菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记及其快速PCR检测方法

摘要

本发明为“菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记及其快速PCR检测方法”，属生物技术领域。菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根据菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段设计的引物HfF1和HfR1，在PCR快速检测菲利普孢囊线虫的方法中，可扩增出313bp的片段，同时还可以在PCR反应体系中加入通用引物TW81和AB28作为内标，能同时扩增出1000bp的片段。本发明提高了分子检测灵敏度并且快速准确，在菲利普孢囊线虫检测和菲利普孢囊线虫病的早期诊断方面，具有很高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记全序列、特异性SCAR 标记引物序列及菲利普孢囊线虫SACR特异性快速PCR检测方法。

背景技术

小麦孢囊线虫(CCN)是温带禾谷作物上的世界性重要病原线虫，自1874年在德国被发现 以来，随后在英国、俄罗斯、挪威、澳大利亚、加拿大、日本、印度、美国、新西兰、中国 等40多个国家均发生不同程度的危害，严重影响禾谷作物尤其是对麦类作物的产量和质量。 我国自1989年彭德良等首次在我国湖北天门县发现禾谷孢囊线虫为害小麦后，目前已发现在 湖北、河北、河南、北京、山西、内蒙古、青海、安徽、江苏、山东、甘肃、陕西、宁夏等 13省市都有CCN的分布。CCN已成为严重威胁我国小麦生产的主要病害。

小麦禾谷孢囊线虫(CCN)最早是被德国人Kuhn在1874年发现的，起初被认为是甜菜孢 囊线虫(Heterodera schachtii)，1934年Filipjev单独建立了一个种H.avenae。目前这些危害禾 谷类作物的Heterodera属的孢囊线虫种统一被定义为禾谷孢囊线虫组。在这个组群中对禾谷 类作物危害最大的为三个种，禾谷孢囊线虫(H.avenae)，菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)和大 麦孢囊线虫(H.latipons)。

菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)1981年首次在塔吉克斯坦发现，目前已经德国、英国、瑞 士、挪威、伊朗、美国等国家发生危害，是国际小麦等禾谷类作物生产中面临的潜在威胁性 线虫。2009年彭德良等在我国河南省开展小麦孢囊线虫病发生危害和跨区收割是否传播小麦 孢囊线虫病的调查中首次采集和鉴定出菲利普孢囊线虫，目前菲利普孢囊线虫已经在河南省 的许昌市，临颍县，卫辉县，延津县等地区发现和危害小麦。

菲利普孢囊线虫与禾谷孢囊线虫(H.avenae)非常相似。主要区别在于其阴门锥有明显 的下桥结构。目前菲利普孢囊线虫的鉴定多数情况下仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，生 理小种和致病性的鉴定主要是用鉴别寄主或寄主植物的不同品种的反应型来确立。但形态学 鉴定非常困难，需要许多的技术、耗时、费力且许多表型特征的不稳定性，形态特征测量值 有重叠等原因使鉴定时常出现误差。

以PCR为基础的分子生物学技术为解决线虫鉴定诊断存在的问题提供了最有力的工具。 特异性引物PCR或多重PCR技术是近年来线虫分子诊断取得的重要进展。通过一次PCR 测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。基于核糖体DNA(rDNA)而 构建的线虫特异性引物进展较快，在诊断根腐线虫、根结线虫中取得了突破性进展，形成了 特异性诊断4种重要根腐线虫如穿刺根腐线虫P.penetrans、斯克里布根腐线虫P.scribneri、 咖啡根腐线虫P.Coffeae和卢赛根腐线虫P.loosi的特异性引物，以及3种根结线虫如戚乌 得根结线虫M.Chitwoodi、法拉克斯根结线虫M.fallax和北方根结线虫M.Hapla(Zijlstra，C. 1997，Petersen et al.，1997，Williamson et al.，1997)的特异性引物，诊断的水平达到单条幼虫的 水平。

Mulholland et al.(1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一 种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯 白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应 中应用了3个引物，通用引物5.8SrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITS1-Gr和马铃薯白线 虫的特异性引物ITS1-Gp。Bulman & Marshall(1997)成功应用多重PCR技术快速诊断马 铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的rDNA-ITS的序 列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSr3和白线虫的特异性引物PITSp4， 通用引物ITS5与PITSr3可以扩增343bp马铃薯金线虫的特异性片段，与PITSp4可以扩增出 265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用PITSr3，PITSp4和 ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合 种群检测出金线虫。

彭德良和Subbotin等(2001)构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物 GlyF1，应用两组引物D3A和D3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1和引物rDNA2成功 地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。第一对引物D3A和D3B是证实PCR扩增的成功性， 第二对引物GlyFI和rDNA2是特异性检测大豆孢囊线虫。用这两对引物进行的双倍PCR扩 增，从所有52个大豆孢囊线虫群体都扩出了大豆孢囊线虫的特异性DNA片段(181bp)，而 在所有测试的其他8种孢囊线虫22群体没有181bp片段。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyF1 灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆孢囊线虫种特异性片段。

Amiri，Subbotin等(2002)构建了基于rDNA-ITS的甜菜孢囊线虫(H.schachtii)特 异性引物SHF6。将特异性引物SHF6与通用引物AB28引物结合，同时将通用引物D2A和 D3B放在一个PCR反应体系中，从58个孢囊线虫群体中成功地鉴定出甜菜孢囊线虫，从36 个甜菜孢囊线虫群体中扩增200bp特异性片段，而没有甜菜孢囊线虫(H.schachtii)DNA的 样品没有200bp的片段。

而基于基因组DNA的SCAR标记植物线虫特异性引物进展较慢。但在马铃薯金线虫 和马铃薯白线虫的快速分子诊断中取得进展，Fullanodo，A.et.al.(1999)用随机引物OPG5 分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD标记片段为826bp，马铃薯白线虫特异性RAPD 标记片段为1100bp。对扩增出的马铃薯金线虫和白线虫的RAPD标记片段进行全序列分析， 将RAPD标记转化成SCAR标记，设计出马铃薯金线虫FullGrf和FullGrr以及马铃薯白线虫 的SCAR特异性标记引物FullGpf和FullGpr，用FullGrf和FullGrr扩增出了315bp马铃薯金 线虫的特异性片段，用FullGpf和FullGpr扩增出798bp的马铃薯白线虫的特异性片段。

Ou，S.Q.Peng D.L.(欧师琪 彭德良等2008)采用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫 基因组DNA的特异性SCAR标记，构建了特异性SCAR标记的特异性引物SCNFI和SCNRI， PCR扩增出500bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR片段，选用核糖体引物D2A和D3B作为内 标与上述特异性引物SCNF1和SCNR1相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫， 在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了500bp的特异性SCAR标记片段和800bp片 段。

国内外虽然有关于菲利普孢囊线虫核糖体DNA的ITS区域研究报道，但是没有关于菲 利普孢囊线虫特异性引物的报道，更没有关于基于基因组DNA的菲利普孢囊线虫特异性 SCAR标记引物检测菲利普孢囊线虫的研究报道。

发明内容

针对上述技术领域的空白，本发明提供菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的全长序列， 同时提供了特异性SCAR标记的特异性引物。

本发明还提供菲利普孢囊线虫SACR特异性快速PCR检测方法，为制定线虫的快速分子 检测、菲利普孢囊线虫病的早期诊断和制定线虫病害综合治理对策服务。

菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于具其如SEQ ID NO1所示的 核苷酸序列。

根据菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段的设计的特异性引物。

优选特异性引物为HfF1和HfR1，其序列为：

HfF1：5’-AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3’，

HfR1：5’-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3’。

菲利普孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述 引物HfF1和HfR1。

所述PCR反应体系中还含有通用引物。

所述通用引物序列为：

TW81：5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’，

AB28：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’。

所述PCR检测为一步双重PCR检测。

本发明利用RAPD技术，获得了基于菲利普孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记， 将RAPD标记转换成SCAR标记，经克隆测序后获得了特异性SCAR标记的全长序列SEQ ID NO1，根据该特异性SCAR标记，可以设计出其特异性引物，用于菲利普孢囊线虫的快速PCR 检测。

本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HfF1和HfR1(即SEQ ID NO2和SEQ ID  NO3)。利用菲利普孢囊线虫特异性引物HfF1和HfR1，在PCR扩增条件下，所有菲利普孢 囊线虫群体都获得了313bp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有313bp的特异性 SCAR标记片段。为防止假阴性反应，可以在PCR反应体系中加入通用引物作内标。本发明 选用核糖体引物TW81和AB28与上述特异性引物HfF1和HfR1相结合，利用一步双重PCR 方法检测菲利普孢囊线虫，在PCR扩增条件下，菲利普孢囊线虫群体都获得了313bp的特异 性SCAR标记片段和1000bp片段，而其它线虫类则没有313bp的特异性SCAR标记片段， 只有1000bp片段，增加了可靠性。本发明构建的特异性引物HfF1和HfR1，其特异性强，准 确，灵敏。

本发明应用特异性SCAR标记及核糖体基因相结合的一步双重聚合酶链式反应PCR检测 技术检测目标线虫，与重复性较差的RAPD技术(RAPD-PCR)、核糖体DNA限制性内切酶 技术(RFLP-PCR)检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的菲利普 孢囊线虫检测技术。该技术可应用于对菲利普孢囊线虫田间土壤样品及菲利普孢囊线虫病发 生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1：用随机引物OPC06扩增菲利普孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、大豆孢囊线虫和Heterodera  latipons等线虫群体的RAPD的特异性DNA片段结果，

M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-6分别为菲利普孢囊线虫(编码为 Hf01，Hf02，Hf07，Hf10，Hf11，Hf12)，7-8分别为禾谷孢囊线虫群体(编码为Ha01，Ha02)， 9-11分别为大豆孢囊线虫群体(编码为Hg01，Hg02，Hg03)；12为Heterodera latipons群体 (编码为H101)；13为阴性对照；

图2：用菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物(HfF1和HfR1)扩增菲利普孢囊线虫的结 果，

M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-11分别为菲利普孢囊线虫不同群体(编 码为Hf01，Hf02，Hf03，Hf04，Hf05，Hf06，Hf07，Hf08，Hf09，Hf10，Hf11)；12为禾谷孢囊线虫群 体(编码为Ha01)；13为大豆孢囊线虫群体(编码为Hg01)；14为阴性对照；

图3：菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(TW81和AB28)结合一步双重PCR 检测结果，

M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2,000)；1-11分别为菲利普孢囊线虫 (Hf01，Hf02，Hf03，Hf04，Hf05，Hf06，Hf07，Hf08，Hf09，Hf10，Hf11)；12为阴性对照；

图4：菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(TW81和AB28)结合一步双重PCR 检测5种孢囊线虫的结果，

M为标准DNA分子标记(DNA marker 100bp)；1-4为菲利普孢囊线虫群体 Hf01，Hf02，Hf07，Hf10；5-12为禾谷孢囊线虫群体Ha01，Ha02，Ha03，Ha04，Ha05，Ha06，Ha07， Ha08；13为大豆孢囊线虫群体Hg01；14为马铃薯腐烂茎线虫群体Dd01；15为香蕉穿孔线 虫群体Rs01；16为Heterodera latipons群体H101；17：阴性对照

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明的实验选用的材料：

12个菲利普孢囊线虫群体为本实验室长期从河南省许昌市，临颍县，卫辉县，等地收集 保存的孢囊线虫种群，8个禾谷孢囊线虫群体为本实验室从北京、河北、河南等省市收集保 存。3个大豆孢囊线虫群体，1个豌豆孢囊线虫群体，1个旱稻孢囊线虫群体，1个马铃薯腐 烂茎线虫群体，1个香蕉穿孔线虫群体为本实验保存(见表1、表2)。上述线虫本实验室均 有保存，可以对公众发放。

表1 菲利普孢囊线虫样品代码及群体来源

表2 供试其他线虫群体样品代码及来源

主要试剂：Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker购自TaKaRa公司， 限制性内切酶(Biolabs)购自京科宏达生物技术公司；引物由上海生工生物技术有限公司合 成；PMD 18-T vector(TaKaRa，Dalian，China)购自北京华绿源生物技术公司。

实施例1：菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段、特异性引物

1.1 菲利普孢囊线虫DNA的提取

手挑菲利普孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、大豆孢囊线虫等群体各1个孢囊，放入10μl灭 菌的重蒸水中，-20℃冰箱中冷冻1h。用75％酒精消毒的玻璃棒在eppendorf tube中转动至冰 融化，加入7μl的10X的PCR buffer，3μl蛋白酶K溶液(600μg/ml)，然后在-20℃下冷冻至少 2h。2h后，将eppendorf tube从冰箱中取出，置65℃下温育1.5h；接着在95℃ 10min，使蛋 白酶K变性，最后1000rpm下离心1min，取上清DNA悬浮液于-20℃保存备用。

1.2 菲利普孢囊线虫特异性RAPD标记(SCAR标记)的筛选

借鉴彭德良研究大豆孢囊线虫群体的遗传变异分析结果(彭德良，小麦和大豆孢囊线 虫毒性、分子诊断及线虫病害生防因子研究博士学位论文，2001年7月)，在产生多态性的 RAPD引物中，遴选12个Operon系列的含10个碱基的随机引物OPA02、OPA03、OPA06、 OPA09、OPA13、OPA18、OPB15、OPC06、OPD13、OPG06、OPG08、OPK16(见表3)进 行扩增。从扩增结果来看，随机引物OPC06获得的特异性片段稳定，因此选用OPC06对14 个菲利普孢囊线虫群体和其他孢囊线虫群体的DNA进行扩增，寻找出菲利普孢囊线虫群体 的特异性SCAR标记片段位579bp。

RAPD-PCR反应体系：采用25μl的PCR反应体系，配比如下：10X PCR-buffer(含 Mg++)2.5μl，dNTPs 2.0μl，引物OPC06为1.0μl，Taq DNA多聚酶0.25μl(5U/μl)，模板 DNA1.0μl，灭菌重蒸水补足25μl。在Eppendorf PCR扩增仪上进行扩增。

PCR扩增条件为94℃ 4min；94℃ 30s，35℃ 30s，72℃ 1min，10个循环；94℃ 30s；37℃ 1min； 72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃过夜。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样 缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，用0.5X TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳1小时，用 EB染色，在紫光灯下观测并照相。如图1。

表3 本发明所使用引物代码和序列

用随机引物OPC06经过多次RAPD扩增多态性较稳定，从图1中可以看出用随机引物 OPC06扩增菲利普孢囊线虫群体获得579bp的特异性DNA片段(图1中1-5泳道)

1.3、菲利普孢囊线虫特异性SCAR的序列测定及构建特异性SCAR标记引物

将随机引物OPC06扩增菲利普孢囊线虫获得的579bp的RAPD特异性DNA片段从琼 脂糖凝胶上切割，使用大连宝生物公司的DNA回收试剂盒对579bp的RAPD特异性DNA 片段进行回收和纯化后，纯化后的RAPD-PCR产物连接到PMD 18-T载体上，PCR产物与载 体连接后，转化到E.coli中进行克隆，用原来的RAPD引物和限制性内切酶EcoRI对质粒DNA 进行检测。将表现为阳性克隆的重组质粒委托大连宝生物公司进行序列测定，见SEQ ID NO1。 用Vector NTI 9.0(InforMax Co.)软件对序列进行分析比较。

根据菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的序列测序结果，取其中保守序列构建了一对菲 利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物，该引物对各含23碱基。将菲利普孢囊线虫特异性SCAR 标记上游引物和下游引物分别命名为HfF1和HfR1，其序列特征如下：

HfF1：5’-AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3’

HfR1：5’-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3’

实施例2：菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物的分子检测

本发明构建的菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物HfF1和HfR1由上海生工生物有限 公司合成，特异性SCAR标记的扩增反应体系总体积为50μl，其中含有5μl 10XPCR buffer (含Mg++)；4μl 2.5mM dNTP；1.0μl HfF1(0.1μg/μl)；1.0μl HfR1(0.1μg/μl)；1U Taq DNA 聚合酶(5U/μl)；2μl模板DNA(菲利普孢囊线虫及其它孢囊线虫群体提取的DNA)；ddH₂O  36.5μl。

所应用的菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列如下：

HfF1：5’-AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3’

HfR1：5’-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3’

PCR扩增程序为：94℃预变性4min，然后94℃ 30S，56℃ 30S，72℃ 1min循环35次， 72℃延伸10min，保存在4℃条件下。取5μl PCR反应产物与1μl上样缓冲液(0.09％溴酚 兰，60％甘油，60mMEDTA)混匀，点入含0.5mg/LEB的1.2％琼脂糖凝胶中，在100V下 电泳1小时，取出凝胶，采用Kodak EDAS-120凝胶分析系统进行照相分析。统计特异条带 的分离结果(见图2)，与特异RAPD标记的分离情况进行对比分析。

利用菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物，在56℃的退火温度和35个循环的条件下 扩增，所有菲利普孢囊线虫群体都获得313bp特异性SCAR标记片段(图2中1-11泳道)， 而禾谷孢囊线虫(图2中12泳道)，大豆孢囊线虫(图2中13泳道)，豌豆孢囊线虫，旱稻 孢囊线虫，马铃薯腐烂茎线虫和香蕉穿孔线虫等都没有获得313bp SCAR标记片段。说明本 发明所构建的SCAR标记引物对菲利普孢囊线虫具有特异性，这是目前国际首例菲利普孢囊 线虫特异性SCAR标记引物。

实施例3：特异性SCAR标记引物与通用引物(TW81和AB28)一步双重PCR方法检测菲利 普孢囊线虫

本发明将构建的菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物HfF1和HfR1与通用引物TW81 和AB28等4个引物置于同一个PCR反应中，HfF1和HfR1特异性扩增菲利普孢囊线虫基因 组DNA的SCAR标记片段，引物TW81和AB28用于扩增rDNA基因ITS扩展区域的DNA 片段。本发明所采用的一步双重PCR方法为世界首例菲利普孢囊线虫分子诊断方法，此分 子检测方法含有基因组DNA和核糖体DNA两个片段。

本发明的菲利普孢囊线虫分子检测方法含用25μl的PCR反应体系，配比如下：10X  PCR-buffer(含Mg++)2.5μl，dNTPs 2μl，TW81 0.1μl，AB28 0.1μl，HfF1 1μl，HfR1 1μl，Taq DNA 多聚酶0.25μl(5U/μl)，模板DNA 2.0μl，灭菌重蒸水补足25μl

PCR反应扩增程序为：94℃预变性4min，然后94℃ 30S，56℃ 30S，72℃ 2min循环35 次，72℃延伸10min后，4℃条件下保存。取3μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖 凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，100V下电泳40min，用EB染色，在紫光灯下观测 并照相。相同样品的双重PCR至少重复两次以证实结果的准确性。同一采样地点的样品的鉴 定试验重复三次。

所应用的菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物序列如下：

HfF1：5’-AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3’

HfR1：5’-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3’

TW81：5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’

AB28：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’

用特异性SCAR标记引物HfF1和HfR1，TW81和AB28两对引物在同一个PCR反应体 系中对孢囊线虫群体进行PCR扩增(见图3，图4)，菲利普孢囊线虫全部扩增到特异性SCAR 标记的313bp片段(图3中1-11，图4中1-4)及ITS扩展区的1000bp两个DNA片断。

而禾谷孢囊线虫等其它孢囊线虫12个群体仅扩增到ITS扩展区的1000bpDNA片断，而 没有特异性SCAR标记的313bp片段(见图4中5-16)。说明本发明所构建的SCAR标记引 物与通用引物(TW81和AB28)一步双重PCR方法对菲利普孢囊线虫具有特异性，这是目 前国际首例菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(TW81与AB28)一步双重特 异性检测菲利普孢囊线虫的分子方法。