建鲤类胰岛素生长因子1启动子SNPs的PCR-RFLP检测方法

摘要

本发明属于建鲤分子生物学技术领域，具体涉及建鲤类胰岛素生长因子1（insulin-likegrowthfactor1，IGF-1）基因启动子及其核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）检测技术领域。其步骤包括：建鲤血液基因组DNA提取，根据鲤IGF-1基因设计引物，PCR扩增，纯化，转化到载体，蓝白斑筛选，质粒测序，序列比对分析，SNPs检测。本发明公开了建鲤IGF-1基因启动子基于限制性内切酶的SNPs的PCR-RFLP检测方法，为建鲤生长、体型的标记辅助育种提供了新的标记。

说明书

技术领域

本发明属于建鲤的分子生物学技术领域，涉及建鲤类胰岛素生长因子1启动子SNPs的PCR-RFLP检测技术。

背景技术

类胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)属于胰岛素家族成员，是动物生长轴的重要基因之一，在下丘脑-垂体-性腺信号转导通路中起着重要的作用，其主要生理功能之一是介导生长激素(growth hormone，GH)的促生长作用，促使组织细胞的生长与分化。在次级纤维的形成过程中表达量增加，刺激成肌细胞增殖，维持肌纤维的分化。

单核苷酸多态性(signal nucleotide polymorphisms, SNPs)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，具有分布广泛、数目多且相对稳定等诸多优点，在人类遗传性疾病的病因诊断、治疗和防治方面已受到广泛的重视和强有力的支持。在动物育种方面，SNPs作为一种分子标记辅助育种强有力的工具也得到了广泛的应用，将SNPs与经济性状进行相关性分析，寻找影响性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的候选基因，然后将其运用于后续的育种实践中。作为生长轴上的重要基因，IGF-1基因的SNPs在鸡、猪、牛、羊、鱼等动物上进行了广泛深入的研究，获得了一些与生长、体型等经济性状相关的SNPs。

建鲤是中国水产科学研究院淡水渔业研究中心采用生物工程育种技术培育出的鲤鱼新品种,具有生长快、体型优、肉质肉味好、饲料转化率高、性温顺、易驯养、适应性与抗病力强、适宜全国各地各种方式饲养的优点。此后，又持续进行了多年的遗传改良和推广工作，并取得了一定的成绩，但在各种经济性状方面还存在较大的选育空间。因此有必要寻找一些与生长相关的SNPs，为下一步建鲤分子标记育种研究工作提供参考。

发明内容

本发明目的之一在于克隆出建鲤IGF-1基因启动子序列，通过测序、序列比对分析找出SNPs；本发明目的之二是基于发现的SNPs，建立IGF-1基因启动子SNPs的PCR-RFLP检测方法，为建鲤生长、体型的标记辅助选择提供有用的分子标记。

本发明通过以下技术方案实现：

建鲤类胰岛素生长因子1启动子SNPs的PCR-RFLP检测方法，其特征在于该检测方法包括利用位于Seq NO.1  第731bp的单核苷酸多态性， PCR扩增出含有多态性位点的基因片段进行检测，其中引物为Seq NO.3和Seq NO.4。

PCR反应条件为：

含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、pH8.0 50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl₂、200umol/L 在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行、反应条件是95℃ 3min、30循环、72℃延长8min，4℃度保存，其中30循环的条件为94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min；5ul PCR产物，加入0.2ul×10U/ul的限制性内切酶，37℃酶切3小时，消化产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

其中所述的多态性是118bp和282bp限制性片段长度多态性如上所述的基因序列。

建鲤IGF-1基因启动子，其核苷酸序列，见Seq NO.1。

一种克隆建鲤IGF-1启动子的方法，按照以下步骤：建鲤血液基因组DNA提取，设计特异引物、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序，获得建鲤IGF-1启动子。其中PCR引物为Seq NO.2和Seq NO.3。

一种建鲤IGF-1启动子SNPs查找的方法，按照以下步骤：10尾建鲤血液基因组DNA提取，设计特异引物、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序，获得10尾建鲤IGF-1启动子，10条序列比对，获得SNPs。

所述的方法还包括建立了建鲤IGF-1启动子SNPs的PCR- RFLP检测方法，所述的限制性内切酶是Hpy188III。 

有益效果

本发明的基因标记和SNP的PCR-RFLP检测技术可用于建鲤IGF-1基因SNPs分析，以及研究基因与建鲤生长、体型相关性能的关系。

 

附图说明：

图1：建鲤IGF-1启动子酶切图，其中AA为A型，TT为T型，AT为杂合型，M为DL1000 marker。

 

具体实施方式

实施例1：建鲤IGF-1基因启动子的扩增

建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，根据GenBank上公布的鲤IGF-1基因DNA序列设计一对引物扩增建鲤IGF-1基因启动子，见表1。

表1 扩增建鲤IGF-1基因启动子的引物

Tab.1 Primers for cloning IGF-1 promoter in Jian common carp (Cyprinus Carpio var. Jian)

引物(Primer)序列Sequence（5’- 3’）碱基数（nt）退火温度（Tm）正向(Forward)CGTCTCCATATAGAGCGATGATGG2456.9反向(Reverse)CAGGCTCGTTGTGGAGAAGTGA2260.8

PCR是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl（pH8.0）、2mmol/L MgCl2，200umol/L 在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行、反应条件是95℃ 3min、30循环（94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min）、72℃延长8min，4℃度保存。扩增的PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体，转化到感受态细胞中，经蓝白斑筛选，挑选阳性质粒，送到上海博尚生物技术有限公司测序。DNA序列用Blast软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行分析。建鲤IGF-1启动子序列如图1所示。

实验例2：建鲤IGF-1 SNPs的查找

建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，分别从10尾建鲤中扩增出IGF-1的启动子和外显子1。PCR是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl（pH8.0）、2mmol/L MgCl2，200umol/L 在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行、反应条件是95℃ 3min、30循环（94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min）、72℃延长8min，4℃度保存。扩增的PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体，转化到感受态细胞中，经蓝白斑筛选，挑选阳性质粒，送到上海博尚生物技术有限公司测序。经clustalW软件分析序列，发现在扩增出的序列中，存在6处SNPs位点。经DNASTAR软件包中的MAPDRAW进行酶切位点分析，发现只有一个SNPs位点适合做RFLP检测，即核苷酸731bp处A/T碱基替换。

实验例3：建鲤IGF-1 SNPs的PCR-RFLP检测技术

建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，根据要检测的SNPs位点，设计一对引物扩增包含该位点的DNA序列，见表2。

表2 建鲤IGF-1的SNP扩增引物

Primers for amplification IGF-1 including SNPs in Jian common carp (Cyprinus Carpio var. Jian)    

引物(Primer)序列Sequence（5’-3’）碱基数（nt）退火温度（Tm）正向(Forward)GAACACAAAAAGTTAGAATATAGTGT2656.2反向(Reverse)TCATCTCTGTATACTTGCCAGCGT2460.8

PCR是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl（pH8.0）、2mmol/L MgCl2，200umol/L 在dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行、反应条件是95℃ 3min、30循环（94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 1min）、72℃延长8min，4℃度保存。5ul PCR产物，加入0.2ul（10U/ul）的限制性内切酶，37℃酶切3小时，消化产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。等位基因T（IGF-1启动子731bp处位点为T）限制性片段长度为118bp和282bp，等位基因A（IGF-1启动子731bp处位点为A）限制性片段长度为400bp；杂合基因TA型限制性片段长度为118bp，282bp和400bp。