一种适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145低温碱性脂肪酶基因、氨基酸序列及重组脂肪酶

摘要

本发明涉及从渤海海泥中筛选到的一株能够分泌低温碱性脂肪酶的适冷性海洋酵母菌株(Bohai Sea-9145)中，利用简并引物聚合酶链式反应(PCR)与cDNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法克隆得到了一条编码低温碱性脂肪酶(LipY)的基因。该基因含有一个1206bp的开放阅读框(ORF)，编码401个氨基酸，在氨基端含有一个28个氨基酸的信号肽。编码的氨基酸含有脂肪酶的保守序列(G-X-S-X-G)和1个潜在的N-糖基化位点。将此脂肪酶基因克隆到真核表达载体(pIC9K)上，在巴斯德毕赤酵母(GS115)中进行异源表达。以甲醇作为诱导剂，发酵96小时后在上清液中获得了高活力的重组脂肪酶。利用镍离子亲和柱对重组脂肪酶进行纯化，得到了电泳纯的脂肪酶样品。该重组脂肪酶具有低温催化活力高、碱性条件下性能稳定等一系列优点，在日化、纺织及食品加工等低温催化领域有着广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物克隆技术领域，特别是涉及一种适冷性海洋酵母(菌株)Bohai Sea-9145的低温碱性脂肪酶基因的克隆、氨基酸序列及重组脂肪酶酶学特征。 

背景技术

脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3.)是一类能催化三酰甘油酯、二酰甘油酯及单酰甘油酯酯键水解的酶。脂肪酶的催化反应有两个显著特点。一是不需要辅酶，反应条件温和，副产物少；二是脂肪酶催化反应中的底物难溶于水，能在异相系统(即油-水界面)或有机相中发挥作用。 

脂肪酶来源广泛，动物、植物、微生物均能产脂肪酶。微生物所产的脂肪酶种类最多，由于具有比动植物脂肪酶更广范围的反应pH值、反应温度以及对底物的选择专一性，它们在工业研究中的发展相当迅速。随着固定化技术、细胞工程、基因工程等新技术的兴起，脂肪酶的研究取得了日新月异的进步。目前，微生物脂肪酶己成为继蛋白酶、淀粉酶之后跃居世界工业酶制剂市场第三位的酶种，具有良好的发展和应用前景。因此各国纷纷开展脂肪酶的生产及应用研究。然而国内已经开发的脂肪酶市场占有率较低，现今世界上80％的脂肪酶市场仍被丹麦诺维信(NOVO)公司所占有，且价格较高(600-1500美元/公斤)。分析原因主要有两个：一是国内开发的脂肪酶的酶学性质并不能适应新的使用需求。比如目前使用的脂肪酶大多都是中温酶(其最适温度基本都在50℃左右)，而在食品、洗涤、制药、脂类加工、环境修复等领域中，却需要低温脂肪酶的参与来进行；二是野生型产脂肪酶的微生物菌株代谢产物复杂，繁琐的提取纯化步骤提高了生产成本，降低了经济效益。因此如何寻找性能更加稳定、功能更加完善的新型产酶微生物及构建高产酶水平的基因工程菌株是目前酶制剂行业关注的焦点。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，发明人在长期从事海洋微生物的开发、生产及应用实践过程中，利用最新科学技术-分子克隆技术，在前期专利基础上，从已筛选得到的适冷性海洋解脂亚罗酵母中，通过简并引物PCR与cDNA 末端快速扩增(RACE)相结合的方法，开发提供一种适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145的低温碱性脂肪酶基因序列及利用该基因获得的重组脂肪酶。 

本发明提供的适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145的低温碱性脂肪酶基因、氨基酸序列及重组脂肪酶，包括下列二部分： 

一、适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145低温碱性脂肪酶基因(以下简称脂肪酶基因)的克隆 

1、适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145脂肪酶基因组DNA的提取方法参照Adams等的国际标准方法(Adams et al.，1998)。 

所述适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145作为脂肪酶基因的来源，分离自渤海海泥中。经鉴定该酵母为海洋解脂亚罗酵母的一个新的亚种。现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为M203095(NCBI登录号EU 086828；中国专利授权号ZL200410096668.7)。 

2、简并引物的设计 

根据不同种属微生物来源的脂肪酶基因的保守序列以及解脂亚罗酵母密码子偏好性设计简并引物F1，R1： 

F1 5’-GTSTTYMGAGGHACYTT-3’ 

R1 5’-CC SARRGAGTGDCCRGT-3’ 

上述简并引物F1，R1是在克隆编码海洋解脂亚罗酵母脂肪酶的基因序列时采用的。首先从生物信息网站GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找有关脂肪酶的氨基酸序列信息，共选择了5种不同菌株的脂肪酶氨基酸序列，分别来自黑曲霉Aspergillus niger(ABG37906.1)，出芽短梗霉Aureobasidium pullulans(ABV03820.1)，假丝念珠菌Candida deformans(CAD21428.1)，得巴利汉逊酵母Debaryomyces hanseni(XP_460224.1)与解脂亚罗酵母Yarrowia lipolytica(XP_500777.1)。将5种脂肪酶氨基酸序列利用基因序列分析软件(DNAMAN 6.0)进行比对，比对结果见图1。 

通过比对找出这5种脂肪酶的保守结构域(图中箭头所示区域)，并结合解脂亚罗酵母密码子的使用频率(图2)，去除使用频率较低的密码子，设计简并引物(F1，R1)用于克隆脂肪酶基因的部分序列。 

3、脂肪酶基因部分序列的PCR扩增 

反应体系： 

其中所述基因组DNA为解脂亚罗酵母基因组DNA(图3.A)，PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司，引物F1、R1由上海生工生物技术有限公司合成。 

将设计好的简并引物按以下方法进行PCR扩增。反应条件：预变性94℃，5分钟；变性温度94℃，1分钟；退火温度49℃，1分钟；延伸温度72℃，1分钟；30个循环后，72℃延伸10分钟。结果见图3(B)，最终获得了大小为266bp的一条核酸片段。 

4、PCR产物的回收 

将上述的PCR产物通过1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行分离，电压50V，电泳20分钟。在紫外灯下切下目标带(266bp)，用凝胶回收试剂盒回收。 

凝胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。 

5、PCR产物与克隆载体(pMD19-T)的连接 

将回收的PCR产物与pMD19-T载体连接 

连接体系： 

16℃连接2h。 

其中克隆载体pMD19-T、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。 

6、阳性克隆的筛选 

将连接后产物按分子克隆实验指南(第三版，作者：萨姆布鲁克)标准转化方法转入DH5α感受态细胞中。根据α互补原理，用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷 (X-gal)与IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)对转化子进行蓝白斑初筛。其中蓝色菌落为阴性菌落，白色菌落为阳性菌落。用无菌牙签挑取白斑克隆转接于肉汤(LB)液体培养基溶液中，提取质粒并测序；最终得到了266bp的核酸序列，见图4。绿色标注的区域分别是上下游引物。 

根据所获得的核酸序列利用分子生物学软件(Primer 5.0)直接推测得到了该基因片段所编码的88个氨基酸(88AA)： 

VFRGTFSLADAITDMQFLLSPTVDDSPLWQTFSANDTTAEAQTHCEGCNHHDGFSKAFTETWYRIGHDLQKHLDANPDYQLYVTGHSL 

上述LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，pH7.2到7.5，121℃，20分钟灭菌。DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒测序由上海生工生物技术有限公司完成。 

7、cDNA末端快速扩增(RACE)方法获取全长脂肪酶基因 

1)根据上述6测序结果设计合成寡聚核苷酸引物(GSP)1和2。 

GSP2 5’-CCCAGAGAGTGGCCAGTCACGTACAG-3’ 

GSP1 5’-GTCTTCCGAGGAACCTTTTCGCTGG-3’ 

2)根据上述6测序结果在合成的引物GSP1和引物GSP2内侧分别设计巢试引物(NGSP)1和2。 

NGSP2 5’-TACAGCTGGTAGTCCGGGTTAGCGT-3’ 

NGSP1 5’-AGACGCGATCACGGACATGCAGTTC-3’ 

引物GSP与NGSP由上海生工生物技术有限公司合成。 

3)以适冷性海洋酵母(Bohaisea-9145)RNA为模板，合成cDNA第一链，然后反转录合成第二链(合成及反转录方法按分子克隆实验指南第三版标准方法进行)。以合成的cDNA为模版，分别以GSP1(5′-RACE)，GSP2(3′-RACE)作为引物进行首轮PCR(反应条件如上述3所示)。将首轮扩增的5′-RACE与3′-RACE产物用无菌水稀释50倍作为模板，利用巢试引物NGSP进行第二轮PCR扩增(反应条件如上述3所示)，结果见图5。使用巢试引物进行PCR扩增后，分别得到了大小为545bp(5′RACE产物)与880bp(3′RACE产物)左右的两组产物(图5)，将得到的核酸序列送上海生工生物技术有限公司测序并进行序列拼接，拼接后最终得到一条大小为1206bp的编码脂肪酶的核酸序列(图6)。 

以上所述RACE试剂盒购自美国Clon tech公司。 

8、脂肪酶编码基因的生物信息学分析 

通过cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得了一条完整编码脂肪酶的的基因序列(1206bp)，共编码401个氨基酸(图7)。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure)保守区域数据库(Conserved Domain Database)分析所获得的脂肪酶氨基酸序列，显示其属于脂肪酶超家族(图8)。对所获得的脂肪酶基因序列和它编码的氨基酸序列的生物信息学分析主要检索了附表1中的网站和数据库。 

表1生物信息学分析网址 

9、信号肽(signal peptide)是引导新合成肽链转移到内质网上的一段多肽，位于新合成肽链的N端，一般15-30个氨基酸残基，含有6-15个带正电荷的非极性氨基酸，信号肽中没有其它保守序列也没有酸性基团。图9是克隆到的脂肪酶基因所编码的氨基酸序列的信号肽分析结果，在第28和29个氨基酸之间被信号肽酶酶切的可能性最大，该脂肪酶信号肽为一个包含28个氨基酸残基的N端肽链。 

10、N-糖基化位点 

N-糖基化是蛋白翻译后修饰的重要步骤，它影响着蛋白质的折叠、运送、定位、表达、稳定性、活性及其抗原性等，从而影响细胞的生物学行为。分析由上述方法得到的脂肪酶基因编码的氨基酸序列，结果如图10所示，其N-糖基化位点位于氨基酸序列的133处(N-D-T)。 

11、脂肪酶基因的同源性分析 

将上述7中所获得的基因通过表1中所列网址进行同源性分析，比对结果见图11。该基因与解脂亚罗酵母LipY8p(DQ200800.1)脂肪酶基因同源性最高，相似度达到89％。初步判定所克隆的基因属于脂肪酶基因。 

二、低温碱性重组脂肪酶的制备 

1、脂肪酶基因的PCR扩增 

根据上述已克隆的脂肪酶基因序列，添加酶切位点，设计表达引物如下： 

F2 5’-GACGAATTC

GCAGGCGTGTCTCAAGG-3’ 

R2 5’-AACGCGGCCGCGTTCTCAACTTGTGGGG-3’ 

下划线标注的分别为EcoRI与NotI酶切位点，斜体部分为编码6×组氨酸的碱基。EcoRI与NotI购自宝生物工程(大连)有限公司，引物F2、R2由上海生工生物技术有限公司合成。 

脂肪酶基因的PCR扩增 

反应体系： 

以上反应体系中所述基因组DNA为解脂亚罗酵母基因组DNA，PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。 

反应条件：预变性94℃，5分钟；变性温度94℃，1分钟；退火温度54℃，1分钟；延伸温度72℃，1分钟；30个循环后，72℃延伸10分钟。 

以解脂亚罗酵母基因组DNA为模板，F2和R2为引物，得到一条大小约为1200bp的片段，命名为LipY1，如图12所示。 

2、脂肪酶基因表达载体的构建 

将LipY1与表达载体pIC9K分别用EcoRI与NotI进行双酶切。 

酶切体系： 

37℃酶切4h，加入4μL10×终止反应液，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，并回收酶切产物。回收步骤如第一部分中4所述。 

EcoRI、NotI、pIC9K、10×M与终止反应液缓冲液均购自宝生物工程(大连)有限公司。 

将双酶切产物进行16℃过夜连接，将连接好的表达载体命名为pIC9K-LipY1。 

连接反应体系： 

T4DNA连接酶、10×T4DNA连接酶缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司。 

将表达载体pIC9K-LipY1用线性化酶(Bg1 II)进行酶切，37℃酶切4h，加入4μL10×终止反应液，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物，电泳检测。图13所示即为线性化处理后的pIC9K-LipY1，大小约为11kb。 

线性化酶切反应体系如下： 

Bg1 II与10×H缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司。 

3、重组脂肪酶的制备 

将线性化处理后的表达载体pIC9K-LipY1采用电转化的方法转入巴斯德毕赤酵母GS115中。采用甲醇作为诱导剂，对重组酵母进行诱导表达。 

巴斯德毕赤酵母GS115(购自宝生物工程(大连)有限公司)。巴斯德毕赤酵母GS115感受态的制备及电转化的方法按分子克隆实验指南(第三版，作者：萨姆布鲁克)标准转化方法进行。 

重组脂肪酶制备方法： 

1)将重组酵母接入到装有100mL甘油培养基(BMGY)中，100mLBMGY需使用1L摇瓶，250-300转(rpm)，28℃培养OD₆₀₀至12-16。 

所述BMGY培养基： 

13.4g/LYNB (酵母基本氮源)，0.4mg/L生物素，1.0％(v/v)甘油，用100mmol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液配制，121℃，20分钟灭菌。其中YNB和生物素需要过滤除菌。 

2)3000g，离心5分钟，弃上清，收集细胞转移到20mL甲醇培养基(BMMH)液体培养基中，20mL BMMY需使用100mL摇瓶，保证通气量，28℃继续培养。 

所述BMMY培养基： 

13.4g/LYNB (酵母基本氮源)，0.4mg/L生物素，0.5％(v/v)甲醇，用100mmol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液配制，121℃，20分钟灭菌。其中YNB和甲醇需要过滤除菌。 

3)每隔24小时在培养基中加入100％甲醇至终浓度为0.5％(v/v)。 

4)每隔24小时取一次样，取1mL样品于1.5mL离心管中，用于检测重组脂肪酶表达水平。 

以上以转化空质粒pIC9K的重组菌为对照。 

48小时即有重组蛋白分泌到胞外上清液中，在产酶量最高的96h时取样，测定脂肪酶酶活，结果见附表2。脂肪酶酶活力测定具体步骤如下： 

0.2mL溶液A(40mg对硝基苯基月桂酸酯溶于12.0mL异丙醇)加入到3.0mL溶液B(0.4g曲拉通X-100与0.1g阿拉伯树胶溶于90mL 100mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.5)中，剧烈振荡，充分混匀，置于35℃保温5分钟，然后加入0.1mL粗酶液，对照组中加入灭活粗酶液(粗酶液煮沸5分钟)，35℃反应10分钟，测定OD₄₁₀，由产物对硝基酚(pNP)的生成量，计算酶活单位。 

酶活单位定义：1U表示在上述条件下每分钟释放1μmolpNP所需要的酶量。 

表2发酵液上清中的脂肪酶活力 

由表2可以看出发酵上清液中脂肪酶活力达到了2123U/mL，而在空白对照的 上清液中检测不到脂肪酶的活力，由此可见，海洋酵母(Bohai Sea-9145)中的脂肪酶基因已经在巴斯德毕赤酵母中实现了高活性表达。 

4.重组脂肪酶的纯化 

将发酵粗酶液离心浓缩10倍(10KDa超滤膜)，取0.5mL浓缩酶液以1mL/分钟的流速通过预先平衡好的镍离子亲和柱(平衡液：50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，500mmol/L氯化钠，20mmol/L咪唑)，随即用洗脱液进行洗脱(洗脱液50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4，500mmol/L氯化钠，300mmol/L咪唑)。脂肪酶洗脱过程采用快速蛋白液相色谱(FPLC)在线检测。 

将经镍离子柱纯化后的脂肪酶样品进行不连续十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)凝胶电泳，结果如图14所示。从图14中可以看出，重组脂肪酶浓缩液经镍离子亲和柱亲和层析纯化后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条电泳带，根据已知分子量的标准蛋白质SDS-PAGE电泳图谱进行比较，重组脂肪酶分子量约为44000道尔顿(44kDa)，该酶为单体蛋白。 

5.重组脂肪酶的酶学性质 

i纯化后重组脂肪酶最适pH与pH稳定性 

分别测定不同pH条件下的重组脂肪酶的活力，确定酶的最适作用pH。使用的缓冲液包括0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)，0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0-8.0)，0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5-10.0)。 

将酶液预先在不同pH5.5-10.5环境下(pH3.5-5.5乙酸-乙酸钠缓冲液，pH6.10-8.10磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)4℃保温2小时后测定酶活，测定其温度稳定性。结果见图15。 

图15表明重组脂肪酶的最适作用pH为8.5。该脂肪酶在pH 7.5-9.5范围内较稳定。在pH 9.5，4℃保温2h后酶活力始终保持在91.0％以上。Vakhlu等曾报道酵母所产脂肪酶的最佳pH大多集中在pH 3-8之间。如玫瑰假丝酵母(Candida Rugosa)、丝孢酵母(Trichosporon fermentanswas)所产脂肪酶的最佳pH分别为5.0与5.5。由于大部分洗涤溶液都处于碱性环境中，本研究得到的重组碱性脂肪酶在洗涤行业中应用潜力巨大。 

ii纯化后重组脂肪酶最适温度与温度稳定性 

将纯化后的重组脂肪酶与底物混合后分别置于15-70℃范围内不同温度点测定纯化脂肪酶的最适作用温度。图16表明，重组脂肪酶在35℃时活力最高，30℃时酶活 力仍保持在91.9％，20℃时为75.1％。60℃孵育120分钟，脂肪酶活性仍保持在86.0％以上。从图16中可以看出，重组脂肪酶有两个显著特性：1)低温时可以维持一个高的催化活性；2)在较广的温度范围内(0-50℃)保持稳定性。该重组脂肪酶属于低温脂肪酶。 

iii金属离子对重组脂肪酶活力的影响 

将重组脂肪酶与不同金属离子混合(离子终浓度分别为1mmol/L与5mmol/L)，4℃放置30分钟，对照为不加任何金属离子时测得的脂肪酶酶活，根据剩余酶活判断金属离子对重组脂肪酶活性的影响。 

从图17可以看出，当酶液中有Na⁺、Li⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺以1mmol/L存在时，重组脂肪酶活力有一定程度的增加，Ca²⁺使脂肪酶的活力增加了22％；而当酶液中有Ba²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Ag⁺以5mmol/L存在时，重组脂肪酶的活力受到抑制，分别下降到了91％，92％，74％和88％。尤其Hg²⁺离子存在时，酶活性急剧降低。 

iv不同化合物对重组脂肪酶活力的影响 

将各种化合物(蛋白抑制剂、有机溶剂等)与纯化后的重组脂肪酶混合，化合物终浓度分别为1mmol/L与10mmol/L，4℃保温30分钟，测定脂肪酶活性，以不加任何化合物时测得的酶活作为对照，根据剩余酶活判断化合物对重组脂肪酶活性的影响。 

从图18中可以看出，浓度为1mmol/L时，丝氨酸特异性抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对重组脂肪酶活性有轻度抑制作用，但在浓度10mmol/L时抑制作用明显，重组脂肪酶的活性降低了55％，这表明重组脂肪酶活性中心含有丝氨酸残基。钙离子螯合剂EGTA，在浓度为1mmol/L与10mmol/L时，分别使重组脂肪酶的活性降低了13％与27％，证明了钙离子在重组脂肪酶催化中心中的重要地位。脂肪酶活性受到金属离子螯合剂乙二氨四乙酸(EDTA)的抑制，但不会完全丧失活性。而二硫苏糖醇(DTT)与十二烷基磺酸钠(SDS)对重组脂肪酶有保护作用。 

v重组脂肪酶动力学常数(K_m)和最大反应速度(V_max) 

为测定纯化重组脂肪酶对底物对硝基苯基月桂酸酯的Km和Vmax，分别将0.1mL重组脂肪酶加入到1.5mL底物溶液中(重组脂肪酶终浓度17U/mL)，按上述3所示方法测定酶活力。根据双倒数作图法以1/[s]为横坐标1/v为纵坐标作图，对1/v和1/[s]作图即得到一条直线，斜率为Km/Vmax、，截距为1/Vmax。结果如图19。 

以对硝基苯基月桂酸酯为底物，重组酶的K_m和V_max分别达到0.565μmol/L和0.132mmol/min/mg。 

本发明提供了脂肪酶基因的克隆、重组脂肪酶的制备、纯化及酶学性质分析工作。重组脂肪酶在碱性条件下保持良好的低温催化特性及温度稳定性性，与部分金属离子及蛋白螯合剂、表面活性剂有着良好的配伍性。该重组脂肪酶在日化、纺织及食品加工领域将有广阔的应用前景。 

附图说明

图1为不同来源脂肪酶氨基酸序列比对结果。 

图2为解脂亚罗酵母密码子使用情况。 

图3为解脂亚罗酵母基因组DNA提取结果(A)与简并引物PCR结果(B)。 

图4为脂肪酶基因部分核酸序列。 

图5为采用RACE方法的PCR结果 

图示说明1：5′RACE产物2：3′RACE产物M：DL2000的标准核酸。 

图6为脂肪酶(LipY)基因序列。绿色标注为上下游引物。 

图7为Bohai Sea-9145脂肪酶的氨基酸序列 

图示下划线表示信号肽序列；方框表示保守区域。 

图8为脂肪酶的保守性分析。 

图9脂肪酶信号肽预测。 

图10脂肪酶糖基化位点预测。 

图11脂肪酶氨基酸相似性比对结果图。 

图12脂肪酶基因的PCR扩增 

图示说明：M：DL2000的标准核酸；1：脂肪酶基因PCR结果。 

图13脂肪酶基因线性化结果 

图示说明：M：1KB的标准核酸；1.线性化脂肪酶基因。 

图14纯化后重组脂肪酶SDS-PAGE电泳图 

图示说明：Lane 1空白对照，Lane 2发酵上清液，Lane 3纯化后的脂肪酶，M为标准蛋白。 

图15不同pH对脂肪酶活性的影响 

图示说明：(■)pH稳定性；(▲)最适作用pH。 

图16温度对脂肪酶活性的影响 

图示说明：(■)热稳定性；(▲)最适作用温度。 

图17不同金属离子对脂肪酶活力的影响。 

图18不同化合物对脂肪酶活力的影响。 

图19重组脂肪酶动力学参数。 

具体实施方式

实施例1脂肪酶基因保守序列的获得 

发明人筛选到一株产低温碱性脂肪酶的适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145，属解脂亚罗酵母的一个亚种(专利授权号ZL200410096668.7)；通过PCR扩增方法从该菌株中克隆脂肪酶基因。 

11海洋低温脂肪酶基因保守序列的获得 

根据不同种属脂肪酶基因的保守序列以及解脂亚罗酵母密码子偏好性设计简并引物F1，R1，序列如下 

F1    5’-GTSTTYMGAGGHACYTT-3’ 

R1    5’-CC SARRGAGTGDCCRGT-3’ 

以筛选的野生适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145菌株的总DNA为模板，进行PCR扩增，条件如下： 

反应条件：预变性94℃，5分钟；变性温度94℃，1分钟；退火温度49℃，1分钟；延伸温度72℃，1分钟；30个循环后，72℃延伸10分钟。 

将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收266bp的片段，测序结果见图4所示。该序列属于脂肪酶基因的保守序列。 

1.2海洋低温脂肪酶基因全长的获得 

1)根据测序获得的脂肪酶基因保守序列设计寡聚核苷酸引物GSP1和GSP2。 

GSP2 5’-CCCAGAGAGTGGCCAGTCACGTACAG-3’ 

GSP1 5’-GTCTTCCGAGGAACCTTTTCGCTGG-3’ 

2)根据已知保守序列在合成的引物GSP1和引物GSP2内侧分别设计巢试引物NGSP1和NGSP2。 

NGSP2 5’-TACAGCTGGTAGTCCGGGTTAGCGT-3’ 

NGSP1 5’-AGACGCGATCACGGACATGCAGTTC-3’ 

按照宝生物工程(大连)有限公司试剂盒提供的方法，分别以GSP1，GSP2作为引物进行首轮PCR。将首轮扩增的PCR产物稀释50倍，分别作为第二轮巢试引物 扩增的模板进行PCR扩增。结果见图5所示。使用巢试引物进行PCR扩增后，分别得到了大小为545bp(5′RACE产物)与880bp(3′RACE产物)左右的两组产物，将得到的核酸序列进行DNA序列测定并进行序列拼接，拼接后最终得到一条大小为1206bp的核苷酸序列(图6)。 

在基因数据库(Genbank)中将核苷酸所编码的蛋白序列进行同源性比对，该基因与解脂亚罗酵母LipY8p(DQ200800.1)脂肪酶基因同源性最高，相似度达到89％。初步判定所克隆的核酸片段所编码的蛋白为脂肪酶。 

实施例2重组脂肪酶的制备 

2.1脂肪酶LipY基因的克隆 

根据海洋低温碱性脂肪酶基因序列，设计两条表达引物F2与R2， 

F2 5’-GACGAATTC  

GCAGGCGTGTCTCAAGG-3’ 

R2 5’-AACGCGGCCGCGTTCTCAACTTGTGGGG-3’ 

下划线标注的分别为EcoRI与NotI酶切位点，并在引物F25’端添加编码6×组氨酸(斜体表示)的碱基。 

以适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145菌株的基因组DNA为模板，以F2与R2作为引物进行PCR扩增，条件如下： 

反应条件：预变性94℃，5分钟；变性温度94℃，1分钟；退火温度54℃，1分钟；延伸温度72℃，1分钟；30个循环后，72℃延伸10分钟。 

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收大小约1200bp的核酸片段。 

2.2重组脂肪酶的制备 

将通过2.1方法得到的脂肪酶基因与表达载体pIC9K相连并转入毕赤酵母GS115中，随后接入到BMGY液体培养基中，250-300rpm，28℃培养OD₆₀₀至12-16之间时；3000rpm，离心5分钟，弃上清，收集细胞转移到20mLBMMH液体培养基中，20mLBMMY需使用100mL摇瓶配置，保证一定的通气量，28℃继续培养；每隔24小时在培养基中加入100％甲醇至终浓度为0.5％。培养96小时，将发酵上清液离心，用10KDa超滤膜浓缩，经镍离子交换柱进行亲和纯化，得到了电泳纯的脂肪酶样品(脂肪酶基因的表达)，见图14。 

表达产物(脂肪酶)的活力测定： 

用3.1中的脂肪酶进行水解反应，以鉴定表达产物。具体步骤如下： 0.2mL溶液A(40mg对硝基苯基月桂酸酯溶于12.0ml异丙醇)加入到3.0mL溶液B(0.4g曲拉通X-100与0.1g阿拉伯树胶溶于90ml 100mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 8.5)中，剧烈振荡，充分混匀，置于35℃保温5分钟，然后加入0.1mL粗酶液，对照组中加入灭活粗酶液(粗酶液煮沸5分钟)，35℃反应10分钟，测定OD₄₁₀，由产物对硝基酚(pNP)的生成量，计算酶活单位。 

酶活单位定义：1U表示在上述条件下每分钟释放1μmol pNP所需要的酶量。