海洋嗜冷杆菌的鉴定及所产低温碱性脂肪酶的基因工程和生物信息学研究

摘要

海洋低温脂肪酶是(Marine low-temperature Alkaline Lipase,MLAL)是由一株海洋细菌EastSeaG5-1415产生的一种胞外酶.该论文主要进行了EastSeaG5-1415菌株的鉴定低温脂肪酶多克隆抗体的制备及所产低温脂肪酶基因的克隆、序列测定、生物信息学分析和其空间结构的模建:从东海深海底泥中筛选得到一株低温脂肪酶产生菌EastSeaG5-1415,对它进行了形态、生理生化和生长特征的观察,结合对其16SrRNA序列的分析比较,将其鉴定为嗜冷杆菌Psychrobacter glacincola,并将该菌株合名为嗜冷杆菌P.glacincola EastSeaG5-1415.利用纯化的低温脂肪酶采用背皮内多点注射和皮下组织免疫相结合的方法对新西兰白兔进行免疫,制备得到多克隆抗体,再对其进行纯化.用ELISA的方法对其效价进行检测,结果表明其效价为64000,并用Western印迹实验证明了抗原抗体的结合具有高度特异性.利用不完全酶切和末端半补齐技术构建了嗜冷杆菌P.glacincola EastSeaG5-1415的基因文库.末端半补齐技术的优点有:(1)彻底消除载体自环化的可能性;(2)消除了插入片段自身相互连接的可能性;(3)同常用的碱性磷酸酯酶法相比较,采用半补齐技术、处理的连接产物为完整的共价闭环质粒,不像碱性磷酸酯酶法那样留有缺口,因而半补齐法的连接产物其转化率不受影响.采用三丁酸甘油酯平板和ELISA两种方法相结合从基因文库中筛选得到一株阳性克隆(命名为pPG1).序列测定分析表明,此重组质粒包含有长度为此951bp的低温脂肪酶基因的完整的开放读码框架(ORF)和上游调控序列.此片段编码由317个氨基酸组成的酶,计算其分子量为35001.83Dal.通过Southern杂交证实了此片段来自于嗜冷杆菌P.glacincola EastSeaG5-1415基因组DNA.并通过构建表达载体在大肠杆菌中得到了表达.利用已有的各种生物信息学软件对得到的低温脂肪酶氨基酸序列进行了分析.

目录

ABSTRACT

第一章前言

第一节海洋微生物及海洋微生物酶的研究进展

第二节海洋低温微生物及所产酶低温适应性机制的研究进展

第三节微生物脂肪酶的研究进展

结语

第二章产低温脂肪酶的海洋细菌的鉴定

第三章嗜冷杆菌EastSeaG5-1415低温脂肪酶多克隆抗体的制备

第四章嗜冷杆菌EastSeaG5-1415基因文库的构建

第五章嗜冷杆菌海洋低温脂肪酶基因的克隆、序列测定和在大肠杆菌中表达研究

第六章低温脂肪酶基因的生物信息学分析

第七章低温脂肪酶的同源模建

第八章展望

参考文献

致谢