一种治疗肝癌的中药癌毒方及其在制药中的应用

摘要

本发明公开了一种治疗肝癌的中药癌毒方及其在制备抗肝癌药物中的应用，癌毒方系根据国医大师周仲瑛教授的癌毒理论由蛇舌草、僵蚕、蜈蚣、八月扎、太子参、麦冬、山慈菇按一定重量配比制成，全方驱邪消癌解毒为主，辅以扶正，本发明以肝癌H

说明书

技术领域

本发明涉及中医药领域的细胞生物学、分子生物学技术，具体地说是涉及治疗肝癌的中药癌毒方及其在制备抗肝癌药物中的应用。 

背景技术

肝癌是严重危害人类生命健康的重大疾病之一，是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来死亡率增加了41.17％，其发病率和死亡率还正在逐年升高。肝癌具有发现晚、发展快、治疗难、预后差等特点,被称为“癌中之王”,由于其早期症状隐匿,多数患者就诊时已属中晚期,能手术切除者甚少,即使手术切除,术后5年复发率仍高达60%以上,小肝癌复发率也高达40%-50%。 

西医治疗肝癌以直接对抗某一病理环节发挥作用，而许多患者或为弥漫性肝癌、或伴有腹水、肾功能不全,难以接受手术、肝动脉栓塞化疗、冷冻等治疗。以中医理论为基础治疗肝癌则是对机体整体调节，发挥多层次、多环节、多靶点的综合作用，无论是在抑制、杀伤癌细胞，调节机体免疫功能，还是改善症状、提高生存质量、延长生命上都显示出独特的优势。长期以来，中医药在治疗肝癌方面取得了一定的临床疗效，尤其以中医理论为基础形成的中药复方治疗肝癌更能充分发挥辨证论治和对机体整体调节的优势，中医药抗肝癌作用越来越得到国际社会的关注和承认，但中医药治疗肝癌存在的核心问题是其作用机理不清，尤其是对创新性理论指导下形成的名老中医抗肝癌效验方的现代机制研究还不够。 

我国著名中医药专家周仲瑛教授根据近六十年的临床实践，提出了“癌毒”学说，他认为癌毒是肿瘤发生发展的关键，是在肿瘤发病过程中体内产生的一种特殊的病理因素，癌毒是肿瘤患者在正虚的基础上，因体内邪盛而生毒，癌毒与痰浊、瘀血、湿浊、热毒等病理因素同时胶结存在、互为因果，亦可兼夹转化、共同为病。癌毒一旦形成，阻滞体内，则病变乖戾，一方面大量耗伤人体气血津液，一方面导致脏腑气血功能失调，诱生痰浊、瘀血、湿浊、热毒等多种病理因素，并耗气伤阴，发生各种复杂证候，表现出邪毒嚣张、难以消除、易于传变、病情笃重、病势凶险、正气虚败、预后极差等证候特点。 

近年来，随着Toll样受体(TLRs)的发现及其丰富生物学功能的进一步揭示，以及Toll样受体/核因子-κB（TLRs／NF-κB）信号通路的部分阐明，为探讨中医药抗癌机制开启了新的思路与方法。本研究以TLRs／NF-κB通路为切入点进行癌毒方抗癌机制研究。 

TLRs是新近发现的存在于生物机体中的一大类非常重要的模式识别受体(PRR)，可表达于多种免疫细胞及上皮细胞，机体多种免疫防御反应（包括肿瘤免疫）均需要不同TLRs的参与。根据TLRs的信号传递是否包含髓样分化因子88（MyD88），TLRs信号通路又分为MyD88依赖性和MyD88非依赖性两种途径，再通过一系列反应，激活核因子-κB(NF--κB)，激活的NF-κB进入细胞核内，调控多种重要的细胞因子、粘附分子和趋化因子的表达，在机体的免疫应答、炎症反应、细胞增殖、分化及凋亡调控等方面发挥重要的作用。目前研究比较多的是TLRs／NF-κB通路对炎症性疾病、自身免疫性疾病、肝脏疾病、哮喘、冠状动脉粥样硬化等的影响。近年来，人们发现多种肿瘤细胞表面也表达TLRs，它们可被存在于局部的配体激活，刺激肿瘤细胞分泌过量肿瘤相关蛋白及细胞因子,这些因子可刺激肿瘤细胞生长、血管和淋巴管生成、肿瘤的浸润转移、导致T细胞和NK细胞功能失调等，即肿瘤细胞表面表达的TLRs可能与肿瘤细胞生长、免疫逃逸及化疗耐药相关。如在人类部分黑色素瘤细胞中，透明质烷碎片能够通过TLR4诱导产生细胞因子和MMP，这些物质恰能促进肿瘤生长，而产生的MMP又能溶解细胞间质产生透明质烷,这种正反馈调节形成恶性循环，加速肿瘤恶化；Kelly 等研究发现卵巢癌能通过TLR4-MyD88通路激活NF-κB，诱导致炎细胞因子产生，促进肿瘤生长，同时在试验中还发现卵巢癌可能通过TLR4-MyD88-NF-κB通路抵抗抗肿瘤药物紫杉醇诱导的凋亡。 

研究表明，TLRs／NF-κB通路有双重作用，既可能通过增强宿主免疫功能而发挥抗肿瘤作用，又可能起保护肿瘤细胞，逃脱免疫监视的作用。一些研究发现中药可通过影响免疫细胞中TLRs／NF-κB通路而发挥抗肿瘤作用，而中药直接对肿瘤细胞此通路影响的研究，目前国内外未见报导。 

发明内容： 

本发明的目的在于提供一种治疗肝癌的中药癌毒方及其在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明的目的是通过以下的技术方案来实现： 

癌毒方是在我校著名中医专家周仲瑛教授的“癌毒”理论指导下确立的中医药治疗肝癌的处方。本方主要由白花蛇舌草、山慈菇、蜈蚣、八月扎等组成，全方共奏清热化痰、祛瘀散结、消癌解毒之功效，在继承名老中医经验的基础上，如何将其有效验方进一步总结与验证，是名老中医传承工作一项重要的课题。

中药癌毒方其特征在于它是由下列重量配比的原料药所制成：蛇舌草3-20g；僵蚕3-10g；蜈蚣1-3g；八月扎3-12g；太子参3-15g；麦冬3-12g；山慈菇3-10g。 

上述的中药癌毒方在制备治疗肝癌药物中的应用。 

癌毒方的药理实验： 

本发明是以肝癌H₂₂移植瘤小鼠为材料，观察癌毒方的抗肝癌作用机制，本研究以TLRs／NF-κB通路作为新靶点，从细胞因子表达的源头TLRs入手，观察癌毒方对肝癌模型鼠细胞TLRs/NF-κB通路关键环节TLR4、NF-κB、髓样分化因子88（MyD88）的影响探讨抗癌作用机制。具体实验如下：

1 材料与方法

药物配制

癌毒方按上述处方剂量比例配制而成，为周仲瑛教授原创组方，其中药制剂购自安徽省亳州市中西药有限公司，由南京中医药大学药理教研室煎制，浓缩成生药量为2g/ml滤液，保存备用。顺铂注射液购自南京制药厂有限公司（批号20091118），注射用生理盐水购自南京小营药业集团有限公司（批号2009090403）。VEGF-ELISA试剂盒购买自美国 Pierce 公司。

实验动物及分组

清洁级ICR小鼠，雄性，体重18±2g，共72只。购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，饲料均购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。H22肝癌种鼠由南京市鼓楼医院动物房提供，颈椎脱臼法处死H22肝癌种鼠，用碘酒、酒精消毒腹部，抽取种鼠腹水5 ml，加入10 ml的生理盐水稀释，75%酒精消毒待接种的ICR小鼠右腋下皮肤，按每鼠0.2 ml接种小鼠右腋皮下。整个操作在60 min内完成，接种24 h后称重，随机分为5组，每组10只，即对照组（生理盐水灌胃），顺铂组（顺铂腹腔注射，0.001 g/kg/d），癌毒方高、中、低剂量组（癌毒方10、30、90 g/kg/d灌胃），以上剂量依据成人临床拟用量，通过体表面积换算得出，造模后第2 d小鼠每天给药1次，连续10 d。

观测癌毒方对荷H22肝癌小鼠生长的抑制

癌毒方给药前、给药期间用游标卡尺测量小鼠的右前肢直径进行记录，以肿瘤大小的变化和给药时间绘制移植瘤生长曲线，并在给药期间观察各给药组小鼠体重的变化。给药后第10 天处死小鼠，随机严格剥离干净皮下肿瘤组织，使用电子秤称量（精确到0.01 g）称瘤重后，计算各组瘤体平均重量及肿瘤抑制率，按以下公式计算抑瘤率：抑瘤率（％）=（对照组瘤重均数一癌毒方组瘤重均数）／对照组瘤重均数×100%。

流式细胞术检测H22移植瘤细胞周期及凋亡峰（亚二倍体峰）

取处死的小鼠H22移植瘤组织并剪碎研磨，400目尼龙网过滤成单细胞悬液，1000 r/min离心5 min，快速弃去上清液，加入PBS 0.5 ml，在混悬仪上缓慢注入2 ml 4℃、75%的冷乙醇，细胞固定后在20℃保存，1800 r/min离心10 min去掉乙醇，加PBS 2 ml，1000 r/min离心弃上清液，加PBS调细胞密度为1×106个/ml，使终体积约为0.5 ml，加PI染液混匀，30 min后上机检测，分析各组H22移植瘤细胞亚二倍体凋亡峰，研究该方对肿瘤细胞周期及细胞凋亡的影响。

法检测癌毒方对TLR4、MyD88及NF-кB蛋白表达的影响

取处死的小鼠H22移植瘤组织，于冰PBS中充分洗涤，留取约200mg组织置于1ml冰预冷裂解缓冲液，匀浆后冰浴30min，充分裂解。离心：4℃，10000×g，10min。将上清分装，存于-70℃备检。用Bradford方法测定蛋白浓度。

将样本用裂解缓冲液稀释相同浓度，取等量上样缓冲液于试管中，蛋白量为50ug，并于95-100℃ 5min后冰上冷却上样。电泳条件：浓缩胶40V，分离胶80V，约2h溴酚兰至底部。取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡15min。平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、PVDF膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200mA通电，电转移1h。PVDF膜在5％脱脂奶粉封闭液中封闭(室温，1h)，弃去封闭液，不洗。按约0.1ml/cm²的量加入封闭液和适量一抗(用封闭液稀释，稀释比1:400)。摇床摇荡孵育(4℃，过夜)。PBST漂洗滤膜4次，每次10min。将膜与HRP结合的二抗（辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG抗体, 二抗用封闭液稀释，稀释比1:10000）室温下摇荡孵育1h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次10min。进行显影和图像分析。 

统计学方法

实验数据以 ±s表示，采用SPSSI7.0统计软件，根据方差齐性采用单因素方差分析和q检验比较各组间差异， 以P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。 

实验结果

癌毒方对H22肝癌移植瘤的抑制作用

表1  各组小鼠实体瘤重比较（±s）

注：与模型组比较，^★★P< 0.0 1，^★P< 0.0 5。

与模型组比较，癌毒方各剂量组、顺铂组对H22移植瘤的生长具有显著的抑制作用（P<0.05，P<0.01），中剂量（30 g/kg剂量组）效果最好（抑瘤率42.8%），与顺铂组（抑制率58.6%）效果相当，提示癌毒方灌胃给药对H22小鼠移植瘤具有较好的抑制作用（见表1）。 

癌毒方对H₂₂移植瘤肿瘤细胞凋亡的影响

表2 各组细胞凋亡率比较（n=10，±s）

注：与模型组比较，^★★P< 0.0 1，^★P< 0.05

与模型组比较，癌毒方各剂量组和顺铂组与模型组相比其移植瘤细胞凋亡率有统计学差异（P<0.05，P<0.01），中剂量（30 g/kg剂量）组效果与顺铂组相当，提示癌毒方灌胃给药具有诱导H22小鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡的作用（见表2）。

癌毒方对H₂₂移植瘤肿瘤细胞TLR4、MyD88、NF-кB蛋白表达的影响

图1：western blot 图显示出癌毒方各剂量组及顺铂组TLR4、MyD88、NF-кB蛋白相对表达量明显低于模型组。

图2：灰度比图显示出癌毒方各剂量组及顺铂组TLR4蛋白相对表达量明显低于模型组(P<0.05)。 

图3：灰度比图显示出癌毒方各剂量组及顺铂组MyD88蛋白相对表达量明显低于模型组(P<0.05)。 

图4：灰度比图显示出癌毒方各剂量组及顺铂组NF-кB蛋白相对表达量明显低于模型组(P<0.05)。 

由图1-4可见，癌毒方用药组能降低肝癌细胞中TLR4、MyD88、NF-кB蛋白表达。 

癌毒方的有益效果：

药理试验以荷瘤小鼠实体瘤重、抑瘤率、凋亡率为评价指标研究癌毒方对肝癌H22小鼠移植瘤生长的影响，以小鼠肿瘤细胞TLR4、MyD88及NF-кB蛋白表达水平的变化为实验指标，从蛋白水平研究癌毒方的抗癌机制。与对照组比较，癌毒方各剂量组及顺铂组对移植瘤的生长具有显著的抑制作用。癌毒方能诱导肿瘤细胞凋亡。癌毒方各剂量组及顺铂组TLR4、MyD88及NF-кB蛋白表达量明显低于模型组。研究表明，癌毒方能抑制肝癌H22小鼠移植瘤的生长，并诱导其凋亡，阻断TLR4高表达，阻断TLR4胞内信号转导的MyD88依赖性途径，抑制下游NF-кB蛋白表达。抑制肿瘤细胞TLR4及其下游信号转导通路主要元件MyD88、NF-кB蛋白表达可能是癌毒方抗肿瘤作用机制之一。

四、附图说明 

图1 TLR4、MYD88、NF-кB及β-actin的免疫印迹（western blot）图（1：模型组；2 ：顺铂组；3：低剂量组；4：中剂量组；5：高剂量组）。

图2 TLR4与β-actin灰度比图。 

图3 MYD88与β-actin灰度比图。 

图4 NF-кB与β-actin 灰度比图。 

五、具体实施方式： 

实施例1

癌毒方：蛇舌草3g、僵蚕5g、蜈蚣1g、八月札3g、太子参3g、麦冬3g、山慈菇3g。

煎煮：将诸药按照上述处方药物量正确配齐并放入砂锅，水浸过2cm，大火煮至95℃—100℃后，改小火煎煮40—60分钟后，倒出药汁。将所剩药渣加入冷水，再次大火煮至95℃—100℃后，改小火煎煮40—60分钟，倒出药汁。将两次药汁混匀，供一天服用。 

实施例2 

癌毒方：蛇舌草6g、僵蚕5g、蜈蚣1g、八月札5g、太子参6g、麦冬5g、山慈菇5g。

    煎煮：同实施例1 

实施例3

癌毒方：蛇舌草10g、僵蚕8g、蜈蚣2g、八月札8g、太子参10g、麦冬8g、山慈菇8g。

    煎煮：同实施例1 

实施例4

癌毒方：蛇舌草15g、僵蚕10g、蜈蚣2g、八月札10g、太子参15g、麦冬10g、山慈菇10g。

    煎煮：同实施例1 

实施例5

癌毒方：蛇舌草20g、僵蚕10g、蜈蚣3g、八月札12g、太子参15g、麦冬12g、山慈菇10g。

    煎煮：同实施例1。