一种利用外源大豆异黄酮缓解大豆幼苗盐害的方法

摘要

本发明公开了一种利用外源大豆异黄酮缓解大豆幼苗盐害的方法，包括：（1）用DMSO溶解大豆异黄酮，配置成含1%DMSO的大豆异黄酮水溶液，浓度不大于1.0mg/L；（2）用大豆异黄酮水溶液浸大豆种子，恒温箱25℃，浸种10h后置于发芽床上避光催芽；（3）取发芽苗播于盛有石英砂的具孔塑料杯中，置于盛有1/2Hoagland营养液的周转箱中，光照培养，营养液每2~3d更换一次；（4）待第1对真叶长出时，移苗至具孔的泡沫板上，在盛有用1/2Hoagland营养液配制的100~130mmol/L NaCl溶液的周转箱中进行培养，观察幼苗生长状况和测定叶面积；并在处理6d后，分为根、茎、叶三部分取样，采用HPLC法分别测定其大豆异黄酮含量。该方法可增强大豆幼苗的耐盐性，有效缓解大豆幼苗的盐害，对耐盐性弱的大豆材料效应更明显。

说明书

技术领域

本发明属于农作物耐逆调控新技术领域，涉及一种缓解大豆幼苗盐害的方法，具体涉及一种利用外源大豆异黄酮缓解大豆幼苗盐害的方法。

背景技术

大豆异黄酮（soybean isoflavones）是从大豆籽料中提取分离出的具有典型异黄酮类化合物结构的一类活性物质，是大豆中最引人注目的功能成分之一。大量的研究表明，大豆异黄酮具有预防癌症、心血管疾病和骨质疏松症、抗氧化和减轻妇女更年期综合症等重要生理功能，因而引起了学术界的广泛关注，成为世界各国科学家研究的热点之一（宋冰等，2008）。

大豆异黄酮代谢是大豆等豆科植物中的主要次生代谢途径，大豆异黄酮能在某些豆科植物抵抗逆境过程中发挥多种重要的生态作用，如避免紫外辐射的伤害（Bohm，1998），在植物的地上部，大豆异黄酮可在植物受到病源侵染时诱导合成，以抵抗植物病原微生物的侵袭，是具有广谱抗菌活性的植物保护素（Harborne et a1.，1976；Adesanya et a1.，1986；Dixon，2001），对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用（Lane et a1.，1985）；在地下部，豆科植物根系分泌异黄酮类化合物对根瘤菌有趋化作用，还是根瘤菌结瘤基因的诱导物质（Kosslak et a1.，1987；Hirsch，1992；Tahara 和 Ingham，2000）。当植物氮素缺乏时，合成异黄酮的基因会被诱导表达，从而产生异黄酮类物质作为根瘤菌的信号分子促使根瘤的形成（Subramanian et al.，2004）。

盐胁迫是植物遭遇逆境的一种，大豆异黄酮代谢可能与植物适应盐渍环境有关。通过比较耐盐型和盐敏感型大豆中的主要次生代谢物发现，大豆异黄酮和大豆皂苷在这两种类型的大豆中有很大区别，可以利用大豆异黄酮和大豆皂苷指标来鉴定大豆的耐盐性（Wu et al.，2008）。耐盐野生大豆种子中大豆异黄酮含量远高于当地同期收获的不耐盐栽培大豆品种，而且在可控的栽培条件下，一定浓度的盐渍条件有促进野生大豆籽粒中大豆异黄酮积累的作用，对于栽培大豆的大豆异黄酮形成则有抑制作用（周三等，2007）。在非豆科植物中，通过外施大豆异黄酮也能改善某些逆境条件下如酸雨和干旱胁迫下植物的生理指标，减轻逆境的伤害作用（叶梅荣等，2008）。然而，内、外源大豆异黄酮与大豆耐盐性之间的关系并不明确，相关的应用方法或技术，如通过外源大豆异黄酮浸种处理的方式，研究其对大豆植株耐盐性的影响或对盐害的生理效应，经检索目前未见这方面的报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种利用外源大豆异黄酮缓解大豆幼苗盐害的方法，以使大豆幼苗具有较高的耐盐性，有效缓解大豆幼苗盐害。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用外源大豆异黄酮缓解大豆幼苗盐害的方法，包括以下步骤：

（1）用DMSO溶解大豆异黄酮，配置成含1%（V/V）DMSO的大豆异黄酮水溶液，浓度不大于1.0 mg/L

（2）用大豆异黄酮水溶液浸大豆种子，恒温箱25℃，浸种10 h后置于发芽床上避光催芽；

（3）取发芽苗播于盛有石英砂的具孔塑料杯中，置于盛有1/2 Hoagland营养液的周转箱中，光照培养，营养液每2~3d更换一次；

（4）待第1对真叶长出时，移苗至具孔的泡沫板上，在盛有用1/2 Hoagland营养液配制的100~130mmol/LNaCl溶液的周转箱中进行培养，观察幼苗的生长情况，拍照并测定其叶面积；处理6d后，分为根、茎、叶三部分取样，采用HPLC法分别测定其大豆异黄酮含量；

其中，大豆异黄酮水溶液为大豆苷溶液或染料木苷溶液。大豆种子为耐盐性较弱的栽培大豆品种N23674品种，耐盐滩涂野大豆BB52种群及其经逐代耐盐性筛选而获得的杂交后代4076株系。

步骤（1）中，含1% DMSO的大豆异黄酮水溶液的浓度为0.01 mg/L。

大豆籽粒中含量较多的两种大豆异黄酮组分为大豆苷和染料木苷，而大豆苷元和染料木素含量较少。苗期耐盐系数是大豆耐盐性鉴定的重要指标之一，耐盐系数值越大，表示耐盐性越强。把籽粒中大豆异黄酮含量与相应材料幼苗的耐盐系数作相关性分析，其相关系数为0.696，显示两者间具有极显著正相关关系。大豆异黄酮也是耐盐型和盐敏感型大豆中具有显著差异的主要次生代谢物之一。因此，大豆异黄酮可作为大豆耐盐性鉴定的参考指标之一，通过测定籽粒中大豆异黄酮含量，无需发芽或苗期培养，即可对大量种质进行批量快速的耐盐性筛选和鉴定。

有益效果：与现有的大豆幼苗相比，本发明的利用外源大豆异黄酮浸种处理缓解大豆幼苗盐害的方法具有的突出优点，包括：（1）操作简便、成本低廉、缓解效应明显；（2）发现内源大豆异黄酮含量与大豆耐盐性有极显著正相关性，通过测定籽粒中大豆异黄酮组分与含量，无需发芽或苗期培养，即可对大量种质进行批量快速的耐盐性筛选和鉴定，能作为大豆耐盐性鉴定的参考指标之一；（3）在浸种时外源添加大豆苷或染料木苷，即使浓度低至0.01 mg/L时，也能有效缓解盐胁迫对大豆幼苗生长的抑制作用，效果显著，对耐盐性相对较弱的栽培大豆品种效果更明显，在实际生产应用过程中，能够有效节约成本，具有一定的实用性。

附图说明

图1是N23674、4076、BB52用不同浓度的大豆苷或染料木苷溶液浸种后在100 mmol/L NaCl胁迫下生长的幼苗；其中A、B、C、D分别代表0、0.01、0.1、1 mg/L大豆苷或染料木苷溶液浸种处理，E代表无大豆苷或染料木苷浸种及盐胁迫处理；

图2是不同浓度大豆苷溶液浸种后于100 mmol/L NaCl胁迫下N23674生长的幼苗叶面积变化图；D表示大豆苷溶液，浓度分别为0、0.01、0.1和1mg/L， Cotrol为对照；

图3是不同浓度大豆苷溶液浸种后于100 mmol/L NaCl胁迫下4076生长的幼苗叶面积变化图；D表示大豆苷溶液，浓度分别为0、0.01、0.1和1mg/L，Cotrol为对照；

图4是不同浓度大豆苷溶液浸种后于100 mmol/L NaCl胁迫下BB52生长的幼苗叶面积变化图；D表示大豆苷溶液，浓度分别为0、0.01、0.1和1mg/L，Control为对照；

图5是不同浓度染料木苷溶液浸种后于100 mmol/LNaCl胁迫下N23674生长的幼苗叶面积变化图；G表示染料木苷溶液，浓度为0、0.01、0.1和1 mg/L， Cotrol为对照；

图6是不同浓度染料木苷溶液浸种后于100 mmol/LNaCl胁迫下4076生长的幼苗叶面积变化图；G表示染料木苷溶液，浓度为0、0.01、0.1和1 mg/L，Control为对照；

图7是不同浓度染料木苷溶液浸种后于100mmol/LNaCl胁迫下BB52生长的幼苗叶面积变化图；G表示染料木苷溶液，浓度为0、0.01、0.1和1 mg/L，Control为对照；

图8是大豆苷（D）和染料木苷（G）浸种（0.01 mg/L）处理后，盐胁迫下栽培大豆N23674幼苗中大豆异黄酮含量图；

图9是大豆苷（D）和染料木苷（G）浸种（0.01 mg/L）处理后，盐胁迫下野生大豆BB52幼苗中大豆异黄酮含量图；

图10是大豆苷（D）和染料木苷（G）浸种（0.01 mg/L）处理后，盐胁迫下杂交后代4076幼苗中大豆异黄酮含量图；

图11是材料籽粒中大豆异黄酮含量表图，表中，同一列不同字母表示P＜0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的材料和分析方法如下：

材料：以耐盐性不同的代表性栽培大豆品种N23674（江苏溧水，耐盐性较弱）和滩涂野大豆种群BB52（山东垦利，耐盐性强）及其杂交后代F5代株系（4013、4035、4076和4111等）为试验材料。各材料籽粒中大豆异黄酮含量如图11所示。

分析方法：用高效液相色谱法（HPLC）测定其籽粒中大豆异黄酮含量；籽粒中大豆异黄酮采用温和水解法提取，以高效液相色谱技术（HPLC）检测（王松等，2005）。标准品大豆苷（Daidzin）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein）纯度≥99%，样品根据标样的出峰时间定性，根据峰面积定量。大豆异黄酮总量为上述4种大豆异黄酮含量之和。统计分析测量结果，并应用SPSS软件中的二元定距变量相关分析法将大豆异黄酮含量与相应材料幼苗耐盐系数作相关性分析。

实施例1 

分别称取适量的大豆苷和染料木苷，先以少量DMSO溶解，最终配制成含1%（V/V）DMSO的大豆苷溶液和染料木苷溶液，浓度分别为0.01 mg/L、0.1 mg/L和1.0 mg/L。取大豆种子，用上述不同浓度的大豆苷溶液、染料木苷溶液和1%（V/V）DMSO溶液分别浸种，恒温箱25℃，10h后催芽。取出以1%（V/V）DMSO溶液浸种的一半种子，用去离子水催芽（Control），另一半种子用100 mmol/L NaCl溶液催芽（NaCl单独处理），其它处理均是用100 mmol/L NaCl溶液催芽。各处理选取发芽一致者播于盛有石英砂的具孔塑料杯中。除对照置于盛有1/2 Hoagland营养液的周转箱中，其余处理均置于含有100 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland营养液的周转箱中。在适宜的光照和温度下培养，处理液每2~3d更换一次。观察幼苗的生长情况，拍照并计算叶面积形态指标。如图1所示，从大豆幼苗生长外观上即可看出，100 mmol/L NaCl的胁迫下，N23674、4076和BB52的幼苗生长均受到抑制，而经过大豆苷或染料木苷浸种处理后，栽培大豆N23674品种和杂交后代4076株系幼苗生长所受的抑制作用均得到明显缓解，野大豆BB52种群此效应不明显。叶面积指标分析结果如图2、图3、图4、图5、图6和图7所示，表明大豆苷或染料木苷三个处理浓度之间的缓解效果多未达到显著差异水平，但从生产应用过程中节约成本的角度，优选最低浓度进行。

实施例2

根据实施例1的结果，选择0.01 mg/L的大豆苷溶液和染料木苷溶液进行浸种处理，每种材料的种子分别用1%（V/V）DMSO溶液、0.01 mg/L的大豆苷溶液、0.01 mg/L的染料木苷溶液于25℃恒温箱内浸种10h，然后置于发芽床上避光催芽，选取发芽一致者播于盛有石英砂的具孔塑料杯中，置于盛有1/2 Hoagland营养液的周转箱中，适宜的光照和温度下培养，处理液每2~3d更换一次。待第1对真叶长出时，移苗至具孔的泡沫板上，在盛有1/2 Hoagland营养液的周转箱中进行水培。当幼苗长至第1片复叶展开时，将1% DMSO溶液浸种处理的材料分成两组，一组为对照（Control，1/2 Hoagland营养液），另一组为NaCl单独处理（NaCl，用1/2Hoagland营养液配制的130 mmol/L NaCl溶液），其它的均用1/2 Hoagland营养液配制的130 mmol/L NaCl溶液进行水培，大豆苷浸种的处理命名为NaCl+D，染料木苷浸种的处理命名为NaCl+G。营养液或处理液每2d更换1次，处理6d后，分为根、茎、叶三部分取样，采用HPLC法分别测定其大豆异黄酮含量。

盐胁迫下，大豆幼苗组织中的大豆异黄酮含量较对照有明显增加，而两种大豆异黄酮外源浸种处理则可使大豆异黄酮含量增加得更高，在栽培大豆N23674品种和杂交后代4076株系幼苗上表现更为明显，如图8、图9和图10所示。这说明盐胁迫下和外源大豆异黄酮浸种处理后，均能通过提高大豆幼苗的内源大豆异黄酮水平，以适应盐胁迫或缓解盐害。