交替假单胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的应用

摘要

本发明公开了一种交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)及其在生物氧化L-氨基酸中的应用，所述应用为：以交替假单胞菌B3发酵培养获得的酶为酶源，以L-氨基酸为底物，25～50℃，pH 6～8，反应0.5～2h，使L-氨基酸氧化，释放出过氧化氢，本发明提供了一株新的产L-氨基酸氧化酶的微生物菌种，该菌种能生物氧化L-氨基酸，并具有底物广谱、反应温和、对环境友好等特点，在L-氨基酸的定量分析、DL-氨基酸拆分等方面具有广阔的应用前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种产L-氨基酸氧化酶的新菌株，特别涉及交替假单胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的应用。

(二)背景技术

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，简称LAAO，酶学编号为：EC1.4.3.2)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的黄素蛋白酶。此酶能够特异性催化L-氨基酸的氧化脱氨生成α-酮酸、氨和过氧化氢。因此，它能被应用于生物氧化L-氨基酸。近年来有文献报道了LAAO具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用。还报道它具有出血或溶血活性、引起水肿及抗菌、抗艾滋病病毒(张云等.蛇毒L-氨基酸氧化酶在制备艾滋病治疗药物中的应用.申请号：03117417.5.申请日：2004-09-08.)等特性。LAAO在抗菌、杀病原虫、抗肿瘤及抗艾滋病病毒等领域具有极其广阔的应用前景。

LAAO被发现广泛存在于微生物、蛇毒、鱼的表皮粘液、老鼠、海兔子等多种生物体中。到目前为止，来源于不同物种的一些LAAO已经被成功分离、纯化及鉴定，酶活性、底物特性、酶稳定性等理化性质被研究，一些LAAO的基因序列已被测定和公布。相关研究表明，来源于不同物种的目前已知的LAAO在细胞内均是由两个非共价的亚基组成的二聚体，分子量大约为120kDa，每个亚基的分子量约为60kDa，是一种需要FAD为辅基的含糖基化位点的蛋白；LAAO的抗菌等生物活性中大部分与LAAO催化产生过氧化氢具有直接或间接的联系，过氧化氢酶能抑制LAAO的抗菌等生物活性，不过，研究表明，LAAO是被分泌到细胞外，这就便于将LAAO分离纯化。已有来源于鱼的表皮粘液的LAAO被成功在大肠杆菌中克隆表达，并且，已有来源于蛇毒的LAAO被初步结晶。这些都给深入开展LAAO的相关研究提供了坚实基础和理论指导。同时，国内外的研究表明，不同物种来源的LAAO的底物特异性和最适性差异较大。有些LAAO能作用于几种甚至几十种氨基酸，像国外文献报道的浑浊红球菌LAAO，它不仅能催化二十种L-氨基酸，而且也能催化它们的一些衍生物；但有些只能作用于一种氨基酸，像海默氏菌LAAO仅能严格地作用于L-赖氨酸。某些物种既含有底物特异性宽的LAAO，同时还含有底物特异性窄的LAAO。许多LAAO对疏水性和中性氨基酸的催化活性比较高，而有些LAAO对其他类型的氨基酸活性较高。L-氨基酸被LAAO催化氧化后生成对应的α-酮酸是重要的有机合成与生物合成的中间体，在食品、医药和化工等行业有重要应用前景。虽然，国外对LAAO已有三、四十年的研究，对来源于微生物、蛇毒、鱼的表皮粘液等不同LAAO均有涉猎，但相关报道还不是特别多，研究主要集中在蛇毒来源的LAAO。国内对LAAO的研究只有十多年的时间，仅有对来源于蛇毒的LAAO有所研究，对来源于其它物种的未见报道，而且，国内对利用微生物源LAAO进行生物氧化L-氨基酸也未见报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种产L-氨基酸氧化酶的新菌株——交替假单胞菌B3，以及所述菌株在氧化L-氨基酸中的应用，具有底物光谱，反应温和，环境友好等特点。

本发明采用的技术方案是：

交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为：CGMCC NO.5353，保藏日期为2011年10月17日。

本发明所述交替假单胞菌B3菌种的筛选与鉴定：

a)菌种筛选

(1)菌种来源：从浙江宁波定海海域(30.03°N，122.11°E)的海泥中分离筛选获得；

(2)菌种筛选：从宁波定海海域(30.03°N，122.11°E)海平面50cm以下收集海泥，置于无菌的样品瓶中带至实验室，然后称取10g海泥样品，加入到90mL的无菌海水中，混匀后即是浓度为10^-1的样品，然后按常规方法分别梯度稀释成浓度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的样品；分别取不同浓度的样品100μL涂布于MM固体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L；pH 7.2，溶剂为水)平板上，于28℃下培养4d，获得单菌落；然后将初筛获得的单菌落在MM固体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L；pH 7.2，溶剂为水)平板上进行两次划线复筛；然后将复筛后获得的单菌落分别接种于5mL的MM液体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L；pH 7.2，溶剂为水)中，于28℃，200rpm转速下摇床培养4d，8000rpm离心5min收集发酵上清液；取3mL发酵上清液作为酶液，与150mmol/L的L-苯丙氨酸(L-Phe)反应，用过氧化氢检测试剂盒(Amplex RedHydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit，Invitrogen，USA)检测过氧化氢产生情况，发现交替假单胞菌B3能使过氧化氢检测试剂发生颜色反应，说明交替假单胞菌B3能催化氧化L-苯丙氨酸而释放出过氧化氢，从而说明交替假单胞菌B3能产生L-氨基酸氧化酶(LAAO)。

(3)菌株形态特征和生理生化特征：

所述的交替假单胞菌B3形态特征为：短小杆菌，直径1.0μm，长3μm，28℃培养24h后，菌落为点状、圆形、湿润；革兰氏阴性，生理生化特征见表1所示：

表1菌株B3的生理生化特性(表中“+”为阳性，“-”为阴性)

b)16S rDNA序列鉴定：

上游引物5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

下游引物5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’

扩增程序为：94℃变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸90s，循环结束后，72℃再延伸10min，然后保存在4℃下。扩增结束后，用浓度为1.0％琼脂糖凝胶电泳确证PCR产物大小后，送生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。测序结束后，将菌株B3的16S rDNA序列在NCBI网站上进行与其他物种的同源性比对，然后用MegaV4.0.2软件制作遗传进化树，结果如图5所示，发现菌株B3与交替假单胞菌属中的一些菌的同源性较高，尤其是同Pseudoalteromonas rubra G31a有98.5％的同源性，因此，将菌株B3命名为交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)。

16S rDNA序列为：

AGTCGAGCGGTA ACATTTCTAGCTTGCTAGA AGATGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTTAGGTGGGGGACAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTGATTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGTCAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGGAGCTGGGGTCTTCGGACAACTTTTCCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAGAGTGCTGCGAACTAGCGATAGTAAGCGAATCACTTAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTGGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTCA

本发明所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用。

进一步，所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用为：以交替假单胞菌B3发酵培养获得的酶为酶源，以L-氨基酸为底物，25～50℃，pH 6～8，反应0.5～2h，使L-氨基酸氧化，释放出过氧化氢。

所述酶源为交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述交替假单胞菌B3发酵液中湿菌体浓度为10～25mg/L，所述L-氨基酸初始底物浓度为30～300mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.04～0.8mg湿菌体/mmol底物，所述含湿菌体发酵液是指离心前的含湿菌体发酵液。

所述的L-氨基酸优选为L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-甲硫氨酸、L-胱氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸或L-半胱氨酸。

所述的酶源按如下步骤制备：(1)斜面培养：将交替假单胞菌B3接种于斜面培养基(即MM固体培养基)，20～37℃培养12～24h，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，琼脂15～25g/L，pH 7～8，溶剂为水；(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基(即MM液体培养基)，20～37℃培养18～24h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，pH 7～8，溶剂为水；(3)发酵培养：将种子液以1～10％的接种量接种至发酵培养基(即MM液体培养基)，20～37℃培养48～120h，获得发酵液，将发酵液经8000～12000rpm，离心5～10min后，弃去沉淀，收集上清液，获得所述酶源；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏1.5～6g/L，蛋白胨2.5～10g/L，海盐15～45g/L，pH 7～8，溶剂为水。

更进一步，所述的交替假单胞菌B3在生物氧化L-氨基酸中的应用为：以交替假单胞菌B3发酵培养后的含湿菌体发酵液离心获得的上清液为酶源，以L-氨基酸为底物，30℃，pH7.0，反应0.5h，使L-氨基酸氧化释放出过氧化氢，用过氧化氢试剂盒检测过氧化氢；所述的交替假单胞菌B3发酵液中湿菌体浓度为10～25mg/L，所述L-氨基酸初始底物浓度为30～300mmol/L，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.08～0.8mg湿菌体/mmol底物。

本发明中菌株B3所产生的L-氨基酸氧化酶是被分泌到细胞外的，因此，交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心后去除菌体，获得的上清液中含有酶，即酶源。所以本发明中以交替假单胞菌B3发酵液离心后获得的上清液而不是湿菌体来进行酶促反应。所述上清液的用量以离心前含湿菌体发酵液中湿菌体的质量来计。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：提供了一株新的产L-氨基酸氧化酶的微生物菌种，该菌种能生物氧化L-氨基酸，并具有底物广谱、反应温和、对环境友好等特点，在L-氨基酸的定量分析、DL-氨基酸拆分等方面具有广阔的应用前景。

(四)附图说明

图1实施例2中交替假单胞菌B3生物氧化L-氨基酸的验证：A-组1，B-组2，C-组3，D-组4；

图2实施例3中交替假单胞菌B3生物氧化L-氨基酸的验证：A-实验组，B-阳性对照组，C-阴性对照组；

图3交替假单胞菌B3菌落特征照片；

图4交替假单胞菌B3菌体显微照片，A：藤黄八叠球菌；B：交替假单胞菌B3；

图5交替假单胞菌B3系统发育树；

图6交替假单胞菌B3对不同L-氨基酸的生物氧化性能；

图7温度对交替假单胞菌B3生物氧化L-氨基酸的影响；

图8pH对交替假单胞菌B3生物氧化L-氨基酸的影响；

图9金属离子对交替假单胞菌B3生物氧化L-氨基酸的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1菌种筛选与鉴定

a)菌种筛选

从宁波定海海域海平面50cm以下收集海泥(30.03°N，122.11°E)，置于无菌的样品瓶中，然后称取10g海泥样品，加入到90mL的无菌海水中，混匀后即是浓度为10^-1的样品，用无菌海水按常规方法分别梯度稀释成浓度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的样品；分别取不同浓度的样品100μL涂布于MM固体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L；pH 7.2，溶剂为水)平板上，于28℃下培养4d，获得单菌落；然后将初筛获得的单菌落在MM固体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L；pH 7.2，溶剂为水)平板上进行两次划线复筛；然后将复筛后获得的单菌落分别接种于5mL的MM液体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L；pH 7.2)中，于28℃，200rpm转速下摇床培养4d，8000rpm离心5min收集发酵上清液，获得酶源；取3mL(湿菌体浓度：0.1mg湿菌体/mmol底物)上述上清液作为酶液，与300mmol/L的L-苯丙氨酸(L-Phe)3mL反应0.5h，用过氧化氢检测试剂盒(Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assaykit，Invitrogen，USA)检测过氧化氢产生情况，发现交替假单胞菌B3能使过氧化氢检测试剂发生颜色反应，说明交替假单胞菌B3能催化氧化L-苯丙氨酸而释放出过氧化氢(见表1)，从而说明交替假单胞菌B3能产生LAAO。

表1用过氧化氢检测试剂盒对反应液产生的过氧化氢的检测

  反应  过氧化氢的浓度(mmol/L)  相对活性(％)  1  184  100  2  14  7.61  3  4  2.17

反应1：菌株B3发酵上清液中加入150mmol/L的L-苯丙氨酸

反应2：菌株B3发酵上清液中没有加入L-苯丙氨酸

反应3：菌株B3发酵上清液用95℃高温处理10min后再加150mmol/L的L-苯丙氨酸

b)菌种鉴定

(1)菌种形态特征及生理生化特征：

将交替假单胞菌B3接种于MM固体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂30g/L；pH 7.2，溶剂为水)平板上，于28℃下培养4d，获得单菌落并观察其菌落生长特性，如图3所示。

将交替假单胞菌B3的单菌落接种于5mL的MM液体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L；pH 7.2，溶剂为水)中，于28℃，200rpm转速下摇床培养4d后，以藤黄八叠球菌(Sarcina lutea，CPCC160021，中国微生物资源库)为对照进行革兰氏染色，其单菌落形态的显微镜(油镜，1500×)照片如图4(A：藤黄八叠球菌；B：交替假单胞菌B3)。

(2)16S rDNA序列测定：

将菌株B3的单菌落接种于5mL的MM液体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L；pH 7.2，溶剂为水)中，于28℃，200rpm转速下摇床培养4d后，取1.5mL培养液，12000rpm离心1min后弃上清，收集菌体，加入125μL浓度为0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，10μL浓度为200μg/mL的RNase A，剧烈震荡悬浮菌体后，在28℃水浴处理30min后，加入70μL浓度为10％的十二烷基硫酸钠(SDS)，5μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K，混匀后，反复冻融三次，然后加入70μL浓度为5M的NaCl，混匀后置于冰上30min，12000rpm离心20min，取上清，加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，12000rpm离心10min，去上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃下保存10min后，12000rpm离心10min，弃上清，用适量75％的乙醇清洗3遍，晾干后，加入50μL的TE溶液溶解菌株B3基因组DNA。

配制50μL的PCR反应混合液，内含：37μL无菌水，5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，4μL浓度为2.5mM的dNTPs，100nM上游引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，100nM  下游引物1527R(5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，1ng菌株B3基因组DNA和1UTaq DNA聚合酶。然后将反应混合液置于PCR仪上扩增菌株B3的16SrDNA，扩增程序为：94℃变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸90s，循环结束后，72℃再延伸10min，然后保存在4℃下。扩增结束后，用浓度为1.0％琼脂糖凝胶电泳确证PCR产物大小后，送生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。测序结束后，将菌株B3的16S rDNA序列在NCBI网站上进行与其他物种的同源性比对，然后用MegaV4.0.2软件制作遗传进化树，结果如图5所示，发现菌株B3与交替假单胞菌属中的一些菌的同源性较高，尤其是同Pseudoalteromonas rubra G31a有98.5％的同源性，因此将菌株B3命名为交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)。

实施例2交替假单胞菌B3生物氧化L-氨基酸的验证——酮酸的检测

将菌种B3的单菌落分别接种于5mL的MM液体培养基(酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L；pH 7.2，溶剂为水)中，于28℃，200rpm转速下摇床培养4d，8000rpm离心5min收集发酵上清液，获得酶源；

反应分为4组：组1为阳性对照组(直接用α-苯丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应)，组2为实验组，组3为无底物组(不加底物L-氨基酸，其他操作同实验组)，组4为酶失活组(将含酶的上清液高温灭活，其他操作同实验组)；

组1操作为：1.5mL体积浓度为0.1％的2，4-二硝基苯肼水溶液与1.5mL浓度为0.2mmol/L α-苯丙酮酸水溶液在室温下反应10min后，用6mL浓度为2.5M的NaOH终止反应，13000rpm离心5min收集上清，用分光光度计检测520nm波长(OD₅₂₀)下的吸光值。结果显示(图1A)：反应液有较明显的颜色变化(从淡黄色变成红棕色)，而且，在520nm波长(OD₅₂₀)下有较高的吸光值(OD₅₂₀＝0.202)；

组2操作为：取1.5mL的上述发酵上清液作为酶液(湿菌体浓度：0.1mg湿菌体/mmol底物)，加入300mmol/L的L-苯丙氨酸1.5mL和2000U的过氧化氢酶，在室温下反应30min后，加入1.5mL体积浓度为0.1％的2，4-二硝基苯肼水溶液，在室温下反应10min后，用6mL浓度为2.5M的NaOH终止反应，13000rpm离心5min收集上清，用分光光度计检测520nm波长(OD₅₂₀)下的吸光值，结果如图1所示，未高温处理的交替假单胞菌B3的发酵上清液并加入了底物L-苯丙氨酸的反应管内的反应液(组2，图1B)有较明显的颜色变化(从淡黄色变成红棕色)，而且，在520nm波长(OD₅₂₀)下有较高的吸光值(OD₅₂₀＝0.145)，此结果与阳性对照(组1，图1A，直接用α-苯丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应)相一致(OD₅₂₀＝0.202)，说明，交替假单胞菌B3的发酵上清液与L-苯丙氨酸反应后，有α-苯丙酮酸生成。相应的，如果不加底物L-苯丙氨酸(组3，图1C)，反应后仍为淡黄色，OD₅₂₀值也较低(OD₅₂₀＝0.038)，说明没有α-酮酸生成；同样的，先将交替假单胞菌B3的发酵上清液高温处理灭活后，再加入L-苯丙氨酸(组4，图1D)，反应后也仍为淡黄色，OD₅₂₀也较低(OD₅₂₀＝0.051)，说明也没有α-苯丙酮酸生成。结果与理论一致，说明交替假单胞菌B3发酵后，产生了LAAO。

实施例3交替假单胞菌B3生物氧化L-氨基酸的验证——氨的检测

实验分3组，实验组，阳性对照组和阴性对照组。

阳性对照组：47mL的未经培养的MM液体培养基中加入3mL体积浓度为4％的氨水，室温保存30min后，加入1M的NaOH水溶液0.5mL，反应1min，pH试纸条颜色由黄色(中性)变成绿色(碱性)；

阴性对照组：50mL未经培养的MM液体培养基作为酶液，其他操作同实验组；

实验组：根据实施例2方法收集上清液，取50mL的交替假单胞菌B3上清液(湿菌体浓度：0.1mg湿菌体/mmol底物)作为酶液，并装入250mL的三角烧瓶，与300mmol/L的L-苯丙氨酸50mL在室温反应30min后，加入0.5mL浓度为1M的NaOH水溶液(NaOH是强碱，可以使溶液中的氨(NH₄⁺)以氨气(NH₃)释放出来)，反应1min，在三角烧瓶瓶口用pH试纸条检测氨的释放，结果如图2A(实验组)所示，含交替假单胞菌B3的反应体系有氨气释放，使得pH试纸条颜色由黄色(中性)变成绿色(碱性)，其结果与阳性对照(图2B，氨水中直接加入1M的NaOH水溶液)相一致；而阴性对照(图2C，未经培养的MM液体培养基作为酶液，其他条件同实验组)的pH试纸条没有颜色变化，仍为黄色。说明交替假单胞菌B3可以产生LAAO，从而作用于L-苯丙氨酸而产生氨(NH₄⁺)。

实施例4交替假单胞菌B3对不同底物的生物氧化性能

(1)斜面培养：将交替假单胞菌B3接种于斜面培养基，25℃培养18h，获得斜面菌体(MM固体培养基)，所述斜面培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，琼脂20g/L，pH 7.2，溶剂为水；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基(MM液体培养基)，25℃培养24h，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，pH 7.2，溶剂为水；(3)发酵培养：将种子液以10％的接种量接种至发酵培养基(MM液体培养基)，25℃培养120h，获得发酵液，将发酵液经12000rpm，离心5min后，收集上清液，所述发酵培养基终浓度组成为：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，海盐30g/L，pH 7.2，溶剂为水；(4)生物氧化：分别取3mL上述发酵上清液作为酶液(湿菌体浓度：0.1mg/mmol底物)，分别与300mmol/L的L-亮氨酸(L-Leu)3mL、300mmol/L L-赖氨酸(L-Lys)3mL、300mmol/LL-酪氨酸(L-Tyr)3mL、300mmol/L L-天冬酰胺(L-Asn)3mL、300mmol/LL-谷氨酰胺(L-Gln)3mL、300mmol/L L-甲硫氨酸(L-Met)3mL、300mmol/L L-胱氨酸(L-cystine)3mL、300mmol/L L-精氨酸(L-Arg)3mL、300mmol/L L-色氨酸(L-Trp)、3mL300mmol/L L-缬氨酸(L-Val)3mL、300mmol/L L-谷氨酸(L-Glu)3mL、300mmol/L L-丝氨酸(L-Ser)3mL、300mmol/L L-脯氨酸(L-Pro)3mL、300mmol/L Beta-丙氨酸(Beta-Ala)3mL、300mmol/L DL-天冬氨酸(DL-Asp)3mL和300mmol/L L-半胱氨酸(L-Cys)3mL在温度25℃，pH 7下反应0.5h，用过氧化氢检测试剂盒(Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit，Invitrogen，USA)检测过氧化氢产生情况，结果如图6所示，发现交替假单胞菌B3能以多种L-氨基酸作为底物进行生物氧化反应，而使过氧化氢检测试剂发生颜色反应，酶活性最高的底物是L-亮氨酸，其次是L-赖氨酸，L-酪氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酰胺，L-甲硫氨酸，L-胱氨酸，L-精氨酸，L-色氨酸；酶活性最低的底物是L-半胱氨酸。

实施例5不同温度下交替假单胞菌B3的生物氧化性能

交替假单胞菌B3发酵培养后获得酶源的制备方法同实施例4。

分别取3mL发酵上清液作为酶液(湿菌体浓度：0.1mg湿菌体/mmol底物)，依次与300mmol/L的L-苯丙氨酸3mL在pH7.0条件下(用50mmol/L磷酸钾缓冲液调节pH)，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃下，反应0.5h，用过氧化氢检测试剂盒(Amplex RedHydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit，Invitrogen，USA)检测过氧化氢产生情况，结果如图7所示，发现交替假单胞菌B3发酵上清液能在25～50℃下保持较好的氧化活力，其中，30℃条件下活力最高。

实施例6不同pH值下交替假单胞菌B3的生物氧化性能

交替假单胞菌B3发酵培养后获得的酶源的制备方法同实施例4。

分别取3mL发酵上清液作为酶液(湿菌体浓度：0.1mg湿菌体/mmol底物)，依次与300mmol/L的L-苯丙氨酸3mL，在30℃条件下，分别在pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5和pH8.0下(用50mmol/L磷酸钾缓冲液调节pH)，反应0.5h，用过氧化氢检测试剂盒(Amplex RedHydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit，Invitrogen，USA)检测过氧化氢产生情况，结果如图8所示，发现交替假单胞菌B3发酵上清液能在pH6.0～8.0条件下保持较好的氧化活力，其中，pH7.0条件下活力最高。

实施例7不同金属离子对交替假单胞菌B3生物氧化性能的影响

交替假单胞菌B3发酵培养后获得的酶源的制备方法同实施例4。

分别取3mL发酵上清液作为酶液(湿菌体浓度：0.1mg湿菌体/mmol底物)，依次与300mmol/L的L-苯丙氨酸3mL在30℃、pH7.0条件下(用50mmol/L磷酸钾缓冲液调节pH)，分别添加100mmol/L的硫酸锌水溶液0.6mL、100mmol/L硫酸锰水溶液0.6mL、100mmol/L硫酸铜水溶液0.6mL、100mmol/L氯化钙水溶液0.6mL、100mmol/L氯化钴水溶液0.6mL、100mmol/L硫酸镁水溶液0.6mL、100mmol/L硫酸亚铁水溶液0.6mL、100mmol/L氯化钾水溶液0.6mL、100mmol/L硝酸镉水溶液0.6mL和100mmol/L氯化钡水溶液0.6mL，反应0.5h，用过氧化氢检测试剂盒(Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit，Invitrogen，USA)检测过氧化氢产生情况，结果如图9所示，发现硫酸锌、氯化钙、硫酸镁、氯化钾和硝酸镉可以提高交替假单胞菌B3发酵上清液的氧化活力，其中，添加硫酸锌条件下氧化活力最高。而其他金属离子均会不同程度地抑制B3发酵上清液的氧化活力，其中，硫酸亚铁和氯化钡抑制最明显。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江工业大学

 

<120>  交替假单胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  1396

<212>  DNA

<213>  Pseudoalteromonas sp.

 

<400>  1

agtcgagcgg taacatttct agcttgctag aagatgacga gcggcggacg ggtgagtaat     60

gcttgggaac atgcctttag gtgggggaca accattggaa acgatggcta ataccgcata    120

atgtctacgg accaaagggg gcttcggctc tcgcctttag attggcccaa gtgggattag    180

ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatccct agctggtttg agaggatgat    240

cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat    300

tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt    360

gtaaagcact ttcagtcagg aggaaaggtt agtagttaat acctgctagc tgtgacgtta    420

ctgacagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcga    480

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aagccccggg cttaacctgg gaactgcatt tcgaactggt caactagagt gtgatagagg    600

gtggtagaat ttcaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctgaaggaat accgatggcg    660

aaggcagcca cctgggtcaa cactgacgct catgtacgaa agcgtgggga gcaaacagga    720

ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtctact aggagctggg gtcttcggac    780

aacttttcca aagctaacgc attaagtaga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa    840

actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca    900

acgcgaagaa ccttacctac acttgacata cagagaactt accagagatg gtttggtgcc    960

ttcgggaact ctgatacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gagatgttgg   1020

gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat ccttagttgc cagcgattcg gtcgggaact   1080

ctaaggagac tgccggtgat aaaccggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc   1140

ccttacgtgt agggctacac acgtgctaca atggcatata cagagtgctg cgaactagcg   1200

atagtaagcg aatcacttaa agtatgtcgt agtccggatt ggagtctgca actcgactcc   1260

atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagaatgccg cggtgaatac gttcccgggc   1320

cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgct ccagaagtgg atagcttaac   1380

cttcgggagg gcgtca                                                   1396