CpG免疫刺激序列增强弓形虫速殖子复合基因疫苗免疫保护作用的研究

摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫,其生活史及致病机理复杂,人类对弓形虫普遍易感,孕妇感染弓形虫后可导致胎儿先天性弓形虫病,严重可致畸胎,死胎,在AIDS,恶性肿瘤等免疫力低下患者中,弓形虫作为一种机会性感染因子,是引发致死的病因之一。目前尚无有效治疗弓形虫病的药物。因此,弓形虫病的预防尤为重要。
　　 对弓形虫疫苗的研究经历了死疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗以及DNA疫苗,DNA疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫,但其诱导免疫反应的效率相对较低,尤其对于大型动物种系和人类。为提高DNA疫苗诱导的免疫反应的强度,构建基因佐剂成为一种替代方法。免疫刺激序列为非甲基化的短核苷酸重复序列,即CpG基序,是目前广被接受的一种基因佐剂,CpG基序在细菌,病毒的DNA中普遍存在,研究表明,人工合成的非甲基化CpG基序同样能通过To11样受体9直接活化B细胞,诱导其增殖并抑制其凋亡,并能促进免疫球蛋白和IL-6,IL-10,IL-12等细胞因子分泌。在寄生虫等感染性疾病中,CpG序列可在动物体内激发强烈的Th1型相关反应,在寄生虫病预防的研究中,CpG的应用也不乏成功的例子。由于质粒DNA分为两个明显的功能单位,一个是转录单元指导抗原表达,一个是DNA骨架中的佐剂单元(CpG基序),诱导免疫反应激活。在质粒DNA骨架中适量增加CpG基序数量,可增强DNA疫苗的免疫效应。
　　 SAG1抗原作为弓形虫速殖子期特异的主要表面抗原之一,具有高度的免疫原性和免疫保护性,是弓形虫感染免疫诊断和疫苗开发的的主要候选抗原。SAG1蛋白分布于弓形虫速殖子表膜、速殖子内以及纳虫泡的管状结构中,约占弓形虫体总蛋白的3-5％,却可抑制患者血清中抗体活性的50％,是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原。ROP2蛋白是弓形虫棒状体分泌的一种蛋白,主要协助虫体入侵宿主细胞,在弓形虫生活史的速殖子期、缓殖子期和子孢子期中均有表达,具有高度的保守性和免疫原性。SAG1和ROP2在虫体入侵宿主细胞的过程中有相互促进作用,其相应的抗体可有效拮抗弓形虫的感染。
　　 本研究根据已报道对小鼠有免疫刺激作用的免疫刺激序列,设计并合成一段含三对免疫刺激序列的核苷酸,作为内源性佐剂插入质粒pcDNA3.1中,构建质粒pcDNh3.1/GpG作为DNA疫苗载体,再与弓形虫抗原基因片段SAG1-ROP2相连,以重组质粒肌肉注射免疫小鼠,观察基因疫苗与佐剂的免疫效果。结果表明,增加CpG基序的基因疫苗的免疫效果优于对照组,且以细胞免疫为主。CpG基序作为内源性佐剂可增强免疫效应。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明

前言

第一部分 弓形虫基因疫苗pcDNA3.1-SAG1-ROP2/CpG的构建

材料与方法

结果

讨论

第二部分 弓形虫融合蛋白SAG1-ROP2在Hela细胞中的表达

材料与方法

结果

讨论

第三部分 pcDNA3.1-SAG1-RoP2/CpG疫苗的免疫保护作用

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

学位论文评阅及答辩情况表