07 g催化剂吡啶（0.88 mmol），再用针筒注入3 mL的DMF搅拌溶解，充放气驱除支管瓶中空气和氧气，在室温下搅拌反应72小时。反应产物先过滤除去吡啶盐酸盐，再用50 mL冰乙醚沉淀2次，收集沉淀物，用DMF溶解后转移到透析袋中，透析除去未反应掉的巯基小分子及DMF，透析3天，每12小时更换一次去离子水，最后冷冻干燥，得到白色粉末状的产物，即氨基修饰聚磷酸酯侧基的嵌段共聚物，产率约为：41%。产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）验证，聚合物的核磁共振谱图见图8（D）。 

实施例十二：聚磷酸酯侧基修饰的嵌段共聚物的制备 （[丙烯酸酯]:[-SH]:[吡啶]=1:10:10） 

预先将装有搅拌子的反应瓶和针筒放在120 ℃烘箱中至少干燥6 小时。取出后，塞好塞子后用橡皮筋绑紧，再用真空油泵边抽真空边充高纯氩气，反复三次直至反应瓶冷却后，瓶中充满高纯氩气待用。

在充满氩气的50 mL 支管瓶中加入充放气3次后，依次加入嵌段共聚物50 mg PCL₇₀-b-POPEA₅₀（0.004 mmol）、0.16 g L-半胱氨酸盐酸盐（0.88 mmol）以及0.14 g催化剂吡啶（0.88 mmol），再用针筒注入3 mL的DMF搅拌溶解，充放气驱除支管瓶中空气和氧气，在室温下搅拌反应72小时。反应产物先过滤除去吡啶盐酸盐，再用50 mL冰乙醚沉淀2次，收集沉淀物，用DMF溶解后转移到透析袋中，透析除去未反应掉的巯基小分子及DMF，透析3天，每12小时更换一次去离子水，最后冷冻干燥，得到白色粉末状的产物，即氨基酸修饰聚磷酸酯侧基的嵌段共聚物，产率约为：32%。产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）验证，聚合物的核磁共振谱图见图8（E）。 

实施例十三描述聚磷酸酯嵌段共聚物胶束的制备及胶束性能的测试。 

实施例十三：聚磷酸酯嵌段共聚物胶束的制备及胶束性能的测试 

以嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀为例，其余嵌段共聚物胶束的制备及其性能研究方法与此类似。

(1) 两亲性嵌段聚合物胶束的制备 

通过透析法制备两亲性嵌段共聚物的胶束，具体制备方法如下：

在50 mL的圆底烧瓶中，取25 mg嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀ 溶于5 mL的DMF中，配成5 mg/mL的溶液，在剧烈搅拌的条件下逐滴加人去离子水，直至溶液轻度变浑且出现蓝色乳光，得到稳定的胶束溶液。将其转移至透析袋中，置于去离子水中透析，透析过程中每12小时更换一次去离子水。3天后，配成1.0 mg/mL的水溶液.

(2) 两亲性嵌段聚合物的临界胶束浓度（CMC）的测试

用荧光探针法测定两亲性嵌段聚合物胶束的临界胶束浓度，以芘为荧光探针剂。将1.0 mg/mL的嵌段共聚物胶束水溶液分别配制浓度为1.0×10^-5-1.0×10 mg/mL 的溶液，再分别移取5 mL 于容量瓶中，再分别注入5 μL 浓度为6×10^-4 mol/L 芘的丙酮溶液，用水泵抽除丙酮，得到芘浓度为6×10^-7 mol/L的聚合物溶液。然后将上述溶液避光搅拌24 小时，用荧光分光光度计测试。

25℃下，以溶液I₃₇₃与I₃₈₃强度比对聚合物浓度作图，曲线的水平线与斜线切线的交点即为嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀的临界胶束浓度（CMC）。图9为嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀荧光曲线图，从图中可得该嵌段共聚物的临界胶束浓度为1.5×10^-2 mg/mL。 

(3) 两亲性嵌段聚合物胶束的扫描电镜（TEM）及粒径（DLS）测试 

两亲性嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀胶束的扫描电镜（TEM）和粒径及其分布是在其1 mg/mL浓度下的水溶液中进行测试。具体结果见图10和表2。

  

表2. 各嵌段聚合物的临界胶束浓度（CMC）、粒径大小及其分布

 CAC>_z（nm)Size>PCL₄₀-b-POPEA₂₀3.0×10^-31730.442>PCL₇₀-b-POPEA₅₀1.5×10^-21140.173>PCL₉₆-b-POPEA₄3.0×10^-41860.392>

从图表中可以看出，两亲性嵌段聚合物胶束的形成以及在水中具有良好的分散性。

实施例十四描述的是聚磷酸酯嵌段共聚物及其迈克尔加成修饰产物的细胞毒性测试。 

实施例十四：以嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀及其迈克尔加成修饰产物为例，其余共聚物的毒性测试与此类似。 

通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT方法）测定不同浓度下PCL₇₀-b-POPEA₅₀其迈克加成修饰产物的细胞毒性测试。分别将浓度为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mg/mL的聚合物水溶液与MCF-7细胞共同培养24小时后，测细胞存活率。图11为这类聚合物及其迈克尔加成修饰产物的毒性测试结果，结果表明该类聚合物及其迈克加成修饰产物均为低毒的，因此具有良好的生物相容性；所述迈克加成修饰产物的结构式为： 

。

  

实施例十五~十六描述两亲性聚磷酸酯嵌段共聚物用作药物载体。

以嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀为例，包载抗肿瘤药物阿霉素（DOX），其余共聚物的载药应用与此类似。 

实施例十五：嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀包载DOX及其药物释放 

（1）嵌段聚合物PCL₇₀-b-POPEA₅₀包载DOX的胶束的制备

通过透析法制备嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀的载药胶束，具体制备方法如下：

在50 mL的圆底烧瓶中，取25 mg嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀、5mg阿霉素（DOX）溶于5 mL的DMF中，配成5 mg/mL的溶液，在避光条件下，边剧烈搅拌边逐滴加人去离子水，得到稳定载药胶束溶液后，将其转移至透析袋中，置于去离子水中透析，透析过程中每12小时更换一次去离子水。3天后，配成1.0 mg/mL的载药溶液，避光保存。

（2）嵌段聚合物PCL₇₀-b-POPEA₅₀载药胶束的药物释放 

取5mL嵌段聚合物PCL₇₀-b-POPEA₅₀载药胶束溶液置于截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋转移到盛有20mL PBS缓冲溶液（pH=7.4）的离心管中，然后放入37 ℃的水浴振荡器，在设定的时间取样，每次取出5mL 的PBS 溶液（含释放的DOX），再补充5 mL新鲜的PBS缓冲溶液。对取出的溶液用荧光分光光度计进行测试，换算在480 nm处激发的特定荧光吸收值，得到阿霉素的累积释放量，并对时间作图，绘制得药物释放曲线。图12为嵌段聚合物PCL₇₀-b-POPEA₅₀包载阿霉素的药物释放曲线，从图中可以看出本发明制备的两亲性聚磷酸酯聚合物对包载的阿霉素具有缓慢释放作用。

实施例十六：嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀载药胶束的细胞内吞作用。 

取0.5 mL嵌段聚合物PCL₇₀-b-POPEA₅₀载药胶束溶液，加到A549肿瘤细胞培养液中，将此培养液转移到活细胞工作站（Living Cell Imaging System），通过荧光显微镜测定载药胶束进入A549肿瘤细胞的现象。图13(a)为肿瘤细胞A549的荧光照片，图13(b)为载药胶束初加到A549肿瘤细胞培养液中的照片，照片显示没有荧光性物质，当培养时间增加到20分钟时，有明显红色荧光出现，表明有阿霉素（DOX）开始进入细胞，并随着时间增加，荧光强度增强，说明嵌段共聚物PCL₇₀-b-POPEA₅₀的载药胶束可以成功进入肿瘤细胞，并与细胞发生相互作用。 

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