巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的羧酸产生成员

摘要

本发明涉及最初从牛瘤胃中分离的，命名为DD1的新细菌菌株，其具有产生有机酸，尤其是琥珀酸(SA)的能力，并能够利用甘油作为碳源；还涉及来自所述菌株的保留该能力的变体菌株；以及涉及通过使用所述微生物产生有机酸，尤其是琥珀酸的方法。

说明书

本发明涉及最初从牛瘤胃中分离的，命名为DD1的新细菌菌株，其具有产生有机酸，尤其是琥珀酸(SA)的能力，并能够利用甘油作为碳源；还涉及来自所述菌株的保留该能力的变体菌株；以及涉及通过使用所述微生物产生有机酸，尤其是琥珀酸的方法。 

发明背景 

因为来自生物质的琥珀酸(SA)代表合成树脂的重要成分或者是更具价值的低分子量化合物，尤其是四氢呋喃(THF)、1，4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮的来源，来自所述酸的发酵产物早已经引起了很大关注(WO-A-2006/066839)。 

Lee等(2002a)描述了从牛瘤胃中分离的SA产生菌。所述细菌是不运动的、无孢子形成的、嗜中温且嗜二氧化碳的革兰氏阴性棒状或球杆菌。基于16S rRNA序列的系统发生分析及生理学分析表明所述菌株作为新的物种属于Mannheimia属，并已经命名为曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimiasucciniciproducens)MBEL55E。在100％CO₂条件下，其在6.0-7.5的pH范围内生长良好并产生2∶1∶1恒定比的琥珀酸、醋酸和甲酸。当曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E在CO₂-饱和葡萄糖作为碳源进行厌氧培养时，在温育的7.5小时里消耗19.8g/L葡萄糖并产生13.3g/L的SA。 

然而，所述生物的显著缺点是其不能代谢甘油的能力，所述甘油作为三酰甘油(TAG)的组分可容易地获得(Dharmadi等，2006)，例如作为生物柴油生产的转酯反应中的副产物。 

已经在科学文献中描述了来自甘油的琥珀酸发酵产物(Lee等，2001；Dharmadi等，2006)，并且利用甘油比利用常见的糖，如葡萄糖，可获得更 高的产率[产生的SA的量/消耗的原材料的量](Lee等，2001)。然而，利用甘油获得的空间时间产率比利用葡萄糖获得的低得多(0.14相比于1.0gSA/[L h])并且没有使用任何粗甘油。 

仅在少数情况下曾经描述过甘油到发酵产物的厌氧代谢。大肠杆菌(E.coli)能够在非常特定的条件下如酸性pH、避免发酵气体氢气积累以及适当的培养基组分下发酵甘油(Dharmadi等2006，Yazdani和Gonzalez2007)。许多微生物能够在外部电子受体存在下发酵甘油(呼吸代谢)，很少能够这样发酵(即在缺少电子受体的情况下)。已经在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族的几个物种中，如弗氏柠檬酸细菌(Citrobacterfreundii)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中详细研究了甘油的发酵代谢。这些生物中的甘油异化与其合成高度还原产物1，3-丙二醇(1，3-PDO)的能力紧密相关(Dharmadi等2006)。已经报道了使用产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)将甘油转化成琥珀酸(Lee等2001)。该研究表明可以通过使用甘油作为碳源，在极少形成副产物醋酸的情况下产生琥珀酸，因此促进琥珀酸的纯化。通过间歇地喂饲甘油和酵母提取物获得最高产率，这是导致产生大约19g/L琥珀酸的策略。然而注意到，甘油发酵发生需要在酵母提取物中存在的未鉴定营养组分。 

通过酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)和丙酮酸羧化酶(PycA)催化的草酰醋酸盐的羧化反应利用HCO₃^-作为CO₂来源(Peters-Wendisch，PG等)。因此，碳酸氢盐(hydrogencarbonate)来源如NaHCO₃、KHCO₃、NH₄HCO₃等可应用于发酵和培养基来提高HCO₃^-在底物向琥珀酸代谢中的有效性。迄今为止，在现有技术中未曾发现琥珀酸从葡萄糖的产生依赖于HCO₃^-的添加。 

厌氧生物的生物量产生受限于从发酵途径产生的ATP的量。在厌氧生物中甘油的生物量产率比糖类，所述糖类像己糖如葡萄糖、果糖，戊糖如木糖、阿拉伯糖，和二糖如蔗糖或麦芽糖的生物量产率低(Lee等2001，Dharmadi 2007)。 

然而，因为糖类(Saccharides)相对于多元醇甘油具有更低的还原态， 理论上，糖类比甘油以显著更低的产率转化成琥珀酸。已经发现糖类与甘油的组合在产生琥珀酸的厌氧生物中起作用(Lee等2001)，但不能达到琥珀酸高于28g/l的值(titer)。 

因此，需要其他细菌菌株，其具有从甘油产生有机酸，尤其是SA的能力。具体而言，此类菌株应该以高生产率从甘油产生所述酸，尤其是如果使用例如来自生物柴油产品的粗甘油而不需前期纯化。 

发明概述 

本发明目标是提供具有从甘油，尤其是粗甘油产生琥珀酸能力的细菌菌株。 

本发明人解决了该目标，其令人惊奇地分离了具有期望的代谢特征的新细菌菌株，命名为DD1。 

附图简述 

图1显示DD1的系统树。 

图2显示DD1的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1)。 

图3显示DD1的23S rDNA序列(SEQ ID NO：2)；其与“曼海姆产琥珀酸菌”MBEL55E的相应6个单独序列的比对；其中DD1序列(下)与MBEL55E序列之间的差异示于单独的附件1中； 

图4显示DD1的光学显微镜图像。 

图5显示在不同的初始葡萄糖浓度下DD1的NH₄OH控制分批培养。 

图6显示在不同温度和pH值下DD1的NH₄OH控制分批培养。 

图7显示DD1的NH₄OH控制分批培养。图代表酵母提取物(Y)、蛋白胨(P)和玉米浆(C)的初始浓度[g/L]。 

图8显示在含有和没有蛋白胨的情况下在DD1的NH₄OH控制分批培养中获得的副产物。 

图9显示在葡萄糖作为碳源的情况下DD1需氧分批培养的结果。 

图10显示如Lee等，2002a和2002b所述，在含有葡萄糖的CO₂饱和 条件下DD1的厌氧分批培养的结果。 

发明详述 

本发明的第一个实施方案涉及命名为DD1的细菌菌株，其可从牛瘤胃中分离，并能够利用甘油(包括粗甘油)作为碳源；并涉及来自其的保留该能力的变体菌株。 

优选地，所述菌株具有从甘油(包括粗甘油)，尤其是在厌氧条件下产生琥珀酸的能力。 

具体而言，所述新菌株具有SEQ ID NO：1的16S rDNA或显示至少96、97、98、99或99.9％序列同源性的序列；和/或SEQ ID NO：2的23SrDNA或显示至少95、96、97、98、99或99.9％序列同源性的序列。 

两条核苷酸序列之间的“同一性”或“同源性”指在比对序列全长上的残基的同一性，例如在来自生物信息学软件包EMBOSS(版本5.0.0， http://emboss.sourceforge.net/what/)的程序needle的帮助下(对十分相似的序列)计算的同一性，所述程序具有默认参数： 

-空位开放(开放空位的罚分)：10.0 

-空位延伸(延伸空位的罚分)：0.5 

-数据文件(软件包中包括的得分矩阵)：EDNAFUL 

菌株DD1的23S rDNA序列与“曼海姆产琥珀酸菌”MBEL55E的相应6个单独序列的比对示于附件1中。其中，强调了DD1序列(下)与MBEL55E序列的6个23S rDNA序列之间的差异。所述DD1序列(也参阅SEQ ID NO：2)代表通过测序PCR扩增的DD1的23S rDNA获得的序列信息。测序实验产生了确切的序列信息，说明来自DD1的23S rDNA信息可用作DD1菌株的辨别特征。所述DD1序列与各MBEL55E序列在至少6个序列位置上不同。最显著的差异是在各MBEL55E序列中(接近位置1325)约133bp的插入，其在DD1序列中是缺失的。其他显著的特定序列差异在位置451、1741、2040、2041、2045和2492处(如比对中使用的编号)。 

本发明的菌株也优选显示至少一个以下额外的代谢特征： 

a)从蔗糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

b)从麦芽糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

c)从D-果糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

d)从D-半乳糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

e)从D-甘露糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

f)从D-葡萄糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

g)从D-木糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

h)从L-阿拉伯糖产生琥珀酸；尤其是在厌氧条件下； 

i)不利用木糖醇、肌醇和山梨醇； 

j)在需氧和厌氧条件下均生长； 

k)在75g/L和更高的初始葡萄糖浓度下生长； 

l)铵耐受。 

具体而言，所述菌株显示至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或全部所述额外特征。 

例如，进一步分析DD1共代谢糖类和多元醇甘油的能力。发现DD1能够共代谢麦芽糖与甘油，导致生物量形成、琥珀酸形成，同时还有麦芽糖和甘油的利用。 

应以其最广泛意义理解术语“酸”(在如本文涉及的有机单羟酸或二羟酸的上下文中，i.p.醋酸、乳酸和琥珀酸)，并也包括其盐，例如碱金属盐，像Na和K盐，或碱土金属盐，像Mg和Ca盐，或铵盐；或所述酸的酐。 

术语“粗甘油”应理解为在这样的过程中产生的未加工的含甘油的流体，其中甘油是副产物，例如生物柴油或生物乙醇的产物。除非另有说明，如本文所用的术语“甘油”也包括“粗甘油”。 

在优选的实施方案中，本发明涉及保藏于DSMZ并具有保藏号DSM18541的细菌菌株DD1，和来自其的变体或突变体菌株。所述变体和突变体保留至少其从甘油、蔗糖、麦芽糖、D-葡萄糖、D-果糖和/或D-木糖产生琥珀酸(SA)的能力。具体而言，它们也具有SEQ ID NO：1的16S rDNA 或显示至少96、97、98、99或99.9％序列同一性的序列；和/或SEQ IDNO：2的23S rDNA或显示至少95、96、97、98、99或99.9％序列同一性的序列。所述DD1菌株的变体或突变体具有不同于SEQ ID NO：2的23SrDNA，但保留如上讨论的至少一个序列差异，其使所述23S rDNA序列区别与MBEL 55E菌株的23S rDNA序列。例如，132bp的插入也在此类变体或突变体中缺失，任选地与附件1比对中描述的一个或更多个其他特定序列差异组合。 

根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少0.5g/g高达约1,28g/g的产率系数YP/S；例如至少0,6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g、至少1.1g/g、至少1.15g/g、至少1.20g/g、至少1.22g/g、至少1.24g/g的产率系数YP/S将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。 

根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少1.0g/g、或＞1.0g/g、或＞1.05g/g、或＞1.1g/g、或＞1.15g/g、或＞1.20g/g、或＞1.22g/g、或＞1.24g/g高达约1,28g/g的产率系数YP/S将至少28g/L的甘油转化成至少28.1g/L的琥珀酸。例如，28g/L的甘油可转化成高达约40或高达约35g/L琥珀酸。 

根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少0.6g gDCW^-1h^-1琥珀酸、或至少0.65、至少0.7g gDCW^-1h^-1、至少0.75g gDCW^-1h^-1、或至少0.77g gDCW^-1h^-1琥珀酸的特定生产产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。 

根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以对琥珀酸而言至少2.2g/(Lh)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L＊h)琥珀酸的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。 

根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L＊h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L的至少一种碳源转化成琥珀酸。 

根据另一实施方案，本发明的细菌菌株以至少0,6g g DCW^-1h^-1或至少0.65或至少0.7g gDCW^-1h^-1琥珀酸，或至少0.77g gDCW^-1h^-1琥珀酸的特定生产产率，和对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L＊h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少一种碳源转化成琥珀酸。 

在如上定义的本发明细菌菌株的另一实施方案中，所述碳源是甘油或甘油与选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一种其他碳源的混合物。 

如本文所述，不同的产率参数(“产率(yield)”或YP/S；“特定生产产率(specific productivity yield)”；或空间时间产率(Space-Time-Yield，STY))为本领域所熟知并如Song和Lee，2006描述来测定。 

“产率”和“YP/S”(各自以产生的产物量/消耗的材料的量表述)此处用作同义词。 

特定生产产率描述产物，像每小时每升发酵培养液每克干生物量产生的琥珀酸的量。表述为DCW的细胞干重的量描述生物化学反应中生物活性微生物的量。给定的数值为每小时每克DCW多少克产物(即g gDCW^-1h^-1)。 

本发明的其他实施方案涉及用于发酵产生有机酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤： 

a)在含有可同化碳源的培养基中培养如一项前述定义中所定义的细菌菌株，并在存在二氧化碳下，在约10到60，或20到50，或30到45℃的温度，5.0到9.0，或5.5到8.0，或6.0到7.0的pH中培养所述菌株；和 

b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物。 

可间断地或连续地进行所述方法，并且可通过常规手段，例如HPLC或GC分析监测酸产生的过程。 

优选地，优选在厌氧条件下通过所述方法产生琥珀酸(SA)。可通过常规技术，例如通过将反应培养基的成分脱气并通过以例如0.1到1或0.2到0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮气或其混合物以及任选地氢气维持厌氧条件来建立厌氧条件。 

可通过常规技术，例如通过以例如0.1到1，或0.2到0.5vvm的流速引入空气或氧气来建立需氧条件。 

适当时，可应用0.1到1.5bar的轻微超压。 

在所述方法中，所述可同化碳源优选选自甘油、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖及其混合物，或含有至少一种所述化合物的组合物，或选自淀粉、纤维素、半纤维素和/或木质素纤维素的分解产物。 

可优选将可同化碳源的初始浓度调整到5到100g/l范围内的值，并可在培养过程中维持在该范围内。 

通过添加合适的碱例如NH₄OH、NH₄HCO₃、(NH₄)₂CO₃、NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、KOH、K₂CO₃、KHCO₃、Mg(OH)₂、MgCO₃、Mg(HCO₃)₂、Ca(OH)₂、CaCO₃、Ca(HCO₃)₂、CaO、CH₆N₂O₂、C₂H₇N或其他碱及其混合物控制反应培养基的pH。所述碱的生理状态可以是水溶液、水悬浮液、气体或液体。 

用于产生SA的尤其优选条件是： 

碳源：葡萄糖、木糖或麦芽糖和/或甘油(包括粗甘油) 

温度：30到45℃ 

pH：6.0到7.0，通过如上述碱，优选通过HCO₃^-源如Na₂CO₃、NaHCO₃、Mg(HCO₃)₂、Ca(HCO₃)₂或Mg(OH)₂、MgCO₃、Ca(OH)₂、CaCO₃控制 

供给气体：CO₂

在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤： 

a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株； 

b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物； 

并且所述方法的特征还在于至少28g/L的甘油以至少1.0g/g、或＞1.0g/g、或＞1.05g/g、或＞1.1g/g、或＞1.15g/g、或＞1.20g/g、或＞1.22g/g、或＞1.24g/g；高达约1,28g/g的产率系数YP/S；例如以至少0,6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g、至少1.1g/g、至少1.15g/g、至少1.20g/g、至少1.22g/g、至少1.24g/g的产率系数YP/S转化成至少28.1g/L琥珀酸。例如，28g/L的甘油可转化成高达约40或高达约35g/L的琥珀酸。 

在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤： 

a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株； 

b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物； 

并且所述方法的特征还在于以至少0.6g gDCW^-1h^-1琥珀酸或至少0.65或至少0.7g gDCW^-1h^-1琥珀酸、或至少0.75g gDCW^-1h^-1琥珀酸、或至少0.77g gDCW^-1h^-1琥珀酸的特定生产产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源转化成琥珀酸。 

在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤： 

a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株； 

b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物； 

并且所述方法的特征还在于以对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L＊h)琥珀酸的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉 伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源转化成琥珀酸。 

在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤： 

a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株； 

b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物； 

并且所述方法的特征还在于以对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L＊h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的至少28g/L碳源转化成琥珀酸。 

在另一实施方案中，本发明提供用于发酵产生琥珀酸或其盐或衍生物的方法，所述方法包括步骤： 

a)在含有至少一种可同化碳源的培养基中培养细菌菌株并在利于所期望有机酸形成的条件下培养所述菌株； 

b)从所述培养基中获得所述有机酸或其盐或衍生物； 

并且所述方法的特征还在于以至少0,6g gDCW^-1h^-1琥珀酸或至少0.65或至少0.7g gDCW^-1h^-1琥珀酸，或至少0.77g gDCW^-1h^-1琥珀酸的特定生产产率，和对琥珀酸而言至少2.2g/(L h)、或至少2.5、至少2.75、至少3、至少3.25、至少3.5或至少3.7g/(L＊h)的空间时间产率将选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖和/或甘油的碳源转化成琥珀酸。 

在产生琥珀酸的上述确定的方法的另一实施方案中，所述碳源是甘油或甘油的混合物和选自蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的至少一种其他碳源。 

其他优选条件将来自所附实施例和附图。 

可通过本领域已知的方法例如结晶、过滤、电透析、层析，以常规方式来分离所产生的琥珀酸和/或琥珀酸盐。例如，可通过使用用于中和及过滤沉淀的氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙或碳酸氢钙在发酵过程中的发酵罐中 通过沉淀将它们分离为琥珀酸钙产物。 

通过用硫酸对琥珀酸进行酸化从沉淀的钙或琥珀酸盐中回收期望的琥珀酸产物，随后通过过滤除去硫酸钙(石膏)或沉淀物。可通过离子交换层析对所得的溶液进行进一步的纯化，以去除不想要的残留离子。 

本发明的另一实施方案涉及用于产生琥珀酸和/或琥珀酸盐，尤其是铵盐的方法，所述方法包括发酵产生如上定义的琥珀酸并用合适的碱，尤其是无机碱，像铵，或其水溶液控制pH。 

本发明的另一实施方案涉及产生四氢呋喃(THF)和/或1，4-丁二醇(BDO)和/或γ-丁内酯(GBL)的方法，其包括 

a)发酵产生琥珀酸和/或琥珀酸盐，例如如上定义的铵盐，和 

b1)将所获的游离酸直接催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL，或 

b2)所获游离琥珀酸和/或琥珀酸铵盐化学酯化成其对应的二低级烷基酯，并随后将所述酯催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL。 

低级烷基优选代表直链或分支C₁-C₆-，优选C₁-C₄-烷基残基，尤其是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基以及正戊基和n-nexyl及其分支类似物。 

本发明的另一实施方案涉及用于产生吡咯烷酮的方法，其包括 

a)发酵产生如上定义的琥珀酸盐，和 

b)以本身已知的方式，例如在WO-A-2006/066839(其文件在此引入作为参考)中描述的方式将琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。 

在优选的实施方案中，用作可同化碳源的所述甘油是粗甘油。 

SA直接氢化的更多细节 

用于进行直接催化氢化的合适的实验条件是众所周知的，并例如描述于US 4,550,185中，此处引用作为参考。 

使用本领域技术人员熟悉的方法、装置和助剂如溶剂以本身已知的方式将SA氢化。具体而言，在适合酸氢化的多相催化剂存在下进行连续或分批液相氢化。本领域技术人员在可接受的努力下可确定最佳方法参数。例如，反应温度在约100到约300℃的范围内，优选在约130到285℃范围 内，并且压力从约20到350bar，例如从100到250bar。可用于氢化反应的催化剂为本领域技术人员所知。例如，可使用多种钯/铼/碳催化剂。可用于氢化反应的溶剂为本领域技术人员所知。例如，可使用水溶剂介质。 

氢化后SA酯化的更多细节 

直接催化氢化后用于进行化学酯化的合适的实验条件是众所周知的，并例如描述于在此引入作为参考的欧洲专利申请06007118.0中。 

a)酯化方法： 

使用本身已知的装置以多种设计进行酯化方法，其可包括反应性蒸馏(reactive distillation)。 

例如，可使用以连续方式运转的酯化车间(esterification plant)，其包含具有通过安装支架或填垫材料完成适当数量的理论级的精馏柱。一旦在柱中因上样(feeding-in)链烷醇形成稳定状态温度模式，就将包含SA铵盐的水装料从储存容器上样到柱的顶部，所述链烷醇在粘着到所述柱的贮槽(sump)的蒸发器环路(evaporator loop)中蒸发。反应形成下降的含铵盐液体与冷凝物，和上升的含链烷醇的蒸气相的对流。为了催化酯化反应，可向铵盐初始装料中加入均相催化剂。或者，可在柱内部提供多相催化剂。所形成的羧酸酯在反应条件下是液体，并经柱的底部流向蒸馏柱的贮槽，并从所述贮槽中连续流出。从反应柱中去除气态组分，例如包含链烷醇-水和/或铵的共沸混合物，并因此在所述柱的顶部从反应平衡中去除。 

可通过本领域技术人员在可接受的努力下完成对上述特定实施方案的进一步修改。 

根据所用装置的配置，例如所用柱内容物的类型、反应物的类型和量、适当时所用催化剂的类型和量，本领域技术人员可容易地确定用于本发明酯化方法的合适的方法参数范围。例如，并非限制性的，可在以下参数范围中设置各参数： 

柱温度：0-300℃，具体而言40-250℃，或70-200℃ 

压力：0.1到6bar，具体而言标准压力 

停留时间：几秒(例如1到60秒)多至几天(例如1到5天)，具体 而言几分钟(例如1到60分钟)至几小时(例如1到15小时)，更优选几分钟(例如5到20分钟)至2小时。 

b)氢化方法 

使用本领域技术人员熟悉的方法、装置和助剂，如催化剂以本身已知的方式将根据本发明制备的SA酯氢化。 

具体而言，在适合酯氢化的多相催化剂的存在下进行连续或分批气相氢化。本领域技术人员在可接受努力下可为特定酯确定最佳方法参数。例如，反应温度在约100到约300℃的范围内，优选在约200到280℃范围内，并且压力从约5到100bar，例如从10到50bar。反应物与氢气的摩尔比值设置在约1∶100到约1∶2000，例如1∶800到1∶1500的范围内。 

可用于本发明氢化反应的催化剂为本领域技术人员所知。例如，可使用多种铜催化剂。例如，现有技术描述了还原亚铬酸铜催化剂的用途，所述催化剂可获自Davy Process Technology Ltd.，英国，名称为85/1。然而，尤其适合于本发明的催化剂是支持性氧化铜催化剂，所述氧化铜应用于氧化铝或硅支持材料。也在以下论文中描述了利用铜催化剂将琥珀酸酯氢化成BDO(1，4-丁二醇)/GBL(γ-丁内酯)/THF的实例：Schlander，Jan.，2000年2月，University of Karlsruhe，″Gasphasenhydrierung von zu 1，4-Butandiol，gamma-Butyrolacton undTetrahydrofuran an Kupfer-Katalysatoren″。 

发酵步骤的更多细节： 

可在搅拌发酵罐、鼓泡塔和环式反应器中进行本发明所用的发酵。包括搅拌类型和几何设计的可能的方法类型的综述可见于″Chmiel：Bioprozesstechnik：Einführung in die Bioverfahrenstechnik，Band 1″。在所述方法中，可获得的典型变体是本领域技术人员已知或例如在″Chmiel，Hammes and Bailey：Biochemical Engineering″中解释的以下变体，如分批式发酵、分批补料式发酵、重复分批补料式发酵或具有或不具有循环生物量的连续发酵。根据生产菌株，可以/必须完成空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或适当气体混合物的喷射，以达到好的产率。 

在本发明方法的发酵液中进行化学转化之前，可对发酵液进行预处理；例如，可以去除发酵液的生物质(biomass)。去除生物质的方法为本领域技术人员所知，例如过滤、沉淀和浮选。结果，例如可通过离心机、分离器、倾析器、过滤器或在浮选装置中去除生物质。为了最大回收有价值的产物，经常建议例如以透析过滤的形式洗涤生物质。方法的选择依赖于发酵罐培养液中的生物质含量和生物质的性质，还有生物质与有价值产物的相互作用。在一个实施方案中，可将发酵液灭菌或巴士消毒。 

在其他实施方案中，将发酵液浓缩。根据需要，可分批或连续进行该浓缩。应该选择压力和温度范围，使得首先没有产物损伤发生，其次最少使用装置和能量是必须的。灵巧的选择用于多级蒸发的压力和温度水平使得能够节约能量。 

对于装置，可以天然的或强制循环方式利用搅拌罐、降膜式蒸发器、薄膜蒸发器、强闪循环蒸发器和其他蒸发器类型。 

结果，术语“发酵液”理解为表示基于发酵方法并且如本文所述未曾起作用或已经起作用的水溶液。 

将通过以下实施例来更详细地描述本发明。以下实施例用于说明性目的，而不旨在限制本发明的范围。 

实施例1：分离DD1 

为了分离使用四步方法，该方法包括为取样、浓缩培养、分离纯培养物和检测纯培养物的琥珀酸(SA)产生的步骤。 

1.实验方法 

1.1取样 

从牛瘤胃、来自城市污水处理厂的消化污泥和酿酒残渣果渣中取样。通过相对高浓度的有机物和无氧富含CO₂的大气来对这些产地进行表征。以下给出关于所述样品、其起源及处理的更详尽信息。 

a)瘤胃内含物取自Institut für University ofHohenheim的插管的Holstein奶牛。原位pH值及温度分别为6.7和37℃。 将材料经无菌滤布过滤，通CO₂并立即在冰上冷却以当天运输并处理。 

b)消化污泥取自Mannheim-Sandhofen的城市污水处理厂的消化塔中。原位pH值及温度分别为7.1和36.3℃。将样品置于冰上冷却并当天处理。污泥中气相的主要成份为甲烷和二氧化碳。 

c)果渣样品于2005年11月收集于德国西南部的田地。来自红葡萄 的果渣取自大stash的中部。该区域应为无氧状态。来自白葡萄(Müller-Thurgau)的果渣取自其中已在进行乙醇发酵的贮存容器中。 

1.2富集培养 

在含D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖作为唯一碳源的不同培养基上进行富集培养。培养基组分如下所述： 

表1：用于富集培养的培养基组分。 

^a D-葡萄糖、D-木糖或L-阿拉伯糖 

^b MgCO₃(Riedel-de Haen，Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH，Seelze，德国的产品号：13117). 

^c乙醇中的贮存液 

^d二甲亚砜中的贮存液 

^e将瘤胃液离心。将上清液无菌过滤，无菌的滤液加入到以瘤胃内含物作为接种物的富集试验中。 

^f将10g消化污泥或果渣与25mL蒸馏水混合并剧烈搅动15分钟。用过滤毯(filter fleece)分离粗颗粒。将悬浮液无菌过滤，无菌滤液加入到各富集试验中。 

在100mL血清瓶中将MgCO₃和水高压灭菌(121℃，20分钟)。酵母提取物、蛋白胨、碳源、NH₄SO₄和K₂HPO₄分别高压灭菌。对于氯化钙、氯化镁和氯化钠，制备高压灭菌的贮存液。 

为确保无氧气存在，使用以下标准方法： 

-高压灭菌后向培养基通入无菌无氧的CO₂。 

-对于必须在厌氧条件下进行的实验，使用厌氧盒(Meintrup DWS GmbH， -Holte，德国)。 

-在厌氧培养罐中培养琼脂板。使用 A(Merck)以确保厌氧条件。 

使用未稀释的瘤胃样品和消化污泥作为接种物。在100mL 0.9％NaCl溶液中稀释50g固体果渣，过滤去除粗颗粒并随后用作接种物。 

在100mL血清瓶(Zscheile & Klinger，Hamburg，德国)中装入50mL培养基和2mL各种接种物，用丁基橡皮塞(Ochs GmbH，Bovenden/Lenglern，德国)封口并通入CO₂。调节约0.8bar的超压。在振荡培养箱中(160转/分钟，振荡直径：2.5cm)37℃下温育血清瓶。 

使用RI，经培养液的未稀释无细胞上清液的HPLC分析对葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的消耗，以及琥珀酸及副产物的形成进行定量。用无菌注射器经丁基橡皮塞取培养液样品，经过滤(0.22μm)进行细胞分离。使用300x7.8mm I.D.Column Aminex HPX-87H(Biorad)和5mm H₂SO₄分 别作为固定相和移动相。柱温度为30℃，流速为0.5mL分钟^-1。 

1.3纯培养物的分离 

通过在琼脂板上重复划线完成纯培养物从富集培养中的分离。 

1.4检测用于琥珀酸产生的纯培养物 

在用于SA产生的液体培养物中检测纯培养物。用HPLC对糖消耗和SA及副产物形成进行定量。培养及HPLC条件与上节“富集培养”中描述的相同。 

1.结果 

2.1推荐的富集条件 

下表总结了那些实验条件，推荐其用于琥珀酸(SA)产生者的富集。 

表2：用于SA产生者产生的推荐实验条件 

^a消化污泥试验中未检测葡萄糖和木糖。 

对于来自瘤胃内含物的产生者的富集，最佳碳源为阿拉伯糖(3/3富集培养物显示SA产生，葡萄糖为0/3，木糖为2/3)。结果总结于下表中。向富集培养基中加入离子载体抗生素拉沙里菌素和莫能菌素导致显著更高的SA产生，(17小时内1.9-5.4g/L相对于0.9-1.2g/L)及更低的乳酸和丙酸产生。这些结果因此确定了产SA微生物的确偏好于向富集培养基中加入这些化合物(Lee等，2002a)。用MgCO₃进行缓冲的富集培养基比TRIS缓冲的试验显示更高的SA产生(17小时内1.9-5.4g/L相对于1.2-1.4g/L)。推测这是由于i)MgCO₃更高的缓冲能力，ii)由于更低的可溶性的更低的渗透压，和iii)由来自碳酸根离子的CO₂释放，其对于SA生物合成是必需的。 

表3：来自瘤胃内含物的SA产生者的富集培养结果。 

对于从消化污泥中富集SA产生者，检测的唯一碳源是阿拉伯糖。结 果总结于下表中。这些实验说明24小时或更短的短温育时间可能对防止通过丙酸产生菌的底物缺失和SA消耗是必需的：琥珀酸根^2-+H₂O→丙酸盐^-+HCO₃^-(Janssen，1991)。 

表4：来自消化污泥的SA产生者的富集培养结果。 

从果渣中的富集培养物中获得的结果总结于下表中。如果使用来自红葡萄( 型)的果渣，从果渣中富集SA产生者才是成功的。向富集培养基中加入两性霉素B来抑制可能由酿酒酵母引起的乙醇产生是完全必需的。葡萄糖和阿拉伯糖都是合适的碳源，而木糖则不是。足以 明显检测到SA产生的温育时间要明显地高于来自瘤胃或消化污泥中的样品材料所用的时间。 

5：来自瘤胃的SA产生者的富集培养结果。 

2.2富集实验的最佳结果 

SA产生者的富集培养中所获的最佳结果列于下面的表6中。 

表6：SA产生者的富集培养中的最佳结果。 

^a琥珀酸的空间时间产率和琥珀酸产率。 

该表说明三种样品材料的每一种都可以获得产SA的富集培养物。来自消化污泥的富集培养物比来自瘤胃和果渣的富集培养物显示更高的空间时间产率(0.4相对于0.2及0.1g/[L h])。然而，产SA分离群唯独从以瘤胃材料为接种物的产SA富集培养中获得。显然，从消化污泥和果渣中分离SA产生者需要更为复杂的策略。 

2.3产琥珀酸分离群 

在纯培养实验中显示SA产生的最佳分离群(＝纯培养物)及它们的特征总结于下表中。用瘤胃分离群DD1获得了最高的SA浓度(8.8g/L)和空间时间产率(0.6g/[L h])。 

表7：产琥珀酸(SA)最佳分离群的特征。 

^a分离群DD1在纯培养中检测两次，一次利用葡萄糖，一次利用阿拉 伯糖。 

^b碳源enr.＝富集过程中的碳源，碳源，纯＝纯培养实验中的碳源。 

^c琥珀酸的空间时间产率和琥珀酸产率。 

3.结论 

建立的流程适合于从瘤胃、消化污泥和果渣中富集SA产生者。然而，产SA分离群唯独从以瘤胃材料为接种物的产SA富集培养中获得。最有希望的分离群是瘤胃细菌DD1。它利用葡萄糖和阿拉伯糖用于SA产生。在仍未优化的条件下，从15g/L的阿拉伯糖中产生大概9g/L的SA。图4显示了用光学显微镜拍摄的DD1的图片。 

实施例2：DD1的细胞库制备 

1.培养基制备 

培养基的成分描述于表8中。 

表8：用于制备DD1细胞库的固体和液体培养基组分。 

^a葡萄糖浓度为15g/L(平板)和20或50g/L(液体培养基)。 

^b MgCO₃(Riedel-de Haen，Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH的产品号：13117)浓度为5g/L(平板)和2或30g/L(液体培养基)。 

在900mL蒸馏水中混合5g酵母提取物、5g蛋白胨、MgCO₃和(仅用于固体培养基)12g Bacto-Agar并高压灭菌(20分钟)。冷却到约65℃ 后，加入作为无菌贮存液的缺少组分。葡萄糖、硫酸铵和K₂HPO₄均分别高压灭菌。氯化钙、氯化镁和氯化钠一起高压灭菌。 

2.MCB制备 

用DD1新鲜接种两块琼脂平板并在厌氧培养罐(Anaerocult A，Merck)中37℃温育过夜。从所述平板上取出生物质并在不含MgCO₃液体培养基中重悬，用20g/L葡萄糖调整至OD600≈1.0。用0.5mL该细胞悬液进行接种。在具有不漏气丁基橡皮塞(Ochs GmbH，Bovenden/Lenglern，德国)的100mL-血清瓶中进行培养，所述血清瓶中含有具有20g/L葡萄糖和30g/L MgCO₃的50mL液体培养基并具有0.8bar超压的CO₂大气压。所述血清瓶(总计10个)在37℃下，以160转/分钟的转速和2.5cm的振荡直径下温育。 

为了监测葡萄糖消耗，终止一个瓶的培养并在0、3、4、5、7、8和8.5小时后进行取样和HPLC分析。8.5小时后(葡萄糖浓度为3.4g/L)，终止培养。将0.5mL细胞悬浮液和0.5mL无菌甘油的等分式样装入冷冻管，混合并在-20℃储存13小时，然后在-80℃储存为MCB。通过从最终冷冻管取一接种环在琼脂糖平板上划线用于污染控制并在液体培养基(如表8中所述培养基)中检查产物谱和污染(通过显微镜)来检测MCB的纯度。HPLC条件与实施例1中描述的那些条件相同。 

3.WCB制备 

使用一管MCB接种具有不漏气丁基橡皮塞(见上文)的100mL-血清瓶，其含有具有50g/L葡萄糖的50mL液体培养基。在振荡培养箱(旋转速度：180转/分钟，振荡直径：2.5cm)中37℃下进行温育10小时。在培养结束时，葡萄糖的浓度为20g/L并且pH在6.5附近。将0.5mL细胞悬浮液和0.5mL无菌甘油的等分式样装入冷冻管，混合并在-80℃储存为WCB。纯度检查与用于MCB的相同。HPLC条件与实施例1中描述的那些条件相同。 

实施例3：DD1的分类学表征 

通过16S和23S rDNA分析进行菌株DD1的分类学表征，其如下进行： 

如Rainey等，1996描述进行基因组DNA的提取、16S rDNA的PCR介导的扩增和PCR产物的纯化。通过相同方法，使用正向引物5’-AGTAATAACGAACGACACAG-3’和反向引物5’-AGCCGATTCCCTGACTAC-3’扩增含有23S rDNA的DNA片段。根据制造商方案指导，使用CEQ^TMDTCS-Quick Start试剂盒(Beckman Coulter)对纯化的PCR产物测序。CEQ^TM8000Genetic Analysis System用于序列反应产物的电泳。ae2编辑程序(Maidak等，1999)用于比对菌株DD1的16S rDNA序列与从EMBL和RDP数据库获得的Proteobacteria的-亚类的那些代表性成员的16S rDNA序列。为了构建系统树，使用PHYLIP(Phylogeny InferencePackage，版本3.5c.，J.Felsenstein，Department of Genome Sciences，University of Washington，Seattle，USA发布)的程序：使用Jukes和Cantor(1969)的方法计算配对进化距离，使用邻近连接方法从这些距离构建系统树(Saitou & Nei，1987)。 

基于16S rDNA的系统树描述于图1中。在16S rDNA分析的基础上，菌株DD1最近的亲缘关系是具有99.8％相似性的“曼海姆产琥珀酸菌”MBEL 55E。该菌株由Korea Advanced Institute of Science and Technology(KAIST)的科学家从牛瘤胃中分离(Lee等，2002a；Lee等，2002b)。来自DD1的扩增的23S rDNA片段与来自“曼海姆产琥珀酸菌”MBEL 55E(完整的基因组序列登录号AE016827)的23S rDNA比对，以表明菌株之间的差异。 

图2显示菌株DD1的16S rDNA序列。图3显示菌株DD1的23S rDNA序列，并且与“曼海姆产琥珀酸菌”MBEL 55E(完整的基因组序列登录号AE016827)的23S rDNA的比对示于附件1中。 

实施例4：DD1的细胞形态和菌落形态 

使用一管WCB(实施例2)接种具有不漏气丁基橡皮塞(见上文)的 100mL-血清瓶，其含有具有50g/L葡萄糖的50mL液体培养基(如实施例2中所述组分及制备)。在37℃和170转/分钟(振荡直径：2.5cm)下进行温育15小时。在培养结束时，葡萄糖的浓度已经降低到约17g/L(通过HPLC测定，条件如实施例1所述)。为了检查DD1的细胞形态，使用光学显微镜观察单一细胞。为了对DD1的菌落形态进行表征，将一接种环细胞悬浮液划到Brain Heart Infusion平板上(Bacto Brain HeartInfusion，产品号：237500，以12g/L Bacto Agar凝固，产品号：214010；两者均来自Becton，Dickinson and Company)并在37℃下进行有氧和厌氧温育((Anaerocult A，Merck))。 

DD1的细胞呈现为单独、成对或短链的棒状(见图4)。温育24小时后，菌落是环状、浅黄色、半透明的且直径为0.51μm(好氧生长)和1-2μm(厌氧生长)。 

实施例5：不同碳源的利用 

在Lee等，2002a描述的条件下，检测DD1对不同碳源的利用率。 

1.培养基制备 

培养基的组分描述于表9中。 

表9：检测不同碳源的利用的培养基的组分。 

酵母提取物、聚胨和MgCO₃一起高压灭菌。冷却后加入作为无菌贮存液的缺失组分。葡萄糖和其他碳源、硫酸铵和K₂HPO₄均分别进行高压 灭菌。氯化钙、氯化镁和氯化钠一起高压灭菌。加入Na₂S＊9H₂O达到1mg/L的终浓度以保证缺氧条件。 

2.培养和分析 

对于培养种子培养物，使用一管WCB接种具有不漏气丁基橡皮塞(见上文)的100mL-血清瓶，所述血清瓶含有具有20g/L葡萄糖的如表9中描述的50mL液体培养基，和0.8bar超压的CO₂大气压。在37℃和160转/分钟(振荡直径：2.5cm)下进行温育13小时。用5000g离心细胞悬液(Biofuge primo R，Heraeus，)5分钟，洗涤细胞沉淀然后在不含碳源和MgCO₃的50mL培养基中重悬浮，以产生不含葡萄糖的接种物(所有步骤在室温和厌氧培养室中进行)。 

主要培养物在含10g/L各种碳源(D-甘露糖醇、D-果糖、D-木糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖醇、肌醇、D-山梨醇、甘油、L-阿拉伯糖、D-半乳糖或D-甘露糖)的50mL液体培养基以及0.8bar超压的CO₂大气压的100mL血清瓶中生长。对于甘油利用率的检测，使用质量‘甘油99％，puriss.’(Riedel-de Haen，Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH，Seelze，德国的产品号：15523-1L-R)。用1.5mL不含葡萄糖的接种物进行接种。在37℃和160转/分钟(振荡直径：2.5cm)下温育血清瓶。当在24小时内消耗至少3g/L的碳源时，认为DD1对各碳源的利用率是阳性的。为了验证在主要培养中获得的结果，使用1mL的各主要培养物接种含10g/L各碳源的50mL的新鲜培养基。因此在随后两次主要培养中验证了所述结果。如实施例1中所述经HPLC对碳源的消耗进行定量。当测定甘油时，调整柱温度至50℃以实现具有相似滞留时间的SA、乳酸和甘油的充分分离。 

3.结果 

结果总结于以下表10中。 

表10：DD1和MBEL 55E对不同碳源的利用。 

^a24小时后各种碳源的消耗分析。一式两份进行培养。 

^b来自Lee等，2002a的数据。ND＝未确定。 

所述表显示两种菌株的碳源利用模式在甘油方面不同。DD1可代谢甘油，而MBEL 55E不使用甘油。 

除了蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖，DD1利用D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-甘露糖。因此DD1利用木质素纤维素中的所有类型的单糖(Kamm等，2006；Lee，1997)。Lee等，2002a未检测MBEL55E对L-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-甘露糖的利用。 

实施例6：来自甘油和不同己糖及戊糖的SA和副产物形成 

在含10g/L的各种碳源(参考10g/L葡萄糖)的血清瓶试验中评估甘油、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-甘露糖上的DD1的琥珀酸(SA)生产率(productivity)。 

1.培养基制备 

培养基的组分及制备与实施例2(种子培养)和实施例5(主要培养)中相同。 

2.培养和分析 

如实施例2中所述，种子培养物的生长在含50g/L葡萄糖和30g/LMgCO₃的液体培养基中完成。如实施例5中所述进行不含葡萄糖的接种物的制备。 

如实施例5中所述，利用10g/L甘油、蔗糖、D-木糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖或D-葡萄糖和10g/L MgCO₃完成主要培养物的生长。如实施例5中所述，通过HPLC对各碳源的消耗，及SA和副产物的产生进行定量。 

3.结果 

结果概括于下表11中。 

表11：通过DD1来自甘油和不同糖类的SA和副产物形成。 

^a培养时间。 

^b碳源消耗。 

^c琥珀酸、乳酸、甲酸和醋酸的形成。 

^d琥珀酸的空间时间产率和产率。 

表11显示在所有情况下均形成基本的SA量。通过DD1从甘油(glyc)而非蔗糖(suc)、D-葡萄糖(gluc)、D-果糖(fruc)、D-木糖(xyl)、L-阿拉伯糖(ara)、D-半乳糖(gal)或D-甘露糖(man)的SA产生具有两个显著优势：i)显著更高的产率，ii)显著更少的甲酸和醋酸形成。另一方面，利用甘油的 SA生产率(空间时间产率)比利用糖类的生产率低。利用甘油的DD1的SA生产率比Lee等，2001利用产琥珀酸厌氧螺菌获得的值(0.14g SA/[L h])高得多。 

尤其是，利用甘油达到的显著更高的产率是非常有趣的结果：其可促进发酵琥珀酸、琥珀酸盐和分别从其制备的BDO/GBL/THF或吡咯烷酮的制备成本显著减少-尤其是如果可应用来自生物柴油工厂的廉价粗甘油。 

实施例7：来自不同粗甘油的SA和副产物形成 

在含10g/L各甘油(参考10g/L纯甘油[P1])的血清瓶试验中评估不同粗甘油(C1到C3)上的DD1的SA生产率。 

1.培养基制备 

培养基组分描述于下表12中。 

表12：检测来自不同粗甘油的SA形成的培养基组分。 

^a在种子培养中浓度为50g/L的葡萄糖，在主要培养中为10g/L的各种甘油。 

MgCO₃和水(1.5g和40mL)在100mL-血清瓶中灭菌(121℃，20分钟)。冷却后，加入其他化合物的单独的无菌溶液。通过过滤各自的贮存液分别对酵母提取物、蛋白胨、硫酸铵和K₂HPO₄进行灭菌。对于氯化钙、氯化镁和氯化钠，制备通过过滤灭菌的一种贮存液。葡萄糖和不同的甘油 均分别灭菌(121℃，20分钟)。对于使用纯甘油(P1)的参考试验，使用Honeywell Specialty Chemicals Seelze GmbH，Seelze，德国的质量‘甘油99％，puriss.’(Riedel-de Haen，产品号：15523-1L-R)。 

2.培养和分析 

种子培养物在具有不漏气丁基橡皮塞(见上文)的100mL-血清瓶中生长，所述血清瓶中含有具有50g/L葡萄糖的表12所述的50mL培养基和0.8bar超压的CO₂大气压。用1mL的WCB(实施例2)进行接种。在37℃和170转/分钟(振荡直径：2.5cm)下进行温育15小时。在培养结束时，葡萄糖浓度降低到约17g/L。 

用5000g离心(Biofuge primo R，Heraeus)细胞悬浮液5分钟，并洗涤细胞沉淀，然后在不含葡萄糖和MgCO₃的50mL培养基中重悬浮以产生不含葡萄糖的接种物。 

主要培养物在含10g/L各种甘油的50mL培养基以及0.8bar超压的CO₂大气压的100mL血清瓶中生长。用2.0mL不含葡萄糖的接种物进行接种。在37℃和170转/分钟(振荡直径：2.5cm)下温育血清瓶9小时。 

如实施例5中所述通过HPLC测定各种碳源(种子培养中的葡萄糖，主要培养中的甘油)的消耗，以及SA和副产物的产生。 

3.结果在下表13中概述了结果。 

表13：通过DD1的来自不同甘油的SA和副产物的形成。 

^a ecoMotion GmbH，Sternberg，德国； 

Biopetrol Schwarzheide GmbH，Schwarzheide，德国； 

Glacon Chemie，Merseburg，德国； 

Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH，Seelze，德国的Riedel deHaen(产品号：15523-1L-R). 

^b制造商的分析。 

^c培养时间。 

^d甘油消耗。 

^e琥珀酸、乳酸、甲酸和醋酸的形成。 

^f琥珀酸的空间时间产率和产率。 

表13显示9小时后SA浓度和因此利用粗甘油C1到C3获得的STY(7.4到8.4g SA/L和0.8到0.9g SA/[L h])在所有情况下高于利用纯甘油P1获得的各值(6.2g SA/L和0.7g SA/[L h])。因此除了低廉的价格，所述粗甘油还具有更高生产率的优势。利用粗甘油C1到C3获得的产率(1.1到1.2g SA/g甘油)与利用纯甘油P1获得的各值(1.1g SA/g甘油)类似。 

实施例8：DD1的氨和葡萄糖耐量 

用于从葡萄糖发酵产生琥珀酸和/或琥珀酸铵盐的常用方法是具有某一初始葡萄糖水平的NH₃^-控制补料分批培养。该设置需要菌株的NH₃/NH₄OH^-和葡萄糖耐量。为了检测DD1的这些性质，进行以NH₄OH作为pH控制剂，且具有不同葡萄糖水平的分批培养。 

1.培养基制备 

培养基的组分描述于表14中。 

表14：不同葡萄糖浓度用于pH控制分批培养的培养基组分。 

^a在预培养中初始葡萄糖浓度为50g/L，并且在发酵罐中分别为25、50或75。 

酵母提取物、蛋白胨和MgCO₃在发酵罐和血清瓶中一起高压灭菌。葡萄糖、硫酸铵和K₂HPO₄均分别进行高压灭菌。氯化钙、氯化镁和氯化钠一起高压灭菌。冷却后，向发酵罐和血清瓶中加入作为贮存液的缺失组分。为了预培养，使用相同的培养基组分，但将MgCO₃调整至30g/L。 

2.培养和分析 

预培养物在振荡培养箱(旋转速度：160转/分钟，振荡直径：2.5cm)中的100mL血清瓶中，37℃下厌氧生长，所述血清瓶具有不漏气的丁基橡皮塞(Ochs GmbH，Bovenden/Lenglern，德国)，且含有50mL预培养基。在厌氧培养室(MAKS MG 500，meintrup-dws)中用1mL的DD1工作细胞库进行预培养物的接种。接种后，立即用具有大约0.8bar超压的纯CO₂替换大气压(80％N₂、15％CO₂和5％H₂)。温育16到18小时后，在厌氧箱中集中两个血清瓶，在每种情况下使用15mL接种含有300mL培养基的发酵罐(Sixfors，Infors，瑞士)，所述培养基已经过夜通入CO₂，以保证无氧条件。培养温度是37℃，用25％NH₄OH维持6.5的pH。CO₂气流和搅拌速度分别调整到0.1L/分钟和500转/分钟。如实施例1中所述通过HPLC对葡萄糖的消耗和SA的产生进行定量。 

3.结果 

结果示于图5中。 

在利用葡萄糖的NH₄OH控制分批培养中，在48小时内形成了高达40g/L SA。DD1因此具有强的琥珀酸和/或琥珀酸铵盐合成能力，所述琥珀酸和/或琥珀酸铵盐利于向THF/BDO/GBL和吡咯烷酮的化学转化(WO-A-2006/066839)。 

在利用75g/L葡萄糖的试验中初始SA生产率比利用50和25g/L的试验中的生产率稍低。然而，在6小时到12小时之间，再也没有这种差异，表明在高达75g/L的葡萄糖水平上底物抑制不是问题。 

实施例9：培养温度和pH对通过DD1形成SA的影响 

在该实验中，培养温度和pH在利用75g/L葡萄糖的NH₄OH控制分批培养中是可变化的。 

1.培养基制备 

除了恒定的葡萄糖浓度，培养基组分和制备与实施例8‘DD1的氨和葡萄糖耐量’中的那些相同。 

2.培养和分析 

除了所检测的不同培养温度和pH值，培养和HPLC分析的实验条件与实施例8‘DD1的氨和葡萄糖耐量’中的那些相同。 

3.结果 

结果示于图6中。图6显示在37℃和pH 6.5下的两次试验在葡萄糖消耗和SA产生方面十分相似，说明了可变性低。基于该可变性，在pH 6.5下进行的试验显示34.5到39.5℃之间的培养温度对过程性质没有影响。然而，在37℃下的试验表明0.5单位的pH降低导致SA产生的明显降低，并且0.5单位的pH升高导致SA产生的轻微降低。基于这些结果，如果可以进行pH控制，在pH 6.5下进行DD1的进一步培养。 

实施例10：复合培养基成分对DD1培养的影响 

在含有5g/L酵母提取物和5g/L蛋白胨的培养基中进行DD1的富集 和分离。因此在含有这些化合物的培养基中进行DD1的第一个实验。因为它们增加了原材料的成本并引入了额外的杂质，所以检测了不同的培养基组分，其中分别减少酵母提取物和蛋白胨，并用更廉价的玉米浆(SolulysL48L，Roquette)进行了替换。通过图(代表浓度，即2、5、15或25g/L)和字母(代表各种复杂化合物，即酵母提取物、蛋白胨或玉米浆)说明了试验的初始培养基组分。 

1.培养基制备 

除了对酵母提取物和蛋白胨分别进行了修改，浓度和额外的玉米浆培养基组分以及制备与实施例8‘DD1的氨和葡萄糖耐量’中的那些相同。葡萄糖的分批浓度在所有试验中是50g/L。 

2.培养和分析 

实验条件与实施例8‘DD1的氨和葡萄糖耐量’中的那些相同。所有培养在37℃下进行，用25％NH₄OH将发酵罐中的培养维持在pH 6.5。如实施例8中所述进行HPLC分析。 

3.结果 

结果示于图7中。试验‘5Y5P’和‘5Y’的比较显示可省略蛋白胨，而对SA产生没有任何负面影响。CSL部分替换酵母提取物也没有导致琥珀酸产生减少(试验‘5Y’相比于试验‘2Y15C’)。然而，CSL完全替换酵母提取物导致中等程度的生产率损失。 

试验‘5Y5P’和‘5Y’的副产物谱示于图8中。图8显示在培养基中省略蛋白胨导致甲酸和醋酸的浓度显著更低，而乳酸的浓度在两个试验中相当。该实验表明通过i)降低原材料成本，ii)减少培养基化合物引入的杂质和iii)降低培养过程中副产物的形成来改善培养基的潜力。 

实施例11：DD1与氧气的关系 

因为发酵中SA产生是依赖于厌氧条件的过程，所以培养DD1用于SA产生必须在缺少氧气的情况下进行。然而，知道如果DD1耐受氧气的存在也是非常重要的。如果这就是事实，那么可以在使得实验室工作更容 易且快捷的有氧条件下操作菌株。因此，在具有葡萄糖的摇瓶试验中测试菌株DD1。 

1.培养基制备 

培养基组分和制备与表8中描述的相同。 

2.培养和分析 

厌氧种子培养物在100mL血清瓶中，37℃和160转/分钟(振荡直径：2.5cm)下生长16小时，所述血清瓶具有不漏气的丁基橡皮塞(见上文)并含有具有50g/L葡萄糖和30g/L MgCO₃的50mL培养基和0.8bar超压的CO₂大气压。用1mL的WCB进行接种(实施例2)。使用7.5mL这些预培养物接种需氧的主要培养物。 

需氧主要培养物(具有60g/L葡萄糖和80g/L MgCO₃的150mL培养基)在具有两个隔板和棉塞的500mL锥形瓶中，37℃和200转/分钟(振荡直径：2.5cm)下生长。如实施例1中所述通过HPLC测定底物消耗和产物形成。 

3.结果 

结果示于图9中。所述结果清晰地显示了菌株DD1的需氧葡萄糖消耗。主要产物是醋酸和乳酸，其也是“曼海姆产琥珀酸菌“MBEL 55E的需氧生长细胞的主要产物(Lee等，2002a)。初始SA浓度由厌氧预培养物引入并在15小时培养后被大量消耗。数据清晰地显示DD1是耐氧的。 

实施例12：在KAIST描述的条件下检测DD1 

DD1亲缘关系最近的是KAIST分离的菌株“曼海姆产琥珀酸菌”MBEL 55E(见上文)。为了比较DD1与所述菌株，利用DD1进行KAIST描述的培养实验(Lee等，2002a中的图2b和Lee等，2002b中的图3)。 

1.培养基制备 

培养基的组分与Lee等，2002b各实验中相同，并描述于下表15中。 

表15：用于在Lee等，2002b描述的条件下分批培养DD1的培养基组分。 

酵母提取物、蛋白胨和MgCO₃在发酵罐和血清瓶中一起高压灭菌。葡萄糖、硫酸铵和磷酸钾均单独进行高压灭菌。氯化钙、氯化镁和氯化钠一起高压灭菌。冷却后，向发酵罐和血清瓶中加入作为贮存液的缺失组分。为了种子培养，使用相同的培养基。 

2.培养和分析 

种子培养物在振荡培养室(旋转速度：160转/分钟，振荡直径：2.5cm)内的100mL血清瓶中，39℃下厌氧生长，所述血清瓶具有不漏气的丁基橡皮塞，且含有50mL培养基。在厌氧培养室(MAKS MG 500，meintrup-dws)中用1mL的WCB(实施例2)进行种子培养物的接种。接种后，立即用具有大约0.8bar超压的纯CO₂替换大气压(80％N₂、15％CO₂和5％H₂)。温育9小时后，用30mL接种发酵罐以开始在含有300mL培养基的发酵罐(Sixfors，Infors瑞士)中进行培养，所述培养基已经过夜通入CO₂，以保证无氧条件。培养温度维持在39℃，并用5M NaOH维持6.5的pH。CO₂气流调整到0.25vvm。搅拌速度调整到500转/分钟。 

如实施例1中所述通过HPLC测定葡萄糖的消耗和SA及副产物的形成。 

3.结果 

结果概述于图10中。在温育的5小时里，消耗了18.9g/L葡萄糖，并通过DD1产生了12.3g/L琥珀酸，4.5g/L醋酸和3.3g/L甲酸，显示了与MBEL55E产物谱类似的产物谱。然而，用DD1获得琥珀酸的空间时间产 率是2.5g/(L h)，其显然高于菌株MBEL55E的空间时间产率(1.8g/[L h]，Lee等，2002b)。产率是0.7g琥珀酸/g葡萄糖，其与菌株MBEL55E的产率类似。 

实施例13：DD1在合成培养基中的生长 

使用合成培养基而不使用复杂成分进行DD1的发酵以改善下游加工并设计贫瘠的合成培养基用于节省成本的发酵是有利的。因此，设计用于DD1的合成培养基。同时，也已经公开了用于亲缘关系近的曼海姆产琥珀酸菌的合成培养基(Song等，2008)。已经测定了用于DD1生长的基本化合物和刺激化合物。与利用曼海姆产琥珀酸菌的结果进行比较，观察到明显的差异，暗示了适合于菌株DD1的更经济的生长培养基。 

1.培养基制备 

先前用其他细菌在室内进行并通过进行单个省略实验，与用于瘤胃细菌的其他合成生长培养基(Nili和Brooker，1995，McKinlay等，2005)类似的开发用于DD1的合成生长培养基。最终，所述培养基含有50g/L葡萄糖、1g/L(NH₄)₂SO₄、0.2g/L CaCl₂＊2H₂O、0.2g/L MgCl₂＊6H₂O、1g/L NaCl、3g/L K₂HPO₄、1mg/L烟酸、1.5mg/L泛酸、5mg/L维生素B6、5mg/L核黄素、5mg/L生物素、1.5mg/L硫胺素HCl、0.26g/L赖氨酸、0.15g/L苏氨酸、0.05g/L甲硫氨酸、0.71g/L谷氨酸、0.06g/L组氨酸、0.07g/L色氨酸、0.13g/L苯丙氨酸、0.06g/L酪氨酸、0.5g/L丝氨酸、0.5g/L甘氨酸、0.5g/L半胱氨酸、0.1g/Lβ-丙氨酸、0.27g/L丙氨酸、0.19g/L缬氨酸、0.23g/L亮氨酸、0.16g/L异亮氨酸、0.33g/L天冬氨酸、0.1g/L天冬酰胺、0.13g/L脯氨酸、0.15g/L精氨酸和0.1g/L谷氨酰胺。 

含有50mL复合培养基或合成培养基的血清瓶与作为缓冲系统的水和30g/L MgCO₃一起高压灭菌。葡萄糖、硫酸铵和磷酸钾分别灭菌。氯化钙、氯化镁和氯化钠一起灭菌。维生素和氨基酸组合成多种贮存液并过滤灭菌。血清瓶冷却后，加入作为无菌贮存液的组分。 

如实施例12中所述，在不使用聚胨并以50g/L葡萄糖和30g/L MgCO₃ 起始的情况下制备标准的复合培养基。对于种子培养和一些主要培养，使用对照实验复合培养基。 

2.培养和分析 

在振荡培养箱(转速：170转/分钟，振荡直径：2.5cm)中37℃下使用含50mL培养基的具有不漏气丁基橡皮塞的100mL血清瓶在复合培养基中厌氧生长种子培养物。用1mL的WCB(实施例2)在无菌条件下厌氧进行第一种子培养的接种。接种后，立即用具有约0.8bar的超压的纯CO₂替换需氧气体大气。接种8小时后，将2ml的第一种子接种物离心并在接种至第二种子培养的100mL血清瓶中之前，使用含2g/L(NH₄)₂SO₄、0.4g/L CaCl₂＊2H₂O、0.4g/L MgCl₂＊6H₂O、2g/L NaCl和6g/L K₂HPO₄的的无菌洗涤溶液洗涤三次。 

如第一种子培养所述，在再次使用2mL的第二种子培养物接种主培养物之前，第二种子培养的温育进行20小时，以接种主要培养物，将其再温育20小时。为了测定基本化合物或刺激化合物，在第二种子培养和主培养中省略了目的维生素或氨基酸。如实施例1中描述通过HPLC测定葡萄糖消耗和琥珀酸形成。 

3.结果 

结果概括于表16中。观察到省略生物素和硫胺素HCl的培养基不维持生长和琥珀酸产生。因此显示生物素和硫胺素HCl是DD1生长的必需化合物。低于0.6mg/L的生物素浓度对于DD1的生长是足够的。由于省略半胱氨酸导致了与含半胱氨酸对照中相似的琥珀酸产生，发现氨基酸半胱氨酸对于DD1的生长不是必需的。 

与这些结果不同，生物素被描述为不是曼海姆产琥珀酸菌生长必需但是具有刺激作用，而半胱氨酸是必需的(Song等，2008)。硫胺素HCl对于两种生物都是必需的。预期半胱氨酸原养型菌株具有用于琥珀酸产生的更贫乏且廉价的生产培养基。 

表16：在合成培养基中生长的DD1的葡萄糖消耗和琥珀酸产生 

  生长条件   葡萄糖消耗[g/L]   琥珀酸产生[g/L]   完全合成培养基   49.93   30.35   无生物素的合成培养基   0.8   0.08   无硫胺素HCl的合成培养基   6.27   0.81   无半胱氨酸的合成培养基   48.88   30.01

实施例14：DD1菌株的甘油代谢 

使用以下优化培养基和培养条件进一步分析在甘油作为碳源的情况下菌株DD1的生产率。 

1.培养基制备和培养 

DD1以下述方式生长。在BHI琼脂平板(Becton Dickinson)上将来自冷冻贮存液的细胞划线。刮下细胞并在新鲜BHI培养基中悬浮并在37℃下厌氧血清瓶中温育5.5小时。使用100mL血清瓶将细胞接种至含表17中所述化合物的培养基中。600nm处的起始OD为0.1(在1mL通径(path)中测定)。将培养基组分1-7一起高压灭菌，在血清瓶中将化合物8高压灭菌，将化合物9和10分别高压灭菌并加入到最终培养基中。用CO₂经丁基橡皮塞向血清瓶中至少喷洒3次，并在CO₂超压为0.8bar时停止。在37℃和200转/分钟下温育血清瓶。24小时后，打开血清瓶，并如实施例1中描述通过HPLC测定代谢物。 

表17：培养基组分 

表18：实施例14的结果 

^c培养时间。 

^d甘油消耗。 

^e琥珀酸、甲酸和醋酸形成。 

^f琥珀酸的空间时间产率和产率。 

^g每克副产物甲酸(FA)和醋酸(AA)的g/L琥珀酸比率 

2.结果 

如表18中描述获得以下结果。24小时内DD1从28.4g/L甘油产生35.3g/L琥珀酸，使得空间时间产率为每小时1.47g/L琥珀酸，其优于其他记录的甘油代谢实例(Lee等2001)。如果获得1M甘油和1M CO₂向1M琥珀酸的循环，1.24g/g的产率接近于描述的每克甘油1.29g琥珀酸的理论产率(Song和Lee，2006)。 

实施例15：从甘油和麦芽糖中产生琥珀酸盐 

测定了在两种碳源存在的情况下DD1的生产率。DD1在二糖麦芽糖和甘油同时存在的情况下生长。 

1.培养基制备和培养 

在BHI琼脂平板(Becton Dickinson)上将来自冷冻贮存液的细胞划线。刮下细胞并在新鲜BHI培养基中悬浮并在37℃下厌氧血清瓶中培养5.5小时。培养基描述于表19中。使用200mL的血清瓶。以0.1的起始OD接种细胞(用pharmacia光度计在600nm处1mL通径中测定)。用CO₂经丁基橡皮塞向血清瓶喷洒至少3次，并在CO₂超压为0.8bar时停止。在37℃和200转/分钟下温育血清瓶。 

表19：实施例15的培养基制备 

化合物                    [g/L]浓度 

Maltose＊H₂O               22 

甘油                       56.82 

Bacto酵母提取物            10 

(NH₄)₂SO₄                  2 

CaCl₂＊2H₂O                0.2 

MgCl₂＊6H₂O                0.2 

NaCl                       2 

K₂HPO₄                     3 

NaHCO₃                     8.4 

MgCO₃                      50 

防泡剂聚丙二醇1200         0.1 

用2mL冷冻培养物接种种子培养物，在振荡培养室中(转速：160转/分钟，振荡直径：2.5cm)37℃下在含50mL培养基的200mL带有不漏气丁基橡皮塞的血清瓶中厌氧生长。用具有约0.8bar超压的纯CO₂喷洒血清瓶。培养8小时后，用50mL接种发酵罐来在含1L培养基的发酵罐中开始培养，已向所述培养基通入CO₂来确保无氧条件。培养温度维持在37℃并且pH值为6.5，培养基中除缓冲液MgCO₃外不添加碱(base)。将CO₂气流调整到0.2vvm。将搅拌速度调整到300转/分钟。如实施例1 中描述通过HPLC测定麦芽糖和甘油消耗以及SA和副产物的形成。细胞在37℃生长，并通过取样并加入1M HCl溶解残留的MgCO₃来测定生物质。溶解MgCO₃后，用水洗涤细胞并通过冻干干燥。通过称重测定干生物重。 

结果： 

结果概括于表20中。在16小时温育中，DD1消耗了36.5g/L甘油和11.2g/L麦芽糖，并且形成了57.54g/L琥珀酸、3.41g/L醋酸和3.7g/L甲酸。用DD1获得的琥珀酸的空间时间产率为3.4g/(L h)，其明显高于之前报道的菌株MBEL55E和产琥珀酸厌氧螺菌的产率，并优于文献中描述的其他菌株(Lee等，2002b，Lee等，2001，Song和Lee，2006)。 

对甘油和麦芽糖总量而言，测定琥珀酸产率为每克碳源1.2g琥珀酸。该产率也优于文献中描述的菌株(Lee等，2002b，Lee等，2001，Song和Lee，2006)。 

3.7g/(L h)的琥珀酸空间时间产率优于文献中描述的菌株(Song等，2006)。 

此外发现0.77[g gDCW^-1h^-1]h的琥珀酸特定产率优于文献中描述的菌株(Song等，2006)。 

表20：实施例15的结果 

^b培养时间 

^c通过溶解MgCO₃测定的干生物量 

^d甘油或麦芽糖消耗 

^e琥珀酸、甲酸和醋酸的形成 

^f每g琥珀酸空间时间产率(L＊h) 

^g每克底物(麦芽糖和甘油总量)g琥珀酸产率 

^h特定产率：每小时每克生物量(细胞干重)g琥珀酸 

实验总结： 

1.本发明菌株DD1具有非常有前途的特征： 

-基于甘油的具有吸引力的生产率参数(SA值：高达57g/L，3.4g/(Lh)琥珀酸的空间时间产率，0.77g/(gDCW h)琥珀酸的特定生产率，及消耗的高达1.24g/g碳的碳产率)。 

-耐受葡萄糖和甘油水平分别为至少75g/L和70g/L。 

-D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖可有效地转化为SA，说明生物精炼方法用于SA产生的适合性。 

-甘油，尤其是来自生物柴油机工厂的未纯化材料，也足以用于SA产生；产率空间时间产率特定生产率和产物/副产物比率比D-葡萄糖和其他糖类显著更高且更好。 

-NH₃/NH₄OH对于pH调节是耐受的，因此琥珀酸和/或琥珀酸铵盐的产生是可能的。 

-D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖可有效地转化为SA，说明说明生物精炼方法用于SA产生的适合性。 

-甘油，尤其是来自生物柴油机工厂的未纯化材料，也足以用于SA生产；产率和产物/副产物比率比D-葡萄糖和其他糖类显著更高。 

-单独碳源的组合可有效地转化为琥珀酸。 

-好氧细胞生长是可能的，其对于实验室中菌株的常见操作，尤其是对于进一步的菌株开发是个明显的优势。 

-在没有生产率损失的情况下基本上改善了培养基。 

结论： 

1.该菌株具有产生琥珀酸和/或琥珀酸盐，例如铵盐(其可以转化为THF/BDO/GBL和吡咯酮)的极大潜力。 

2.产生用于单体应用的琥珀酸是另一个具有吸引力的选项。 

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在本发明上下文中，细菌菌株DD1于2006年8月11日以保藏号DSM18541保藏在DSMZ。 

 [0001] 

与保藏的微生物或其它生物材料有关的声明 

(PCT细则第13条之2) 

[0005] 

PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印) 

序列表

<110>巴斯夫欧洲公司

 

<120>巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的羧酸产生成员

 

<130>M/47282

 

<160>2

 

<170>PatentIn版本3.3

 

<210>1

<211>1517

<212>DNA

<213>巴斯德氏菌属物种(Pasteurella sp.)

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1517)

<223>16S rDNA

 

<400>1

tttgatcctg gctcagattg aacgctggcg gcaggcttaa cacatgcaag tcgaacggta   60

gcgggaggaa agcttgcttt ctttgccgac gagtggcgga cgggtgagta atgcttgggg  120

atctggctta tggaggggga taacgacggg aaactgtcgc taataccgcg taatatcttc  180

ggattaaagg gtgggacttt cgggccaccc gccataagat gagcccaagt gggattaggt  240

agttggtggg gtaaaggcct accaagccga cgatctctag ctggtctgag aggatgacca  300

gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg  360

cacaatgggg ggaaccctga tgcagccatg ccgcgtgaat gaagaaggcc ttcgggttgt  420

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<210>2

<211>3008

<212>DNA

<213>巴斯德氏菌属物种

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3008)

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<400>2

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