两种含不同CpG序列PCV2-ORF2基因疫苗及其制备方法

摘要

本发明为两种含有14个CpG-ODN重复基序及18个CpG-ODN重复基序和表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核酸疫苗。本发明是为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)基因免疫的效果，构建含14个及18个CpG基序和PCV2-ORF2的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF2。经酶切鉴定和序列测定，将重组质粒转染PK-15细胞，经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF2可表达PCV2Cap蛋白。该核酸疫苗中插入了具有免疫增强作用的CpG-ODN重复基序，可增强核酸疫苗的免疫效果，该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生Cap蛋白，使机体不断产生抗体，对猪体提供持久的免疫保护力，在PCV2的防控中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因疫苗使用的佐剂和其制备方法，具体是两种含有14个CpG-ODN重复基序及18个 CpG-ODN重复基序的PCV2ORF2基因核酸疫苗。

技术背景

基因疫苗(gene vaccine)是近年来随着基因治疗而发展起来的第三代疫苗。它是将编码某一特定保护 性抗原蛋白的外源基因与真核表达载体进行重组后，直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达 出抗原蛋白质引起机体的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与常规疫苗相比，基因疫苗具有如下 优点：免疫效果好；不散毒，无污染；保护性免疫持续时间长；方法简便、价格低廉；核酸疫苗具有相同 的理化性质，为联合免疫提供了可能；便于贮藏和运输；不受个体已有的免疫反应(如母源抗体)的影响。

猪圆环病毒是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪 多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型：PCV-1与PCV-2。 PCV-2含有两个主要阅读框ORF1和OFR2。其中ORF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构 蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。

在核酸疫苗的免疫应答过程中，高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫水平，增强抗病防 御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG-ODN(CpG寡聚脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序 列已被证实能作为疫苗的高效免疫增强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。 近来大量免疫学研究证实：含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果：(1)诱导B细胞增殖、分化、成熟 和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤 (NK)细胞的裂解活性和干扰素(IFN-γ)分泌。但CpG-ODN具有种属特异性，本发明中的CpG-ODN都是 经过实验证实对猪具有免疫增强作用的序列。

附图说明

图1：PCV2的ORF2基因的PCR扩增产物，其中条带1为DNA标准DL 2000，条带2、3、4、7、9为 阳性PCR产物(ORF2)，条带5、6、8为阴性PCR产物。

图2：重组质粒pVAX1-ORF2的PCR鉴定，其中条带1为DNA标准DL 2000，条带2-5为从pVAX1-ORF2 上PCR扩增出的ORF2片段，条带6为阳性对照(从PCV2病毒DNA上扩增出的ORF2片段)。

图3：免疫荧光检测结果，其中图A为pVAX1-ORF2-CpG(14CpG)转染组间接免疫荧光检测结果(100x 放大)，图B为pVAX1-ORF2转染组间接免疫荧光检测结果(100x放大)，图C为pVAX1空载体转染组间 接免疫荧光检测结果(100倍放大)。

图4：仔猪平均日增重记录结果

图5：猪体温检测结果图

图6：猪外周血抗体水平检测结果

图7：病理组织切片图，其中，左侧一列(A组)为PBS组，中间一列(B组)为空载体组，右侧一列(C 组)为疫苗(14CpG)注射组。

图8：攻毒后组织病理变化。

发明内容

本发明的第一个目的足提供两种新的供猪免疫疫苗使用的CpG-ODN基序，可使DNA疫苗产生更有 效的免疫反应。

本发明的第二个目的是提供本发明核酸疫苗的制备方法。

本发明CpG-ODN作为免疫增强剂的优越性：制备方法简单，易于保存和运输；质量易于控制，易规 模化生产，成本低廉，易于保存和运输；安全性好。细胞因子是机体内本身存在的免疫调节分子，对人体 无毒副作用，同时也受机体免疫调节网络的控制；易于构建和改造，利用分子生物学技术在基因水平可实 现人们所期望的免疫应答强度和类型。

具体实施方式

本发明的佐剂的制备方法详述如下：

(1)人工合成不同的CpG-ODN基序

14个CpG-ODN重复基序：

(SEQ ID NO：1)

18个CpG-ODN重复基序：

(SEQ ID NO：2)

利用引物ORF2s、ORF2r扩增出PCV2SD1株的完整ORF2基因，序列如下：

ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGA TCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCAT CTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAAGCGAACCACAGTCAGAACGCCCTTCT GGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGC TCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCAC CCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACA GCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCTGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACT CCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGA AATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCG AAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATC TTAAAGACCCCCCACTTAACCCTAAGTGA(SEQ ID NO：3)

(2)采用基因工程重组技术，选择合适的含酶切位点，将目的基因和CpG-ODN序列克隆入真核细胞表达载 体pVAX1；

(3)用步骤(2)所得的重组质粒载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测序鉴定后，再进行扩增培养；

(4)大量提取和纯化目的基因的重组质粒DNA。

(5)免疫原性的检测

实施例1.PCR扩增ORF2基因

根据PCV2SD1株(Gene bank accession number：DQ346683)全序列设计如下PCR引物。引物序列为 ORF2s：5’-ATCgCTAgCgCCgCCACCATgACgTATCCAA-3’；ORF2r： 5’-gCCgCgAAgCTTTCgCTTAgggTTAAgT-3’，为便于克隆，在上游引物和下游引物中分别添加了Nhe I酶切 位点和Hind III酶切位点。PCR反应体系如下：10×PCR buffer 5μl；dNTP Mixture  4μl；P5s 2μl；P5r 2μl； 模板2μl；Ex Taq E 0.5μl；用ddH₂O补至50μl。PCR扩增条件为：预变性95℃5min，变性 94℃1min，，退火55℃1min，延伸72℃1min，35个循环后，72℃延10min。

PCR产物经8％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，表明扩增出了与ORF2相应的705bp的特 异片段，与预期结果相符。

实施例2.pVAX1-ORF2载体的构建

用限制性内切酶Hind III/Nhe I消化PCR纯化产物和pVAX1，分别获得ORF2基因片段和线性载体 pVAX1，将产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，按照上海生工胶回收试剂盒说明书进行。连接、转化、挑菌、 提质粒、用限制性内切酶Hind III/Nhe I和测序鉴定。

以待鉴定重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经8g/L的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所 示，表明扩增出了与ORF2相应的705bp的特异片段，与预期结果相符。

将PCR阳性质粒送上海生工生物有限公司进行测序鉴定，测序结果与ORF2序列相符。如下所示(黑 体字部分为ORF2序列)

ATGGCTGCGCGCACCAAGCTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGAT CCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGC CCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCCAGCCCATCTGTTTGTTTGC

实施例3.CpG-ODN的设计及合成

由上海生工生物工程有限公司合成不同的CpG-ODN基序

14个CpG-ODN重复基序：

18个CpG-ODN重复基序：

用Mlu I分别单酶切重组质粒pVAX1-ORF2和人工合成的CpG序列，取酶切产物分别在8g/L和20g/L 的琼脂糖凝胶上进电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。回收片断用DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit Ver.2.0)进行连接，转化DH5α感受态细胞。将Mlu I酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物有限公 司测序鉴定，测序结果与人工合成的CpG序列相符，如下所示(黑体字部分为CpG序列)： 14个CpG-ODN重复基序测序结果：

TGTACGGGCCAGATATACGCGTTCACGCGTTGACATTGA 18个 CpG-ODN重复基序测序结果：

TGTACGGGCCAGATATACGCGTACGCGTTGACATTGA

实施例4.重组质粒的纯化和转染细胞

按常规方法提取质粒，按Promega试剂盒使用说明书进行纯化。使用Lipofectamine^TM 2000脂质体转染 试剂盒(Invitrogen公司)转染正常生长的PK15细胞。

实施例5.目的蛋白的表达检测

将质粒和消化的PK15细胞一起转染，5％CO₂、37℃培养三天后，取出玻片，用PBS液冲洗三次，100％ 冷丙酮固定15～30min，再用PBS液洗涤三次；用含有5％BSA封闭2h，冲洗三次，每次5min；加入一 抗(猪抗PCV2血清)，37℃作用2h后，冲洗3次；加入二抗(异硫氰荧光素标记的山羊抗猪IgG)，室温 避光作用1h，冲洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于载玻片上，荧光显微镜下观察。结果如图3 所示，在转染了pVAX1-ORF2-CpG质粒和pVAX1-ORF2质粒的细胞培养孔中都观察到了荧光，说明有目 的蛋白表达，在转染了pVAX1空载体质粒的阴性对照组中未观察到荧光。

实施例6.疫苗免疫试验及攻毒保护性试验：

(1)试验设计

40头3周龄的仔猪，随机分成8组，每组5头，各组饲养管理条件相同。用紫外分光光度计测量所提 取的含有14CpG和18CpG的质粒浓度，调整为200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，耳背部肌肉注射核酸疫苗。 正常对照组注射1ml PBS，空载体组注射1ml pVAX1。于第1、14天进行疫苗免疫，于58天攻毒进行攻 毒保护试验，攻毒用的PCV2SD1株病毒液为10^6.2TCID₅₀/ml，每头猪颈部肌肉注射1ml，于77天 时将剩余试验猪全部剖杀。

按下表对各组进行免疫注射。

表1.1免疫接种动物试验分组情况

(2)免疫指标检测

于试验前、攻毒前称量试验仔猪的体重，试验期间每天测量体温，观察饮食等，观察疫苗的注射及攻 毒对仔猪体重及生理指标的影响。

平均日增重：分别于试验前及攻毒前称取试验仔猪的重量，计算每组猪的平均日增重，并进行组间的 显著性分析，结果如图4所示，其P≥0.05，差异不显著。

猪体温检测：验过程中每天对猪进行体温测量，结果如图5示。由图5知所有试验猪体温均正常或略 有升高，无明显发烧情况，说明疫苗的注射，并没有引起猪体温的大波动。注射部位未发现红肿，各项生 理指标稳定。

(3)猪外周血中抗体水平检测

疫苗免疫过程中，天、14天、28天、42天、56、63天、70天和77天采取仔猪外周血，分离猪外周 血清，用ELLSA的方法检测其抗体水平，计算SP值。检测结果见图6，由上图可以看出不同CpG基序不 同剂量引起的抗体水平变化。从0到14dpi，可见抗体水平不断上升，但是14dpi到28dpi只有H组抗体仍 然上升，并且达到最高值0.89，随后下降。于58天进行攻毒，除了A、B、C三组，其他组抗体水平开始上 升。攻毒一周后，H组抗体水平最高，且含18个CpG基序的F、G、H三组总体水平都好于含14个CpG 基序的C、D、E三组。

(4)病理组织切片观察

于攻毒后3周将猪宰杀，采集各组猪的肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结等组织，经10％福尔马林固定、脱 水、透明、浸蜡、切片、HE染色等组织切片步骤，做成石蜡包埋的组织切片。进行病理学观察，结果如 图7所示，攻毒后各组体温均正常，未出现发烧现象。剖检后发现对照组猪肾苍白有散在白色病灶，胆囊 肿大，颌下淋巴结、腹股沟淋巴结变硬，淋巴结切面呈均质苍白色，膀胱有出血点，肠系膜淋巴结肿大， 肺有轻微的出血。出现典型的PCV2临床剖解变化，这与各免疫组基本没有白色病灶形成明显的对比。

组织病理变化检测结果见图8，由图可知：

1：对照组肺出血，肺泡萎缩；

2：免疫组(18CpG)肺泡充盈，间隔正常；

3：对照组淋巴结生发中心萎缩，不成形状；

4：免疫组(18CpG)淋巴结生发中心完整明显。

5：对照组脾脏出血，淋巴细胞核浓缩，核碎裂；

6：免疫组(18CpG)正常的脾脏结构；

7：对照组肾脏出血；

8：免疫组(18CpG)正常肾脏结果；

通过以上病理图片可见，对照组在攻毒后，病毒引起仔猪病理变化，而免疫组却没有病变。