采用发酵法制备富马酸发酵液及富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的方法

摘要

本发明所公开的是一种采用发酵法制备富马酸发酵液及富马酸发酵分离提取纯品富马酸的方法，以葡萄糖为原料，以米根霉菌株为出发菌株，以其发酵培养采用分时段间歇通入空气流量为主要特征；而其富马酸发酵液的分离提纯，以富马酸发酵液加钠盐加热搅拌→抽滤→加酸沉淀→抽滤→热水浸泡、冷却沉淀→清水浸泡→烘干→得纯品富马酸的工艺流程为主要特征，具有工艺易控，装备简单，收得率高，产品纯度高，制备成本低，环保无污染等特点。为制备纯品富马酸提供了一条科学合理的新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用发酵法制备富马酸发酵液及富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

富马酸是一种重要的基本化工原料和精细化工产品，广泛用于涂料、树脂、医药、增塑剂等领域。工业上可用于生产不饱和树脂和醇酸树脂，以及用作生产电泳漆的原料。食品级富马酸是口味纯正的酸味剂，用作饮料、酒类、糕点以及腌菜等的酸味剂，并起着食品防腐剂、抗氧化剂和PH调节剂的作用。饲料级富马酸及其酸类能提高饲料中有机物质的吸收率和生物学利用率，减少机体能量消耗，具有促进增重等作用。同时，以富马酸为原料可以进一步合成多种高价值衍生物。近代已开发出一系列的富马酸酯类防霉防蛀剂，其代表性产品富马酸二甲酯为国外八十年代开发的一类低毒、高效、价廉、广谱的新型防霉防腐剂。以富马酸作为原料，可以进一步合成多种药品，诸如富马酸亚铁已广泛应用于医学上治疗人体的小红血球贫血病。另外，富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，还可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸等四碳化合物。随着科技的发展，富马酸的应用领域和应用范围，将会得到进一步的全面拓宽，社会对于富马酸的需求量将会与日俱增。为此，高质量、低成本制备富马酸，已成为业内的重点追求。

采用微生物发酵法生产富马酸，是目前业内所注重的一种方法。Tsao教授等报道了利用米根霉菌株发酵生产富马酸技术（Appl  Environ  Microbiol，1996，62：2926~2931.），并设计了一种旋转膜生物接触器偶联吸附柱的装置，从发酵液中分离富马酸的方法；中国专利CN101225412公开了利用木质纤维素资源生产富马酸的报道，在降低原料成本的基础上拓宽了生物质资源制备富马酸的原料来源。但由于已有技术的原料路线所造成的制备工艺复杂，制备成本高等不足，而严重制约了富马酸工业化生产。

已有技术制备富马酸终端纯品富马酸，是以富马酸和富马酸钙为主的富马酸发酵液为原料。通过分离提取纯品富马酸。目前已有多种分离提取方法，诸如中国专利CN101235394A公开了一种反应分离耦合技术，从发酵液中移出富马酸的方法，反应器中的发酵液经中空纤维膜过滤，纳滤浓缩和离子交换吸附过程可将发酵液中一部分富马酸及时移出，从而降低了产物抑制效应以及富马酸积累引起的低PH抑制菌体生理活性等问题。中国专利CN101492366A公开了在添加碳酸钠作为中和剂得到富马酸钠的条件下分离提取富马酸的方法，通过微滤、超滤、蒸发浓缩、酸化、离心洗涤过程可获得高纯度富马酸产品。同样由于分离提取工艺复杂，提纯成本高等不足，而严重制约了富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的工业化生产。

发明内容

本发明旨在提供一种工艺相对简单，成本相对较低的采用发酵法制备富马酸发酵液及富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的方法，为富马酸工业化生产和社会对富马酸需求量的日益增长提供技术支持。

实现本发明第一个目的的技术方案是，提供以葡萄糖为料，通过米根霉菌株发酵制备富马酸发酵液的方法，即：

一种采用发酵法制备富马酸发酵液的方法，以葡萄糖为原料，以米根霉菌株（Rhizopus  Oryzae  ClCC 40506）为出发菌株，依次按照种子培养和发酵二个步骤进行，制备以富马酸为主的富马酸发酵液；所述发酵步骤，是将种子培养步骤所制备的种子液，与含有葡萄糖的发酵培养基，按一定的体积比接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐内实施发酵，而其：

a、按发酵罐体积的55~75%将发酵培养基加入发酵罐内，按发酵培养基体积的5~15%接种由种子培养步骤制备的种子液，发酵温度为30~40℃，搅拌转速为150~300RPm。

b、通入空气策略为：前24h维持通气量为1.0~1.2vvm，24~36h维持通气量为0.5~0.6vvm，36~48h维持通气量为0 vvm，48~60h维持通气量0.5~0.6 vvm，60~72h维持通气量为1.0~1.2 vvm，72h后继续维持通气量1.0~1.2 vvm，并流加无菌葡萄糖溶液，维持发酵罐中葡萄糖浓度20~30g/L，直至100~105h发酵结束，即获得所述富马酸发酵液。

由以上所给出的第一个技术方案可以明了，本发明的种子培养，与已有技术基本相同，但其发酵培养，由于采取了分时段间歇改变通入空气流量的方式，而有效提高了糖酸（葡萄糖/富马酸）转换率。且所述工艺流程较短，葡萄糖原料广泛，工艺装备简单，工艺操作方便，从而实现了本发明的目的。

在上述第一个主旨技术方案中，本发明还主张，所述发酵培养基的组分及各组分单位体积的重量含量是：葡萄糖40~120 g/L，磷酸二氢钾0.6~1.0 g/L，尿素0.1~0.3 g/L，硫酸镁0.5~0.6 g/L，硫酸锌0.1~0.15 g/L，硫酸亚铁0.0088~0.01 g/L，碳酸钙40~50 g/L；通过一定浓度的酸或碱的加入，令发酵培养基的PH值维持在2.75~3.25范围内。但不局限于此。所述用来调节PH值的酸或碱，可以是硫酸或碳酸钠。

在上述第一个主旨技术方案中，本发明还主张，所述种子培养步骤的种子培养基的组分及各组分单位体积的重量含量是：葡萄糖10~30 g/L，磷酸二氢钾0.6~1.0 g/L，硫酸铵1~3 g/L，硫酸镁0.5~0.6 g/L，硫酸锌0.1~0.15 g/L，硫酸亚铁0.0088~0.01 g/L；在对所述种子培养基灭菌完毕后，用无菌稀硫酸调节其PH值维持在2.5~3.5范围内。但不局限于此。

以上所述发酵培养基和种子培养基其中的多种工艺条件添加剂的金属盐的含量，都应当从严控制，而其葡萄糖的含量，在通常情况下，可以从宽控制，以保证米根霉菌在繁殖、发育和生长过程中充足的食量，而且在其整个发酵过程中，还要严格控制葡萄糖浓度不要低于20 g/L。

实现本发明第二个目的的技术方案是，提供以如前所述富马酸发酵液为原料，分离提取纯品富马酸的方法，即：

一种如前述第一个技术方案所提供的所述富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的方法，而其步骤依次按照如下程序进行：

a、将所述富马酸发酵液加热至60~90℃，缓缓加入固体钠盐，钠盐的加入量为所述发酵液中富马酸总质量的0.8~1.2倍，搅拌30~60min；

b、将步骤a的料液进行抽滤或压榨，除去细胞菌体以及包括过剩固体碳酸钙在内的其它固体杂质，得到澄清滤液；

c、在步骤b的澄清滤液中加入较高浓度强酸，调节澄清滤液的PH至1.0~2.0之间，得到含有一定量沉淀颗粒的酸化液；

d、将步骤c的酸化液进行抽滤或压榨，收集主要成分为富马酸以及一定量的不溶性钙盐以及杂蛋白的固体沉淀，而所述滤液可循环用于步骤a；

e、将步骤d所得的固体物料用热水浸泡洗涤，并加热至70~80℃，搅拌10~30min，抽滤得到澄清滤液，所得滤液室温冷却24h，至大量沉淀固体析出，固体为富马酸产品；

f、将步骤e富马酸产品用清水浸泡洗涤，浸泡用水量为固体富马酸质量的5~10%。

g、将步骤f浸泡洗涤后的富马酸固体通过流化床在60~80℃温度下烘干，得到富马酸纯品。

由以上所给出的所述提纯富马酸的方法可以明了，本发明所采用的是：富马酸发酵液→加钠盐→加热搅拌→抽滤→加酸沉淀→抽滤→热水浸泡、冷却沉淀→清水浸泡→烘干→得固体纯品富马酸的工艺路线。不但所述工艺路线简单易控；加热温度不高（≤100℃），能源消耗少，环境无污染；而且所得纯品富马酸含量高（≥99%），从而实现了本发明的第二个主旨目的。

在上述第二个主旨技术方案中，本发明还主张，步骤a加入的所述钠盐是碳酸钠或者是硫酸钠。本发明积极推荐的是碳酸钠。

在上述第二个主旨技术方案中，本发明还主张，步骤c所加入的强酸是硫酸或盐酸或硝酸或磷酸，本发明积极推荐的是硫酸。

上述技术方案得以实施后，本发明所具有的工艺简单，产品收得率高，产品纯度高，制备成本低，环保无污染和适合工业化生产等特点是显而易见的。

附图说明

图1是本发明一种具体实施方式的富马酸发酵液制备工艺流程图；

图2是本发明一种具体实施方式的富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1，如附图1所示，

一种采用发酵法制备富马酸发酵液的方法，其工艺步骤是：

（1）菌株选用：选用米根霉菌株（Rhizopus  Oryzae  CICC40506）。

（2）培养基制备：

培养基组分种子培养基（g/L）发酵培养基（g/L）葡萄糖10~3040~120磷酸二氢钾0.6~1.00.6~1.0硫酸铵1.0~3.0 硫酸镁0.5~0.60.5~0.6硫酸锌0.1~0.150.1~0.15硫酸亚铁0.0088~0.010.0088~0.01尿素 0.1~0.3碳酸钙 40~50

（3）种子培养：用500ml三角瓶，装液量（种子培养基）50~100ml，培养温度30~35℃，孢子菌株接种量1.0~8.0×10⁷/100 ml种子液，摇床转速180~220RPm，培养12h，此为一级种子液。将一级种子液以10%接种量接种至新的无菌培养基中培养12h，即为二级种子液；同理二级种子液以10%接种量接种至新的无菌培养基中培养12~16h，即为三级种子液。二、三级种子培养基及其工艺参数，均同一级种子液培养。

（4）发酵培养：采用300L发酵罐，装液量（发酵培养基）为250L，将种子液以10%的体积比接入发酵培养基中，发酵整个过程采取分时间段不等量间歇通入空气策略，前24h维持通气量为1.0~1.2vvm，24~36h维持通气量为0.5~0.6 vvm ，36~48h维持通气量为0 vvm，48~60h维持通气量0.5~0.6 vvm ,60~72h维持通气量为1.0~1.2 vvm ,72h后继续维持通气量1.0~1.2 vvm，发酵温度控制在30~35℃范围内，搅拌转速为150 RPm，并流加无菌葡萄糖溶液，维持发酵罐中的葡萄糖浓度为20~30g/L，发酵共进行100h结束，即得以富马酸为主的富马酸发酵液。所述发酵液中的富马酸浓度≥40 g/L。

实施例2，如附图2所示。

一种如实施例1制备的富马酸发酵液分离提取纯品富马酸的方法，其步骤是：

（1）将实施例1制备的浓度为40 g/L的富马酸发酵液加热至60℃，加入12kg固体硫酸钠，继续搅拌60min。

（2）将上述料液进行抽滤，除去细胞菌体以及过剩碳酸钙固体及其它固体杂质，得到澄清滤液。

（3）在步骤（2）的滤液中缓慢加入浓硫酸，调节PH至2.0以下，获得含有大量沉淀颗粒的酸化液。

（4）将步骤（3）的酸化液进行抽滤，收集固体沉淀，固体主要成分为富马酸以及一定量的不溶性钙盐以及杂蛋白，含有硫酸钠的滤液可循环用于步骤1所需要添加的硫酸钠。

（5）将步骤（4）的固体用热水浸泡洗涤，并加热至80℃，搅拌15min，抽滤，得到澄清滤液，室温冷却24h至大量沉淀固体析出，固体为富马酸产品。

（6）将步骤（5）富马酸产品用清水洗涤浸泡，洗涤用水量为固体质量的10%。

（7）将洗涤后的固体通过流化床在60~80℃温度下烘干，即得含量≥99%的固体纯品富马酸。

实施例3，如附图2所示。

一种如实施例1制备的富马酸发酵液分离提取富马酸的方法，其步骤是：

（1）将实施例1所制备的60g/L的富马酸发酵液加热至90℃，加入15kg固体硫酸钠，继续搅拌60min。

（2）将上述料液经压滤机处理压滤，除去细胞菌体以及过剩碳酸钙固体及其它固体杂质，得到澄清滤液。

（3）在步骤（2）的滤液中缓慢加入浓盐酸，调节PH至2.0以下，获得含有大量沉淀颗粒的酸化液。

（4）将步骤（3）的酸化液进行抽滤，收集固体沉淀，固体主要成分为富马酸以及一定量的不溶性钙盐以及杂蛋白。

（5）将步骤（4）的固体用清水浸泡洗涤，洗涤用水量为固体质量的5%。

（6）将洗涤后的固体通过流化床在60~80℃温度下烘干，即得含量≥99%的固体纯品富马酸。

小试和中试效果显示，本发明采用多级种子培养方式以及调节种子液PH控制菌体形态的方法获得了颗粒均匀、直径合适的米根霉菌球，从而用于米根霉发酵生产富马酸；良好的菌球形态显著提高了菌体的溶氧水平以及传质情况，为高效率转化生产富马酸奠定了基础；同时在发酵过程中， 采用分时段间歇改变通入空气流量方式，可以很直观地保持菌体生长和产酸两个不同阶段的不同溶氧需求，在保证菌体良好生长的同时优化了微生物合成目标产物富马酸的代谢通量，提高了糖酸转化率和生产效率。在富马酸分离提取过程中，仅通过添加固体硫酸钠或碳酸钠，与传统的纤维膜分离和电渗析分离等工艺相比，具有流程简单，操作条件温和，成本低，分离时间短，产品收得率高，产品纯度高等优点。

中试效果显示，本发明具有广泛的工业化应用前景。