用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及涉及分子生物学领域，旨在提供一种用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括qPCR混合反应液、锁核酸阻滞探针、参照引物、ARMS引物和阳性对照样品；其中qPCR混合反应液包括：PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、Goldstarbest Taq酶、PCR通用下游引物和通用TaqMan探针。本发明的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测各种癌组织中KRAS基因特定位点突变。灵敏度高，可以检测各种组织来源的基因组DNA，不仅来源于细胞体系，尤其是采用非细胞体系如血清、血浆或其他体液来源的游离DNA片段。与直接测序等突变检测技术比较，本发明用于检测KRAS基因突变具有特异性强、敏感性高、操作简单快速、高通量、安全、结果判读明确客观等优势。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种指导肿瘤个体化治疗的KRAS基因突变分型的快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

RAS原癌基因最初是从大鼠肉瘤病毒中克隆出来的转化基因，自1982年Weinberg等人发现人的膀胱癌细胞中有活化的HRAS基因后，引起了人们对RAS癌基因在人类肿瘤发生发展过程中所起的作用的极大关注。RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。其中，KRAS对人类癌症影响最大，它就像一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常如KRAS基因突变时，该基因永久活化，使细胞内信号传导紊乱，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡从而发生癌变。

KRAS基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。KRAS基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40％，胰腺癌为90％以上，肺癌约为15％。KRAS基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子(≥90％)，这些突变破坏了KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于持续活性状态。

快速灵敏的检测KRAS基因突变，具有重大的临床意义：(1)正常人血检中出现KRAS基因异常，提示属于肿瘤高危人群；(2)良性肿瘤患者若是检出KRAS基因突变，提示有恶变的可能；(3)大量多中心3期临床试验表明，靶向新药爱必妥(Erbitux，西妥昔单抗)和帕尼单抗(Panitumumab)仅适用于无突变的KRAS基因野生型患者，对KRAS突变患者无效。《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2008年第3版)明确指出：一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的治疗；就如美国乔治敦大学马歇尔所言：在结直肠癌的治疗中，结直肠癌从此“一分为二”：KRAS基因是野生型还是突变型，使传统意义上的一种疾病被分成两种独立的疾病。KRAS突变型结直肠癌患者约占40％，这类患者不能从抗EGFR靶向药物治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而其余60％左右的KRAS野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当KRAS基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治疗。因此，检测病人KRAS基因是否突变成为决定能否使用抗EGFR靶向药物的必要前提条件。

恶性肿瘤病人外周血中存在高水平的循环游离DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细胞。新近研究已经从癌症患者血浆或血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变如KRAS突变，表明这是检测肿瘤相关基因改变的一条新途径。由于取材方便，血浆分子检测迅速成为肿瘤研究的一个热点。但是肿瘤外周血仅存在微量的循环游离DNA，其中突变基因的拷贝数更低，因此血浆分子检测对检测技术的灵敏度要求较之组织更高。

用于KRAS基因突变检测的方法很多，包括如DNA直接测序、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、变性高效液相色谱法(HDPLC)、高分辨率溶解曲线技术(HRM)、限制小片段长度多态性分析法(RFLP)等。其中DNA直接测序为突变检测的金标准。该方法存在以下缺点：检测的敏感性不够高：Katsuhiko等人曾在2005年8月份出版的《Lung Cancer》(《肺癌》)上报道，如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，则用直接测序法检测不到突变样本的存在；费时，操作过程复杂，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；测序结果的判读主观性强；一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。因此直接测序法难以在临床普遍开展。

恶性肿瘤病人外周血中存在高水平的循环游离DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细胞。新近研究已经从癌症患者血浆或血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变如KRAS突变，表明这是检测肿瘤相关基因改变的一条新途径。由于取材方便，血浆分子检测迅速成为肿瘤研究的一个热点。但是肿瘤外周血仅存在微量的循环游离DNA，其中突变基因的拷贝数更低，因此血浆分子检测对检测技术的灵敏度要求较之组织更高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种KRAS基因突变分型ARMS-qPCR检测试剂盒，以此解决现有突变检测技术中、费时、程序繁琐和易污染等问题。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测KRAS突变，其灵敏度高，特异性强，可适用于临床常见样本如新鲜冰冻组织、石蜡组织，尤其提供了除病理组织之外的非创伤性血清或血浆样本中微量突变的高灵敏度检测。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括qPCR混合反应液、锁核酸阻滞探针、参照引物、ARMS引物和阳性对照样品；其中qPCR混合反应液包括：PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、Goldstarbest Taq酶、PCR通用下游引物和通用TaqMan探针；

qPCR反应体系中各组分的终浓度分别是：PCR缓冲液为1×；dNTPs为0.01～1.5mM；MgCl₂为0.5～5mM；Goldstarbest Taq酶为0.05U/μL；PCR通用下游引物为0.1～1μM；通用TaqMan探针为0.1～1μM；锁核酸阻滞探针为0.9μM、参照引物为0.3μM、ARMS引物为0.3μM、阳性对照样品为10～300ng/μl；

所述PCR通用下游引物的序列如SEQ ID NO A1所示；

所述通用TaqMan探针的序列如SEQ ID NO A2所示；

所述锁核酸阻滞探针与野生模板完全匹配，部分碱基锁核酸化，且其末端磷酸化，从而抑制KRAS基因突变区野生型DNA扩增。其序列如SEQ ID NO A0所示；

所述参照引物为一条能够同时扩增KRAS野生型及突变型基因组DNA的上游引物，其序列如SEQ ID NO A3所示；

所述ARMS引物为七种上游引物中的任意一种，用于分别对应检测KRAS基因第12密码子中GAT、GTT、GCT、TGT、AGT和CGT这六种突变型及第13号密码子GAC这一种突变类型；这七种上游引物的序列如SEQ ID NO A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO A6、SEQ ID NO A7、SEQ ID NO A8、SEQ ID NO A9、SEQ ID NO A10所示；7条ARMS引物分别在3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，同时在其3’末端倒数2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增加其特异性；用于特异性扩增KRAS基因第12密码子六种碱基置换突变(GGT→GAT，GGT→GTT，GGT→GCT，12GGT→TGT，GGT→AGT和GGT→CGT)模板DNA及第13密码子一种碱基置换突变(密码子13GGC→GAC)模板DNA。

所述阳性对照样品是分别存在KRAS基因第12号密码子六种突变类型及13密码子一种碱基置换突变类型的质粒基因组DNA。

各引物序列列举如下：

SEQ ID NO A0：5’-TGGAGCTGGTGGCGTAGGC-PO4-3’

SEQ ID NO A1：5’-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’

SEQ ID NO A2：5’-FAM-GAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3’

SEQ ID NO A3：5’-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT-3’

SEQ ID NO A4：5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA-3’

SEQ ID NO A5：5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGT-3’

SEQ ID NO A6：5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’

SEQ ID NO A7：5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’

SEQ ID NO A8：5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCGT-3’

SEQ ID NO A9：5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCC-3’

SEQ ID NO A10：13Asp-3：5’-GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA-3’

进一步地，本发明还提供了基于前述试剂盒的KRAS基因突变分型ARMS-qPCR检测方法，该方法是先针对KRAS基因设计一对参照引物、TaqMan探针和锁核酸阻滞探针，针对KRAS基因突变位点分别设计ARMS引物，反应体系中加入qPCR混合反应液、参照引物或者ARMS引物、锁核酸阻滞探针和待检模板DNA进行荧光定量PCR的检测。具体包括以下步骤：

(1)设计并筛选含有KRAS基因第12号和13号密码子的通用TaqMan探针、锁核酸阻滞探针、参照引物及7种ARMS引物；

(2)从非细胞体系或细胞体系中提取的基因组DNA作为模板DNA；

(3)进行实时荧光定量PCR扩增：每个样本的突变检测分8管进行；每管中加入相同的qPCR混合反应液、锁核酸阻滞探针和模板DNA，每管分别加入参照引物或者7种ARMS引物中的一种，进行KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测；

(4)结果判读：

参照引物管扩增曲线阳性，各种ARMS引物管均无扩增曲线或者其与参照引物管的扩增曲线Δct＞10，该样本结果判断为野生型；

参照引物管扩增曲线阳性，相应ARMS引物管扩增曲线阳性，且其与参照引物管的扩增曲线Δct≤7，该样本结果判读为突变型；

参照引物管扩增曲线阳性，相应ARMS引物管扩增曲线阳性，且其与参照引物管的扩增曲线Δct＞7，该样本结果判读为可疑突变型；如重复检测3次均显示扩增曲线阳性，该样本结果判读为突变型；

参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新提取。

所述步骤(2)中模板DNA选择自新鲜冰冻或者石蜡包埋的肿瘤组织外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物中提取。

所述步骤(3)中进行PCR扩增反应的条件为：92～97℃预变性10～15min；92～97℃变性5～15s，58～64℃退火40s，40～50个循环。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明的试剂盒能快速、准确、高敏感度的检测各种癌组织中KRAS基因特定位点突变。灵敏度高，可以检测各种组织来源的基因组DNA，不仅来源于细胞体系，尤其是采用非细胞体系如血清、血浆或其他体液来源的游离DNA片段。

锁核酸(locked nucleic acid，LNA)是一种新型的寡核酸衍生物，结构中B-D一呋喃核糖的2一0，4C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结构。LNA作为一种新的反义核酸，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点。其能够与DNA和RNA特异性地结合从而可以制备LNA探针，与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性增加，可大大提高基因诊断的效率和灵敏度。本发明设计锁核酸阻滞探针，其序列与野生模板完全匹配，部分碱基锁核酸化，用于特异性结合模板DNA中的KRAS野生型DNA，因其末端磷酸化，无法延伸从而抑制野生型模板的非特异性扩增，大大增加突变检测的灵敏度与特异性。

扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system ARMS)于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变特异性ARMS引物，其3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶，镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA有错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2-3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。

本发明将锁核酸(LNA)野生阻滞探针和ARMS突变特异性引物相结合，用于KRAS基因突变分型。本检测试剂盒是针对KRAS基因热点突变区的检测而设计的，包括KRAS基因第12、13密码子的共7种突变基因型。该试剂盒包括经优化的25ul qPCR反应体系，该反应体系的特征是均含有qPCR混合反应液，TaqMan探针阳性对照品和抑制野生型KRAS基因组DNA扩增的LNA阻滞序列，只是ARMS引物针对特异的突变位点有所区别。

本发明所使用的探针为5‘端FAM标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。在ARMS-qPCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时Goldstarbest Taq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。

综合ARMS引物与LNA阻滞探针的优势，以及实时荧光定量PCR技术的特点，与直接测序等突变检测技术比较，本发明用于检测KRAS基因突变具有以下优势：

1.特异性强：设计的ARMS引物分别针对KRAS基因第12和第13密码子的七种特异突变序列，能特异性扩增相应突变模板DNA；在ARMS引物的3’末端倒数2-3位增加一个或者两个碱基错配，可以增加ARMS引物的特异性；本发明技术在PCR反应体系中加入野生型KRAS基因特异性的锁核酸阻滞探针，通过抑制野生型基因组DNA扩增从而富集突变型DNA的扩增，进一步提高了检测的特异性。

2.敏感性高：本发明技术在PCR反应液中加入野生型KRAS基因锁核酸阻滞探针(LNA)，通过特异性地抑制野生型模板的扩增，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测敏感性；本技术检测KRAS基因突变敏感度达0.1-1％(即突变基因组DNA达到基因总DNA的0.1-1％即可检出)；而直接测序法检测KRAS突变的敏感度约为10％(即突变基因组DNA达到基因总DNA的10％才能检出)。

3.检测过程为闭管反应，大大降低了污染及结果偏差的可能性。

4.操作简单快速，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。而直接测序法检测步骤繁琐：送检标本→提取DNA→PCR扩增→验证PCR产物(电泳)→纯化PCR产物→直接测序，且其经历两个PCR产物的电泳过程，污染机会大，不适合在医院大规模开展。

5.结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。

6.高通量，一次最多可检测48例。

7.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需PCR产物的后处理，对操作员和环境都无危害。

附图说明

图1为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测结直肠癌阳性样本的KRAS基因第12密码子GGT→GAT碱基置换突变的扩增曲线图，该样本经测序证实GGT→GAT突变阴性，经T-A克隆证实GGT→GAT突变阳性，阳性克隆率约为3％；

图2为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测结直肠癌阳性样本的KRAS基因第12密码子GGT→GTT碱基置换突变的扩增曲线图，该样本经测序证实GGT→GTT突变阳性；

图3为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测结直肠癌阳性样本的KRAS基因第12密码子GGT→GCT碱基置换突变的扩增曲线图，该样本经测序证实GGT→GCT突变阳性；

图4为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测肠癌阳性样本的KRAS基因第12密码子GGT→AGT碱基置换突变的扩增曲线图，该样本经测序证实GGT→AGT突变阴性，经T-A克隆证实GGT→AGT突变阳性，阳性克隆率约为6％；

图5为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测肠癌阳性样本的KRAS基因第12密码子GGT→TGT碱基置换突变的扩增曲线图；

图6为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测阳性对照样本12Arg即KRAS基因第12密码子GGT→CGT碱基置换突变的扩增曲线图，该突变形式在中国结直肠癌人群中比较少见。

图7为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测肠癌阳性样本的KRAS基因第13密码子GGT→GAT碱基置换突变的扩增曲线图；

图8为用ARMS-qPCR检测试剂盒检测肠癌阳性样本的KRAS基因野生型的扩增曲线图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施案例。

收集临床病理诊断为结直肠腺癌(CRC)的100例患者的蜡块组织，所有患者术前均未接受过西妥昔单抗(cetuximab)治疗。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。用ARMS-qPCR检测KRAS基因第12，13密码子常见7种碱基置换突变。

设计并筛选能特异性检测上述7种碱基置换突变的特异性ARMS引物各一条及参照引物一条，设计通用下游引物一条，设计并筛选通用TaqMan探针一条，设计并筛选LNA阻滞探针一条，各探针、引物序列分别具体如下：

LNA序列如序列表中SEQ ID NO A0所示：5’-TGGAGCTGGTGGCGTAGGC-PO4-3’。

通用下游引物序列为：SEQ ID NO A1：5’-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’

TaqMan探针序列为：SEQ ID NO A2：5’-FAM-GAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’

参照引物序列为：SEQ ID NO A3：5’-CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT-3’

针对KRAS基因第12密码子GGT→GAT

突变型的ARMS引物序列为：SEQID NO A4：5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA-3’

针对KRAS基因第12密码子GGT→GTT

突变型的ARMS引物序列为：SEQID NO A5：5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGT-3’

针对KRAS基因第12密码子GGT→GCT

突变型的ARMS引物序列为：SEQID NO A6：5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’

针对KRAS基因第12密码子GGT→AGT

突变型的ARMS引物序列为：SEQID NO A7：5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’

针对KRAS基因第12密码子GGT→TGT

突变型的ARMS引物序列为：SEQID NO A8：5’-AACTTGTGGTAGTTGGAGCGT-3’

针对KRAS基因第12密码子GGT→CGT

突变型的ARMS引物序列为：SEQID NO A9：5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCC-3’

针对KRAS基因第13密码子GGC→GAC

突变型的ARMS引物序列为：SEQID NO A10：13Asp-3：5’-GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA-3’

1.反应体系的优化：

(1)引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较定最佳引物浓度是0.3μmol/L。

(2)探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将探针浓度分别从，确0.05μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.1μmol/L。

(3)退火温度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，进行梯度PCR(56°至64°退火温度)，通过对试验结果的分析比较，确定最佳退火温度是60°。

(4)酶的优化在反应体系中加入各种酶，通过对试验结果的分析比较，确定最佳酶是gold star TAQ酶。

经优化反应体系为25μl，包括qPCR mix 20μl，参照引物或者ARMS引物各0.75μl(终浓度0.3μM)，LNA阻滞探针2.25μl(终浓度0.9μM)模板DNA 2.0μl(终浓度10-300ng/μl)。所述qPCR mix组分及其终浓度为：

PCR缓冲液             终浓度为1×；

dNTPs                 终浓度为0.2mM；

通用下游引物          终浓度为0.3μM；

TaqMan探针            终浓度为0.1μM；

Goldstarbest Taq酶    终浓度为0.05U/μL；

MgCl₂                 终浓度为3.5mM；

ARMS-qPCR在ABI7500检测仪上进行。每个样本进行8管反应，每管反应加入共同的qPCR mix，LNA阻滞探针及模板DNA，所不同的只有参照引物或者ARMS引物。PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，95℃15秒，60℃40秒，扩增反应40循环，在60℃40秒阶段收集荧光。

结果为：在100例样本中共检测出20例样本发生KRAS基因第12密码子GGT→GAT突变，4例样品发生KRAS基因第12密码子GGT→GTT突变，2例样本发生KRAS基因第12密码子GGT→GCT突变，3例样本发生KRAS基因第12密码子GGT→AGT突变，11例样本发生KRAS基因第13密码子GGC→GAC突变，2例样本发生KRAS基因第12密码子GGT→TGT突变。其中3例样品经KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测判读为第12密码子GGT→GAT突变阳性，经测序结果为GGT→GAT突变阴性，经T-A克隆证实GGT→GAT突变阳性，阳性克隆率约为3-7％；其中1例样品KRAS基因分型ARMS-qPCR检测判读为第12密码子GGT→AGT突变阳性该样本经测序结果为GGT→AGT突变阴性，经T-A克隆证实GGT→AGT突变阳性，阳性克隆率约为6％。其余结果与直接测序结果均相符合。

上述结果表明本发明的ARMS-qPCR法检测肿瘤组织KRAS基因突变灵敏度高，可检测临床样本中的微量突变模板(＜10％)；其结果可靠，与突变检测“金标准”：直接测序的结果符合率≥95％。此外所述方法快速，操作简单，结果判读客观，闭关反应污染少，非常适于在临床中大规模开展。