用于治疗与血管发生相关的疾病和病症的针对血管生成素/Tie系统的氨基酸序列和包括其的多肽

摘要

本发明涉及针对来自血管生成素/Tie家族的组的蛋白的氨基酸序列，以及涉及包括一种或多种所述氨基酸序列或基本上由一种或多种所述氨基酸序列组成的化合物或构建体，且特别是蛋白和多肽，所述来自血管生成素/Tie家族的组的蛋白诸如Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl12，Angptl13，Angptl14，Angptl15，Angptl16。

说明书

本发明涉及针对来自血管生成素(Angiopoietin)/Tie家族的组的蛋白 的氨基酸序列，以及涉及包括一种或多种所述氨基酸序列或基本上由一种 或多种所述氨基酸序列组成的化合物或构建体，且特别是蛋白和多肽，所 述来自血管生成素/Tie家族的组的蛋白诸如Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，Angptl6。

本发明还涉及编码所述氨基酸序列和多肽的核酸(在本文中还称为 “本发明的核酸”或“本发明的核苷酸序列”)；制备所述氨基酸序列和 多肽的方法；表达或能够表达所述氨基酸序列或多肽的宿主细胞；包括所 述氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主细胞的组合物，且特别是药物组合 物；以及所述氨基酸序列或多肽、核酸、宿主细胞和/或组合物的应用， 特别是用于预防、治疗或诊断目的，诸如本文所提到的预防、治疗或诊断 目的的应用。

本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将从本发明的进一步描述 中变得清楚。

血管生成素1-4(Ang1-Ang4)组成作用为Tie2配体的生长因子家族， 所述Tie2为主要在内皮细胞中表达的受体酪氨酸激酶(RTK)。Angs/Tie2 信号传导参与多步血管发生，诸如现有血管的去稳定化和内皮细胞迁移 (Bouis等2006)。已表明Ang1和4作用为促进血管结构完整性的专性激 动剂，而Ang2和Ang3作用为环境依赖性(context-dependent)拮抗剂或 激动剂。尽管与Tie2具有结构同源性，已知的Angs中没有一种结合称为 Tie1的另一种RTK，尽管一些研究表明Tie1在血管发育中的基本作用 (Eklund L.，Olsen B.R.Tie receptors and their angiopoietin ligands are  context-dependent regulators of vascular remodeling.(Tie受体及其血管生成 素配体是血管重建的环境依赖性调控剂)Experimental Cell Research(实 验细胞研究)(2006)312：630-641)。基于其与Angs的结构相似性，已经 鉴定了6种血管生成素样蛋白(Angptls)。有趣地是，尽管Angptls不结合 血管生成素受体Tie2，但是这些蛋白还通过调控内皮细胞的存活和迁移而 在血管发生中起作用(Oike Y.，Akao M.，Kubota Y.，Suda T. Angiopoietin-like  proteins：potential new targets for metabolic syndrome therapy(血管生成素样 蛋白：用于代谢综合征治疗的潜在的新靶标).TRENDS in Molecular  Medicine(分子医学趋势)(2005).11：473-479；Bouis D，Kusumanto Y，Meijer C，Mulder NH，Hospers GAP.A review on pro-and anti-angiogenic factors as  targets of clinical intervention(作为临床干涉的靶标的促血管生成和抗血管 生产因子的综述).Pharmalogical Research(药学研究)53(2006)89-103，综 述)。失控的血管发生导致多种恶性病，局部缺血(ischemic)，炎症 (inflammatory)，传染性和免疫病症(Carmeliet P.Angiogenesis in health  and disease(在健康和疾病中的血管发生).Nature Medicine(自然医学) 9(2003)653-660)，并且因此，Tie受体，即Angs和Angptls的调控可能 具有很多令人感兴趣的潜在的治疗性应用。

Tie受体是享有高度同源性的内皮特异性的RTKs。两种受体Tie1和 Tie2的细胞外区，具有33％的相似性，包含一个免疫球蛋白样环，3个 EGF-样结构域，第二Ig-样环，和3个III型纤连蛋白重复。两种受体的细 胞质区，呈现76％的相似性，包含酪氨酸激酶结构域，其包括多个磷酸化 位点和蛋白质相互作用位点(Thurston G.Role of Angiopoietins and Tie  receptor tyrosine kinases in angiogenesis and lymphangiogenesis(血管生成素 和Tie受体酪氨酸激酶在血管发生和淋巴管发生中的作用).Cell Tissue Res (细胞组织研究)(2003)314：61-68；Fiedler U.，Augustin H.G.Angiopoietins： a link between angiogenesis and inflammation(血管生成素：血管发生和炎 症之间的联系).TRENDS in Immunology(免疫学趋势).(2006) 27：552-558)。已经研究了在与激动剂Angs结合时通过Tie2的二聚体化和 自磷酸化作用的信号传导，并且结果表明，该主要信号传导途径包括磷脂 酰肌醇3’激酶(phosphatidylinositol 3’kinase)的激活(Eklund和Olsen，2006， 同前所述)。此外，从本文的进一步公开内容中清楚的是，并且取决于它 们所针对的Tie和它们的所需的(治疗性)作用，本发明的氨基酸序列、 纳米抗体和多肽可以作用为Tie，例如Tie2和/或与其相关的生物学功能、 途径、机制、作用、信号传导或反应的(完全或部分)激动剂，(完全或 部分，和竞争性或非竞争性)拮抗剂或作用为逆激动剂。它们可以以不可 逆的方式但是优选以可逆的方式作用。

Angs包含氨基端血管生成素-特异性结构域，其后是卷曲螺旋结构域、 接头肽和羧基端纤连蛋白同源结构域。纤连蛋白同源结构域负责受体结 合，血管生成素单体的二聚体化需要卷曲螺旋结构域，并且短的氨基端区 域形成环样结构，所述环样结构使二聚体聚集成Tie2激活必需的不同大 小的多聚体(Eklund和Olsen，2006，同前所述)。人Ang1与小鼠Ang1享有 约97％的氨基酸序列同一性，而人和小鼠Ang2仅享有85％的氨基酸序列 同一性。小鼠和人Ang2与它们的Ang1同系物60％相同。在人Ang4的 情形中，其分别与人Ang1、人Ang2和小鼠Ang3享有45％、47％和54％ 的氨基酸序列同一性。与Angs结构非常相似，Angptls包含与在Angs中 存在的那些相似的卷曲螺旋结构域和纤连蛋白样结构域。

Tie，Angs和Angptls的列表：(Bouis等.，2006；Eklund和Olsen，2006；Oike 等.，2005，同前所述)

Tie-家族

Tie1

Tie2

Angs-家族

Ang1

Ang2

Ang3

Ang4

Angptls-家族

Angptl1

Angptl2

Angptl3

Angptl4

Angptl5

Angptl6

血管发生在数种病理过程中起主要作用，所述病理过程如肿瘤血管化 (tumour vascularisation)，糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy)，银屑 病(psoriasis)和类风湿性关节炎(reumathoid arthritis)，其中广泛表达 促血管生成的血管生成素和抗血管生成的血管生成素以及Tie受体(Bach  F.，Uddin F.J.，Burke D.Angiopoietins in malignancy(恶性病中的血管生成 素).EJSO(2007).33：7-15；Pandya N.M.，Dhalla N.S.，Santani D.D. Angiogenesis-a new target for future therapy(血管发生-未来治疗的新靶 标).Vascular Pharmacology(血管药理学)(2006)44：265-274；Carmeliet， 2003，同前所述)。正在开发多种靶向Tie和血管生成素的抗血管生成因子。 已经报道对这些血管发生-相关蛋白的表达和抑制的调控通过抑制肿瘤血 管发生而引起肿瘤生长和转移的减少(Bach等.，2007，同前所述；Onliner J. 等.，Suppression of angiogenesis and tumor growth by selective inhibition of  angiopoietin-2(通过选择性抑制血管生成素-2而抑制血管发生和肿瘤生 长).Cancer Cell(癌症细胞)(2004)，6：507-516；Bouis等.2006，同前所述)。 由于Ang2是环境依赖性的，所以Ang2的作用不那么清楚。似乎在非病 理情形功能中，Ang2作用为拮抗剂并且Ang1∶Ang2的比率是1∶1，但是 在具有肿瘤发生的恶性病中，Ang2的表达增加。

此外，在治疗缺血性疾病中，促血管生成治疗可能是有利的。

本发明的多肽和/或组合物通常可以用来调控，且特别是用来抑制和/ 或防止血管生成素-Tie相互作用，并且特别是血管生成素配体(Ang 1-4) 与受体Tie1和/或Tie2的结合，并且因此调控、特别是抑制或预防由所述 相互作用介导的信号传导，以调控其中涉及配体和/或靶标的生物学途径， 和/或调控与所述信号传导或这些途径相关的生物学机制、反应和作用。 类似地，血管生成素样配体(Angptl-Angptl6)相互作用可以被本发明的多 肽和/或组合物破坏。

同样地，本发明的多肽和组合物可以用于预防和治疗与血管发生相关 的疾病和病症。通常，“所述与血管发生相关的疾病和病症”可以定义为 这样的疾病和病症，即，所述疾病和病症分别可以通过向需要其的受试者 (即，患有所述疾病或病症或至少其一种症状和/或处于易患或发展所述 疾病或病症的危险中)适当施用本发明的多肽或组合物(且特别是其药物 活性量)和/或针对血管生成素/Tie系统或其中涉及所述系统的生物学途径 或机制的已知的活性成分(且特别是其药物活性量)而进行预防和/或治 疗。基于本文的公开内容，专业人员将清楚所述疾病和病症的实例，并且 例如，包括下述疾病和病症：

癌症与血管生成素：

-Bach F.，Uddin F.J.，Burke D.

Angiopoietins in malignancy(恶性病中的血管生成素).EJSO(2007). 33：7-15.

癌症与Tie受体：

-Blume-Jensen P和Hunter T.

Oncogenic kinase signaling(致癌激酶信号传导).Nature(自然)(2001).44： 355-365.

糖尿病视网膜病与血管生成素：

-Patel J.I.，Hykin P.G.，Gregor Z.J.，Boulton M.和Cree I.A.

Angiopoietin concentrations in diabetic retinopathy(糖尿病视网膜病中的血 管生成素浓度).Br.J.Ophthalmol(英国眼科学杂志)(2005).89：480-483.

类风湿性关节炎与Tie2和血管生成素：

-DeBusk L.M.，Chen Y.，Nishishita T.，Chen J.，Thomas J.W.，Lin P.C.

Tie2 receptor tyrosine kinase，a major mediator of tumor necrosis factor  a-induced angiogenesis in rheumatoid arthritis(Tie2受体酪氨酸激酶，类风 湿性关节炎中肿瘤坏死因子a诱导的血管发生的主要调控剂). ARTHRITIS & RHEUMATISM(关节炎和风湿病)(2003).48：2461-2471.

-Shahrara S.，Volin M.V.，Connors M.A.，Haines G.K.，Koch A.E.

Differential expression of the angiogenic Tie receptor family in arthritic and  normal synovial tissue(血管生成Tie受体家族在关节炎和正常滑膜组织中 的差异性表达).Arthritis Res(关节炎研究)(2002)4：201-208.

银屑病与Tie2和血管生成素：

Kuroda K.，Sapadin A.，Shoji T.，Fleischmajer R.，Lebwohl M.

Altered expression of angiopoietins and Tie2 endothelium receptor in psoriasis (银屑病中血管生成素和Tie2内皮受体的改变的表达).The journal of  investigate dermatology(研究皮肤病学杂志).(2001).116：713-720.

局部缺血、肾癌与Angptl4：

LeJan S.，Amy C.，Cazes A.，Monnot C.，Lamande N.，Favier J.，Philippe J.， Sibony M.，Gasc J-M.，Corvol P.，Germain S.

Angiopoietin-like 4 is a proangiogenic factor produced during Ischemia and  conventional renal cell carcinoma(血管生成素样4是在局部缺血和常规肾细 胞癌中产生的促血管发生因子).American Journal of Pathology(美国病理 学杂志)(2003)162：1521-1528.

特别地，本发明的多肽和组合物可以用于预防和/或治疗与血管发生 相关的疾病和病症，所述疾病和病症的特征在于过度和/或不需要的血管 产生或缺少血管产生。所述病症的实例是心血管病症，癌症，糖尿病视网 膜病，伤口愈合，类风湿性关节炎，肥胖(obesity)，肺泡化(alveolarization) 和银屑病。

因此，但不限于此，例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以用来预防 和/或治疗目前正用可以调控血管发生的活性成分预防或治疗的所有疾病 和病症，诸如在上文引用的现有技术中提及的那些及其它。还考虑本发明 的多肽可以用来预防和/或治疗目前正研发、已经提议或将来将提议或研 发使用所述活性成分治疗的所有疾病和病症。另外，考虑由于本文进一步 所述的其有利的特性，所以本发明的多肽可以用于预防和治疗除正用或将 提议或研发用这些已知的活性成分治疗的那些疾病和病症之外的其它疾 病和病症；和/或本发明的多肽可以提供用于制备本文所述的疾病和病症 的新方法和方案。

从本文的进一步公开内容中，专业人员将清楚本发明的氨基酸序列和 多肽的其它应用和用途。

一般地，本发明的一个目的是提供药理学活性剂，以及包含其的组合 物，其可以用于诊断、预防和/或治疗癌症、糖尿病视网膜病、伤口愈合、 类风湿性关节炎、肥胖、肺泡化和银屑病以及本文提及的其它疾病和病症； 并且提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病和病症的方法，所述方法包 括施用和/或使用所述试剂和组合物。

具体地，本发明的一个目的是提供较本领域目前所用的和/或已知的 的试剂、组合物和/或方法具有某些优点的所述药理学活性试剂、组合物 和/或方法。这些优点将从下文进一步的描述中变得清楚。

更特别地，本发明的一个目的是提供可以用作药理学活性试剂的治疗 性蛋白，以及包含其的组合物，其用于诊断、预防和/或治疗癌症、糖尿 病视网膜病、伤口愈合、类风湿性关节炎、肥胖、肺泡化和银屑病以及本 文提及的其它疾病和病症；并且提供用于诊断、预防和/或治疗所述疾病 和病症的方法，所述方法包括施用和/或使用所述治疗性蛋白和组合物。

因此，本发明的一个具体的目的是提供针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6(如本 文定义)，特别是针对来自温血动物的Tie2，Ang1，Ang2，Ang4或Angptl4， 更特别地是来自哺乳动物的Tie2，Ang1，Ang2，Ang4或Angptl4，并且尤其 是针对人Tie2，Ang1，Ang2，Ang4或Angptl4的氨基酸序列；并且提供包括 至少一种所述氨基酸序列或基本上由至少一种所述氨基酸序列组成的蛋 白和多肽。

特别地，本发明的一个具体的目的是提供适于温血动物、特别是哺乳 动物、更特别是人类中的预防、治疗和/或诊断应用的这样的氨基酸序列 和这样的蛋白和/或多肽。

更特别地，本发明的一个具体目的是提供这样的氨基酸序列和这样的 蛋白和/或多肽，其可以用于预防、治疗、减轻和/或诊断温血动物、特别 是哺乳动物、更特别是人类中的与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，Angptl6相关和/或由Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6介导的一种或多种疾病、病症或病况(诸如本文提及的疾病、病 症和病况)。

本发明还有一个具体的目的是提供这样的氨基酸序列和这样的蛋白 和/或多肽，其可以用于制备用于预防和/或治疗温血动物、特别是哺乳动 物、更特别是人类中的与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6相关或由其介导的一种或多 种疾病、病症或病况(诸如本文提及的疾病、病症和病况)的药物组合物 或兽医用组合物。

在本发明中，通常，这些目的通过使用本文所述的氨基酸序列、蛋白、 多肽和组合物而实现。

通常，本发明提供针对(如本发明定义)和/或可以特异性结合(如本发 明定义)Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的氨基酸序列；以及包括至少一种所述氨基 酸序列的化合物和构建体，特别是蛋白和多肽。

更特别地，本发明提供可以以本文定义的亲和力(适当测量和/或表 示为K_D-值(实际的或表观的)，K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速率和/或 k_off-速率，或备选地为IC₅₀值，如本文进步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 的氨基酸序列；以及包括至少一种所述氨基酸序列的化合物和构建体，特 别是蛋白和多肽。

特别地，本发明的氨基酸序列和多肽优选是这样的，即，它们：

-以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并 且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(K_D)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更 大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔 合常数(K_A))结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6；

和/或是这样的，即，它们：

-以10²M^-1s^-1-约10⁷M^-1s^-1，优选10³M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，更优选10⁴M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，诸如10⁵M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1的k_on-速率结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6；

和/或是这样的，即，它们：

-以1s^-1(t_1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t_1/2的几乎不可逆的复合 体)，优选10^-2s^-1-10^-6s^-1，更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1，诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的k_off速率结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6。

优选地，本发明的单价氨基酸序列(或包含仅一个本发明的氨基酸序 列的多肽)优选是这样的，即，它将以小于500nM，优选小于200nM，更 优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和力结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6。

关于本发明的氨基酸序列或多肽与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合的一些 优选的IC50值将通过本文的进一步描述和实施例变得清楚。

对于与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合，本发明的氨基酸序列通常将在其氨基酸 序列内包含一个或多个氨基酸残基、或氨基酸残基的一个或多个序列(即， 每个“序列(stretch)”包括彼此相邻或彼此紧邻的两个(或多个)氨基 酸残基，即，在该氨基酸序列的一级或三级结构上)，通过其本发明的氨 基酸序列可以与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合，因此所述氨基酸残基或氨基酸 残基的序列形成结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的“位点”(本文还称为“抗原结合 位点”)。

本发明提供的氨基酸序列优选地基本上采用分离形式(如本文所定 义)、或形成本发明的蛋白或多肽的一部分(如本文所定义)，其可以包括 一个或多个本发明的氨基酸序列或基本上由一个或多个本发明的氨基酸 序列组成，并且其可以任选地还包括一个或多个其它的氨基酸序列(全部 任选地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，并且不限于，本发明的 一个或多个氨基酸序列可以用作在这样的蛋白或多肽内的结合单位，所述 蛋白或多肽可以任选地包含可以充当结合单位的一个或多个其它的氨基 酸序列(即，针对除Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6以外的一个或多个其它靶标)，以便 分别提供单价、多价或多特异性的本发明的多肽，全如本发明所述。这样 的蛋白或多肽也可以采用基本上分离的形式(如本文所定义)。

因此，本发明的氨基酸序列和多肽优选地基本上由不通过二硫键与任 一另一氨基酸序列或链连接(但是其可以或可以不包含一个或多个分子内 二硫键。例如，已知纳米抗体----如本文所述----有时可以含有在CDR3和 CDR1或FR2之间的二硫键)的单个氨基酸链组成。然而，应该注意，一 个或多个本发明的氨基酸序列可以彼此连接和/或与其他氨基酸序列连接 (例如，通过二硫键)，以提供也可以用于本发明的肽构建体(例如，Fab’ 片段，F(ab’)₂片段，ScFv构建体，“双抗体”和其他多特异性构建体。例如， 参考Holliger和Hudson，Nat Biotechnol.(自然生物技术)2005年9 月；23(9)：1126-36的综述))。

一般地，当本发明的氨基酸序列(或包含其的化合物、构建体或多肽) 意欲施用给受试者时(例如，为了如本文所述的治疗和/或诊断目的)，优 选其是在所述受试者内天然不存在的氨基酸序列；或当它的确在所述受试 者内天然存在时，采用基本上分离的形式(如本文所定义)。

专业技术人员还应该清楚，对于药物应用，本发明的氨基酸序列(以 及包含其的化合物、构建体和多肽)优选地针对人Tie2，Ang1，Ang2，或 Ang4；而对于兽医用目的，本发明的氨基酸序列和多肽优选地针对来自 待治疗的物种的Tie2，Ang1，Ang2，Ang4或Angptl4，或至少与来自待治疗的 物种的Tie2，Ang1，Ang2，Ang4或Angptl4交叉反应。

此外，本发明的氨基酸序列可以任选地，并且除了所述至少一个针对 Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4， Angptl5，或Angptl6结合的结合位点之外，包含针对其它抗原、蛋白或靶 标结合的一个或多个其它的结合位点。

本发明的氨基酸序列和多肽的功效、以及包含其的组合物的功效可以 使用任何适合的体外测定、基于细胞的测定、体内测定和/或本身已知的 动物模型、或它们的任何组合进行检测，这取决于所涉及的具体的疾病或 病症。适当的测定和动物模型对于专业技术人员来说将是清楚的，并且例 如，包括固相受体结合和阻断测定，受体激活/失活测定，体内血管发生 测定，体内直接抗血管发生作用，脂蛋白脂肪酶(LPL)测定，体内CAM(小 鸡绒毛膜尿囊膜(chick chorioallantoric membrane))测定，体内动物模型研 究以及下述实验部分和本文引用的现有技术中使用的测定和动物模型。

并且，根据本发明，针对来自第一温血动物物种的Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 的氨基酸序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它温血动 物物种的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的交叉反应性。例如，针对人Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 的氨基酸序列和多肽可以或可以不表现出与来自一种或多种其它灵长类 物种(诸如，不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别 地，食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca  mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的交 叉反应性，和/或与来自通常用于疾病的动物模型中(例如小鼠、大鼠、 兔、猪或狗)、且特别是用于与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6相关的疾病和病症的动物 模型中的一种或多种动物物种(诸如本文提及的物种和动物模型)的Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的交叉反应性。在这一方面，对于专业技术人员应该清楚，从 药物开发观点来看，所述交义反应性，当存在时，可能具有优点，因为它 允许所述针对人Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的氨基酸序列和多肽在所述疾病模 型中被检测到。

更一般地，与来自多个哺乳动物物种的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6交叉反应的 本发明的氨基酸序列和多肽将通常有利于用于兽医应用，原因在于它将允 许在多种物种之间使用相同的氨基酸序列或多肽。因此，在本发明的范围 内还包括，针对来自一个动物物种的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的氨基酸序列和多 肽(诸如针对人Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的氨基酸序列和多肽)可以用于治 疗另一个动物物种，只要所述氨基酸序列和/或多肽的应用在待治疗的物 种中提供所需要的作用。

本发明在其最广泛意义上也不特别限于或限定于本发明的氨基酸序 列和多肽所针对的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的特异性抗原决定簇、表位、部分、 结构域、亚单位或构象(confirmation)(在适用时)。然而，通常假定并 且优选本发明的氨基酸序列和多肽优选地针对Tie2上的Ang1结合位点， 或Ang2上的Tie2结合位点----参见实验部分。因此，在一个优选的但非 限制性的方面中，本发明的氨基酸序列和多肽针对Tie2的Ang1结合位点 或Ang2的Tie2结合位点，并且如本文进一步所定义。

在适用时，本发明的氨基酸序列可以结合于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的两 个以上的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位或构象，这也在本发 明范围内。在此情况下，本发明的氨基酸序列和/或多肽结合的Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6的抗原决定簇、表位、部分、结构域或亚单位可以基本上是相同 的(例如，如果Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6包含重复的结构基序或以多聚体形 式存在)，或可以是不同的(并且在后一种情况下，本发明的氨基酸序列 和多肽可以以可能相同或不同的亲和力和/或特异性结合于Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6的所述不同的抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚单位)。此外， 例如，当Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6以活化构象存在和以无活性构象存在时，本 发明的氨基酸序列和多肽可以结合于这些构象中的任一种，或者可以结合 于这两种构象(即，以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异性)。此外， 例如，本发明的氨基酸序列和多肽可以这样地结合于Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 的构象，即，在所述构象中其与相关配体结合，可以这样地结合于Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的构象，即，在所述构象中其不与相关配体结合，或者可以结 合于所述两种构象(同样以可能是相同的或不同的亲和力和/或特异性)。

还期望本发明的氨基酸序列和多肽通常将结合于Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片 段；或至少结合于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的下面的那些类似物、变体、突变 体、等位基因、部分和片段，即它们包含与在Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6中(例如在野 生型Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6中)与本发明的氨基酸序列和多肽结合的(一 个或多个)抗原决定簇或(一个或多个)表位基本上相同的一个或多个抗 原决定簇或表位。同样地，在此情况下，本发明的氨基酸序列和多肽可以 以本发明的氨基酸序列与(野生型)Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合的亲和力和特 异性相同或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性结合于所述 类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。本发明的氨基酸序列和 多肽结合于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的一些类似物、变体、突变体、等位基因、 部分和片段而不结合于另一些，这也包括在本发明的范围内。

当Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6以单体形式存在和以一个或多个多聚体形式 存在时，本发明的氨基酸序列和多肽只结合单体形式的Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，只结合多聚体形式的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，或结合单体和多聚体形式 二者，这在本发明的范围内。同样地，在这样的情形中，本发明的氨基酸 序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列和所述多聚体形式结合的亲和 力和特异性相同或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性与单 体形式结合。

此外，当Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6可以与其他蛋白或多肽缔合以形成蛋白复合 体(例如，具有多个亚基)时，本发明的氨基酸序列和多肽与处于其非缔 合状态的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合，与处于其缔合状态的Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 结合，或与二者均结合，这在本发明的范围内。在所有这些情形中，本发 明的氨基酸序列和多肽可以以与本发明的氨基酸序列和多肽与处于其单 体和非缔合状态的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合的亲和力和/或特异性可能是相 同的或不同(即，高于或低于其)的亲和力和/或特异性与所述多聚体或 缔合的蛋白复合体结合。

此外，对于专业技术人员应该是清楚的，包含两个或更多个针对Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的氨基酸序列的蛋白或多肽可以以比相对应的一个或多个单体 氨基酸序列更高的抗体亲抗原性与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合。例如，但不 限于，包含两个或更多个针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的不同表位的氨基酸序列 的蛋白或多肽可以(并且通常将)以比不同单体的每一个更高的抗体亲抗 原性结合，并且包含两个或更多个针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的氨基酸序列的蛋 白或多肽还可以(并且通常将)以更高的抗体亲抗原性结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6的多聚体。

一般地，本发明的氨基酸序列和多肽将至少结合那些形式的Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl 1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6(包括单体、多聚体和缔合形式)，从生物学和/或治疗观点看来， 这些形式是最相关的，这对于专业技术人员将是清楚的。

使用本发明的氨基酸序列和多肽的部分、片段、类似物、突变体、变 体、等位基因和/或衍生物，和/或使用包括一个或多个所述部分、片段、 类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物或基本上由其组成的蛋白 或多肽，也在本发明的范围内，只要这些适用于本发明考虑的应用。所述 部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物通常将包含 (至少部分的)针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6结合的功能性抗原-结合位点；并且 更优选地将能够特异性结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，并且甚至更优选地能够以 如本发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为K_D-值(实际的或表观 的)，K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速率和/或k_off-速率，或备选地作为IC₅₀值，如本发明进一步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6。所述部分、片段、 类似物、突变体、变体、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限 制性实例将通过本发明的进一步描述变得清楚。还可以通过适当组合(即， 通过连接或基因融合)一个或多个(更小的)本发明所述的部分或片段而 提供本发明的其他片段或多肽。

在本发明的一个具体而非限制性方面中，其将在本发明中进一步描 述，与衍生它们的氨基酸序列相比，所述类似物、突变体、变体、等位基 因、衍生物具有增加的血清半衰期(如本发明进一步所述)。例如，可以 将本发明的氨基酸序列连接到(化学或其他方式)一个或多个延长半衰期 的基团或结构部分(诸如PEG)上，以提供具有增加的半衰期的本发明的 氨基酸序列的衍生物。

在一个具体而非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括免 疫球蛋白折叠的氨基酸序列，或可以是在适当条件(诸如生理条件)下能 够形成免疫球蛋白折叠(即，通过折叠)的氨基酸序列。其中特别参考 Halaby等，J.(1999)蛋白质工程(Protein Eng.)12，563-71的综述。优选 地，当正确折叠以形成免疫球蛋白折叠时，这样的氨基酸序列能够特异性 结合(如本发明所定义)Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6；并且更优选地能够以如本 发明所定义的亲和力(适当地测量和/或表示为K_D-值(实际的或表观的)， K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速率和/或k_off-速率，或备选地作为IC₅₀值，如 本发明进一步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6。此外，所述氨基酸序列的 部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物优选是这样 的，即，它们包括免疫球蛋白折叠或者能够在适当的条件下形成免疫球蛋 白折叠。

特别地，但不限于，本发明的氨基酸序列可以是基本上由4个构架区 (分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成 的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何适当的片段(那么其通常将包含 至少一些形成至少一个CDR的氨基酸残基，如本文进一步所述)。

本发明的氨基酸序列可以特别是免疫球蛋白序列或其适当的片段，并 且更特别地是免疫球蛋白可变结构域序列或其适当的片段，诸如轻链可变 结构域序列(例如，V_L-序列)或其适当的片段；或重链可变结构域序列 (例如，V_H-序列)或其适当的片段。当本发明的氨基酸序列是重链可变 结构域序列时，它可以是来源于常规四链抗体的重链可变结构域序列(诸 如，不限于，来源于人抗体的V_H序列)，或是来源于所谓的“重链抗体” (如本文所定义)的所谓的V_HH-序列(如本文所定义)。

然而，应该注意到，本发明不限制本发明的氨基酸序列的来源(或用 于表达其的本发明的核苷酸序列的来源)，也不限制产生或获得(或已经 产生或获得)本发明的氨基酸序列或核苷酸序列的方法。因此，本发明的 氨基酸序列可以是天然存在的氨基酸序列(来自任何适当的物种)或合成 的或半合成的氨基酸序列。在本发明的具体而非限制性方面，所述氨基酸 序列是天然存在的免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或合成的或半 合成的免疫球蛋白序列，包括但不限于“人源化的”(如本文所定义)免疫 球蛋白序列(诸如部分或完全人源化的小鼠或兔免疫球蛋白序列，并且特 别是部分或完全人源化的V_HH序列或纳米抗体)，“骆驼源化的(camelized)” (如本文所定义)免疫球蛋白序列，以及已经通过下列技术获得的免疫球蛋 白序列：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的或天然存在的免 疫球蛋白序列)，CDR嫁接，镶盖术(veneering)，组合来源于不同的免疫 球蛋白序列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及专业技术人员 公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组 合。例如，参考标准手册，以及进一步描述和本文提及的现有技术。

类似地，本发明的核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成 的或半合成的序列，并且例如，可以是通过PCR从适当的天然存在的模板 (例如，从细胞分离的DNA或RNA)分离的序列，已经从文库(并且特 别是表达文库)分离的核苷酸序列，已经通过向天然存在的核苷酸序列中 引入突变(利用任何适当的本身已知的技术，诸如错配PCR)而制备的核 苷酸序列，已经使用重叠的引物通过PCR制备的核苷酸序列，或已经利 用本身已知的DNA合成技术制备的核苷酸序列。

特别地，本发明的氨基酸序列可以是一个“单可变结构域”或多个“单 可变结构域”(以下为“多个单可变结构域”)。本发明的单可变结构域为 形成单个抗原结合单位的任何可变结构域。一般地，所述单可变结构域将 是基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为 CDR1-CDR3)组成的氨基酸序列；或是所述氨基酸序列的任何适当的片 段(然后其通常包含至少一些形成至少一个CDR的氨基酸残基，如本文进 一步所述)。所述单可变结构域和片段是最优选的，以致其包含免疫球蛋 白折叠，或者在适当条件下能够形成免疫球蛋白折叠。因此，例如，所述 单可变结构域可以包括轻链可变结构域序列(例如，V_L-序列)或其适当的片 段；或重链变结构域序列(例如，V_H-序列或V_HH序列)或其适当的片段； 只要其能够形成单抗原结合单位(即，基本上由单可变结构域组成的功能 性抗原结合单位，以致所述单抗原结合结构域不需要与另一可变结构域相 互作用形成功能性抗原结合单位，例如，如在关于例如存在于常规抗体和 ScFv片段中的可变结构域，其需要与另一可变结构域相互作用----例如， 通过V_H/V_L相互作用----来形成功能性抗原结合结构域)。

例如，所述单可变结构域可以是结构域抗体(或适于用作结构域抗体 的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适于用作单结构域抗体的氨基酸序列)， ″dAb″(或适于用作dAb的氨基酸序列)，或纳米抗体^TM(如本发明定义，并 且包括但不限于，V_HH序列)；其它单可变结构域，或其任意一种的任何适 当的片段。对于(单)结构域抗体的概括描述，也参考上文引用的现有技 术，以及EP 0 368 684。对于术语“dAb’s”，例如，参考Ward等.(Nature(自 然)1989年10月12日；341(6242)：544-6)，Holt等.，Trends Biotechnol.(生 物技术趋势)，2003，21(11)：484-490；以及例如WO 04/068820，WO 06/030220，WO 06/003388和Domantis有限公司(Domantis Ltd)的其它公 布的专利申请。还应该注意到，尽管在本发明的情形中由于它们不是哺乳 动物来源的而较不优选，单结构域抗体或单可变结构域可以来源于某些鲨 鱼物种(例如，所谓的“IgNAR结构域”，例如，参见WO 05/18629)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以是纳米抗体^TM或其适当的片段。 [注意：纳米抗体^TM(Nanobody^TM)，纳米抗体^TM(Nanobodies^TM)和纳米 克隆^TM(Nanoclone ^TM)为埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的商标。] 对于V_HH’s和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans在Reviews in  Molecular Biotechnology(分子生物技术综述)74(2001)，277-302中的综述 论文，以及参考下述作为公知背景技术引用的专利申请：Vrije Universiteit  Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor  Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司 (Ablynx N.V.)的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of  Antibodies)的WO 03/025020(＝EP 1 433 793)；以及埃博灵克斯股份有限 公司的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786， WO 06/122787和WO 06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司的其它公布 的专利申请。还参考这些申请中提及的其它现有技术，特别是在国际申请 WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引 用结合在本文中。如在这些参考文献中所述，通常，纳米抗体(特别是 V_HH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于，在一个或多个 构架序列中存在一个或多个“标志残基(Hallmark residues)”。

本发明的氨基酸序列可以特别是结构域抗体(或适于用作结构域抗体 的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适于用作单结构域抗体的氨基酸序列)， ″dAb”(或适于用作dAb的氨基酸序列)，或纳米抗体^TM(如本发明定义，并 且包括但不限于，V_HH序列)；其它单可变结构域，或其任意一种的任何适 当的片段。对于(单)结构域抗体的概括描述，也参考上文引用的现有技 术，以及EP 0 368 684。对于术语“dAb’s”，例如，参考Ward等.(Nature(自 然)1989年10月12日；341(6242)：544-6)，Holt等.，Trends Biotechnol.(生 物技术趋势)，2003，21(11)：484-490；以及例如WO 06/030220，WO 06/003388和Domantis有限公司(Domantis Ltd)的其它公布的专利申请。 还应该注意到，尽管在本发明的情形中由于它们不是哺乳动物来源的而较 不优选，单结构域抗体或单可变结构域可以来源于某些鲨鱼物种(例如， 所谓的“IgNAR结构域”，例如，参见WO 05/18629)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以是纳米抗体(如本文所定义)或其 适当的片段。[注意：纳米抗体(Nanobody)，纳米抗体(Nanobodies )和纳米克隆(Nanoclone)为埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.) 的商标。]所述针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的纳米抗体在本文也称为“本发明的 纳米抗体”。

对于纳米抗体的概括描述，参考下文的进一步描述，以及参考本文所 引用的现有技术。在这一方面，然而，应该注意到，本文描述和现有技术 主要描述所谓“V_H3种类”的纳米抗体(即，与V_H3种类的人种系序列如 DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的纳米抗体)，所述纳米抗体 形成本发明的优选方面。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上通 常涵盖任何类型的针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的纳米抗体，并且例如，还 涵盖属于所谓的“V_H4种类”的纳米抗体(即，与V_H4种类的人种系序列如 DP-78具有高度序列同源性的纳米抗体)，例如，如在埃博灵克斯股份有 限公司(Ablynx N.V.)于2006年4月14日提交的题目为“DP-78样纳米 抗体(DP-78-like Nanobodies)”的美国临时申请60/792,279中描述。

一般地，纳米抗体(特别是V_HH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特 别地特征在于，在一个或多个构架序列(同样如本文进一步所述)中存在一 个或多个“标志残基”(如本文所述)。

因此，通常，纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序 列：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互 补性决定区1-3，并且其中一个或多个标志残基如本文进一步所定义。

特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互 补性决定区1-3，并且其中所述构架序列如本文进一步所定义。

更特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互 补性决定区1-3，并且其中：

i)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104 和108的氨基酸残基中的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基；

并且其中：

ii)所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s：1-22中的至少一种氨基酸序列 具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的， 忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列SEQ ID NO’s：1-22中表示为 X)。

在这些纳米抗体中，所述CDR序列通常如本文进一步所定义。

因此，本发明还涉及这样的纳米抗体，其可以结合(如本文定义)和 /或针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6，涉及其适当的片段，以及涉及包含一种或 多种所述纳米抗体和/或适当的片段或基本上由其组成的多肽。

SEQ ID NO’s 455-501给出了多种已经针对Tie2，Ang1，Ang2，和 Ang4产生的V_HH序列的氨基酸序列。

因此，一些特别优选的本发明的纳米抗体是可以结合(如本文进一步 定义)和/或针对Tie2，Ang1，Ang2，Ang4或Angptl4的纳米抗体，并且其：

i)与SEQ ID NO’s：455-501的至少一种氨基酸序列具有至少80％的 氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目的，忽略形成CDR 序列的氨基酸残基。在这一点上，也参考表A-1，该表列出了SEQ ID NO’s： 455-501的纳米抗体的构架1序列(SEQ ID NO’s：126-172)，构架2序列 (SEQ ID NO’s：220-266)，构架3序列(SEQ ID NO’s：314-360)和构架4序 列(SEQ ID NO’s：408-454)(关于构架1序列位置1-4和27-30的氨基酸 残基，还参考下述评述。因此，为了确定氨基酸同一性程度，优选忽略这 些残基)；

并且其中：

ii)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104 和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基。

在这些纳米抗体中，CDR序列通常如本文进一步所述。

同样地，所述纳米抗体可以以任何适当的方式获得，并且来源于任何 适当的来源，并且例如，可以是天然存在的V_HH序列(即，来自于适当的 骆驼科(Camelid)物种)或合成的或半合成的氨基酸序列，包括但不限于 “人源化的”(如本文所定义)纳米抗体，“骆驼源化的”(如本文所定义)免疫球 蛋白序列(并且特别是骆驼源化的重链可变结构域序列)，以及已经通过下 列技术获得的纳米抗体：诸如亲和力成熟(例如，起始于合成的、随机的 或天然存在的免疫球蛋白序列)，CDR嫁接，镶盖术，组合来源于不同的免 疫球蛋白序列的片段，利用重叠的引物进行的PCR装配，以及专业技术人 员公知的加工免疫球蛋白序列的相似技术；或前述任一项的任何适当的组 合，这如本文进一步描述。此外，当纳米抗体包括V_HH序列时，所述纳米 抗体可以适当地被人源化，如本文进一步所述，以便提供一个或多个本发 明的进一步(部分或完全)人源化的纳米抗体。类似地，当纳米抗体包括 合成的或半合成的序列(诸如部分人源化的序列)时，所述纳米抗体可以 任选地进一步适当地被人源化，同样如本文所述，同样以便提供一个或多 个本发明的进一步(部分或完全)人源化的纳米抗体。

特别地，人源化的纳米抗体可以是如前述段落中关于纳米抗体概括定 义的氨基酸序列，但是其中存在至少一个这样的氨基酸残基(并且特别地， 在至少一个构架残基中)，所述氨基酸残基是和/或对应人源化的置换(如本 文所定义)。基于本发明公开的内容，对于专业技术人员，一些优选的、 而非限制性的人源化置换(及其适当的组合)将变得清楚。另外，或者备选 地，通过比较天然存在的V_HH序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的 人V_H序列的相对应的构架序列，可以确定其它潜在有用的人源化置换， 此后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化置换(或其组合) 引入到所述V_HH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并 且可以检测所得到的人源化的V_HH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的 容易性和水平、和/或其它需要的特性。以这种方式，通过利用有限的试 错程度，专业技术人员基于本发明公开的内容可以确定其它适当的人源化 置换(或其适当的组合)。此外，基于前述内容，纳米抗体(的构架区)可以 是部分人源化的或完全人源化的。

本发明的一些特别优选的人源化纳米抗体是纳米抗体SEQ ID NO’s： 455-501的人源化变体，其中SEQ ID NO’s：455-457，459，460，464-469 的氨基酸序列是一些特别优选的实例。

因此，本发明的一些其它优选的纳米抗体是可以阻断(如本文进一步 定义)Ang1/Tie2或Ang2/Tie2相互作用的纳米抗体，并且它们：

i)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104 和108的氨基酸残基中的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基。

按照本发明的另一个具体的方面，本发明提供多种特别适于结合Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的氨基酸残基序列(stretches)(即，小肽)。这些氨基酸残基 序列可以存在于、和/或可以结合在本发明的氨基酸序列中，特别是以它 们形成本发明的氨基酸序列的抗原结合位点(的一部分)的方式。因为这 些氨基酸残基序列首先作为针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的重链抗体的CDR 序列或V_HH序列产生(或可以基于和/或来源于所述CDR序列，如本文进 一步所述)，它们在本文中通常还可以称为“CDR序列”(即，分别称为 CDR1序列，CDR2序列和CDR3序列)。然而，应该注意到，本发明在其 最广泛意义上不限于这些氨基酸残基序列可能在本发明的氨基酸序列中 具有的特定的结构作用或功能，只要这些氨基酸残基的序列允许本发明的 氨基酸序列结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6。因此，通常，本发明在其最广泛意 义上包括能够结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的任何氨基酸序列，并且所述氨基 酸序列包括一个或多个本文所述的CDR序列，且特别是两个或多个所述 CDR序列的适当组合，其适当地通过一个或多个其它氨基酸序列彼此连 接，以致整个氨基酸序列形成能够结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的结合结构域和/ 或结合单位。然而，还应该注意到，在本发明的氨基酸序列中仅存在一个 所述CDR序列可能自身已经足以提供能够结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的本 发明的氨基酸序列，例如，同样参考WO 03/050531中所述的所谓的“加 速片段(Expedite fragments)”。

因此，在另一个具体的、但非限制性的方面中，本发明的氨基酸序列 可以是包括选自由本文所述的CDR1序列，CDR2序列和CDR3序列(或 其任意适当的组合)组成的组的至少一个氨基酸序列的氨基酸序列。具体 地，本发明的氨基酸序列可以是包括至少个抗原结合位点的氨基酸序 列，其中所述抗原结合位点包括选自由本文所述的CDR1序列，CDR2序 列和CDR3序列(或其任意适当的组合)组成的组的至少一个氨基酸序列。

一般地，在本发明的这一方面中，本发明的氨基酸序列可以是包括至 少一个氨基酸残基序列的任何氨基酸序列，其中所述氨基酸残基序列具有 与至少一种本文所述的CDR序列的序列相对应的氨基酸序列。这样的氨 基酸序列可以包括或可以不包括免疫球蛋白折叠。例如，并且不限于，这 样的氨基酸序列可以是免疫球蛋白序列的这样的适当的片段，即，其包括 至少一种所述CDR序列，但是其不够大不足以形成(完整的)免疫球蛋 白折叠(例如，同样参考WO 03/050531中所述的“加速片段”)。备选地， 所述氨基酸序列可以是适当的“蛋白构架”，其包括至少一种与所述CDR 序列对应的氨基酸残基序列(即，作为其抗原结合位点的一部分)。专业 技术人员将清楚呈递氨基酸序列的适当的构架，并且例如，包括但不限于， 基于免疫球蛋白或来源于免疫球蛋白(即，除本文已经描述的免疫球蛋白 序列之外)的结合构架，来源于蛋白质A结构域的蛋白构架(诸如 Affibodies^TM)，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白(lipocalin)， CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白(ankyrin)重复，avimers和PDZ结构 域(Binz等.，Nat.Biotech(自然生物技术)2005，卷23：1257)，和基于DNA 或RNA(包括但不限于DNA或RNA适体)的结合结构部分(Ulrich等.， Comb Chem High Throughput Screen(组合化学高通量筛选)2006 9(8)：619-32)。

同样，包括一个或多个这些CDR序列的任何本发明的氨基酸序列优 选是这样的，即，其可以特异性结合(如本发明定义)Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，并且 更特别是这样的，即，其可以以本文定义的亲和力(适当测量和/或表示 为K_D-值(实际的或表观的)，K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速率和/或k_off- 速率，或备选地为IC₅₀值，如本文进一步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6。

更特别地，按照本发明这一方面的氨基酸序列可以是包括至少一个抗 原结合位点的任何氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本文所 述的CDR1序列、本文所述的CDR2序列和本文所述的CDR3序列组成 的组的至少两种氨基酸序列，以致：(i)当第一氨基酸序列选自本文所述 的CDR1序列时，第二氨基酸序列选自本文所述的CDR2序列或本文所述 的CDR3序列；(ii)当第一氨基酸序列选自本文所述的CDR2序列时，第 二氨基酸序列选自本文所述的CDR1序列或本文所述的CDR3序列；或 (iii)当第一氨基酸序列选自本文所述的CDR3序列时，第二氨基酸序列选 自本文所述的CDR1序列或本文所述的CDR3序列。

甚至更特别地，本发明的氨基酸序列可以是包括至少一个抗原结合位 点的氨基酸序列，其中所述抗原结合位点包括选自由本文所述的CDR1 序列、本文所述的CDR2序列和本文所述的CDR3序列组成的组的至少三 种氨基酸序列，以致第一氨基酸序列选自本文所述的CDR1序列，第二氨 基酸序列选自本文所述的CDR2序列，并且第三氨基酸序列选自本文所述 的CDR3序列。CDR1，CDR2和CDR3序列的优选的组合将通过本文的进 一步描述变得清楚。专业技术人员应该清楚，所述氨基酸序列优选是免疫 球蛋白序列(如本文进一步所述)，但是，例如，其也可以是包括适于呈递 所述CDR序列的构架的任何其它氨基酸序列。

因此，在一个具体、但非限制性的方面中，本发明涉及针对Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6的氨基酸序列，其包括一种或多种选自由下列各项组成的组的氨 基酸残基序列：

a)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基

酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨基 酸差异的氨基酸序列；

d)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基 酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨基 酸差异的氨基酸序列；

g)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基 酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨基 酸差异的氨基酸序列；

或它们的任何适当的组合。

当本发明的氨基酸序列包含一个或多个b)和/或c)所述的氨基酸序列 时：

i)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，在b)和/或c)所述的这样的氨基酸 序列中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与a)所述的相对应氨基酸序列相比，b)和/或c)所述的氨基酸序列优选 地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式， b)和/或c)所述的氨基酸序列可以是来源于a)所述的氨基酸序列的氨 基酸序列。

类似地，当本发明的氨基酸序列包含一个或多个e)和/或f)所述的氨 基酸序列时：

i)与d)所述的相对应氨基酸序列相比，在e)和/或f)所述的这样的氨基酸 序列中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与d)所述的相对应氨基酸序列相比，e)和/或f)所述的氨基酸序列优选 地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式， e)和/或f)所述的氨基酸序列可以是来源于d)所述的氨基酸序列的氨 基酸序列。

此外，类似地，当发明的氨基酸序列包含一个或多个h)和/或i)所述 的氨基酸序列时：

i)与g)所述的相对应氨基酸序列相比，在h)和/或i)所述的这样的氨基酸 序列中的任何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与g)所述的相对应氨基酸序列相比，h)和/或i)所述的氨基酸序列优选 地仅包含氨基酸置换，并且没有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式， h)和/或i)所述的氨基酸序列可以是来源于g)所述的氨基酸序列的氨 基酸序列。

应该理解，前述最后一段总体上也适用于分别包括b)，c)，e)，f)，h)或 i)所述的一个或多个氨基酸序列的本发明的任何氨基酸序列。

在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的 组的一种或多种氨基酸残基序列：

i)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

ii)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；和

iii)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

或它们的任何适当的组合。

此外，优选地，在所述氨基酸序列中，至少一种所述氨基酸残基序列 形成结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的抗原结合位点的一部分。

在一个更具体的、但同样是非限制性的方面中，本发明涉及针对Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的氨基酸序列，其包括选自由下列各项组成的组的两种或多种 氨基酸残基序列：

a)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基 酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨基 酸差异的氨基酸序列；

d)SEQID NO’s：267-313的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基 酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO’s：267-3l3的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨基 酸差异的氨基酸序列；

g)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨基 酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨基 酸差异的氨基酸序列；

以致：(i)当第一氨基酸残基序列对应于a)，b)或c)所述的一种氨基酸序列 时，第二氨基酸残基序列对应于d)，e)，f)，g)，h)或i)所述的一种氨基酸序 列；(ii)当第一氨基酸残基序列对应于d)，e)或f)所述的一种氨基酸序列 时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，g)，h)或i)所述的一种氨基酸序 列；或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于g)，h)或i)所述的一种氨基酸序 列时，第二氨基酸残基序列对应于a)，b)，c)，d)，e)或f)所述的一种氨基酸 序列。

在该具体方面中，所述氨基酸序列优选地包括选自由下列各项组成的 组的两种或多种氨基酸残基序列：

i)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

ii)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；和

iii)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

以致，(i)当第一氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：173-219的一种氨 基酸序列时，第二氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：267-313或SEQ  ID NO’s：361-454的一种氨基酸序列；(ii)当第一氨基酸残基序列对应于 SEQ ID NO’s：267-313的一种氨基酸序列时，第二氨基酸残基序列对应 于SEQID NO’s：173-219或SEQ ID NO’s：361-454的一种氨基酸序列； 或(iii)当第一氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：361-454的一种氨基 酸序列时，第二氨基酸残基序列对应于SEQ ID NO’s：173-219或SEQ ID  NO’s：267-313的一种氨基酸序列。

此外，在所述氨基酸序列中，所述至少两种氨基酸残基序列同样优选 地形成结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的抗原结合位点的一部分。

在一个甚至更具体的、但非限制性的方面中，本发明涉及针对Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的氨基酸序列，其包括三种或多种氨基酸残基序列，其中第一 氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：

a)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

第二氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：

d)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

并且第三氨基酸残基序列选自由下列各项组成的组：

g)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列。

优选地，在该具体方面中，所述第一氨基酸残基序列选自由SEQ ID  NO’s：173-219的氨基酸序列组成的组；所述第二氨基酸残基序列选自由 SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列组成的组；所述第三氨基酸残基序 列选自由SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列组成的组。

同样，优选地，在所述氨基酸序列中，所述至少三种氨基酸残基序列 形成结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的抗原结合位点的一部分。

所述氨基酸序列的序列的优选组合将通过本文进一步的公开内容变 得清楚。

优选地，在所述氨基酸序列中，CDR序列与SEQID NO’s：455-501 的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基酸同一性，优选至 少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸 同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如，此氨基酸同一性 程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s：455-501的一种 或多种序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。此外，所述本发明的氨基酸序列可以如本文 进一步所述。

此外，所述氨基酸序列优选是这样的，即，它们可以特异性结合(如 本发明定义)Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6；并且更特别地以本文定义的亲和力(适当测 量和/或表示为K_D-值(实际的或表观的)，K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速 率和/或k_off-速率，或备选地为IC₅₀值，如本文进一步所述)结合Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6。

当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3 个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明的氨基酸序列 优选是这样的，即，其：

-CDR1选自由下列各项组成的组：

a)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和/或

-CDR2选自由下列各项组成的组：

d)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和/或

-CDR3选自由下列各项组成的组：

g)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列。

特别地，所述本发明的氨基酸序列可以是这样的，即，CDR1选自由 SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列组成的组；和/或CDR2选自由SEQ  ID NO’s：267-313的氨基酸序列组成的组，和/或CDR3选自由SEQ ID  NO’s：361-454的氨基酸序列组成的组。

特别地，当本发明的氨基酸序列基本上由4个构架区(分别为 FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成时，本发明 的氨基酸序列优选是这样的，即，其：

-CDR1选自由下列各项组成的组：

a)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和

-CDR2选自由下列各项组成的组：

d)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和

-CDR3选自由下列各项组成的组：

g)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何适当的片段。

特别地，所述本发明的氨基酸序列可以是这样的，即，CDR1选自由 SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列组成的组；并且CDR2选自由SEQ  ID NO’s：267-313的氨基酸序列组成的组，并且CDR3选自由SEQ ID  NO’s：361-454的氨基酸序列组成的组。

同样地，CDR序列的优选组合将通过本文进一步的描述变得清楚。

此外，所述氨基酸序列优选是这样的，即，它们可以特异性结合(如 本发明定义)Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6；并且更特别地以本文定义的亲和力(适当测 量和/或表示为K_D-值(实际的或表观的)，K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速 率和/或k_off-速率，或备选地为IC₅₀值，如本文进一步所述)结合Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及基本上由4个构架 区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组 成的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQ ID NO’s：455- 501的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基酸同一性，优 选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨 基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如，此氨基酸同 一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s：455-501的 一种或多种序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其 中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进 一步所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Tie2，阻断与Ang1的相互作用，并且基本上由4个构架区(分别 为FR1-FR4，如上述所述，例如，表A-1所示的任意FR1，FR2，FR3或FR4 的人源化构架区FR1，FR2，FR3或FR4(或优选地，关于Tie2结合剂的任 何相对应的FR，其具有SEQ ID NO’s：455-457，459，或460)或表A-1所 示的任意FR1，FR2，FR3或FR4(或优选地，关于Tie2结合剂的任何相对 应的FR，其具有SEQ ID NO’s：455-457，459，或460))和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：455-457，459，或460的至少一种氨基酸序列的CDR序列 具有至少70％氨基酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少 90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨 基酸同一性。例如，此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序 列和SEQ ID NO’s：455-457，459，或460的一种或多种序列之间的氨基酸 同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残 基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区(分别 为FR1-FR4，如上述所述，例如，表A-1所示的任意FR1，FR2，FR3或FR4 的人源化构架区FR1，FR2，FR3或FR4(或优选地，关于Ang2结合剂的任 何相对应的FR，其具有SEQ ID NO’s：464-469)或表A-1所示的任意FR1， FR2，FR3或FR4(或优选地，关于Ang2结合剂的任何相对应的FR，其具 有SEQ ID NO’s：464-469))和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3) 组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与SEQ ID NO’s：464-469的至少 一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基酸同一性，优选至少80％ 氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸同一性 或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如，此氨基酸同一性程度可 以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s：464-469的一种或多种 序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽略形成 构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Tie2，阻断与Ang1的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：455中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：455的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 455的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Tie2，阻断与Ang1的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：456中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：456的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 456的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Tie2，阻断与Ang1的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：457中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：457的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 457的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Tie2，阻断与Ang1的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：459中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：459的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 459的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Tie2，阻断与Ang1的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：460中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：460的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 460的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：464中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：464的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 464的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：465中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：465的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 465的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：466中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：466的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 466的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：467中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：467的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 467的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：468中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQID NO’s：468的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 468的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区(如在 SEQ ID NO：469中所述的FR1-FR4，或其人源化构架)和3个互补性决 定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中所述氨基酸序列的CDR序列与 SEQ ID NO’s：469的至少一种氨基酸序列的CDR序列具有至少70％氨基 酸同一性，优选至少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性， 诸如95％氨基酸同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。例如， 此氨基酸同一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s： 469的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定，其中忽 略形成构架区的氨基酸残基。所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步 所述。

在所述本发明的氨基酸序列中，构架序列可以是任何适当的构架序 列，并且，例如，基于标准手册和进一步的公开内容以及本文提及的现有 技术，适当的构架序列的实例是专业技术人员所清楚的。

所述构架序列优选地是免疫球蛋白构架序列或来源于免疫球蛋白构 架序列的构架序列(例如，通过人源化或骆驼源化)(的适当组合)。例如， 所述构架序列可以是来源于轻链可变结构域(例如，V_L-序列)和/或来源于 重链可变结构域(例如，V_H-序列)的构架序列。在一个特别优选的方面中， 所述构架序列是已经来源于V_HH-序列的构架序列(其中所述构架序列可以 任选地已经被部分或完全人源化)或是已经骆驼源化(如本文所定义)的常 规V_H序列。

所述构架序列优选地是这样的，以致本发明的氨基酸序列是结构域抗 体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)；是单结构域抗体(或适合用 作单结构域抗体的氨基酸序列)；是″dAb″(或适合用作dAb的免疫球蛋白 序列)；或是纳米抗体^TM(包括但不限于V_HH序列)。同样地，例如，基于 标准手册和进一步的公开内容以及本文所提及的现有技术，适当的构架序 列对于专业技术人员将是清楚的。

特别地，在本发明的氨基酸序列中存在的所述构架序列可以包含一个 或多个标志残基(如本文所定义)，以致本发明的氨基酸序列是纳米抗体 ^TM。所述构架序列(的适当的组合)的一些优选的、而非限制性的实例将 通过本文进一步的公开内容变得清楚。

同样地，如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，还可以使用前述 任一种的适当的片段(或片段组合)，诸如包含适当与一个或多个构架序 列侧连和/或通过一个或多个构架序列连接的一个或多个CDR序列的片段 (例如，以如这些CDR和构架序列可以在衍生所述片段的全尺寸免疫球 蛋白序列中存在的相同的顺序)。所述片段还可以也是这样的，以致它们 包括或可以形成免疫球蛋白折叠，或者备选地是这样的，以致它们不包括 或不能形成免疫球蛋白折叠。

在一个具体的方面中，这样的片段包括如本文所述的单CDR序列 (并且特别是CDR3序列)，其在每一边侧连构架序列(的一部分)(并且特 别地，在衍生所述片段的免疫球蛋白序列中与所述CDR序列相邻的构架 序列的一部分。例如，CDR3序列可以在FR3序列(的一部分)之后并且 在FR4序列(的一部分)之前)。这样的片段还可以包含二硫键，并且特 别是连接分别在所述CDR序列之前和之后的两个构架区的二硫键(为了 形成这样的二硫键的目的，可以使用在所述构架区中天然存在的半胱氨酸 残基，或备选地，半胱氨酸残基可以合成添加或引入到所述构架区)。对 于这些“加速片段”的进一步描述，同样参考WO 03/050531，以及埃博 灵克斯股份有限公司于2006年12月5日提交的题目为“能够结合血清蛋 白的肽(Peptides capable of binding to serum proteins)”的埃博灵克斯股份 有限公司的美国临时申请(发明人：Revets，Hilde Adi Pierrette；Kolkman， Joost Alexander；和Hoogenboom，Hendricus Renerus Jacobus Mattheus)。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Tie2，阻断与Ang1的相互作用，并且基本上由4个构架区和3个 互补性决定区组成，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s：455-457，459， 或460的至少一种氨基酸序列的序列具有至少70％氨基酸同一性，优选至 少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸 同一性或更多或小于基本上99或100％氨基酸同一性。例如，此氨基酸同 一性程度可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s：455-457， 459，或460的序列之间的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定。 所述本发明的氨基酸序列可以如本文进一步所述，例如，人源化和/或格 式化成多价的和/或多特异性的实施方案。

在一个优选的、但非限制性的方面中，本发明涉及这样的氨基酸序列， 其结合Ang2，阻断与Tie2的相互作用，并且基本上由4个构架区和3个 互补性决定区组成，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s：464-469的至 少一种氨基酸序列的序列具有至少70％氨基酸同一性，优选至少80％氨 基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸同一性或 更多或小于基本上99或100％氨基酸同一性。例如，此氨基酸同一性程度 可以例如通过确定所述氨基酸序列和SEQ ID NO’s：464-469的序列之间 的氨基酸同一性程度(以本文所述的方式)来确定。所述本发明的氨基酸序 列可以如本文进一步所述，例如，人源化和/或格式化成多价的和/或多特 异性的实施方案。

在另一个方面中，本发明涉及包括一种或多种本发明的氨基酸序列 (或其适当的片段)或基本上由一种或多种本发明的氨基酸序列(或其适 当的片段)组成的化合物或构建体，且特别是蛋白和多肽(在本文中还分 别称为“本发明的化合物”，和“本发明的多肽”)，其任选地还包括一个或多 个其它基团、残基、结构部分或结合单位。专业技术人员通过本文进一步 公开的内容将清楚，所述另外的基团、残基、结构部分、结合单位或氨基 酸序列可以或可以不为本发明的氨基酸序列(和/或为存在本发明的氨基 酸序列的化合物或构建体)提供其它官能性，并且可以或可以不修饰本发 明的氨基酸序列的特性。

例如，所述其它基团、残基、结构部分或结合单位可以是一种或多种 其它氨基酸序列，以使所述化合物或构建体是(融合)蛋白或(融合)多 肽。在一个优选、但非限制性的方面中，所述一个或多个其它基团、残基、 结构部分或结合单位是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，所述一个或多个 其它基团、残基、结构部分或结合单位选自由下列各项组成的组：结构域 抗体，适于用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适于用作单结 构域抗体的氨基酸序列，″dAb″’s，适于用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗 体。

备选地，例如，所述基团、残基、部分或结合单位可以是化学基团、 残基、结构部分，其自身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。 例如，并且不限于，所述基团可以连接到一个或多个本发明的氨基酸序列 上，以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本文进一步所述。

也在本发明范围内的是这样的化合物或构建体，其包括一个或多个本 发明所述的衍生物或基本上由一个或多个本发明所述的衍生物组成，并且 任选地还包括任选地通过一个或多个接头连接的一个或多个其它基团、残 基、结构部分或结合单位。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、结 构部分或结合单位是氨基酸序列。

在上述化合物或构建体中，所述一个或多个本发明的氨基酸序列以及 所述一个或多个基团、残基、结构部分或结合单位可以彼此直接连接和/ 或通过一个或多个适当的接头或间隔臂连接。例如，当所述一个或多个基 团、残基、结构部分或结合单位是氨基酸序列时，所述接头也可以是氨基 酸序列，以致所得到的化合物或构建体是融合(蛋白)或融合(多肽)。

本发明的化合物或多肽通常可以通过这样的方法制备，所述方法包括 将所述一个或多个本发明的氨基酸序列任选地通过一个或多个适当的接 头适当地连接到所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位上 的至少一个步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通 过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤：提供编码本发明的 多肽的核酸，以适当方式表达所述核酸，和回收所表达的本发明的多肽。 这样的方法可以以本身已知的方式进行，例如，基于本发明进一步所述的 方法和技术，其对于专业技术人员将是清楚的。

由本发明的氨基酸序列起始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或 多肽的方法在本发明中还称为“格式化”所述的本发明的氨基酸序列；并 且组成本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被认为是“格式 化的”或采用所述的本发明的化合物或多肽的“格式”。基于本发明的公 开内容，专业技术人员将清楚本发明的氨基酸序列可以被格式化的方法实 例以及所述格式的实例；并且所述格式化的氨基酸序列形成本发明的另一 个方面。

在本发明的一个具体方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列相比， 本发明的化合物或本发明的多肽可以具有增加的半衰期。基于本发明进一 步的公开内容，所述化合物和多肽的一些优选而非限制性实例对于专业技 术人员将变得清楚，并且例如包括下列各项：已经被化学修饰以增加其半 衰期(例如，通过聚乙二醇化方式)的本发明的氨基酸序列或多肽；包括 至少一个用于结合血清蛋白(诸如血清白蛋白)的另外的结合位点的本发 明的氨基酸序列；或包括至少一个与增加本发明的氨基酸序列的半衰期的 至少一个结构部分(并且特别是至少一个氨基酸序列)连接的本发明的氨 基酸序列的本发明的多肽。基于本发明进一步的公开内容，包括所述半衰 期延长结构部分或氨基酸序列的本发明的多肽的实例对于专业技术人员 将变得清楚；并且例如，包括，但不限于，这样的多肽，其中所述一个或 多个本发明的氨基酸序列适当地连接一个或多个血清蛋白或其片段(诸如 (人)血清白蛋白或其适当的片段)或连接一个或多个可以结合血清蛋白 的结合单位(诸如，例如，结构域抗体，适合用作结构域抗体的氨基酸序 列，单结构域抗体，适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，″dAb″’s，适 合用作dAb的氨基酸序列，或可以结合血清蛋白如血清白蛋白(诸如人 血清白蛋白)、血清免疫球蛋白如IgG、或运铁蛋白的纳米抗体；参考进 一步的描述和本发明提及的参考文献)；这样的多肽，其中本发明的氨基 酸序列连接Fc部分(诸如人Fc)或其适当的部分或片段；或这样的多肽， 其中所述一个或多个本发明的氨基酸序列适当连接一个或多个可以结合 血清蛋白的小蛋白或肽(诸如，但不限于，记述在WO 91/01743，WO 01/45746，WO 02/076489中的蛋白和肽，以及埃博灵克斯股份有限公司 (Ablynx N.V.)于2006年12月5日提交的题目为“能够结合血清蛋白的 肽”的美国临时申请。

通常，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽优选地具有是相对 应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍、优选地至少2倍， 如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期。例如，与相对应的本 发明的氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期的本发明的化合物或多肽 可以具有增加超过1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超 过12小时，或甚至超过24、48或72小时的半衰期。

在本发明的一个优选而非限制性方面中，与相对应的本发明的氨基酸 序列本身相比，所述本发明的化合物或多肽具有增加超过1小时，优选超 过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过24、48或 72小时的血清半衰期。

在本发明的另一个优选而非限制性方面中，所述本发明的化合物或多 肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、 甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，本发明的化合物或 多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9天(诸如约9-14 天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约11天(诸如约11-16 天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、或超过14天(诸如 约14-19天)的半衰期。

在另一个方面中，本发明涉及编码本发明的氨基酸序列或本发明的多 肽(或其适当的片段)的核酸。这样的核酸在本发明中还称为“本发明的 核酸”，并且例如，可以采用遗传构建体的形式，如本文进步所述。

在另一个方面中，本发明涉及表达(或在适当的环境下能够表达)本 发明的氨基酸序列和/或本发明的多肽的宿主或宿主细胞，和/或包含本发 明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本发明进一步的描述，所述宿主或宿主 细胞的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。

本发明还涉及一种产品或组合物，所述产品或组合物包含或包括至少 一种本发明的氨基酸序列、至少一种本发明的多肽(或其适当的片段)和/ 或至少一种本发明的核酸、以及任选地本身已知的所述组合物的一种或多 种其它成分，即，取决于所述组合物的目的用途。例如，这样的产品或组 合物可以是药物组合物(如本文所述)、兽医用组合物或用于诊断用途的 产品或组合物(同样如本文所述)。通过本文进一步的描述，所述产品或 组合物的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。

本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽、或包括其的组 合物在体外(例如，在体外或细胞测定法中)或体内(例如，在单细胞或 在多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如 在处于恶性病、局部缺血、炎症、传染病和免疫病症的危险中或患有恶性 病、局部缺血、炎症、传染病和免疫病症的人中)调节Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6(的方 法或组合物)中的应用。

本发明还涉及在体外(例如，在体外或细胞测定法中)或体内(例如， 在单细胞或多细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类 中，诸如在恶性病、局部缺血、炎症、传染病和免疫病症的危险中或患有 恶性病、局部缺血、炎症、传染病和免疫病症的人中)调节Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 的方法，所述方法至少包括使Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6与至少一种本发明的氨基 酸序列、纳米抗体或多肽、或与包括其的组合物相接触的步骤，其以使用 本发明的至少一种氨基酸序列、纳米抗体或多肽适于调节Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 的方式和量相接触。

本发明还涉及一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于 在体外(例如，在体外或细胞测定法中)或在体内(例如，在单细胞或多 细胞生物体中，且特别是在哺乳动物中，且更特别是在人类中，诸如在处 于恶性病、局部缺血、炎症、传染病和免疫病症的危险中或患有恶性病、 局部缺血、炎症、传染病和免疫病症的人中)调节Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的组 合物(诸如，但不限于如本文进一步所述的药物组合物或制剂)中的应用。

因此，在本发明的上下文中，“调节(modulating)”或“以调节(to  modulate)”通常意指减少或抑制Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Angg3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的活性，或备选地 增加其活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定(诸如本文提及的那些) 测量的。具体地，“调节(modulating)”或“以调节(to modulate)”可以 意指减少或抑制Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的活性，或备选地如使用适当的体 外、细胞或体内测定(诸如本发明提及的那些)测量的，与在相同条件但 不存在本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽的在相同测定中的Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的活性相比较，增加其活性达至少1％，优选至少5％，诸如至 少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％， 或90％或更多。

专业技术人员应该清楚，“调节”还可以包括与相同条件但不存在本 发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽相比较，实现Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6对其 靶标、配体或底物中的一种或多种的亲和力、抗体亲抗原性、特异性和/ 或选择性的改变(其可以是增加或减少)；和/或实现Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6对于 在存在Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的介质或环境的一种或多种条件(诸如pH、 离子强度、辅因子的存在、等等)的敏感性的改变(其可以是增加或减少)。 专业技术人员应该清楚，这同样可以以适当的方式和/或使用本身已知的 任何适当的测定法来确定，诸如本文或本文引用的现有技术中所述的测定 法。

“调节”还可以意指对涉及Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的一种或多种生物 学或生理学机制、作用、反应、功能、途径或活性实现改变(即，分别作 为激动剂或作为拮抗剂的活性)。同样，专业技术人员应该清楚，这样的 作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当方式和/或使用本身已知的任 何适当的(体外且通常是细胞或体内测定法)测定法确定，诸如本文或本 文引用的现有技术中所述的测定法。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用 可以是这样的，以致与在相同条件下但不存在本发明的氨基酸序列、纳米 抗体或多肽的相同测定法中的生物学或生理学活性相比，分别将目的生物 学或生理学活性增加或减少至少1％，优选至少5％，诸如至少l0％或至 少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更 多。

例如，调节可以包括减少或抑制Tie1或Tie2与其底物或配体之一(诸 如Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6)的结合和/或与天然配体、底物竞争结合。调节还可以包括激 活Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4， Angptl5，或Angptl6或其中涉及Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的机制或途径。调 节可以是可逆的或不可逆的，但是对于药学和药理学目的，通常应该是以 可逆的方式。

本发明还涉及用于制备或产生本文所述的氨基酸序列、多肽、核酸、 宿主细胞、产品和组合物的方法。通过本文进一步的描述，所述方法的一 些优选而非限制性实例将变得清楚。

一般地，这些方法可以包括下列步骤：

a)提供氨基酸序列的组、集合或文库；和

b)从所述氨基酸序列的组、集合或文库中筛选可以结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6和/或具有针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的亲和性的氨基酸序列；

和

c)分离所述可以结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6和/或具有针对Tie1，Tie2， Ang 1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl 1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6的亲和性的(一种或多种)氨基酸序列。

在这样的方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是任何适当 的氨基酸序列的组、集合或文库。例如，所述氨基酸序列的组、集合或文 库可以是免疫球蛋白序列的组、集合或文库(如本文所述)，诸如免疫球 蛋白序列的首次用于实验的组、集合或文库；免疫球蛋白序列的合成的或 半合成的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的免疫球蛋白序 列的组、集合或文库。

此外，在这样的方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是重 链可变结构域(诸如V_H结构域或V_HH结构域)或轻链可变结构域的组、集 合或文库。例如，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是结构域抗体或 单结构域抗体的组、集合或文库，或可以是能够作为结构域抗体或单结构 域抗体行使功能的氨基酸序列的组、集合或文库。

在本方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是免 疫球蛋白序列的免疫组、集合或文库，例如，来自已经用Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部 分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动物的免疫球 蛋白序列的组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以 是胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位。

在上述方法中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌 体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，以促进筛选。例 如，基于本发明进一步的公开内容，用于展示和筛选氨基酸序列(的组、 集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员 将是清楚的。同样参考Hoogenboom在自然生物技术(Nature  Biotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。

在另一个方面中，用于产生氨基酸序列的方法包括至少下列步骤：

a)提供表达氨基酸序列的细胞的集合或样品；

b)从所述细胞的集合或样品中筛选表达可以结合Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6 和/或具有针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl 1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的亲和性的氨基酸序列的细胞；

和

c)(i)分离所述氨基酸序列；或(ii)从所述细胞分离编码所述氨基酸 序列的核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。

例如，当所需要的氨基酸序列是免疫球蛋白序列时，所述细胞的集合 或样品可以是，例如，B细胞的集合或样品。此外，在该方法中，细胞样 品可以来源于已经用Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6适当免疫的、或用基于其或来源于 其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其 它表位)适当免疫的哺乳动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可 以是胞外部分、胞外区、胞外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位。

上述方法可以以任何适当的方式进行，这对于专业技术人员将是清楚 的。例如，参考EP 0 542 810，WO 05/19824，WO 04/051268和WO 04/106377。步骤b)的筛选优选地使用流式细胞术技术诸如FACS进行。 对于此，例如，参考Lieby等，血液(Blood)，卷97，No.12，3820(2001)。

在另一个方面中，用于产生针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的氨基酸序列的方 法可以包括至少下列步骤：

a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；

b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6和/或具有针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的亲和性的氨基酸序列的 核酸序列；

和

c)分离所述核酸序列，然后表达所述氨基酸序列。

在这样的方法中，所述编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库 可以是，例如，编码免疫球蛋白序列的首次用于实验的组、集合或文库的 核酸序列的组、集合或文库；编码免疫球蛋白序列的合成的或半合成的组、 集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编码已经进行了亲和力 成熟的免疫球蛋白序列的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库。

此外，在这样的方法中，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码重 链可变结构域(诸如V_H结构域或V_HH结构域)或轻链可变结构域的组、集 合或文库。例如，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码结构域抗体或 单结构域抗体的组、集合或文库，或能够作为结构域抗体或单结构域抗体 行使功能的氨基酸序列的组、集合或文库。

在该方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是核 酸序列的免疫的组、集合或文库，例如，所述核酸序列来源于已经用Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸 如其抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的哺乳动 物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是胞外部分、胞外区、胞 外结构域、胞外环或其他一个或多个胞外表位。

例如，所述核酸序列的组、集合或文库可以编码重链可变结构域或轻 链可变结构域的免疫的组、集合或文库。在一个具体的方面中，所述核苷 酸序列的组、集合或文库可以编码V_HH序列的组、集合或文库。

在上述方法中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌 体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(诸如酵母)上，以促进筛选。例如， 基于本发明进一步的公开内容，用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸 序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体对于本领域 专业技术人员将是清楚的。同样参考Hoogenboom在自然生物技术(Nature Biotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。

本发明还涉及通过上述方法或备选地通过包括上述方法之一以及至 少下列步骤的方法而获得的氨基酸序列，所述步骤为：确定所述免疫球蛋 白序列的核苷酸序列或氨基酸序列；并且以本身已知的方式表达或合成所 述氨基酸序列，诸如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达，或通过 化学合成。

此外，在上述步骤后，一个或多个本发明的氨基酸序列可以适当地被 人源化(或备选地，被骆驼源化)；和/或可以将这样获得的氨基酸序列彼 此连接，或连接一个或多个其它适当的氨基酸序列(任选地，通过一个或 多个适当的接头)，以提供本发明的多肽。此外，编码本发明的氨基酸序 列的核酸序列可以被适当地人源化(或备选地，被骆驼源化)并且适当地表 达；和/或编码本发明的氨基酸序列的一个或多个核酸序列可以彼此连接， 或连接编码其它适当的氨基酸序列的一个或多个核酸序列(任选地通过编 码一个或多个适当的接头的核苷酸序列)，然后，这样获得的核苷酸序列可 以进行适当地表达，以提供本发明的多肽。

本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多肽、核酸、 宿主细胞、产品和组合物的应用和用途，以及涉及用于预防和/或治疗与 Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4， Angptl5，或Angptl6相关的疾病和病症的方法。通过本发明进一步的描述， 一些优选的但非限制性的应用和用途将变得清楚。

本发明还涉及本文所述的用于治疗的氨基酸序列、化合物、构建体、 多肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物。

特别地，本发明还涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多 肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物用于治疗这样的疾病或病症，所述疾 病或病症可以通过向需要其的受试者施用(药物有效量的)本文所述的氨 基酸序列、化合物、构建体或多肽而预防或治疗。

更特别地，本发明涉及本文所述的氨基酸序列、化合物、构建体、多 肽、核酸、宿主细胞、产品和组合物，其用于治疗与血管发生相关的疾病 和病症。

通过本发明进一步的描述，本发明的其它方面、实施方案、优点和应 用也将变得清楚，其中本发明将更详细地描述和讨论本发明的纳米抗体以 及包括其的本发明的多肽，其形成本发明的一些优选方面。

如通过本发明进一步的描述将变得清楚，与“dAb’s”或相似的(单)结构 域抗体或免疫球蛋白序列相比，纳米抗体通常提供某些优点(本发明所述 的)，本发明的纳米抗体也提供所述优点。然而，专业技术人员应该清楚， 下述教导的更通用的方面也可以适用于(直接或类似地)本发明的其它氨 基酸序列。

发明详述

在本说明书、实施例和权利要求书中：

a)除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通 用意思，其对于专业技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如 Sambrook等，″分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory  Manual)″(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor  Laboratory Press)(1989)；F。Ausubel等，编，″现代分子生物学方法(Current  protocols in molecular biology)″，Green Publishing和Wiley Interscience，纽 约(1987)；Lewin，“基因II(Genes II)”，John Wiley & Sons，纽约，纽约， (1985)；Old等，“基因操作原理：基因工程导言(Principles of Gene  Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering)”，第2版，加利福尼 亚大学出版社(University of California Press)，伯克利，CA(1981)；Roitt 等，“免疫学(Immunology)”(第6版)，Mosby/Elsevier，Edinburgh(2001)； Roitt等，Roitt基础免疫学(Roitt’s Essential Immunology)，第10版. Blackwell Publishing，英国(2001)；和Janeway等，“免疫生物学 (Immunobiology)”(第6版)，Garland Science Publishing/Churchill  Livingstone，纽约(2005)，以及本发明所引用的公知背景技术；

b)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”——不管其在本文中用来 指重链抗体或常规的4-链抗体——用作一般术语，包括完整大小的抗体、 其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合 结构域或片段，分别诸如V_HH结构域或V_H/V_L结构域)。另外，术语“序 列”在用于本文时(例如，在如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变 结构域序列”、“V_HH序列”或“蛋白序列”的术语中)，通常应该理解为 包括相关的氨基酸序列以及编码其的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要 更限定的解释。此外，术语“核苷酸序列”当用于本文时，还包括具有所 述核苷酸序列的核酸分子，以致术语“核苷酸序列”和“核酸”应该认为 是等价的并且在本文中互换使用；

c)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操 作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于专业技术人员是清楚 的。例如，仍旧参考标准手册，参考本发明所提及的公知背景技术，和参 考其中所引用的其它参考文献；以及例如下列的综述：Prcsta，先进药物 递送评论(Adv.Drug Deliv.Rev.)2006，58(5-6)：640-56；Levin和Weiss，分 子生物系统(Mol.Biosyst.)2006，2(1)：49-57；Irving等，免疫学方法杂志 (J.Immunol.Methods)，2001，248(1-2)，31-45；Schmitz等，胎盘(Placenta)， 2000，21增刊A，S106-12，Gonzales等，肿瘤生物学(Tumour Biol.)，2005， 26(1)，31-43，它们描述了蛋白工程的技术，诸如亲和力成熟和其他用于改 善蛋白诸如免疫球蛋白的特异性和其他所需特性的技术；

d)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸密码显示，如在 表A-2提及的；

表A-2：一字母和三字母氨基酸密码

e)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第 二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以通过用[第一核苷酸序列 中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一 核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％]而计算，其中在第二核苷酸 序列中核苷酸的每一缺失、插入、置换或添加——与第一核苷酸序列相 比——都视作在单一核苷酸(位置)的差异。

备选地，两种或更多种核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用 已知的用于序列比对的使用标准设置的计算机算法进行计算，诸如NCBI Blast v2.0。

例如，在WO 04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318， WO 00/78972，WO 98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列同 一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。

通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的 “序列同一性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视 作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序 列；

f)出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第 二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文也称为“氨基酸同一 性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基 酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总 数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一缺 失、插入、置换或添加——与第一氨基酸序列相比——都视作在单一氨基 酸残基(位置)上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。

备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算 机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度 的那些，其仍旧使用标准设置。

通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的 “序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序 列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基 酸序列。

此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，专业技术人 员可以考虑所谓的“保守”氨基酸置换，其通常可以描述为这样的氨基酸 置换，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基置换， 并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学特性几乎没有或者基本上没 有影响。这种保守氨基酸置换是本领域内公知的，例如，从WO 04/037999， GB-A-3357 768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并 且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文 献的相关教导而选择这种置换的(优选)类型和/或组合。

所述保守置换优选地是这样的置换，即，其中下列组(a)-(e)内的一 个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基置换：(a)小的脂肪族、非极性或弱 极性的残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不 带电荷的)酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基：His，Arg 和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳 族残基：Phe，Tyr和Trp。

特别优选的保守置换如下：Ala置换成Gly或置换成Ser；Arg置换成 Lys；Asn置换成Gln或置换成His；Asp置换成Glu；Cys置换成Ser；Gln置 换成Asn；Glu置换成Asp；Gly置换成Ala或置换成Pro；His置换成Asn 或置换成Gln；Ile置换成Leu或置换成Val；Leu置换成Ile或置换成Val；Lys 置换成Arg，置换成Gin或置换成Glu；Met置换成Leu，置换成Tyr或置换 成Ile；Phe置换成Met，置换成Leu或置换成Tyr；Ser置换成Thr；Thr置换 成Ser；Trp置换成Tyr；Tyr置换成Trp；和/或Phe置换成Val，置换成Ile 或置换成Leu。

适用于本文所述的多肽的任何氨基酸置换还可以基于Schulz等，蛋 白质结构原理(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，1978发展 的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和 Fasman，生物化学(Biochemistry)13：211，1974和高级酶学(Adv. Enzymol.)，47：45-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg 等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)81：140-144，1984； Kyte和Doolittle；分子生物学杂志(J Molec.Biol.).157：105-132，1981，以 及Goldman等，物理化学年度综述(Ann.Rev.Biophys.Chem.).15： 321-353，1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合 于此。在本文描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一 级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，自 然结构生物学(Nature Structural Biology)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等， 自然结构生物学(Natural Structural Biology)(1996)；3，752-757；和 Decanniere等，结构(Structure)，卷7，4，361(1999)给出来自美洲驼(llama) 的V_HH结构域的晶体结构。关于在常规V_H结构域中形成V_H/V_L界面的一 些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)置换的其它 信息可以在上文引用的现有技术中找到。

g)如果在它们的全长有100％的序列同一性(如本发明所定义)，那 么认为氨基酸序列和核酸序列“完全相同”；

h)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相 比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或置换；应该理解 两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这样的氨基酸差异；

i)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包括”另一个核苷酸序列或 氨基酸序列，或“基本由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时， 这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的 核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷 酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包括核苷酸或氨基酸残基的序列，其 分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管实际上已 经怎样产生或获得最先提及的序列(例如，其可以通过本发明所述的任何 适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为本发明的纳米抗体 包括CDR序列时，这可以意指所述CDR序列已经结合在本发明的纳米抗 体内，但是更通常地，这一般意指本发明的纳米抗体在其序列内包含具有 与所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸残基序列，而不管已经怎样 产生或获得所述本发明的纳米抗体。还应该注意到，当后一个氨基酸序列 具有特异性生物学或结构功能时，它在最先提及的氨基酸序列中优选地具 有基本相同、相似或等价的生物学或结构功能(换言之，最先提及的氨基 酸序列优选是这样的，以致后一个序列能够实施基本上相同的、相似的或 等价的生物学或结构功能)。例如，当认为本发明的纳米抗体分别包括 CDR序列或构架序列时，在所述纳米抗体中的所述CDR序列和构架优选 地分别能够作为CDR序列或构架序列行使作用。此外，当认为核苷酸序 列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核苷酸序列优选是这样的，以致 当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基 酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所 述最先提及的、较大的核苷酸序列相同的阅读框内)。

j)核酸序列或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”——例如， 与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养介质相比——此时 其已经与其通常在所述来源或介质中与之缔合的至少一种其它成分(诸如 另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污 染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是 至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸 序列或氨基酸序列是“基本上分离的”。当使用适当技术确定时，诸如适 当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，“以基本上分离形式”的 核酸序列或氨基酸序列优选地基本上是均质的；

k)当用于本文时，术语“结构域”通常是指氨基酸序列(诸如抗体链， 并且特别是指重链抗体的球状区域)的球状区域，或者指基本上由所述球 状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫 键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)。术语“结合结构域”是指针对抗 原决定簇(如本文所定义)的结构域；

l)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米 抗体或多肽)并且更特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术 语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用；

m)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一 部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨 基酸序列(诸如本发明的纳米抗体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白 或多肽或其片段)认为是“针对(against)”或者“针对(directed against)” 所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。

n)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本 发明的纳米抗体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的 数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和力和/或抗体亲抗原性而 确定。亲和力，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(K_D)，是抗 原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的量度： K_D值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地， 亲和力还可以表示为亲和常数(K_A)，其为1/K_D)。专业技术人员应该清楚 (例如，基于本发明进一步的公开内容)，亲和力可以以本身已知的方式 确定，其取决于目的特异性抗原。抗体亲抗原性是抗原-结合分子(诸如 本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的量度。抗体亲抗 原性与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力 以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地， 抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)将以 10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小并且更优选 地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(K_D)(即，以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并 且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常 数(K_A))而结合它们的抗原。任何大于10⁴摩尔/升的K_D值(或任何小于 10⁴M^-1的K_A值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的 单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小 于10nM诸如小于500pM的亲和力与理想的抗原结合。抗原-结合蛋白与 抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定， 其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定 (RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已 知的其不同的变体；以及本发明提及的其它技术。

专业技术人员应该清楚，解离常数可以是实际的或表观解离常数。确 定解离常数的方法对于专业技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本发 明提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10^-4摩尔/升 或10^-3摩尔/升(例如，10^-2摩尔/升)的解离常数。任选地，专业技术人员应 该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(K_A)利用[K_D＝1/K_A]的关系计 算所述(实际或表观)解离常数。

亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常作为K_D或解 离常数给出，其具有摩尔/升(或M)的单位。亲和力还可以表示为缔合 常数K_A，其等于1/K_D，并且具有(摩尔/升)^-1(或M^-1)的单位。在本说明 书中，两个分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽及其目的靶 标)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的K_D值表示；专业 技术人员应该清楚，考虑到K_A＝1/K_D的关系，通过其K_D值表示分子相互 作用的强度也可以用于计算相对应的K_A值。由于K_D-值通过公知的关系 式DG＝RT.ln(K_D)(等价于DG＝-RT.ln(K_A))与结合的自由能(DG)相关，所 以K_D-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中， R等于气体常数，T等于绝对温度，并且ln表示自然对数。

关于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用的K_D典型 地在10^-10M(0.1nM)-10^-5M(10000nM)范围内。相互作用越强，其K_D越 低。

K_D也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为k_off)与其缔合速率 (表示为k_on)的比例(以致K_D＝k_off/k_on和K_A＝k_on/k_off)。解离速率k_off具 有单位s^-1(其中s是秒的SI单位符号)。缔合速率k_on具有单位M^-1s^-1。缔 合速率可以在10²M^-1s^-1-约10⁷M^-1s^-1之间变化，对于两分子相互作用达 到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t_1/2＝ln(2)/k_off与给定的分子 相互作用的半衰期相关。解离速率可以在10^-6s-1(接近具有数天的t_1/2的 不可逆复合体)到1s^-1(t_1/2＝0.69s)之间变化。

两个分子之间的分子相互作用的亲和力可以通过本身已知的不同技 术测量，诸如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(例如， 参见Ober等，国际免疫学(Intern.Immunology)，13，1551-1559，2001)， 其中将一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下经过 所固定的分子，产生k_on，k_off测量值以及因此产生K_D(或K_A)值。例如，这 可以使用公知的BIACORE仪器进行。

专业技术人员还应该理解，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子 的内在结合亲和力，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的假 象影响，则测量的K_D可以与表观K_D相对应。此外，如果一个分子含有 针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观K_D。在这样的 情形中，所测量的亲和力可以受到两个分子之间相互作用的抗体亲抗原性 的影响。

可以用来评估亲和力的另一个方法是Friguet等(免疫方法杂志(J. Immunol.Methods)，77，305-19，1985)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定) 方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的 一个分子的吸附相关的可能的假象。

然而，K_D的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定 表观K_D值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以 一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观K_D测量可以用作真 实K_D的近似值，并且因此在现有文献中，应该以同等的重要性或相关性 对待K_D和表观K_D。

最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于 一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如，为了评估分子A和B之 间的结合强度，例如，人们可以使用已知与B结合且适合用荧光团或生 色团或其它化学结构部分标记的参照分子C，诸如在ELISA或FACS(荧 光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的 荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA 检测的生物素)。典型地，参照分子C保持在固定的浓度，并且A的浓度 关于B的给定的浓度或量变化。结果，获得IC₅₀值，其对应于将在不存 在A的条件下关于C所测量的信号减半的A的浓度。假定已知参照分子 的K_D，即K_D ref，以及参照分子的总浓度c_ref，则可以通过下式获得关于 A-B相互作用的表观K_D：K_D＝IC₅₀/(1+c_ref/K_D ref)。注意，如果c_ref＜＜K_D ref， 则K_D≈IC₅₀。假定以一致的方式(例如，保持c_ref不变)针对比较的结合 剂进行IC₅₀测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC₅₀进行评 估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量等价于K_D或等价于表观K_D。

o)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所 述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间， 例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化 合物的清除或隔离(sequestration)。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽 的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分 析。适当的技术对于本领域专业技术人员应该是清楚的，并且例如，通常 可以包括下列步骤：将适当剂量的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽适 当施用给温血动物(即，施用给人或另一种适当的哺乳动物，诸如小鼠、 兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物，例如来自猕猴(Macaca)属的猴子(诸 如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河 猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))；从所述动物收 集血液样品或其它样品；确定在所述血液样品中的本发明的氨基酸序列、 化合物或多肽的水平或浓度；并且从这样获得的数据(的图表)计算与在 给药时的初始水平相比较直到本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平 或浓度已经减少50％的时间。例如，参考下述实验部分，以及Dennis等.， J.Biol.Chem(生物化学杂志)277：35035-42(2002)，参考标准手册，诸如 Kenneth，A等：药物的化学稳定性：药剂师手册(Chemical Stability of  Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists)和Peters等，药物动力学分 析：实践方法(Pharmacokinete analysis：A Practical Approach)(1996)。还 参考″药物动力学(Pharmacokinetics)″，M Gibaldi和D Perron，Marcel  Dekker出版，第2综述版(2nd Rev.edition)(1982)。

专业技术人员还应该清楚(例如，参见WO 04/003019的第6和7页 以及其中引用的其它参考文献)，半衰期可以用参数如t1/2-α，t1/2-β和曲 线下面积(AUC)表示。在本说明书中，“半衰期增加”是指在这些参数的 任何一种的增加，诸如这些参数的任何两种，或基本上所有这三种参数的 增加。当用于本发明时，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β 的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。

例如，本发明的氨基酸序列或多肽的半衰期可以通过按下述在啮齿 动物或非人灵长类动物模型中进行的药物动力学研究确定。将多组动物 (n＝2-10)给予1mg/kg或10mg/kg 2D3-17D12融合蛋白的静脉内推注注射。 在给药后不同时间点(例如，给药后1，2，4，6，8，12，24，48，144，192，240， 288和336小时)通过静脉获得血浆样品，并且通过ELISA分析2D3-17D12 融合蛋白的存在。将血浆浓度相对时间拟合为二区室消除模型 (two-compartment elimination model)。将药物动力学参数清除率V1，稳 定态体积(Vss)，T¹/₂，AUC，和关于实际施用剂量校正的AUC(AUC/剂量) 对每个处理组取平均值。通过变化分析确定各组间的差异。

p)在本发明的上下文中，“调节(modulating)”或“以调节(to  modulate)”通常意指减少或抑制靶标或抗原的活性，或备选地增加其活 性，如使用适当的体外、细胞或体内测定测量的。具体地，“调节 (modulating)”或“以调节(to modulate)”可以意指减少或抑制靶标或 抗原的活性，或备选地增加其活性，如使用适当的体外、细胞或体内测定 (其通常取决于所涉及的靶标或抗原)测量的，与在相同条件但不存在本 发明的构建体的在相同测定中的靶标或抗原的活性相比较，达至少1％， 优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至 少70％，至少80％，或90％或更多。

专业技术人员应该清楚，“调节”还可以包括与相同条件但不存在本 发明的构建体相比较，实现靶标或抗原对其配体、结合配偶体、缔合成同 型多聚体或异型多聚体的配偶体、或底物中的一种或多种的亲和力、抗体 亲抗原性、特异性和/或选择性的改变(其可以是增加或减少)；和/或实现 靶标或抗原对于在存在所述靶标或抗原的介质或环境的一种或多种条件 (诸如pH、离子强度、辅因子的存在、等等)的敏感性的改变(其可以 是增加或减少)。专业技术人员应该清楚，这同样可以以适当的方式和/或 使用本身已知的任何适当的测定法来确定，这取决于所涉及的靶标或抗 原。

“调节”还可以意指对涉及靶标或抗原的一种或多种生物学或生理学 机制、作用、反应、功能、途径或活性(或其中涉及其底物、配体或途径， 诸如其信号传导途径或代谢途径以及它们相关的生物学或生理学作用)实 现改变(即，分别作为激动剂、作为拮抗剂或作为逆激动剂，这取决于所 述靶标或抗原和所需要的生物学或生理学作用)。同样，专业技术人员应 该清楚，这样的作为激动剂或拮抗剂的作用可以以任何适当方式和/或使 用本身已知的任何适当的(体外且通常是细胞或体内测定法)测定法确定， 这取决于所涉及的靶标或抗原。特别地，作为激动剂或拮抗剂的作用可以 是这样的，以致与在相同条件下但不存在本发明的构建体的相同测定法中 的生物学或生理学活性相比，分别将目的生物学或生理学活性增加或减少 至少1％，优选至少5％，诸如至少10％或至少25％，例如至少50％，至 少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多。

例如，调节可以包括靶标或抗原的变构调节；和/或减少或抑制所述 靶标或抗原与其底物或配体之一的结合和/或与天然配体、底物竞争与所 述靶标或抗原的结合。调节还可以包括激活所述靶标或抗原或涉及所述靶 标或抗原的机制或途径。例如，调节可以包括关于靶标或抗原的折叠或构 象实施改变，或关于所述靶标或抗原折叠、改变其构象(例如，当结合配 体时)、与其它(亚)单位缔合、或解离的能力实施改变。例如，调节还 可以包括对所述靶标或抗原运输其它化合物或作用为其它化合物(例如， 离子)的通道的能力实施改变。

调节可以是可逆的或不可逆的，但是对于药学和药理学目的，通常应 该是以可逆的方式。

o)本发明还提供交叉阻断本申请所述的一种氨基酸序列的结合的氨 基酸序列和/或被本申请所述的一种氨基酸序列交叉阻断与Ang，Angptl， 或Tie的结合的氨基酸序列。术语“交叉阻断(cross-block)”，“被交叉 阻断(cross-blocked)”和“交叉阻断(cross-blocking)”在本文可以互换 使用，用来意指氨基酸序列或其他结合试剂干扰本发明的其他氨基酸序列 或结合试剂与Ang，Angptl，或Tie结合的能力。本发明的氨基酸序列或其 他结合试剂能够干扰另一种对Ang，Angptl，或Tie的结合的程度，且因此 其能够被认为是本发明所述的交叉阻断的，可以使用竞争结合测定法确 定。一种特别适当的定量测定法使用Biacore机器，其可以使用表面等离 子体共振技术测量相互作用的程度。另一种适当的定量交叉阻断测定法使 用基于ELISA的方法来测量氨基酸序列或其他结合试剂之间对于它们与 Ang，Angptl，或Tie的结合的竞争。本发明其它优选的氨基酸序列是包括 至少一个单可变结构域的氨基酸序列，其交叉阻断SEQID NOs 455-501 的至少一种氨基酸序列或被SEQ ID NOs 455-501的至少一种氨基酸序 列交叉阻断。以下概括描述用于确定氨基酸序列或其他结合试剂是否交叉 阻断或按照本发明能够交叉阻断的适当的Biacore测定法。应该理解，所 述测定法可以与本文所述的Ang，Angptl，或Tie结合试剂的任一种一起使 用。按照供应商的建议使用Biacore机器(例如，Biacore 3000)。因此， 在一种交叉阻断测定法中，使用标准胺偶联化学将Ang，Angptl，或Tie蛋 白偶联到CM5 Biacore芯片上，以产生由Ang，Angptl，或Tie包被的表面。 典型地，200-800个共振单位的Ang，Angptl，或Tie将被偶联到芯片上(易 于给出可测量水平的结合但是易于被所用的测试试剂的浓度饱和的量)。 将两种待检测它们交叉阻断彼此的能力的测试氨基酸序列(称为A^*和B^*) 以结合位点1∶1摩尔比例混合在适当的缓冲液中，以产生测试混合物。 当基于结合位点计算浓度时，假设氨基酸序列的分子量是氨基酸序列的总 分子量除以所述氨基酸序列上的Ang，Angptl，或Tie结合位点的数目。测 试混合物中每种氨基酸序列的浓度应该足够高，足以易于饱和所述氨基酸 序列关于捕获在Biacore芯片上的Ang，Angptl，或Tie分子的结合位点。 在所述混合物中的氨基酸序列处于相同的摩尔浓度(基于结合)，且所述 浓度典型地为1.00-1.5微摩尔(基于结合)。还制备仅包含A^*和仅包含 B^*的分开的溶液。在这些溶液中的A^*和B^*应该处在与在所述测试混合物 中相同的缓冲液中和相同的浓度。将测试混合物通过Ang，Angptl，或Tie- 包被的Biacore芯片，且记录结合的总量。然后，以这样的方式处理芯片， 以在不损坏芯片-结合的Ang，Angptl，或Tie的条件下去除结合的氨基酸 序列。典型地，这通过用30mM HCl处理芯片60秒进行。然后，将仅有 A^*的溶液通过Ang，Angptl，或Tie-包被的表面，并记录结合的量。同样处 理芯片，以在不损坏芯片-结合的Ang，Angptl，或Tie的条件下去除所有结 合的氨基酸序列。然后，将仅有B^*的溶液通过Ang，Angptl，或Tie-包被 的表面，并记录结合的量。接着计算A^*和B^*混合物的最大理论结合，且 为每种氨基酸序列在单独通过Ang，Angptl，或Tie表面时的结合的总和。 如果实际记录的混合物的结合小于该理论最大值，则该两种氨基酸序列彼 此是交叉阻断的。因此，通常，按照本发明的交叉阻断的氨基酸序列或其 他结合试剂是一种将在上述Biacore交叉阻断测定法中与Ang，Angptl，或 Tie结合的物质，以致在该测定法中且在存在本发明的第二氨基酸序列或 其他结合试剂时，所记录的结合是组合的两种氨基酸序列或结合试剂的最 大理论结合(如上文定义)的80％-0.1％(例如，80％-4％)，特别地是最 大理论结合的75％-0.1％(例如，75％-4％)，且更特别地是最大理论结合 的70％-0.1％(例如，70％-4％)。上述Biacore测定法是用来确定氨基酸 序列或其他结合试剂彼此是否是按照本发明交叉阻断的主要测定法。在很 少的情形中，特定的氨基酸序列或其他结合试剂可能不与通过胺化学偶联 到CM5 Biacore芯片上的Ang，Angptl，或Tie结合(这通常在Ang，Angptl， 或Tie上的相关结合位点通过与芯片的偶联而被遮蔽或破坏时发生)。在 这样的情形中，交叉阻断可以使用标记形式的Ang，Angptl，或Tie，例如 N端His-标记的Ang，Angptl，或Tie(R & D Systems(R&D系统)， Minneapolis，MN，USA；2005 cat# 1406-ST-025)确定。以这种特定的形式， 抗-His氨基酸序列将被偶联到Biacore芯片上，然后将His-标记的Ang， Angptl，或Tie通过芯片表面，并被所述抗-His氨基酸序列捕获。交叉阻 断分析将基本上按照上述进行，除了在每次芯片再生循环之后，新的His- 标记的Ang，Angptl，或Tie将被重新负载到抗-His氨基酸序列包被的表面 上。除了使用N端His-标记的Ang，Angptl，或Tie给出的实例之外，可以 备选地使用C端His-标记的Ang，Angptl，或Tie。此外，本领域已知的各 种其他标记和标记结合蛋白组合可以用于这样的交叉阻断分析(例如，具 有抗-HA抗体的HA标记；具有抗-FLAG抗体的FLAG标记；具有链霉 抗生物素蛋白的生物素标记)。下述概括描述用于确定抗-Ang，Angptl，或 Tie的氨基酸序列或其他Ang，Angptl，或Tie结合试剂是否交叉阻断或如 本文所定义那样能够交叉阻断的ELISA测定法。应该理解，所述测定法 可以与本文所述的Ang，Angptl，或Tie结合试剂中的任一种一起使用。本 测定法的一般原理是使得抗-Ang，Angptl，或Tie的氨基酸序列包被到 ELISA平板的孔上。将过量的量的第二、潜在的交叉阻断、抗-Ang，Angptl， 或Tie的氨基酸序列添加到溶液中(即，不与ELISA平板结合)。然后将 有限量的Ang，Angptl，或Tie添加到孔中。所述包被的氨基酸序列和溶液 中的氨基酸序列竞争与有限量的Ang，Angptl，或Tie分子的结合。洗涤平 板，以去除未与包被的[氨基酸序列]结合的Ang，Angptl，或Tie，且还去 除第二、溶液相氨基酸序列以及在所述第二、溶液相氨基酸序列和Ang， Angptl，或Tie之间形成的任何复合物。然后，使用适当的Ang，Angptl，或 Tie检测试剂，测量结合的Ang，Angptl，或Tie的量。相对于在不存在第 二、溶液相的氨基酸序列的条件下所述包被的氨基酸序列可以结合的Ang， Angptl，或Tie分子的数量，溶液中能够交叉阻断所包被的氨基酸序列的 氨基酸序列将能够引起所述包被的氨基酸序列可以结合的Ang，Angptl， 或Tie分子的数量的减少。在其中选择第一氨基酸序列如纳米抗体-X作为 固定的氨基酸序列的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用 适当的封闭溶液来封闭该平板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结 合。然后，将过量的第二氨基酸序列，即纳米抗体-Y添加到该ELISA平 板中，以致在包被所述ELISA平板的过程中，每孔纳米抗体-YAng，Angptl， 或Tie结合位点的摩尔数是每孔所用的纳米抗体-X Ang，Angptl，或Tie结 合位点的摩尔数的至少10倍。然后，加入Ang，Angptl，或Tie，以致每孔 加入的Ang，Angptl，或Tie的摩尔数比用于包被每孔的纳米抗体-X Ang， Angptl，或Tie结合位点的摩尔数低至少24倍。在适当的温育时间之后， 洗涤ELISA平板，且加入Ang，Angptl，或Tie检测剂，以测量由所述包被 的抗-Ang，Angptl，或Tie的氨基酸序列(在该情形中为纳米抗体-X)特异 结合的Ang，Angptl，或Tie的量。关于该测定法的背景信号定义为在使用 所述包被的氨基酸序列(在该情形中为纳米抗体-X)、第二溶液相氨基酸 序列(在该情形中为纳米抗体-Y)、仅有Ang，Angptl，或Tie缓冲剂(即， 无Ang，Angptl，或Tie)和Ang，Angptl，或Tie检测试剂的孔中获得的信 号。关于该测定法的阳性对照信号定义为在使用所述包被的氨基酸序列 (在该情形中为纳米抗体-X)、仅有第二溶液相氨基酸序列缓冲剂(即， 无第二溶液相氨基酸序列)、Ang，Angptl，或Tie和Ang，Angptl，或Tie检 测试剂的孔中获得的信号。该ELISA测定法可以以这样的方式运行，以 使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。为了避免由选择哪种氨基酸序 列用作包被氨基酸序列和哪种用作第二(竞争剂)氨基酸序列导致的任何 假象(例如，纳米抗体-X和纳米抗体-Y之间对于Ang，Angptl，或Tie的 显著不同的亲和力)，该交叉阻断测定法可以以两种形式运行：1)形式1 是其中纳米抗体-X是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，纳米抗体-Y是 在溶液中的竞争氨基酸序列，和2)形式2是其中纳米抗体-Y是包被到 ELISA平板上的氨基酸序列，纳米抗体-X是在溶液中的竞争氨基酸序列。 如果在形式1或在形式2中，与在不存在溶液相抗-Ang，Angptl，或Tie的 氨基酸序列的条件下(即，阳性对照孔)获得的Ang，Angptl，或Tie检测 信号相比较，所述溶液相抗-Ang，Angptl，或Tie的氨基酸序列能够引起 Ang，Angptl，或Tie检测信号(即，由所述包被的氨基酸序列结合的Ang， Angptl，或Tie的量)减少60％-100％，特别地70％-100％，且更特别地 80％-100％，则纳米抗体-X和纳米抗体-Y被定义为是交叉阻断的。所述 基于ELISA的交叉阻断测定法的实例可以在实施例[xxx](“基于ELISA 的交叉阻断测定法”)中找到

p)如本文进一步所述，纳米抗体中氨基酸残基总数可以在110-120 区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米抗体的部分、 片段、类似物或衍生物(如本文进一步所述)不特别限制它们的长度和/ 或大小，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的深层 要求，并且还优选地适于本文所述的目的；

q)纳米抗体的氨基酸残基按照Kabat等(“免疫学目的蛋白的序列 (Sequence of proteins of immunological interest)”，美国公众健康服务中 心(US Public Health Services)，NIH贝塞斯达，MD，公布No.91)给出的 关于V_H结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在Riechmann和 Muyldermans，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2000年6月23日； 240(1-2)：185-195的文章中用于来自骆驼科动物的V_HH结构域(例如，参 见该公布的图2)，或参考本文。按照这种编号方式，纳米抗体的FR1包 括位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31-35的氨基酸 残基，纳米抗体的FR2包括位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括 位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基， 纳米抗体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米抗体的FR4 包括位置103-113的氨基酸残基。[在这一方面，应该注意——如在本领域 内关于V_H结构域和关于V_HH结构域公知的——在每一CDR中的氨基酸 残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基 的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在 实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多 的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能或可能不 与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以认为， 按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR中的氨基酸残基的数目，按照 Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编 号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式 的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的 位置103对应FR4的起点，并且反之亦然]。

用于将V_H结构域的氨基酸残基编号的备选方法是由Chothia等(自然 (Nature)342，877-883(1989))所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓 的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科动物的V_HH结构域以及用于纳米抗体。然而，在本说明书、权利要求书和附图中，遵 循由Riechmann和Muyldermans用于V_HH结构域的按照Kabat的编号方式， 除非另外指明；

r)关于靶标或抗原，术语在所述靶标或抗原上的“相互作用位点” 意指在所述靶标或抗原上的位点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨 基酸残基序列，其是所述靶标或抗原用于结合配体、受体或其他结合配偶 体的位点、催化位点、分解位点、变构相互作用的位点、参与多聚体化(如 同型多聚体化或异型二聚体化)的位点；或是在所述靶标或抗原上参与所 述靶标或抗原的生物学作用或机制的任何其他位点、表位、抗原决定簇、 部分、结构域或氨基酸残基序列。更一般地，“相互作用位点”可以是在 所述靶标或抗原上的本发明的氨基酸序列或多肽可以与之结合的任何位 点、表位、抗原决定簇、部分、结构域或氨基酸残基序列，以致调节(如 本文定义)所述靶标或抗原(和/或其中涉及所述靶标或抗原的任何途径、 相互作用、信号传导、生物学机制或生物学作用)；并且

s)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明， 并且不应该被以任何方式解释为或者认为限制本发明和/或附上的权利要 求的范围，除非本文中另外明确指明。

关于重链抗体及其可变结构域的概括描述，其中特别参考本文引用的 现有技术，参考Muyldermans在分子生物技术综述(Reviews in Molecular  Biotechnology)74(2001)，277-302中的综述论文；以及参考下述专利申请， 其作为公知背景技术提及：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527； Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的(the National Research Council of  Canada)WO 01/90190；抗体研究所(the Institute of Antibodies)的WO 03/025020(＝EP 1 433 793)；以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.) 的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786， WO 06/122787和WO 06/122825，和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx  N.V.)的其它公布的专利申请。还参考在这些申请中提及的其它现有技术， 并且特别参考在国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表， 该列表和参考文献通过引用结合于此。

按照本领域中所用的术语学(参见上述参考文献)，在天然存在的重 链抗体中存在的可变结构域还叫作“V_HH结构域”，以将它们与在常规的 4-链抗体中存在的重链可变结构域(其在下文中叫作“V_H结构域”)区分， 以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域(其在下文中叫作“V_L结构域”)区分。

如在上文提到的现有技术中提及，V_HH结构域具有许多独特的结构特 征和功能特性，这使得分离的V_HH结构域(以及基于此的纳米抗体，其与 天然存在的V_HH结构域享有这些结构特征和功能特性)以及包含其的蛋白 高度有利地用作功能性抗原-结合结构域或蛋白。特别地，并且不限于此， V_HH结构域(其天然地被“设计”为功能性结合抗原，而无需存在轻链可 变结构域，并且无需与轻链可变结构域的任何相互作用)和纳米抗体可以 作用为单一的、相对小的、功能性抗原-结合结构单位、结构域或蛋白。 这将V_HH结构域与常规4-链抗体的V_H和V_L结构域区分开，其本身通常 不适合作为单一抗原-结合蛋白或结构域用于实际应用，但是需要以某种 形式或另一种形式组合以提供功能性抗原-结合单位(例如，在常规抗体 片段诸如Fab片段中；在ScFv’s片段中，其由共价连接到V_L结构域上的 V_H结构域组成)。

由于这些独特的特性，V_HH结构域和纳米抗体用作单一抗原-结合蛋 白或用作抗原-结合结构域(即，作为更大的蛋白或多肽的部分)提供许 多优于常规V_H和V_L结构域、scFv’s或常规抗体片段(诸如Fab-或F(ab’)₂- 片段)应用的显著优点：

-只需要单结构域来以高亲和力和高选择性结合抗原，以致不需要存在 两个分开的结构域，也不需要保证这两个结构域以正确的空间构象和 构型(即，通过使用专门设计的接头，如同scFv’s)存在；

-V_HH结构域和纳米抗体可以从单一基因表达，并且不需要翻译后折叠 或修饰；

-V_HH结构域和纳米抗体可以容易地加工成多价和多特异性形式(如本 文进一步所讨论)；

-V_HH结构域和纳米抗体高度可溶，并且没有聚集倾向(如同Ward等，自 然(Nature)，341卷，1989，第544页所述的来源于小鼠的“dAb’s”)；

-V_HH结构域和纳米抗体对热、pH、蛋白酶和其它变性剂或条件高度稳 定(参见，例如，Ewert等，同前所述)；

-V_HH结构域和纳米抗体制备容易并且相对廉价，即使以生产需要的规 模制备。例如，V_HH结构域、纳米抗体和包含其的蛋白/多肽可以使用 微生物发酵生产(例如，下文进一步所述)，并且不需要使用哺乳动 物表达系统，如同例如常规抗体片段；

-与常规4-链抗体及其抗原-结合片段相比，V_HH结构域和纳米抗体相对 较小(大约15kDa，或比常规IgG小9倍)，并且因此表现出比所述 常规4-链抗体及其抗原-结合片段更高的组织(包括但不限于实体瘤 和其它致密组织)穿透性；

-V_HH结构域和纳米抗体可以表现出所谓的腔-结合(cavity-binding)特 性(与常规V_H结构域相比，尤其由于它们延长的CDR3环)，并且因 此还可以接近常规4-链抗体及其抗原-结合片段不能接近的靶标和表 位。例如，已经表明V_HH结构域和纳米抗体可以抑制酶(参见，例如， WO 97/49805；Transue等，Proteins(蛋白质)1998年9月1日；32(4)： 515-22；Lauwereys等，EMBO J.1998年7月1日；17(13)：3512-20)。

在一个具体且优选的方面中，本发明提供针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的纳 米抗体，更优选针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4的纳米抗体，更 优选针对Tie2或Ang2的纳米抗体；且特别是针对来自温血动物的Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6的纳米抗体，更优选针对来自温血动物的Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4的纳米抗体，更优选针对来自温血动物的Tie2或Ang2 的纳米抗体，且更特别地是针对来自哺乳动物的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6的纳 米抗体，更优选针对来自哺乳动物的Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4 的纳米抗体，更优选针对来自哺乳动物的Tie2或Ang2的纳米抗体，且尤 其是针对人Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6的纳米抗体，更优选针对人Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4的纳米抗体，更优选针对人Tie2或Ang2的纳米抗体； 以及包括至少一种所述纳米抗体的蛋白和/或多肽。

特别地，本发明提供针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2的纳米抗体，和包括其 的蛋白和/或多肽，与常规针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2的抗体或其片段相比， 与可基于所述常规抗体或抗体片段的构建体(如Fab’片段，F(ab’)₂片段， ScFv构建体，“二抗体”和其他多特异性构建体(参见例如Holliger和 Hudson，Nat Biotechnol.(自然生物技术)2005年9月；23(9)：1126-36)的综 述)相比，且还与所谓的“dAb’s”或可能来源于常规抗体的可变结构域相 似的(单)结构域抗体相比，其具有提高的治疗和/或药学特性和/或其他 有利特性(诸如，例如，提高的制备容易性和/或减少的商品成本)。这些 提高的和有利的特性将通过本文的进一步描述变得清楚，且例如包括但不 限于，下述各项的一种或多种：

-提高的针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2的亲和力和/或抗体亲抗 原性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多 特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；

-对于以多价形式(例如，以二价形式)格式化的更好的适合性；

-对于以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之)格式化 的更好的适合性；

-提高的对“人源化”置换(如本文定义)的适合性或易感性；

-更小的免疫原性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式) 和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；

-增加的稳定性，不论以单价形式，以多价形式(例如，以二价形式) 和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式之一)；

-增加的针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2的特异性，不论以单价 形式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例 如，下文所述的多特异性形式之一)；

-减少或在需要时提高与来自不同物种的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优 选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的交叉反 应性；

和/或

-一种或多种对药学应用(包括预防应用和/或治疗应用)和/或诊断应 用(包括但不限于成像目的)理想的其他改善的特性，不论以单价形 式，以多价形式(例如，以二价形式)和/或以多特异性形式(例如， 下文所述的多特异性形式之一)。

如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，本发明的纳米抗体优选以 基本上分离的形式(如本文定义)存在，或形成本发明的蛋白或多肽(如 本文定义)的一部分，其可以包括一个或多个本发明的纳米抗体或基本上 由其组成，且其可以任选地还包括一个或多个其他氨基酸序列(所有任选 地通过一个或多个适当的接头连接)。例如，且不限于，所述本发明的一 个或多个氨基酸序列可以在所述蛋白或多肽中用作结合单位，其可以任选 地包含一个或多个可以作为结合单位的其他氨基酸序列(即，针对除Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或 Ang2外的一个或多个其他的靶标)，以分别提供单价的、多价的或多特异 性的本发明的多肽，所有均如本文所述。特别地，这样的蛋白或多肽可以 包括一个或多个本发明的纳米抗体和任选地一个或多个(其他)纳米抗体 或基本上由其组成(即，针对除Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2外的其他的靶标)，所有均任选地 通过一个或多个适当的接头连接，以分别提供单价的、多价的或多特异性 的纳米抗体构建体，如本文进一步所述。这样的蛋白或多肽也可以以基本 上分离的形式(如本文定义)存在。

在本发明的纳米抗体中，用于针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2， Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2结合的结合位点优选 地由CDR序列形成。任选地，本发明的纳米抗体还可以，且除了用于针 对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4， Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选 Tie2或Ang2结合的至少一个结合位点之外，包含一个或多个用于针对其 他抗原、蛋白或靶标结合的其他结合位点。对于引入所述第二结合位点的 方法和位置，例如，参考Keck和Huston，Biophysical Journal，(生物物理 学杂志)71，1996年10月，2002-2011；EP 0 640 130；WO 06/07260和埃博 灵克斯股份有限公司于2006年11月27日提交的题目为“具有多个结合 位点的免疫球蛋白结构域(Immunoglobulin domains with multiple binding  sites)”的美国临时申请。

如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，当意欲将本发明的纳米抗 体(或包括其的本发明的多肽)施用给受试者时(例如，用于治疗和/或 诊断目的，如本文所述)，它优选地针对人Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针 对人Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对人Tie2或Ang2；而 对于兽医用目的，它优选地针对来自被治疗的物种的Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2。此外， 如使用本发明的氨基酸序列，本发明的纳米抗体可以或可以不是交叉反应 的(即，针对来自两种或多种哺乳动物物种的Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2，如针对人Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或 Ang2和来自本文提及的哺乳动物物种中的至少一种的Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2)。

此外，同样如本文关于本发明的氨基酸序列概括所述，本发明的纳米 抗体可以通常针对Fie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选Tie2或Ang2的任何抗原决定簇、表位、部分、结构域、 亚单位或构象(在适用的情形中)。然而，通常假定并且优选本发明的纳 米抗体(和包括其的多肽)针对Tie2上的Ang1结合位点或Ang2上的Tie2 结合位点。

如本文已经所述，可以认为纳米抗体的氨基酸序列和结构----然而， 不限于此----包括4个构架区或“FR’s”(或有时还称为“FW’s”)，其在本领 域和本文中分别称为“构架区1”或“FR1”；“构架区2”或“FR2”；“构架区3” 或“FR3”；和“构架区4”或“FR4”；所述构架区由3个互补性决定区或 “CDR’s”中断，其在本领域分别称为“互补性决定区1”或“CDR1”；“互补性 决定区2”或“CDR2”；和“互补性决定区3”或“CDR3”。在本发明的纳米抗 体中存在的一些优选的构架序列和CDR’s(及其组合)如本文所述。其他 适当的CDR序列可以通过本文所述的方法获得。

按照本发明的非限制性但是优选的方面，本发明的纳米抗体(其中存 在的CDR序列)是这样的，即：

-所述纳米抗体可以以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(K_D)(即， 以10⁵-10¹²升/摩尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且 更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(K_A))结合Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或 Ang2；

和/或是这样的，即：

-所述纳米抗体可以以10²M^-1s^-1-约10⁷M^-1s^-1，优选10³M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，更优选10⁴M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，诸如10⁵M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1的k_on- 速率结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4， 或Angptl4，更优选Tie2或Ang2；

和/或是这样的，即：

-所述纳米抗体可以以1s^-1(t_1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t_1/2的 几乎不可逆的复合体)，优选10^-2s^-1-10^-6s^-1，更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1， 诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的k_off速率结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优 选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2。

优选地，本发明的纳米抗体(其中存在的CDR序列)是这样的，即： 本发明的单价纳米抗体(或包含仅一个本发明的纳米抗体的多肽)优选是 这样，以致它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸 如小于500pM的亲和力结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2。

本发明的纳米抗体针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2的亲和力可以以本身已 知的方式确定，例如，使用本文提及的用于测量K_D.K_A，k_off或k_on的通用 技术，以及本文所述的一些具体的测定法确定。

对于本发明的纳米抗体(和包括其的多肽)与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优 选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2结合的一些优 选的IC50值将通过本发明的进一步描述和实施例而变得清楚。

在一个优选而非限制性方面中，本发明涉及针对Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2 纳米抗体(如本文定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个 互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：

-CDR1选自由下列各项组成的组：

a)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和/或

-CDR2选自由下列各项组成的组：

d)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和/或

-CDR3选自由下列各项组成的组：

g)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

h)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

或所述氨基酸序列的任何适当的片段。

特别地，按照该优选而非限制性的方面，本发明涉及针对Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对 Tie2或Ang2纳米抗体(如本文定义)，其由4个构架区(分别为FR1-FR4) 和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成，其中：

-CDR1选自由下列各项组成的组：

a)SEQ ID NO’s：173-219的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

c)与SEQ ID NO’s：173-219的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和

-CDR2选自由下列各项组成的组：

d)SEQ ID NO’s：267-313的氨基酸序列；

e)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

f)与SEQ ID NO’s：267-313的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

和

-CDR3选自由下列各项组成的组：

g)SEQ ID NO’s：361-454的氨基酸序列；

h)与SEQID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有至少80％的氨 基酸同一性的氨基酸序列；

i)与SEQ ID NO’s：361-454的至少一种氨基酸序列具有3，2或1个氨 基酸差异的氨基酸序列；

或所述氨基酸序列的任何适当的片段。

如本文关于本发明的氨基酸序列概括提及的，当本发明的纳米抗体包 含一个或多个b)和/或c)所述的CDR1序列时：

i)与a)所述的相对应CDR相比，在b)和/或c)所述的这样的CDR中的任 何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与a)所述的相对应CDR相比，b)和/或c)所述的CDR优选地仅包含氨 基酸置换，并且没有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式， b)和/或c)所述的CDR可以是来源于a)所述的CDR的CDR。

类似地，当本发明的纳米抗体包含一个或多个e)和/或f)所述的CDR2 时：

i)与d)所述的相对应CDR相比，在e)和/或f)所述的这样的CDR中的任 何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与d)所述的相对应CDR相比，e)和/或f)所述的CDR优选地仅包含氨 基酸置换，并且没有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式， e)和/或f)所述的CDR可以是来源于d)所述的CDR的CDR。

此外，类似地，当本发明的纳米抗体包含一个或多个h)和/或i)所述 的CDR3时：

i)与g)所述的相对应CDR相比，在h)和/或i)所述的这样的CDR中的任 何氨基酸置换优选是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与g)所述的相对应CDR相比，h)和/或i)所述的CDR优选地仅包含氨 基酸置换，并且没有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)利用一种或多种本身已知的亲和力成熟技术通过亲和力成熟的方式， h)和/或i)所述的CDR可以是来源于g)所述的CDR的CDR。

应该理解，最后三个段落总体上适用于分别包括b)，c)，e)，f)，h)或i) 所述的一个或多个CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列的本发明的 任何纳米抗体。

在本发明的纳米抗体中，包括上面明确地列举的一个或多个CDR的 纳米抗体是特别优选的；包括上面明确地列举的两个或多个CDR的纳米 抗体是更特别优选的；和包括上面明确地列举的三个CDR的纳米抗体是 最特别优选的。

一些特别优选的，但非限制性的CDR序列的组合，以及优选的CDR 序列和构架序列的组合在下面的表A-1中提及，该表列举了存在于大量优 选的(但非限制的)本发明的纳米抗体中的CDR序列和构架序列。如专业 技术人员所清楚的，在相同克隆中出现的CDR1、CDR2和CDR3序列的 组合(即，在表A-1中同一行中提及的CDR1、CDR2和CDR3序列)通常 将是优选的(尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，并且还包括表A-1 中提及的CDR序列的其他适当的组合)。此外，在同一克隆中出现的CDR 序列和构架序列的组合(即，在表A-1中同一行中提及的CDR序列和构架 序列)通常将是优选的(尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，并且还 包括表A-1中提及的CDR序列和构架序列的其他适当的组合，以及所述 CDR序列和其他适当的构架序列的组合，例如，如本文进一步所述)。

此外，在包括表A-1中提及的CDR的组合的本发明的纳米抗体中， 每个CDR可以被选自由与所提及的CDR具有至少80％，优选至少90％， 更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性(如本文所定义)的氨基 酸序列组成的组的CDR替换；其中：

i)与表A-1中提及的相应CDR序列相比，所述CDR中的任何氨基酸置 换优选地是保守氨基酸置换(如本文所定义)；

和/或

ii)与表A-1中提及的相应CDR序列相比，任何所述CDR序列优选地仅 含有氨基酸置换，且不含有氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)任何所述CDR序列是这样的CDR，其通过本身已知的亲和力成熟技 术并且特别地从表A-1中提及的相应CDR序列开始衍生。

然而，如专业技术人员所清楚的，表A-1中提及的CDR序列(的组合)， 以及CDR序列和构架序列(的组合)通常将是优选的。

因此，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序列的 至少一个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列 组成的组；或选自分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序 列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更 优选至少99％“序列同一性”(如本文所定义)的CDR1，CDR2和CDR3序 列的组；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3 序列的至少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”(如本文所定义)的 CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组。

在该上下文中，通过“适当地选择”是指，根据适用的情况，分别地， CDR1序列选自适当的CDR1序列(即，如本文所定义)，CDR2序列选 自适当的CDR2序列(即，如本文所定义)，和CDR3序列选自适当的CDR3 序列(即，如本文所定义)。更具体地，CDR序列优选地这样选择，以致 本发明的纳米抗体以如本发明所定义的亲和力(适当测量和/或表示为K_D- 值(实际的或表观的)，K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速率和/或k_off-速率， 或备选地作为IC₅₀值，如本文进一步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优 选结合Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选结合Tie2或Ang2 Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选结合Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，or Angptl4，更优选结合 Tie2或Ang2。

具体地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自 由表A-1中列举的CDR3序列组成的组或选自与表A-1中列举的CDR3 序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至 更优选至少99％序列同一性的CDR3序列的组；和/或选自由与表A-1中 列举的CDR3序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR3序 列组成的组。

优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序 列的至少两个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3 序列组成的组；或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和 CDR3序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％， 甚至更优选至少99％序列同一性的CDR1，CDR2和CDR3序列组成的组； 和/或选自由分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至 少一个具有3，2或仅1个“氨基酸差异”的CDR1，CDR2和CDR3序 列组成的组。

具体地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自 由表A-1中列举的CDR3序列组成的组或选自与表A-1中列举的CDR3 序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至 更优选至少99％序列同一性的CDR3序列的组；和存在的CDR1和CDR2 序列的至少一个适当地选自由分别在表A-1中分别列举的CDR1和CDR2 序列组成的组或选自分别与表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列的 至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选 至少99％序列同一性的CDR1和CDR2序列的组；和/或选自由分别与表 A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列的至少一个具有3，2或仅1个氨 基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。

最优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有三个CDR1，CDR2 和CDR3序列适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3 序列组成的组或选自分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3 序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至 更优选至少99％序列同一性的CDR1，CDR2和CDR3序列的组；和/或选 自由分别与表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的至少一个 具有3，2或仅1个“氨基酸差异”的CDR1，CDR2和CDR3序列组成 的组。

甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3 序列的至少一个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3 序列组成的组。优选地，在此方面，存在的其他两个CDR序列的至少一 个或优选两个适当地选自与表A-1中分别列举的相应CDR序列的至少一 个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％ 序列同一性的CDR序列；和/或选自由分别与表A-1中分别列举的相应序 列的至少一个具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。

具体地，在本发明的纳米抗体中，至少存在的CDR3序列适当地选自 由表A-1中列举的CDR3序列组成的组。优选地，在此方面，存在的CDR1 和CDR2序列中的至少一个且优选两个适当地分别选自与表A-1中分别列 举的CDR1和CDR2序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％， 甚至更优选至少99％序列同一性的CDR1和CDR2序列的组；和/或分别 选自由与表A-1中分别列举的CDR1和CDR2序列具有3，2或仅1个氨 基酸差异的CDR1和CDR2序列组成的组。

甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3 序列的至少两个适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3 序列组成的组。优选地，在此方面，存在的其余CDR序列适当地选自与 表A-1中列举的相应CDR序列的至少一个具有至少80％，优选至少90％， 更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同一性的CDR序列的组；和 /或选自由与表A-1中列举的相应序列的至少一个具有3，2或仅1个氨基 酸差异的CDR序列组成的组。

具体地，在本发明的纳米抗体中，至少CDR3序列适当地选自由表 A-1中列举的CDR3组成的组，并且CDR1序列或CDR2序列适当地分别 选自由表A-1中列举的CDR1和CDR2序列组成的组。优选地，在此方 面，存在的其余的CDR序列适当地选自与表A-1中列举的相应CDR序 列的至少一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更 优选至少99％序列同一性的CDR序列的组；和/或选自由与表A-1中列举 的相应CDR序列具有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。

甚至更优选地，在本发明的纳米抗体中，存在的所有三个CDR1， CDR2和CDR3序列适当地选自由表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和 CDR3序列组成的组。

此外，通常，表A-1中列举的CDR的组合(即，表A-1中同一行上提 及的那些)是优选的。因此，通常优选，当本发明的纳米抗体中的CDR是 表A-1中提及的CDR序列或适当地选自与表A-1中列举的CDR序列具 有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序 列同一性的CDR序列的组；和/或选自由与表A-1中列举的CDR序列具 有3，2或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组时，其他CDR中的至 少一个和优选两个适当地选自属于表A-1中相同组合的CDR序列(即表 A-1中同一行上提及的)或适当地选自与属于同一组合的CDR序列具有至 少80％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％序列同 一性的CDR序列的组和/或选自由与属于同一组合的CDR序列具有3，2 或仅1个氨基酸差异的CDR序列组成的组。上述段落中指出的其他优选 项也适用于表A-1中提及的CDR的组合。

因此，借助于非限制性实例，本发明的纳米抗体可以例如包括与表 A-1中提及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列，与 表A-1中提及的CDR2序列之一(但属于不同的组合)具有3，2或1个氨 基酸差异的CDR2序列，和CDR3序列。

本发明的一些优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表A-1中提及的 CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列；与表A-1中提及 的CDR2序列之一(但属于不同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR2 序列；和与表A-1中提及的CDR3序列之一(但属于不同的组合)具有超过 80％序列同一性的CDR3序列；或(2)与表A-1中提及的CDR1序列之一 具有超过80％序列同一性的CDR1序列；CDR2序列，和表A-1中列举的 CDR3序列之一；或(3)CDR1序列；与表A-1中列举的CDR2序列之一具 有超过80％序列同一性的CDR2序列；和与表A-1中提及的CDR3序列(属 于与CDR2序列相同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR3序列。

本发明的一些特别优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表A-1中提 及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列；与表A-1中 提及的CDR2序列(属于相同的组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR2 序列；和与表A-1中提及的CDR3序列(属于相同的组合)具有超过80％ 序列同一性的CDR3序列；(2)CDR1序列；表A-1中列举的CDR2和表 A-1中列举的CDR3序列(其中CDR2序列和CDR3序列可以属于不同的 组合)。

本发明的一些甚至更优选的纳米抗体可以例如包括：(1)与表A-1中 提及的CDR1序列之一具有超过80％序列同一性的CDR1序列；表A-1中 列举的属于同一组合的CDR2序列；和表A-1中提及的属于不同的组合的 CDR3序列；或(2)表A-1中提及的CDR1序列；与表A-1中提及的CDR2 序列(属于同一组合)具有3，2或1个氨基酸差异的CDR2序列；和与 表A-1中列举的CDR3序列(属于相同或不同的组合)具有超过80％序 列同一性的CDR3序列。

本发明的特别优选的纳米抗体可以例如包括表A-1中提及的CDR1 序列，与表A-1中提及的CDR2序列(属于相同的组合)具有超过80％ 序列同一性的CDR2序列；和表A-1中提及的属于相同的组合的CDR3 序列。

在本发明的最优选的纳米抗体中，存在的CDR1，CDR2和CDR3序 列适当地选自表A-1中分别列举的CDR1，CDR2和CDR3序列的组合之 一。

根据本发明的另一优选的但非限制性的方面，(a)CDR1具有1和12 个氨基酸残基之间，和通常2和9个氨基酸残基之间，诸如5，6或7个 氨基酸残基的长度；和/或(b)CDR2具有13和24个氨基酸残基之间，和 通常15和21个氨基酸残基之间，诸如16和17个氨基酸残基的长度；和 /或(c)CDR3具有2和35个氨基酸残基之间，和通常3和30个氨基酸残 基之间，诸如6和23个氨基酸残基之间的长度。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及一种纳米抗体，其中 CDR序列(如本文所定义)具有与SEQ SEQ ID NO’s：455-501，更优选 455-457，459，460，464-469的氨基酸序列的至少一个的CDR序列具有超过 80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多的序列同一性(如 本文所定义)。

通常，具有上述CDR序列的纳米抗体可以如本文进一步所述，并且 优选地具有也如本文进一步所述的构架序列。因此，例如和如本文所提及， 所述纳米抗体可以是天然存在的纳米抗体(来自任何适当的物种)，天然 存在的V_HH序列(即，来自适当的骆驼物种)或合成的或半合成的氨基酸 序列或纳米抗体，包括但不限于部分人源化的纳米抗体或V_HH序列，完全 人源化的纳米抗体或V_HH序列，骆驼源化的重链可变结构域序列，以及已 经通过本文提及的技术获得的纳米抗体。

因此，在一个具体而非限制性的方面中，本发明涉及人源化的纳米抗 体，其由4个构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为 CDR1-CDR3)组成，其中CDR1-CDR3如本文所定义，且其中所述人源 化的纳米抗体包括至少一个人源化置换(如本文定义)，且特别地是在其 至少一个构架序列(如本文定义)中的至少一个人源化置换。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及一种纳米抗体，其中 CDR序列与SEQ ID NO’s：455-501，更优选455-457，459，460，464-469的 氨基酸序列的至少一个的CDR序列具有至少70％氨基酸同一性，优选至 少80％氨基酸同一性，更优选至少90％氨基酸同一性，诸如95％氨基酸 同一性或更多或甚至基本上100％氨基酸同一性。此氨基酸同一性程度可 以例如通过确定所述纳米抗体和SEQ ID NO’s：455-501，更优选455-457， 459，460，464-469的序列的一个或多个之间的氨基酸同一性程度(以本文 所述的方式)来确定，其中忽略形成构架区的氨基酸残基。所述纳米抗体 可以如本文进一步所述。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及具有这样的氨基酸序 列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s：455-501，更优选 455-457，459，460，464-469组成的组或选自由与SEQ ID NO’s：455-501，更 优选455-457，459，460，464-469的氨基酸序列的至少一个具有超过80％， 优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％或更多序列同一性(如本文所 定义)的氨基酸序列组成的组。

本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及SEQ ID NO’s：455-501， 更优选455-457，459，460，464-469的纳米抗体的人源化变体，其与相应的 天然V_HH序列相比，包括至少一个人源化置换(如本文所定义)和特别地在 其构架序列(如本文所定义)的至少一个中的至少一个人源化置换。

专业技术人员应该清楚，本文提及为“优选的”(或“更优选的”、“甚 至更优选的”、等等)纳米抗体也是优选的(或更优选的，或甚至更优选 的，等等)用于本文所述的多肽中。因此，包括一个或多个“优选的”本 发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是优选的，且包括一个或 多个“更优选的”本发明的纳米抗体或基本上由其组成的多肽通常将是更 优选的。

一般地，包括单一纳米抗体(如本发明的单一纳米抗体)或基本上由 其组成的蛋白或多肽在本文称为“单价的”蛋白或多肽或称为“单价的构 建体”。包括两个或多个纳米抗体(如至少两个本发明的纳米抗体或至少 一个本发明的纳米抗体和至少一个其他纳米抗体)或基本上由其组成的蛋 白和多肽在本文称为“多价的”蛋白或多肽或称为“多价的构建体”，且 与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以提供某些优点。通过 本文的进一步描述，所述多价构建体的一些非限制性的实例将变得清楚。

按照一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少两个本发明 的纳米抗体、如两个或三个本发明的纳米抗体或基本上由其组成。如本文 进一步所述，与包括本发明的单一纳米抗体或基本上由其组成的蛋白或多 肽相比较，所述多价构建体可以提供某些优点，如提高很多的对于Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选对于Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选对于 Tie2或Ang2的抗体亲抗原性。基于本文的公开内容，对于专业技术人员 来说所述多价构建体将是清楚的。

按照另一个具体而非限制性的方面，本发明的多肽包括至少一个本发 明的纳米抗体和至少一个其他结合单位(即，针对另一个表位、抗原、靶 标、蛋白或多肽)或基本上由其组成，所述其他结合单位优选地也是纳米 抗体。所述蛋白或多肽在本文还称为“多特异性”蛋白或多肽，或称为“多 特异性构建体”，且与相对应的本发明的单价纳米抗体相比较，这些可以 提供某些优点(如从本文对一些优选的、但非限制性的多特异性构建体的 进一步讨论中将变得清楚)。基于本文的公开内容，对于专业技术人员来 说所述多特异性的构建体将是清楚的。

按照另一个具体的但非限制性的方面，本发明的多肽包括至少个本 发明的纳米抗体、任选地一个或多个其他纳米抗体、和至少一个赋予本发 明的纳米抗体和/或赋予所得到的融合蛋白至少一种需要的特性的其他氨 基酸序列(如蛋白或多肽)，或基本上由其组成。同样地，与相对应的本 发明的单价纳米抗体相比较，所述融合蛋白可以提供某些的优点。所述免 疫球蛋白序列和所述融合构建体的一些非限制性的实例将通过本文的进 一步描述变得清楚。

还可以组合两个或多个上述方面，例如，以提供三价双特异性构建体， 其包括两个本发明的纳米抗体，和一个其他的纳米抗体，和任选地一个或 多个其他的氨基酸序列。所述构建体的其他非限制性的实例，以及在本发 明的情形中特别优选的一些构建体，将通过本文的进一步描述变得清楚。

在上述构建体中，所述一个或多个纳米抗体和/或其他氨基酸序列可 以直接彼此连接和/或适当地通过一个或多个接头序列彼此连接。所述接 头的一些适合的但非限制性的实例将通过本文的进一步所述变得清楚。

在本发明的一个具体的方面中，与本发明相对应的氨基酸序列相比 较，本发明的纳米抗体或包括至少一个本发明的纳米抗体的本发明的化合 物、构建体或多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步公开的内容， 专业技术人员应该清楚所述纳米抗体、化合物和多肽的一些优选的但非限 制性的实例，且例如，包括已经进行化学修饰(例如，通过聚乙二醇化) 提高其半衰期的本发明的纳米抗体序列或多肽；包括至少一个用于结合血 清蛋白(如血清白蛋白，参见例如埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.) 于2006年11月27日提交的题目为“具有多个结合位点的免疫球蛋白结 构域(Immunoglobulin domains with multiple binding sites)”的美国临时中 请)的额外的结合位点的本发明的氨基酸序列；或包括至少一个与至少一 个增加本发明的纳米抗体的半衰期的结构部分(且特别是至少一个氨基酸 序列)连接的本发明的纳米抗体的本发明的多肽。基于本文进一步的公开 内容，专业技术人员应该清楚包括所述半衰期延长结构部分或氨基酸序列 的本发明的多肽的实例；且例如包括，不限于，这样的多肽，其中所述一 个或多个本发明的纳米抗体适当地与下列各项连接：一个或多个血清蛋白 或其片段(如血清白蛋白或其适当的片段)，或一个或多个可以结合血清 蛋白的结合单位(如例如，可以结合血清蛋白如血清白蛋白、血清免疫球 蛋白如IgG、或运铁蛋白的纳米抗体或(单)结构域抗体)；其中本发明 的纳米抗体与Fc部分(如人Fc)或其适当的部分或片段连接的多肽；或 其中所述一个或多个本发明的纳米抗体适当地与可以结合血清蛋白的一 个或多个小蛋白或肽连接的多肽(诸如，不限于，记载在WO 91/01743，WO 01/45746，WO 02/076489和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于 2006年12月5日提交的题目为“能够结合血清蛋白的肽(Peptides capable  of binding to serum proteins)”的埃博灵克斯股份有限公司的美国临时申 请)。

同样地，如专业技术人员应该清楚的，所述纳米抗体、化合物、构建 体或多肽可以包含个或多个另外的基团、残基、结构部分或结合单位， 如个或多个另外的氨基酸序列且特别是一个或多个另外的纳米抗体 (即，不针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选不针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选不针对Tie2或Ang2)，以提供三或多特异性纳米抗体构 建体。

一般地，具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体(或包括其的化合物、 构建体或多肽)优选地具有是相对应的本发明的氨基酸序列本身的半衰期 的至少1.5倍、优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20 倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的氨基酸序列本身相比，具有增加 的半衰期的本发明的纳米抗体、化合物、构建体或多肽可以具有增加超过 1小时，优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚 至超过24、48或72小时的半衰期。

在本发明的一个优选而非限制性方面中，所述本发明的纳米抗体、化 合物、构建体或多肽在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更 优选至少48小时、甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如， 本发明的化合物或多肽可以具有至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9 天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少约 11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更多)、 或超过14天(诸如约14-19天)的半衰期。

在本发明的另一个方面中，本发明的多肽包括与允许所得到的本发明 的多肽穿过血脑屏障的一个或多个(诸如两个并且优选一个)氨基酸序列 连接(任选地通过一个或多个适当的接头序列连接)的一个或多个(诸如 两个或优选一个)本发明的纳米抗体。特别地，允许所得到的本发明的多 肽穿过血脑屏障的所述一个或多个氨基酸序列可以是一个或多个(诸如两 个并且优选一个)纳米抗体，诸如在WO 02/057445中所述的纳米抗体， 其中FC44(WO 06/040153的SEQ ID NO：189)和FC5(WO 06/040154的 SEQ ID NO：190)是优选的实例。

特别地，包括一个或多个本发明的纳米抗体的多肽优选是这样的，以 致它们：

-以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并 且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(K_D)(即，以10⁵-10¹²升/摩 尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(K_A))结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选结合 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选结合Tie2或Ang2；

和/或这样，以致它们：

-以10²M^-1s^-1-约10⁷M^-1s^-1，优选10³M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，更优选10⁴M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，诸如10⁵M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1的k_on-速率结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选结合Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选 结合Tie2或Ang2；

和/或这样，以致它们：

-以1s^-1(t_1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t_1/2的几乎不可逆的复合 体)，优选10^-2s^-1-10^-6s^-1，更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1，诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的k_off速率结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选结合Tie2， Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选结合Tie2或Ang2。

优选地，包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽优选是这样，以致它 将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500 pM的亲和力结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选结合Tie2，Ang2，Ang1，Ang4， 或Angptl4，更优选结合Tie2或Ang2。在这一方面中，专业技术人员应该 清楚，与包含仅一个本发明的氨基酸序列的多肽相比较，包含两个或多个 本发明的纳米抗体的多肽可以以增加的抗体亲抗原性结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，更优选结合Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选结合 Tie2或Ang2。

对于关于本发明的氨基酸序列或多肽与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2结合的一些优选 的IC₅₀值将从本发明的进一步描述和实施例中变得清楚。

例如，按照本发明的这一优选方面的其他多肽可以选自由与SEQ ID  NO’s：455-501，更优选地，455-457，459，460，464-469的氨基酸序列中 的一个或多个具有超过80％，更优选超过90％，更优选超过95％，诸如 99％或更多“序列同一性”(如本文定义)的氨基酸序列组成的组，其中 在所述氨基酸序列中包括的纳米抗体优选如本文进一步所定义。

本发明的另一个方面涉及编码本发明的纳米抗体或包括其的本发明 的多肽的核酸。同样地，如本文关于本发明的核酸概括所述，这样的核酸 可以以遗传构建体的形式存在，如本文定义。

在另一个方面中，本发明涉及表达或能够表达本发明的纳米抗体和/ 或包括其的本发明的多肽的宿主或宿主细胞；和/或包含本发明的核酸的 宿主或宿主细胞。通过本文进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优 选的但非限制性的实例将变得清楚。

本发明的另一个方面涉及包含或包括至少一个本发明的纳米抗体、至 少一个本发明的多肽和/或至少一个本发明的核酸的产品或组合物，和任 选地本身已知的所述组合物的一种或多种其他成分，即，取决于所述组合 物的目的用途。例如，所述产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)， 兽医用组合物或用于诊断应用(也如本文所述)的产品或组合物。通过本 文进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选的但非限制性的实例将变 得清楚。

本发明还涉及用于制备或产生本文所述的纳米抗体、多肽、核酸、宿 主细胞、产品和组合物的方法。通过本文进一步的描述，所述方法的一些 优选的但非限制性的实例将变得清楚。

本发明还涉及本文所述的纳米抗体、多肽、核酸、宿主细胞、产品和 组合物的应用和用途，以及用于预防和/或治疗与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优 选与Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选与Tie2或Ang2相关的疾 病和病症的方法。通过本文进一步的描述，一些优选的但非限制性的应用 和用途的实例将变得清楚。

通过下文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用 也变得清楚。

一般地，应该注意，术语纳米抗体在用于本文时在其最广泛意义上不 限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，如在下文更详细讨论的， 本发明的纳米抗体通常可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体 的V_HH结构域；(2)通过表达编码天然存在的V_HH结构域的核苷酸序列； (3)通过将天然存在的V_HH结构域“人源化”(如本文所述)或者通过表 达编码这样的人源化V_HH结构域的核酸；(4)通过将来自于任何动物物种 且特别是哺乳动物物种诸如来自于人类的天然存在的V_H结构域“骆驼源 化”(如本文所述)，或者通过表达编码这样的骆驼源化的V_H结构域的核 酸；(5)通过如Ward等(同前所述)所述将“结构域抗体”或“Dab”“骆驼 源化”，或者通过表达编码这样的骆驼源化V_H结构域的核酸；(6)应用用 于制备本身已知的蛋白、多肽或其它氨基酸序列的合成或半合成技术；(7) 通过应用本身已知的核酸合成技术制备编码纳米抗体的核酸，然后表达这 样获得的核酸；和/或(8)通过前述一种或多种的任何结合。基于本文的公 开内容，专业技术人员应该清楚实行前述的适当的方法和技术，并且例如 包括本发明更详细描述的方法和技术。

一个优选的纳米抗体种类对应于针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的天然存在的重 链抗体的V_HH结构域。如本文进一步所述，这样的V_HH序列通常可以这 样产生或获得：通过用Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选用Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选用Tie2或Ang2适当免疫骆驼科动物物种(即， 以产生针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4， 更优选Tie2或Ang2的免疫反应和/或重链抗体)，通过获得来自所述骆驼 科动物的适当的生物样品(诸如血液样品、血清样品或B-细胞样品)，并 且通过利用本身已知的任何适当技术从所述样品开始产生针对Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2 的V_HH序列。所述技术对于专业技术人员应该是清楚的，和/或在本文中 进一步所述。

备选地，所述针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的天然存在的V_HH结构域可以从 首次用于实验的骆驼科动物V_HH序列文库获得，例如，通过使用本身已知 的一种或多种筛选技术用Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2，或其至少一部分、片段、抗原决 定簇或表位筛选这样的文库。例如，这样的文库和技术记述在WO 99/37681，WO 01/90190，WO 03/025020和WO 03/035694中。备选地，可 以使用来源自首次用于实验的V_HH文库的改进的合成的或半合成的文库， 诸如通过诸如随机诱变和/或CDR重排的技术从首次用于实验的V_HH文库 获得的V_HH文库获得，如例如记述在WO 00/43507中。

因此，在另一个方面中，本发明涉及用于产生针对Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2 的纳米抗体的方法。在一个方面中，所述方法至少包括下列步骤：

a)提供纳米抗体序列的组、集合或文库；和

b)从所述纳米抗体序列的组、集合或文库中筛选可以结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2 或Ang2和/或具有针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的亲和力的纳米抗体序 列；

和

c)分离所述可以结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2和/或具有针对Tie1， Tie2，Ang 1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4， Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更 优选Tie2或Ang2的亲和力的一种或多种氨基酸序列。

在这样的方法中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是纳米抗 体序列的首次用于实验的组、集合或文库；纳米抗体序列的合成的或半合 成的组、集合或文库；和/或已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、 集合或文库。

在本方法的优选方面中，所述纳米抗体序列的组、集合或文库可以是 纳米抗体序列的免疫组、集合或文库，特别是，来自已经用Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2适当免疫 的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其抗原部分、片段、 区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科物种的V_HH序列的免疫 组、集合或文库。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部 分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。

在上述方法中，所述纳米抗体或V_HH序列的组、集合或文库可以被展 示在噬菌体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促 进筛选。用于展示和筛选纳米抗体序列(的组、集合或文库)的适当的方 法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如，基于 本发明进一步的公开内容。还参考WO 03/054016和Hoogenboom在Nature  Biotechnology(自然生物技术)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。

在另一个方面中，所述用于产生纳米抗体序列的方法包括至少下列步 骤：

a)提供来源于骆驼科物种的表达免疫球蛋白序列的细胞的集合或样品；

b)从所述细胞集合或样品中筛选：(i)表达可以结合Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或 Ang2和/或具有针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的亲和力的免疫球蛋白 序列的细胞；和(ii)表达重链抗体的细胞，其中子步骤(i)和(ii)可以基 本上按照单独一个筛选步骤或作为两个独立的筛选步骤以任何适当 的顺序进行，以提供至少一种表达可以结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选Tie2，Ang2，Ang 1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2和/ 或具有针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4， 或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的亲和力的重链抗体的细胞；

和

c)(i)从所述细胞分离存在于所述重链抗体中的V_HH序列；或(ii)从所 述细胞分离编码存在于所述重链抗体中的V_HH序列的核酸序列，然后 表达所述V_HH结构域。

在该方面所述的方法中，所述细胞的集合或样品可以是，例如，B细 胞的集合或样品。此外，在该方法中，细胞样品可以来源于已经用Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或 Ang2适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当的抗原决定簇(诸如其 抗原部分、片段、区域、结构域、环或其它表位)适当免疫的骆驼科动物。 在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细胞外部分、区域、结构域、 环或其他细胞外表位。

上述方法可以以任何适当的方式进行，这对于专业技术人员将是清楚 的。例如，参考EP 0 542 810，WO 05/19824，WO 04/051268和WO 04/106377。步骤b)的筛选优选地使用流式细胞术技术诸如FACS进行。 对于此，例如，参考Lieby等，血液(Blood)，卷97，No.12，3820。特别 参考在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的国际申请WO 06/079372 中记述的所谓的“纳米克隆^TM”技术。

在另一个方面中，所述用于产生针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的氨基酸序列的 方法可以包括至少下列步骤：

a)提供编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的组、集合或文库；

b)从所述核酸序列的组、集合或文库中筛选编码可以结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2 和/或具有针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选Tie2或Ang2的亲和性的重链抗体或纳米抗体序列的核酸 序列；

和

c)分离所述核酸序列，然后分别表达存在于所述重链抗体中的V_HH序列、或表达所述纳米抗体序列。

在这样的方法中，所述编码重链抗体或纳米抗体序列的核酸序列的 组、集合或文库可以是，例如，编码重链抗体或V_HH序列的首次用于实验 的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；编码纳米抗体序列的合 成的或半合成的组、集合或文库的核酸序列的组、集合或文库；和/或编 码已经进行了亲和力成熟的纳米抗体序列的组、集合或文库的核酸序列的 组、集合或文库。

在该方法的优选方面中，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以是编 码重链抗体或V_HH序列的核酸序列的免疫的组、集合或文库，所述核酸序 列来源于已经用Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选Tie2或Ang2适当免疫的、或用基于其或来源于其的适当 的抗原决定簇(诸如其抗原性部分、片段、区域、结构域、环或其它表位) 适当免疫的骆驼科动物。在一个特别的方面中，所述抗原决定簇可以是细 胞外部分、区域、结构域、环或其它细胞外表位。

在上述方法中，所述核苷酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌 体、噬菌粒、核糖体或适当的微生物(诸如酵母)上，如以促进筛选。用 于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适当 的方法、技术和宿主生物体对于本领域专业技术人员将是清楚的，例如， 基于本文进一步的公开内容。还参考WO 03/054016和Hoogenboom在自然 生物技术(Nature Biotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。

专业技术人员应该清楚，本文所述的方法的筛选步骤也可以作为选择 步骤进行。因此，术语“筛选”在用于本说明书时，可以包括选择、筛选 或选择和/或筛选技术的任何适当的组合。此外，当使用序列的组、集合 或文库时，它可以包含任何适当数量的序列，如1，2，3或约5，10，50，100， 500，1000，5000，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸或更多序列。

此外，上述氨基酸序列的组、集合或文库中的一个或多个或全部序列 可以通过理性的、或半经验的方法如计算机建模技术或生物统计学或数据 采掘(data mining)技术获得或定义。

此外，这样的组、集合或文库可以包括作为来自彼此的变体(例如， 具有设计的点突变或具有随机的位置)的一个、两个或多个序列，包括来 源于不同的天然多样性序列的组(例如，免疫文库)的多个序列，或不同 序列的任何其他来源(例如，如在Hoogenboom等，Nat Biotechnol(自然 生物技术)23：1105，2005和Binz等，Nat Biotechnol(自然生物技术)2005， 23：1247中所述)。所述序列的组、集合或文库可以展示在噬菌体颗粒、核 糖体、细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞的表面上，且在这些载体内与编码 所述氨基酸序列的核苷酸序列连接。这使得所述组、集合或文库易于进行 选择步骤，从而分离需要的本发明的氨基酸序列。更一般地，当将序列展 示在适当的宿主或宿主细胞上时，还可以(且习惯上)首先从所述宿主或 宿主细胞分离编码所需要的序列的核苷酸序列，然后通过在适当的宿主生 物体内适当表达所述核苷酸序列而获得所需要的序列。同样地，这可以以 本身已知的任何适当的方式进行，其是专业技术人员应该清楚的。

用于获得针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选Tie2或Ang2的V_HH序列或纳米抗体序列的另一种技术包 括适当地免疫能够表达重链抗体的转基因哺乳动物(即，以产生针对Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或 Ang2的免疫应答和/或重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得包含所述 V_HH序列或纳米抗体序列(编码其的编码核酸序列)的适当的生物样品(如 血液样品、血清样品或B-细胞样品)，然后使用本身已知的任何适当的技 术(如例如本文所述的任何方法或杂交瘤技术)由所述样品起始产生针对 Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4， Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选 Tie2或Ang2的V_HH序列。例如，为了该目的，可以使用记述在WO 02/085945，WO 04/049794和WO 06/008548和Janssens等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA.(美国国家科学院学报)2006年10月10日；103(41)：15130-5中 的表达重链抗体的小鼠和其他方法和技术。例如，所述表达重链抗体的小 鼠可以表达具有任何适当的(单)可变结构域、如来源于天然来源的(单) 可变结构域(例如，人(单)可变结构域、骆驼科(单)可变结构域或鲨 鱼(单)可变结构域)、以及例如合成的或半合成的(单)可变结构域的 重链抗体。

本发明还涉及通过上述方法、或备选地通过包括上述方法之一和另外 至少下列步骤的方法获得的V_HH序列或纳米抗体序列，所述步骤为：确定 所述V_HH序列或纳米抗体序列的核苷酸序列或氨基酸序列；和以本身已知 的方式，如通过在适当的宿主细胞或宿主生物体内表达或通过化学合成， 表达或合成所述V_HH序列或纳米抗体序列。

如本文提及，本发明纳米抗体的一种特别优选的种类包括具有与天然 存在的V_HH结构域的氨基酸序列相对应的但是已被“人源化”的氨基酸序 列的纳米抗体，“人源化”即，用在来自于人类的常规4-链抗体的V_H结 构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的V_HH序列的氨基酸序列中(并且特别是在构架序列中的)的一个或多个氨基酸 残基(例如上文所示)。这可以以本身已知的方式进行，这对于专业技术 人员是清楚的，例如，基于本文的进一步描述以及本文引用的关于人源化 的现有技术。此外，应该注意，本发明这样的人源化纳米抗体可以以本身 已知的任何适当方法获得(即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有 严格地限于使用包括天然存在的V_HH结构域的多肽作为起始原料而获得 的多肽。

本发明纳米抗体的另一种特别优选的种类包括具有与天然存在的V_H 结构域的氨基酸序列相对应的但是已被“骆驼源化”的氨基酸序列的纳米 抗体，即，用在重链抗体V_HH结构域中相对应位置存在的一个或多个氨基 酸残基替换来自于常规4-链抗体的天然存在的V_H结构域的氨基酸序列中 的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式进行，这对于专业技 术人员是清楚的，例如，基于本文的进一步描述。这样的“骆驼源化”置 换优选插入在形成和/或存在于V_H-V_L界面的氨基酸位置，和/或在所谓的 骆驼科动物标志残基，如本文所定义(参见例如WO 94/04678和Davies 与Riechmann(1994和1996)，同前所述)。优选地，用作产生或设计所述 骆驼源化纳米抗体的起始原料或起点的V_H序列优选地是来自哺乳动物的 V_H序列，更优选地是人类的V_H序列，诸如V_H3序列。然而，应该注意， 这种骆驼源化的本发明纳米抗体可以以本身已知的任何适当方式获得 (即，在上文(1)-(8)点下所示)，并且因此没有严格地限于使用包括天然 存在的V_H结构域的多肽作为起始原料而获得的氨基酸序列。

例如，又如本文进一步所述，“人源化”和“骆驼源化”可以这样进 行：通过提供分别编码天然存在的V_HH结构域或V_H结构域的核苷酸序列， 并且然后以本身已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子， 以致新核苷酸序列分别编码“人源化的”或“骆驼源化的”本发明的纳米 抗体。然后以本身已知的方式表达这种核酸，以提供理想的本发明的纳米 抗体。备选地，分别基于天然存在的V_HH结构域或V_H结构域的氨基酸序 列，可以分别设计理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米抗体的氨基酸 序列，然后应用本身已知的肽合成技术从头开始合成。此外，分别基于天 然存在的V_HH结构域或V_H结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别 设计编码所述理想的人源化或骆驼源化的本发明的纳米抗体的核苷酸序 列，然后应用本身已知的核酸合成技术从头开始合成，之后可以以本身已 知的方式表达这样获得的核酸，以提供合乎需要的本发明的纳米抗体。

专业技术人员应该清楚从天然存在的V_H序列或优选的V_HH序列起始 而获得本发明的纳米抗体和/或编码其的核酸的其它适宜方法和技术，并 且例如，可以包括以适当方式组合一个或多个天然存在的V_H序列的个 或多个部分(诸如一个或多个FR序列和/或CDR序列)，一个或多个天然 存在的V_HH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列或CDR序 列)，和/或一个或多个合成的或半合成的序列，以提供本发明的纳米抗体 或编码其的核苷酸序列或核酸(然后其可以被适当地表达)。基于本文的公 开内容和/或本文引用的其他现有技术(和/或备选地可以通过由使用本文 所述的方法获得的核苷酸序列起始的PCR获得)，编码V_HH序列或纳米抗 体的构架序列的核苷酸序列为专业技术人员所清楚，且可以适当地与编码 需要的CDR’s的核苷酸序列组合(例如，通过利用重叠引物的PCR装配)， 以提供编码本发明的纳米抗体的核酸。

如本文提及，纳米抗体可以特别特征在于，在一个或多个构架序列中 存在一个或多个“标志残基”(如本文定义)。

因此，根据本发明一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体在其最广 泛意义上通常可以定义为这样的多肽，所述多肽包括：

a)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列， 其中在按照Kabat编号方式的位置108的氨基酸残基是Q；

和/或：

b)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列， 其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如 本文所定义)或半胱氨酸残基，并且在位置44的氨基酸残基优选是E；

和/或：

c)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列， 其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成 的组，并且特别选自由R和S组成的组。

因此，在第一优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有 下述结构

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中

a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；

和/或其中：

b)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸或半胱 氨酸，并且按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基优选是E；

和/或其中：

c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的 组，并且特别选自由R和S组成的组；

并且其中：

d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个 优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定 义。

特别地，纳米抗体在其最广泛意义上可以通常定义为这样的多肽，所 述多肽包括：

a)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列， 其中按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；

和/或：

b)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列， 其中按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat 编号方式在位置45的氨基酸残基是R；

和/或：

c)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列， 其中按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的 组，并且特别是选自由R和S组成的组。

因此，根据一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具 有下述结构

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中

a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；

和/或其中：

b)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat 编号方式在位置45的氨基酸残基是R；

和/或其中：

c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的 组，并且特别选自由R和S组成的组；

并且其中：

d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个 优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定 义。

特别地，根据本发明针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的纳米抗体可以具有下述结构：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中

a)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；

和/或其中：

b)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat 编号方式在位置45的氨基酸残基是R；

和/或其中：

c)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P、R和S组成的 组，并且特别选自由R和S组成的组；

并且其中：

d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个 优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定 义。

特别地，根据本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体 通常可以定义为包括包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序 列的氨基酸序列的多肽，其中：

a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q， R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；和

a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的 组；并且优选地选自由L或R组成的组；和

a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成 的组；并且优选地是W或R，并且最优选地为W；

a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；

或者其中：

b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组； 和

b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；和

b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成 的组；并且优选地为W；

b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的 组；并且优选地为Q；

或者其中：

c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S， 和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；和

c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的 组；并且优选地选自由L和R组成的组；和

c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的 组；并且特别选自由R和S组成的组；和

c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的 组；优选地为Q；

并且其中

d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面 而定义。

因此，在另一个优选而非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以具 有下述结构：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中：

a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q， R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；

并且其中：

a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的 组；并且优选地选自由L或R组成的组；

并且其中：

a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成 的组；并且优选地选自由W或R组成的组，并且最优选地为W；

并且其中：

a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q；

并且其中：

d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的 一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方 面而定义。

在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结 构：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中：

b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；

并且其中：

b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；

并且其中：

b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成 的组；并且优选地为W；

并且其中：

b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的 组；并且优选地为Q；

并且其中：

d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面 而定义。

在另一个优选的但非限制性方面中，本发明的纳米抗体可以具有下述 结构

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中：

c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S， 和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；

并且其中：

c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的 组；并且优选地选自由L和R组成的组；

并且其中：

c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的 组；并且特别选自由R和S组成的组；

并且其中：

c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的 组；优选地为Q；

并且其中：

d)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的 一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方 面而定义。

本发明纳米抗体的两个特别优选的但非限制性的组是按照上述a)； 按照上述(a-1)到(a-4)；按照上述b)；按照上述(b-1)到(b-4)；按照上述(c)； 和/或按照上述(c-1)到(c4)的那些，其中：

i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或 如本文所述的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q；

或其中：

ii)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或 KQRE(或如本文所述的KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残 基是Q或L，并且优选地为Q。

因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有 下述结构

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中：

i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或 如本发明定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是 Q；

并且其中：

ii)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的 一个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方 面而定义。

在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结 构：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中：

i)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或 KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并 且优选是Q；

并且其中：

ii)CDR1，CDR2和CDR3如本发明所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定 义。

在其中按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列 KERE或KQRE的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基最优选 是F。在其中按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列 GLEW的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基选自由Y，H，I，L， V或F组成的组，并且最优选是V。

因此，但不以任何方式局限于此，基于在上述位置存在的氨基酸残基， 本发明的纳米抗体可以通常基于下述三组分类：

i)“GLEW-组”：按照Kabat编号方式在位置44-47具有氨基酸序列 GLEW并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q的纳米抗体。如 本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有V，并 且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。 所述GLEW组还包括一些GLEW-样的序列，诸如下表A-3中提及的 那些。更一般地，且不限于，属于该GLEW-组的纳米抗体可以定义 为在位置44具有G和/或在位置47具有W的纳米抗体，其中位置 46通常为E，且其中优选地，位置45不是带电荷的氨基酸残基且不 是半胱氨酸；

ii)“KERE-组”：按照Kabat编号方式在位置43-46具有氨基酸序列KERE 或KQRE(或另一个KERE-样序列)并且按照Kabat编号方式在位置 108具有Q或L的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米 抗体通常在位置37具有F，在位置47具有L或F；并且可以在位置 103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。更一般地， 且不限于，属于该KERE-组的纳米抗体可以定义为在位置44具有K， Q或R(通常为K)的纳米抗体，其中位置45是带电荷的氨基酸残 基或半胱氨酸，且位置47如本文进一步定义；

iii)“103P，R，S-组”：在位置103具有P，R或S的纳米抗体。这些纳米抗 体可以在按照Kabat编号方式的位置44-47具有氨基酸序列GLEW或 者在按照Kabat编号方式的位置43-46具有免疫球蛋白序列KERE或 KQRE，后者最优选地与位置37的F和位置47的L或F组合(如关 于KERE组所定义)；并且可以在按照Kabat编号方式的位置108具 有Q或L，并且优选地具有Q。

此外，在适当的情形中，纳米抗体可以属于这些种类的两种或更多种 (即，具有其特征)。例如，一个特别优选的纳米抗体组在位置44-47具 有GLEW或GLEW-样序列；在位置103具有P，R或S(并且特别是R)； 并且在位置108具有Q(其可以被人源化为L)。

更一般地，应该注意，上述定义描述和应用于以天然(即，非人源化 的)V_HH序列的形式存在的纳米抗体，且这些纳米抗体的人源化的变体可 以包含除了上述显示的那些(即，如本文定义的一个或多个人源化的置换) 之外的其他氨基酸残基。例如，且不限于，在GLEW-组或103P，R，S-组 的一些人源化的纳米抗体中，在位置108的Q可以被人源化为108L。如 本文已经提及的，基于本文的公开内容，其他人源化的置换(及其适当的 组合)将为专业技术人员所清楚。另外，或备选地，其他潜在有用的人源 化置换可以通过将天然存在的V_HH序列的构架区序列与一个或多个紧密 相关的人V_H序列的相对应的构架序列进行比较而确定，之后，可以将由 此确定的一个或多个潜在有用的人源化置换(或其组合)引入到所述V_HH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，且由此人源化的 V_HH序列可以检测针对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平、和 /或其他需要的特性。以这种方式，通过有限程度的试错，其他适当的人 源化置换(或其适当的组合)可以由专业技术人员基于本文的公开内容确 定。此外，基于前述，纳米抗体(的构架区)可以被部分人源化或完全人 源化。

因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是 属于GLEW-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和 CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义， 并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定义。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于 KERE-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且CDR1，CDR2和CDR3如本 文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定义，并且更优选 地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是 属于103P，R，S-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2 和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一个优选方面而定 义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定义。

此外，更一般地，并且除了上文提及的108Q，43E/44R和103P，R，S 残基之外，本发明的纳米抗体可以在常规V_H结构域中形成(部分)V_H/V_L界面的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基比在 相对应的天然存在的V_H序列同一位置天然存在的氨基酸残基更加高度带 电荷，并且特别是一个或多个带电荷的氨基酸残基(如在表A-2中提及)。 这样的置换包括，但不限于下表A-3中提及的GLEW-样序列；以及国际 申请WO 00/29004中所述关于所谓的“微体(microbodies)”的置换，例 如以获得在位置108具有Q和在位置44-47具有KLEW组合的纳米抗体。 基于本发明的公开内容，在这些位置的其它可能的置换对于专业技术人员 应该是清楚的。

在本发明的纳米抗体的一个方面中，在位置83的氨基酸残基选自由 L，M，S，V和W组成的组；并且优选地为L。

此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置83的氨基酸残基选 自由R，K，N，E，G，I，T和Q组成的组；并且最优选地为K或E(对于与天 然存在的V_HH结构域相对应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体， 如本发明所述)。在一个方面中，位置84的氨基酸残基选自由P，A，R，S，D T，和V组成的组，并且最优选地是P(对于与天然存在的V_HH结构域相对 应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体，如本发明所述)。

此外，在本发明的纳米抗体的一个方面中，位置104的氨基酸残基选 自由G和D组成的组；并且最优选地是G。

总而言之，在所述纳米抗体中如上文提及的在位置11，37，44，45，47， 83，84，103，104和108的氨基酸残基在本文中还叫作“标志残基”。所述 标志残基以及在最接近的相关的人V_H结构域，即V_H3的相对应的位置的 氨基酸残基总结在表A-3中。

在天然存在的V_HH结构域中存在的这些标志残基的一些特别优选但 非限制性的组合在表A-4中提及。为了比较，将叫作DP-47的人V_H3的 相对应氨基酸残基以斜体显示。

表A-3：纳米抗体中的标志残基

在所述纳米抗体中，在除所述标志残基外的任何其它位置的每一个氨 基酸残基可以是在天然存在的V_HH结构域的相应位置(按照Kabat编号方 式)天然存在的任何氨基酸残基。

专业技术人员对于这样的氨基酸残基应该是清楚的。表A-5至A-8 提及一些非限制性的残基，其可以存在于天然存在的V_HH结构域的FR1、 FR2、FR3和FR4的每一位置(按照Kabat编号方式)。对于每一位置， 在天然存在的V_HH结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基(并且其在 纳米抗体中对于所述位置是最优选的氨基酸残基)以粗体显示；并且对于 每一位置的其它优选的氨基酸残基已加下划线(注意：在天然存在的V_HH结构域的位置26-30发现的氨基酸残基的数目支持Chothia(同前所述) 的构成编号方式的基础的假说，即，在这些位置的残基已经形成CDR1 的部分)。

在表A-5至A-8中，还已经提及可以在人V_H3结构域的每一位置存 在的一些非限制性的残基。此外，对于每一位置，在天然存在的人V_H3 结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基以粗体显示；并且其它优选的 氨基酸残基加下划线。

仅是为了参考，表A-5至A-8还包含对于代表性样品1118个V_HH序 列关于在每个氨基酸位置的V_HH熵(“V_HH Ent.”)和V_HH可变性(“V_HH Var.”) 的数据(数据由乌得勒支大学(Utrecht University)的David Lutje Hulsing 和Theo Verrips教授馈赠)。关于V_HH熵和V_HH可变性的数值提供对于被 分析的1118个V_HH序列之间的氨基酸残基的可变性和保守度的测量：低 数值(即＜1，诸如＜05)表示在所述V_HH序列之间氨基酸残基是高度保守 的(即，几乎没有可变性)。例如，在位置8的G和在位置9的G分别具 有0.1和0的V_HH熵数值，这表示这些残基是高度保守的，并且具有很小 的可变性(并且假设在所分析的所有1118个序列中位置9是G)，而对于 形成CDR部分的残基通常发现1.5或更大的数值(数据未显示)。注意： (1)在表A-5至A-8的第二列列出的氨基酸残基是基于比1118个V_HH序 列更大的样品，对其进行分析以确定在最后两列引用的V_HH熵和V_HH可变 性；和(2)下述数据支持这样的假说：在位置27-30的氨基酸残基以及还 可能甚至在位置93和94的氨基酸残基已经形成CDR的一部分(尽管本发 明不限于任何具体的假说或解释，并且如上文所提及，本发明使用按照 Kabat的编号方式)。对于序列熵的一般解释，序列可变性以及用于确定其 的方法，参见Oliveira等，蛋自质：结构，功能和遗传(PROTEINS：Structure， Function and Genetics)，52：544-552(2003)。

表A-5：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)

表A-5：FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)

表A-6：FR2中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)

表A-7：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)

表A-7：FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)

表A-8：FR4中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)

因此，在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以 定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中：

i)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的 一个或多个氨基酸残基选自表A-3中提及的标志残基；

并且其中：

ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如本发明的一个更优选的方面而定 义。

例如，上述纳米抗体可以是V_HH序列或可以是人源化的纳米抗体。当 上述纳米抗体序列为V_HH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一 步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被 进一步适当地人源化，同样如本文所述。

特别地，本发明的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序 列：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补 性决定区1-3，并且其中：

i)(优选地)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104 和108的氨基酸残基的一个或多个选自表A-3中提及的标志残基(应 该理解，V_HH序列应该包含一个或多个标志残基；并且部分人源化的 纳米抗体应该通常，且优选地，[仍然]包含一个或多个标志残基[尽 管依据本发明在适当的情形中提供部分人源化的纳米抗体也在本发 明的范围内，在所述部分人源化的纳米抗体中，所有的标志残基，而 不是一个或多个其余氨基酸残基，已经被人源化]；并且在完全人源化 的纳米抗体中，依据本发明在适当的情形中，所有在标志残基位置上 的氨基酸残基应该是在人V_H3序列中存在的氨基酸残基。基于本发 明公开的内容，专业技术人员应该清楚，所述V_HH序列、所述具有至 少一个标志残基的部分人源化的纳米抗体、所述不具有标志残基的部 分人源化的纳米抗体、和所述完全人源化的纳米抗体均形成本发明的 方面)；

并且其中：

ii)所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s：1-22中的至少一个氨基酸序列具 有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度的目 的，忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列SEQ ID NO’s：1-22 中用X表示)；

并且其中：

iii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个 优选方面而定义，并且更优选地如按照本文的一个更优选的方面而定 义。

例如，上述纳米抗体可以是V_HH序列或可以是人源化的纳米抗体。当 上述纳米抗体序列为V_HH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一 步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被 进一步适当地人源化，同样如本文所述。

特别地，本发明KERE-组的纳米抗体可以是具有下述(通用)结构 的氨基酸序列：

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中：

i)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如 本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是E；

且其中：

ii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-10：KERE-组纳米抗体的代表性FW1序列。

  KERE FW1序列号1   SEQ ID NO：23   QVQRVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTSS   KERE FW1序列号2   SEQ ID NO：24   QVQLVESGGGLVQTGDSLSLSCSASGRTFS   KERE FW1序列号3   SEQ ID NO：25   QVKLEESGGGLVQAGDSLRLSCAATGRAFG   KERE FW1序列号4   SEQ ID NO：26   AVQLVESGGGLVQPGESLGLSCVASGRDFV   KERE FW1序列号5   SEQ ID NO：27   EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCEVLGRTAG   KERE FW1序列号6   SEQ ID NO：28   QVQLVESGGGWVQPGGSLRLSCAASETILS   KERE FW1序列号7   SEQ ID NO：29   QVQLVESGGGTVQPGGSLNLSCVASGNTFN   KERE FW1序列号8   SEQ ID NO：30   EVQLVESGGGLAQPGGSLQLSCSAPGFTLD   KERE FW1序列号9   SEQ ID NO：31   AQELEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFN

且其中：

iii)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-11：KERE-组纳米抗体的代表性FW2序列。

  KERE FW2序列号1   SEQ ID NO：41   WFRQAPGKEREFVA   KERE FW2序列号2   SEQ ID NO：42   WFRQTPGREREFVA   KERE FW2序列号3   SEQ ID NO：43   WYRQAPGKQREMVA   KERE FW2序列号4   SEQ ID NO：44   WYRQGPGKQRELVA   KERE FW2序列号5   SEQ ID NO：45   WIRQAPGKEREGVS   KERE FW2序列号6   SEQ ID NO：46   WFREAPGKEREGIS   KER EFW2序列号7   SEQ ID NO：47   WYRQAPGKERDLVA

  KERE FW2序列号8   SEQ ID NO：46   WFRQAPGKQREEVS   KERE FW2序列号9   SEQ ID NO：49   WFRQPPGKVREFVG

且其中：

iv)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-12：KERE-组纳米抗体的代表性FW3序列。

  KERE FW3序列号1   SEQ ID NO：50   RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYRCYF   KERE FW3序列号2   SEQ ID NO：51   RFAISRDNNKNTGYLQMNSLEPEDTAVYYCAA   KERE FW3序列号3   SEQ ID NO：52   RFTVARNNAKNTVNLEMNSLKPEDTAVYYCAA   KERE FW3序列号4   SEQ ID NO：53   RFTISRDIAKNTVDLLMNNLEPEDTAVYYCAA   KERE FW3序列号5   SEQ ID NO：54   RLTISRDNAVDTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAA   KERE FW3序列号6   SEQ ID NO：55   RFTISRDNAKNTVYLQMDNVKPEDTAIYYCAA   KERE FW3序列号7   SEQ ID NO：56   RFTISKDSGKNTVYLQMTSLKPEDTAVYYCAT   KERE FW3序列号8   SEQ ID NO：57   RFTISRDSAKNMMYLQMNNLKPQDTAVYYCAA   KERE FW3序列号9   SEQ ID NO：58   RFTISRENDKSTVYLQLNSLKPEDTAVYYCAA   KERE FW3序列号10   SEQ ID NO：59   RFTISRDYAGNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCAT

且其中：

v)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-13：KERE-组纳米抗体的代表性FW4序列。

  KERE FW4序列号1   SEQ ID NO：60   WGQGTQVTVSS   KERE FW4序列号2   SEQ ID NO：61   WGKGTLVTVSS   KERE FW4序列号3   SEQ ID NO：62   RGQGTRVTVSS   KERE FW4序列号4   SEQ ID NO：63   WGLGTQVTISS

且其中：

vi)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而定 义。

在上述纳米抗体中，一个或多个其他标志残基优选地如本文所述(例 如，当它们为V_HH序列或部分人源化的纳米抗体时。)

此外，上述纳米抗体可以，例如，是V_HH序列或可以是人源化的纳米 抗体。当上述纳米抗体序列为V_HH序列时，它们可以被适当地人源化，如 本文进一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以 任选地被进一步适当地人源化，同样如本文所述。

关于构架1，专业技术人员应该清楚，当上述氨基酸序列通过表达核 苷酸序列而产生时，前4个氨基酸序列(即，按照Kabat编号方式的氨基 酸残基1-4)可以通常通过已经用来生成所述核酸的引物来确定。因此， 为了确定氨基酸同一性的程度，优选忽略前4个氨基酸残基。

此外，关于构架1，且尽管按照Kabat编号方式的氨基酸位置27-30 被认为是构架区的一部分(且不是CDR’s)，通过分析多于1000个V_HH序列的数据库已经发现，位置27-30具有比在位置1-26的可变性高得多 的可变性(以V_HH熵和V_HH可变性表示----参见表A-5至A-8)。因为此， 为了确定氨基酸同一性的程度，优选地也忽略在位置27-30的氨基酸残基。

考虑到此，KERE种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/ 序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：

i)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如 本文定义)或半胱氨酸残基，且位置44优选地是E；

且其中：

ii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与 下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：

表A-14：KERE-组纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。

  KERE FW1序列号10   SEQ ID NO：32   VESGGGLVQPGGSLRLSCAASG   KERE FW4序列号11   SEQ ID NO：33   VDSGGGLVQAGDSLKLSCALTG

  KERE FW4序列号12   SEQ ID NO：34   VDSGGGLVQAGDSLRLSCAASG   KERE FW4序列号13   SEQ ID NO：35   VDSGGGLVEAGGSLRLSCQVSE   KERE FW4序列号14   SEQ ID NO：36   QDSGGGSVQAGGSLKLSCAASG   KERE FW4序列号15   SEQ ID NO：37   VQSGGRLVQAGDSLRLSCAASE   KERE FW4序列号16   SEQ ID NO：38   VESGGTLVQSGDSLKLSCASST   KERE FW4序列号17   SEQ ID NO：39   MESGGDSVQSGGSLTLSCVASG   KERE FW4序列号18   SEQ ID NO：40   QASGGGLVQAGGSLRLSCSASV

且其中：

iii)FR2，FR3和FR4如本文关于KERE-种类的纳米抗体的FR2，FR3和 FR4所提及的；

且其中：

iv)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面 而定义。

上述纳米抗体可以，例如，是V_HH序列或可以是人源化的纳米抗体。 当上述纳米抗体序列为V_HH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进 一步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地 被进一步适当地人源化，同样如本文所述。

GLEW种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断的 4个构架区/序列的氨基酸序列，其中

i)优选地，当所述GLEW-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时， 在位置108的氨基酸残基是Q；

ii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-15：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW1序列。

  GLEW FW1序列号1   SEQ ID NO：64   QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS   GLEW FW1序列号2   SEQ ID NO：65   EVHLVESGGGLVRPGGSLRLSCAAFGFIFK   GLEW FW1序列号3   SEQ ID NO：66   QVKLEESGGGLAQPGGSLRLSCVASGFTFS   GLEW FW1序列号4   SEQ ID NO：67   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVCVSSGCT   GLEW FW1序列号5   SEQ ID NO：68   EVQLVESGGGLALPGGSLTLSCVFSGSTFS

且其中：

iii)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-16：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW2序列。

  GLEW FW2序列号1   SEQ ID NO：72   WVRQAPGKVLEWVS   GLEW FW2序列号2   SEQ ID NO：73   WVRRPPGKGLEWVS   GLEW FW2序列号3   SEQ ID NO：74   WVRQAPGMGLEWVS   GLEW FW2序列号4   SEQ ID NO：75   WVRQAPGKEPEWVS   GLEW FW2序列号5   SEQ ID NO：76   WVRQAPGKDQEWVS   GLEW FW2序列号6   SEQ ID NO：77   WVRQAPGKAEEWVS   GLEW FW2序列号7   SEQ ID NO：78   WVRQAPGKGLEWVA   GLEW FW2序列号8   SEQ ID NO：79   WVRQAPGRATEWVS

且其中：

iv)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-17：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW3序列。

  GLEW FW3序列号1   SEQ ID NO：80   RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCVK   GLEW FW3序列号2   SEQ ID NO：81   RFTISRDNARNTLYLQMDSLIPEDTALYYCAR   GLEW FW3序列号3   SEQ ID NO：82   RFTSSRDNAKSTLYLQMNDLKPEDTALYYCAR   GLEW FW3序列号4   SEQ ID NO：83   RFIISRDNAKNTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQR   GLEW FW3序列号5   SEQ ID NO：84   RFTASRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTARYYCAR   GLEW FW3序列号6   SEQ ID NO：85   RFTISRDNAKNTLYLQMDDLQSEDTAMYYCGR

且其中：

v)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-18：GLEW-组的纳米抗体的代表性FW4序列。

  GLEW FW4序列号1   SEQ ID NO：86   GSQGTQVTVSS   GLEW FW4序列号2   SEQ ID NO：87   LRGGTQVTVSS   GLEW FW4序列号3   SEQ ID NO：88   RGQGTLVTVSS   GLEW FW4序列号4   SEQ ID NO：89   RSRGIQVTVSS   GLEW FW4序列号5   SEQ ID NO：90   WGKGTQVTVSS   GLEW FW4序列号6   SEQ ID NO：91   WGQGTQVTVSS

且其中：

vi)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如按照本文的一个 优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面而 定义。

在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述 (例如，当它们为V_HH序列或部分人源化的纳米抗体时。)

关于构架1，同样专业技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的 程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。

考虑到此，GLEW种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/ 序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：

i)优选地，当GLEW-种类的纳米抗体是非人源化的纳米抗体时，在位 置108的氨基酸残基为Q；

且其中：

ii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与 下述氨基酸序列至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：

表A-19：KERE-组的纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。

  GLEW FW1序列号6 SEQ ID NO：69   VESGGGLVQPGGSLRLSCAASG   GLEW FW1序列号7 SEQ ID NO：70   EESGGGLAQPGGSLRLSCVASG   GLEW FW1序列号8 SEQ ID NO：71   VESGGGLALPGGSLTLSCVFSG

且其中：

iii)FR2，FR3和FR4如本文关于GLEW-种类的纳米抗体的FR2，FR3和 FR4所提及的；

且其中：

iv)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面 而定义。

例如，上述纳米抗体可以是V_HH序列或可以是人源化的纳米抗体。当 上述纳米抗体序列为V_HH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一 步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被 进一步适当地人源化，同样如本文所述。在上述纳米抗体中，其他标志残 基中的一个或多个优选地如本文所述(例如，当它们是V_HH序列或部分人 源化的纳米抗体时)。

P，R，S 103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定区/序列中断 的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：

i)在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于W；

且其中：

ii)优选地，在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是P，R或 S，且更优选是R；

且其中：

iii)FR1是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-20：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW1序列。

  P，R，S 103 FW1序列号1   SEQ ID NO：92   AVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFS   P，R，S 103 FW1序列号2   SEQ ID NO：93   QVQLQESGGGMVQPGGSLRLSCAASGFDFG   P，R，S 103 FW1序列号3   SEQ ID NO：94   EVHLVESGGGLVRPGGSLRLSCAAFGFIFK   P，R，S 103 FW1序列号4   SEQ ID NO：95   QVQLAESGGGLVQPGGSLKLSCAASRTIVS   P，R，S 103 FW1序列号5   SEQ ID NO：96   QEHLVESGGGLVDIGGSLRLSCAASERIFS   P，R，S 103 FW1序列号6   SEQ ID NO：97   QVKLEESGGGLAQPGGSLRLSCVASGFTFS   P，R，S 103 FW1序列号7   SEQ ID NO：98   EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVCVSSGCT   P，R，S 103 FW1序列号8   SEQ ID NO：99   EVQLVESGGGLALPGGSLTLSCVFSGSTFS

且其中：

iv)FR2是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-21：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW2序列。

  P，R，S 103 FW2序列号1   SEQ ID NO：102   WFRQAPGKEREFVA   P，R，S 103 FW2序列号2   SEQ ID NO：103   WVRQAPGKVLEWVS   P，R，S 103 FW2序列号3   SEQ ID NO：104   WVRRPPGKGLEWVS   P，R，S 103 FW2序列号4   SEQ ID NO：105   WIRQAPGKEREGVS   P，R，S 103 FW2序列号5   SEQ ID NO：106   WVRQYPGKEPEWVS   P，R，S 103 FW2序列号6   SEQ ID NO：107   WFRQPPGKEHEFVA   P，R，S 103 FW2序列号7   SEQ ID NO：108   WYRQAPGKRTELVA   P，R，S 103 FW2序列号8   SEQ ID NO：109   WLRQAPGQGLEWVS   P，R，S 103 FW2序列号9   SEQ ID NO：110   WLRQTPGKGLEWVG   P，R，S 103 FW2序列号10   SEQ ID NO：111   WVRQAPGKAEEFVS

且其中：

v)FR3是与下述氨基酸序列中的至少之具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-22：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW3序列。

  P，R，S 103 FW3序列号1   SEQ ID NO：112   RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA   P，R，S 103 FW3序列号2   SEQ ID NO：113   RFTISRDNARNTLYLQMDSLIPEDTALYYCAR   P，R，S 103 FW3序列号3   SEQ ID NO：114   RFTISRDNAKNEMYLQMNNLKTEDTGVYWCGA   P，R，S 103 FW3序列号4   SEQ ID NO：115   RFTISSDSNRNMIYLQMNNLKPEDTAVYYCAA   P，R，S 103 FW3序列号5   SEQ ID NO：116   RFTISRDNAKNMLYLHLNNLKSEDTAVYYCRR   P，R，S 103 FW3序列号6   SEQ ID NO：117   RFTISRDNAKKTVYLRLNSLNPEDTAVYSCNL   P，R，S 103 FW3序列号7   SEQ ID NO：118   RFKISRDNAKKTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQR   P，R，S 103 FW3序列号8   SEQ ID NO：119   RFTVSRDNGKNTAYLRMNSLKPEDTADYYCAV

且其中：

vi)FR4是与下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一 性的氨基酸序列：

表A-23：P，R，S 103-组的纳米抗体的代表性FW4序列。

  P，R，S 103 FW4序列号1   SEQ ID NO：120   RGQGTQVTVSS   P，R，S 103 FW4序列号2   SEQ ID NO：121   LRGGTQVTVSS   P，R，S 103 FW4序列号3   SEQ ID NO：122   GNKGTLVTVSS   P，R，S 103 FW4序列号4   SEQ ID NO：123   SSPGTQVTVSS   P，R，S 103 FW4序列号5   SEQ ID NO：124   SSQGTLVTVSS   P，R，S 103 FW4序列号6   SEQ ID NO：125   RSRGIQVTVSS

且其中：

vii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面 而定义。

在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述 (例如，当它们为V_HH序列或部分人源化的纳米抗体时)。

关于构架1，同样专业技术人员应该清楚，为了确定氨基酸同一性的 程度，优选地忽略在位置1-4和27-30的氨基酸残基。

考虑到此，P，R，S 103种类的纳米抗体可以是包括由3个互补性决定 区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中：

i)在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基不同于W；

且其中：

ii)优选地，在按照Kabat编号方式的位置103的氨基酸残基是P，R或 S，且更优选是R；

且其中：

iii)FR1是这样的氨基酸序列，其在按照Kabat编号方式的位置5-26与 下述氨基酸序列中的至少之一具有至少80％的氨基酸同一性：

表A-24：P，R，S 103-组纳米抗体的代表性FW1序列(氨基酸残基5-26)。

 P，R，S 103 FW1序列号9   SEQ ID NO：100   VESGGGLVQAGGSLRLSCAASG  P，R，S 103 FW1序列号10   SEQ ID NO：101   AESGGGLVQPGGSLKLSCAASR

且其中：

iv)FR2，FR3和FR4如本文关于P，R，S 103-种类的纳米抗体的FR2，FR3 和FR4所提及的；

且其中：

v)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义，并且优选地如根据本发明的一 个优选方面而定义，并且更优选地如根据本发明的一个更优选的方面 而定义。

例如，上述纳米抗体可以是V_HH序列或可以是人源化的纳米抗体。当 上述纳米抗体序列为V_HH序列时，它们可以被适当地人源化，如本文进一 步所述。当所述纳米抗体是部分人源化的纳米抗体时，它们可以任选地被 进一步适当地人源化，同样如本文所述。

在上述纳米抗体中，其他标志残基中的一个或多个优选地如本文所述 (例如，当它们是V_HH序列或部分人源化的纳米抗体时)。

在另一个优选的但非限制性的方面，本发明涉及如上所述的纳米抗 体，其中所述CDR序列与SEQ ID NO’s：455-501，更优选455-457，459， 460，464-469的至少一个氨基酸序列的CDR序列具有至少70％的氨基酸 同一性，优选至少80％的氨基酸同一性，更优选至少90％的氨基酸同一 性，诸如95％的氨基酸同一性或更多，或甚至基本上100％的氨基酸同一 性。此氨基酸同一性的程度可以例如通过确定(以本文中所述的方式)所述 纳米抗体和SEQID NO’s：455-501，更优选455-457，459，460，464-469 的一个或多个序列之间的氨基酸同一性的程度来确定，其中忽略形成构架 区的氨基酸残基。所述纳米抗体可以如本文进一步所述。

如本文已经提及的，本发明的另一个优选的但非限制性的方面涉及具 有这样的氨基酸序列的纳米抗体，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO’s： 455-501，更优选455-457，459，460，464-469组成的组或选自由与SEQ  ID NO’s：455-501，更优选455-457，459，460，464-469的氨基酸序列中 的至少一个具有超过80％，优选超过90％，更优选超过95％，诸如99％ 或更多序列同一性(如本文所定义)的氨基酸序列组成的组。

此外，在上述纳米抗体中：

i)任何氨基酸置换(当其不是如本文所定义的人源化置换时)优选地，并且 与SEQ ID NO’s：455-501，更优选455-457，459，460，464-469的相应氨 基酸序列相比，是保守氨基酸置换，(如本文所定义)；

和/或

ii)与SEQ ID NO’s：455-501，更优选455-457，459，460，464-469的相应 氨基酸序列相比，其氨基酸序列优选地仅含有氨基酸置换，或另外优选地 不超过5个，优选不超过3个，和更优选仅1或2个氨基酸缺失或插入；

和/或

iii)CDR可以是这样的CDR，其通过亲和力成熟衍生，例如，从SEQ ID  NO’s：455-501，更优选455-457，459，460，464-469的相应氨基酸序列的 CDR开始。

优选地，本发明的纳米抗体中的CDR序列和FR序列是这样的，即， 本发明的纳米抗体(和包括其的本发明的多肽)：

-以10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并 且更优选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(K_D)(即，以10⁵-10¹²升/摩 尔或更大、并且优选地10⁷-10¹²升/摩尔或更大、且更优选地10⁸-10¹²升/摩尔的缔合常数(K_A))结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2， Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2；

和/或这样，以致它们：

-以10²M^-1s^-1-约10⁷M^-1s^-1，优选10³M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，更优选10⁴M^-1s^-1-10⁷M^-1s-¹，诸如10⁵M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1的k_on-速率结合Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang 1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2 或Ang2；

和/或这样，以致它们：

-以1s^-1(t_1/2＝0.69s)-10^-6s^-1(假定具有多天的t_1/2的几乎不可逆的复合 体)，优选10^-2s^-1-10^-6s^-1，更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1，诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的k_off速率结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2。

优选地，在本发明的纳米抗体中存在的CDR序列和FR序列是这样 的，以致本发明的纳米抗体将以小于500nM，优选小于200nM，更优选 小于10nM，诸如小于500pM的亲和力结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2。

根据本发明的一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的， 但是具有这样的限制条件：与天然存在的人V_H结构域的相对应的构架区 相比，并且特别是与DP-47的相对应的构架区相比，其在至少一个构架区 具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地，根据本发明的 一个非限制性方面，纳米抗体可以是如本文所定义的，但是具有这样的限 制条件：与天然存在的人V_H结构域的相对应的构架区相比，并且特别是 与DP-47的相对应的构架区相比，其在至少一个标志残基(包括在位置 108，103和/或45的那些)具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。 通常，纳米抗体应该在FR2和/或FR4中的至少一个中，并且特别是在FR2 和/或FR4中的至少一个标志残基(同样，包括在位置108，103和/或45 的那些)与天然存在的V_H结构域具有至少一个这样的氨基酸差异。

此外，人源化的本发明的纳米抗体可以如本发明所定义，但是具有这 样的限制条件：与天然存在的V_HH结构域的相对应的构架区相比，其在至 少一个构架区具有至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。更特别地， 根据本发明的一个非限制性方面，人源化的纳米抗体可以如本文所定义， 但是具有下述限制条件：与天然存在的V_HH结构域的相对应的构架区相 比，其在至少一个标志残基(包括在位置108，103和/或45的那些)具有 至少“一个氨基酸差异”(如本文所定义)。通常，人源化的纳米抗体应该 在FR2和/或FR4中的至少一个、并且特别是在FR2和/或FR4中的至少 一个标志残基(同样，包括在位置108，103和/或45的那些)与天然存在 的V_HH结构域具有至少一个所述氨基酸差异。

从本发明的公开内容应该清楚，使用如本发明所定义的本发明的纳米 抗体的天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直向同 源物(本发明笼统称为“类似物”)，和特别地SEQ ID NO’s：455-501，更 优选455-457，459，460，464-469的纳米抗体的类似物也在本发明的范围之 内。因此，根据本发明的一个方面，术语“本发明的纳米抗体”在其最广 泛意义上还涵盖所述类似物。

通常，在所述类似物中，与如本发明所定义的本发明纳米抗体相比， 一个或多个氨基酸残基可以被置换、缺失和/或添加。这样的置换、插入 或缺失可以在一个或多个构架区和/或在一个或多个CDR内进行。当所述 置换、插入或缺失在一个或多个构架区内进行时，它们可以在一个或多个 标志残基处和/或在构架残基中的一个或多个其它位置进行，尽管通常较 不优选在标志残基处的置换、插入或缺失(除非这些是如本文所述的适当 的人源化置换)。

通过非限制性实例的方式，例如，置换可以是保守置换(如本文所述) 和/或氨基酸残基可以被天然存在于另一个V_HH结构域中相同位置处的另 一个氨基酸残基置换(关于这样的置换的一些非限制性实例参见表A-5 至A-8)，尽管本发明通常不限于此。因此，在本发明的范围内包括任何 一个或多个置换、缺失或插入，或它们的任何组合，所述置换、缺失或插 入或其组合改善本发明的纳米抗体的特性，或至少没有将本发明的纳米抗 体的理想特性或理想特性的平衡或组合减损太多(即，到所述纳米抗体不 再适合其目的应用的程度)。基于本发明的公开内容，以及任选地在有限 程度的常规实验之后，例如，常规实验可以包括引入有限数目的可能的置 换并且确定它们对这样获得的纳米抗体特性的影响，专业技术人员通常应 该能够确定并且选择适当的置换、缺失或插入、或它们的适当的组合。

例如，并且取决于用于表达本发明的纳米抗体或多肽的宿主生物体， 所述缺失和/或置换可以以这样的方式设计，所述方式去除一个或多个翻 译后修饰的位点(诸如一个或多个糖基化位点)，这应该在本领域技术人 员的能力范围内。备选地，可以设计置换或插入，以引入一个或多个附着 官能团(如本文所述)的位点，例如，以允许位点-特异性的聚乙二醇化 (pegylation)(同样如本文所述)。

从在上述表A-5至A-8中提供的关于V_HH熵和V_HH可变性的数据可 以看出，在构架区中的一些氨基酸残基比其它的更保守。通常，尽管本发 明在其最广泛意义上不限于此，优选在较不保守的位置进行任何置换、缺 失或插入。此外，通常，氨基酸置换优于氨基酸缺失或插入。

所述类似物优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的纳米 抗体所定义的亲和力(适当测量的和/或表示为K_D-值(实际的或表观的)， K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速率和/或k_off-速率，或备选地表示为IC₅₀值， 如本发明进一步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选地结合Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选地结合Tie2或Ang2。

所述类似物优选还是这样的，以致它们保留所述纳米抗体的有利特 性，如本文所述。

此外，根据一个优选的方面，所述类似物与SEQID NO’s：455-501，更 优选455-457，459，460，464-469的纳米抗体之一具有至少70％、优选至少 80％、更优选至少90％、如至少95％或99％或更多的序列同一性程度；和 /或优选地具有至多20个、优选地至多10个、甚至更优选地至多5个、 如4，3，2或仅有1个氨基酸差异(如本文定义)。

此外，所述类似物的构架序列和CDR’s优选是这样的，以致它们与本 文定义的优选方面一致。更一般地，如本文所述，所述类似物具有：(a) 在位置108的Q；和/或(b)在位置45的带电荷氨基酸或半胱氨酸残基， 和优选地在位置44为E，更优选地在位置44为E和在位置45为R；和/ 或(c)在位置103的P，R或S。

本发明纳米抗体的类似物的一个优选的种类包括已经被人源化的纳 米抗体(即，与天然存在的本发明的纳米抗体的序列相比较)。如在本发 明引用的背景技术中提及的，这样的人源化通常包括用在人V_H结构域如 人V_H3结构域中相同位置存在的氨基酸残基置换在天然存在的V_HH序列 中的一个或多个氨基酸残基。专业技术人员应该清楚可能的人源化置换或 人源化置换的组合的实例，例如，从本发明的表格，从在本发明引用的背 景技术中提及的可能的人源化置换，和/或从纳米抗体序列与天然存在的 人V_H结构域序列之间的比较获知。

所述人源化置换应该这样选择，以致所得到的人源化的纳米抗体仍然 保留如本发明所定义的纳米抗体的有利特性，并且更优选这样选择，以致 它们如在前述各段落中关于类似物所描述。基于本文的公开内容，并且任 选地在有限程度的常规实验之后，专业技术人员通常能够确定并选择适当 的人源化置换或适当的人源化置换的组合，所述常规实验包括，例如，引 入有限数量的可能的人源化置换，并且确定它们对这样获得的纳米抗体的 特性的影响。

一般地，作为人源化的结果，本发明的纳米抗体可以变得更加“人- 样”，同时仍然保留如本文所述的本发明的纳米抗体的有利特性。结果， 与相对应的天然存在的V_HH结构域相比，这样人源化的纳米抗体可以具有 一些优点，诸如减小的免疫原性。同样，基于本发明的公开内容，并且任 选在有限程度的常规实验之后，专业技术人员应该能够选择人源化置换或 适当的人源化置换组合，其最优化或获得一方面在通过人源化置换提供的 有利特性和另一方面在天然存在的V_HH结构域的有利特性之间的理想的 或适当的平衡。

本发明的纳米抗体可以在任何构架残基处被适当人源化，诸如在一个 或多个标志残基处(如本文所定义)或在一个或多个其它构架残基处(即， 非标志残基)或它们的任何适当的组合。关于“P，R，S-103组”或“KERE组” 的纳米抗体的一个优选的人源化置换是将Q108置换成L108。“GLEW种 类”的纳米抗体也可以通过将Q108置换成L108被人源化，条件是其它标 志残基中的至少一个含有骆驼科动物(骆驼源化)置换(如本文所定义)。例 如，如上文所提及，人源化的纳米抗体的一个特别优选的种类在位置44-47 具有GLEW或GLEW-样序列；在位置103具有P，R或S(并且特别是R)， 并且在位置108具有L。

人源化的和其它类似物，以及编码其的核酸序列，可以以本身已知的 任何方式提供，例如，所述类似物可以这样获得：通过提供编码天然存在 的V_HH结构域的核酸，将要被置换的一个或多个氨基酸残基的密码子改变 成相对应的合乎需要的氨基酸残基的密码子(例如，通过位点定向诱变或 通过使用适当错配的引物进行的PCR)，在适当的宿主或表达系统中表达 这样获得的核酸/核苷酸序列；并且任选地分离和/或纯化这样获得的类似 物，以提供基本上分离形式(如本文进一步所述)的所述类似物。这通常 可以应用本身已知的方法和技术而进行，所述方法和技术应该是专业技术 人员所清楚的，例如从手册和本文所引用的参考文献、本文引用的背景技 术和/或从本文的进一步描述中可知。备选地，编码所述需要的类似物的 核酸可以以本身已知的方法合成(例如使用用于合成具有预先确定氨基酸 序列的核酸序列的自动装置)，并且然后可以如本文所述进行表达。另一 种技术可以包括组合一个或多个分别编码所述理想的类似物的一部分的 天然存在的和/或合成的核酸序列，并且然后如本发明所述表达所组合的 核酸序列。此外，所述类似物可以使用相关氨基酸序列的化学合成而提供， 其应用本身已知的肽合成技术，诸如本发明所提及的那些技术。

在这一方面，专业技术人员还应该清楚，本发明的纳米抗体(包括它 们的类似物)还可以从人V_H序列(即，氨基酸序列或相对应的核苷酸序 列)起始设计和/或制备，所述人V_H序列诸如例如人V_H3序列，诸如DP-47、 DP-51、或DP-29，即，通过引入一个或多个骆驼源化的置换(即，将在 所述人V_H结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基改变成在V_HH结构域相对应位置存在的氨基酸残基)，以提供本发明的纳米抗体序列， 和/或将纳米抗体的有利特性赋予这样获得的序列。同样地，这通常可以 应用前段中提到的各种方法和技术进行，其应用人V_H结构域的氨基酸序 列和/或核苷酸序列作为起点。

一些优选的而非限制性的骆驼源化置换可以来自表A-5-A-8。同样 应该清楚，在一个或多个标志残基的骆驼源化置换通常将比在一个或多个 其它氨基酸位置的置换对所需要的特性有更大的影响，尽管这两种置换以 及它们的任何适当的组合均包括在本发明范围之内。例如，可以引入一个 或多个已经赋予至少一些所需要的特性的骆驼源化置换，并且然后引入进 一步的骆驼源化置换，其进一步改善所述特性和/或赋予额外的有利特性。 同样地，基于本发明的公开内容，并且任选地在有限程度的常规实验之后， 专业技术人员将通常能够确定并选择适当的骆驼源化置换或适当的骆驼 源化置换的组合，所述常规实验可以包括，例如，引入有限数量的可能的 骆驼源化置换，并且确定是否获得或改善纳米抗体的有利特性(即，与原 始V_H结构域相比)。然而，一般地，所述骆驼源化置换优选是这样的以致 得到的氨基酸序列至少包含(a)在位置108的Q；和/或(b)在位置45的带 电荷的氨基酸或半胱氨酸残基以及优选地还有在位置44的E，以及更优 选地在位置44的E和在位置45的R；和/或(c)在位置103的P，R或S； 和任选地一种或多种其它的骆驼源化置换。更优选地，所述骆驼源化置换 是这样的以致它们产生本发明的纳米抗体和/或其类似物(如本文定义)，如 得到人源化的类似物和/或优选地如在前述各段落中定义的类似物。

如从本文的公开内容中还要清楚的是，使用如本文所定义的本发明的 纳米抗体的部分或片段，或两个或多个部分或片段的组合，并且特别是 SEQ ID NO’s：455-501，更优选455-457，459，460，464-469的纳米抗体 的部分或片段，也包括在本发明的范围内。因此，根据本发明的一个方面， 术语“本发明的纳米抗体”在其最广泛的意义上也涵盖所述部分或片段。

一般地，本发明的纳米抗体(包括其类似物)的所述部分或片段具有 这样的氨基酸序列，其中，与相对应的本发明的全长纳米抗体(或其类似 物)的氨基酸序列相比较，已经缺失和/或去除在N末端的一个或多个氨 基酸残基，在C末端的一个或多个氨基酸残基，一个或多个连续的内部 氨基酸残基，或它们的任何组合。

所述部分或片段优选是这样的，以致它们可以以如本文关于本发明的 纳米抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为K_D-值(实际的或表观的)， K_A-值(实际的或表观的)，k_on-速率和/或k_off-速率，或备选地为IC₅₀值，如 本发明进一步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2。

任何部分或片段优选地是这样，以致其包括相对应的本发明的全长纳 米抗体的氨基酸序列的至少10个连续的氨基酸残基，优选地至少20个连 续的氨基酸残基，更优选地至少30个连续的氨基酸残基，诸如至少40个 连续的氨基酸残基。

此外，任何部分或片段优选是这样的，以致其包括CDR1、CDR2和/ 或CDR3中的至少一个或至少其部分(并且特别是至少CDR3或至少其部 分)。更优选地，任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个CDR(并 且优选至少CDR3或其部分)，和至少一个其它CDR(即，CDR1或CDR2) 或至少其部分，优选通过适当的构架序列或至少其部分连接。更优选地， 任何部分或片段是这样的，以致其包括至少一个CDR(且优选至少CDR3 或其部分)，和至少两个剩余CDR的部分，同样优选通过适当的构架序列 或至少其部分连接。

按照另一个特别优选的但非限制性的方面，这样的部分或片段包括至 少CDR3，诸如相对应的本发明全长纳米抗体的FR3、CDR3和FR4，即， 例如，如在国际申请WO 03/050531(Lasters等)中所述。

如上文已经提及，还可以组合两个或更多个这样的部分或片段(即， 来自相同的或不同的本发明的纳米抗体)，即，以提供本发明纳米抗体的 类似物(如本文所定义)和/或以提供其它部分或片段(如本文所定义)。例如， 还可以将本发明纳米抗体的一个或多个部分或片段与人V_H结构域的一个 或多个部分或片段组合。

根据一个优选方面，所述部分或片段与SEQ ID NO’s：455-501，更优 选455-457，459，460，464-469的纳米抗体之一具有至少50％、优选地至 少60％、更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、诸如至少90％、 95％或99％或更多的序列同一性程度。

所述部分和片段，以及编码其的核酸序列可以以本身已知的任何方式 提供并且任选地组合。例如，所述部分或片段可以通过在编码本发明的全 长纳米抗体的核酸中插入终止密码子，并且然后以本身已知的方式(例如， 如本文所述)表达这样获得的核酸而获得。备选地，编码所述部分或片段 的核酸可以这样获得，即，通过适当限制性酶切(restrict)编码本发明的全 长纳米抗体的核酸或通过以本身已知的方式合成这样的核酸。部分或片段 还可以使用本身已知的肽合成技术提供。

本发明在其最广泛意义上还包括本发明的纳米抗体的衍生物。这样的 衍生物通常可以通过本发明的纳米抗体和/或形成本发明的纳米抗体的一 个或多个氨基酸残基的修饰而获得，并且特别是通过化学和/或生物(例 如，酶促)修饰获得。

专业技术人员应该清楚这样的修饰的实例，以及纳米抗体序列中可以 以这样的方式修饰的氨基酸残基的实例(即，在蛋白主链上但是优选地在 侧链上)，可以用来引入所述修饰的方法和技术以及所述修饰的潜在用途 和优点。

例如，这样的修饰可以包括向本发明的纳米抗体内或向本发明的纳米 抗体上引入(例如，通过共价连接或以其它适当的方式)一个或多个官能 团、残基或结构部分，并且特别是赋予本发明的纳米抗体一种或多种理想 的特性或官能性的一个或多个官能团、残基或结构部分。专业技术人员应 该清楚所述官能团的实例。

例如，所述修饰可以包括引入(例如，通过共价结合或以任何其它适 当的方式)一个或多个这样的官能团，即，所述官能团增加本发明的纳米 抗体的半衰期、溶解性和/或吸收，减少本发明的纳米抗体的免疫原性和/ 或毒性，消除或减弱本发明的纳米抗体的任何不理想的副作用，和/或赋 予本发明的纳米抗体和/或多肽以其它的有利特性和/或减少本发明的纳米 抗体和/或多肽的不理想特性；或者上述两种或多种的任何组合。所述官 能团的实例以及引入所述官能团的技术的实例应该为专业技术人员清楚， 并且通常可以包括上文引用的公知背景技术中提及的所有官能团和技术， 以及本身已知的用于修饰药物蛋白并且特别用于修饰抗体或抗体片段(包 括ScFv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，关于其的参考文献例如参 考雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Mack 出版公司，伊斯顿，PA(1980)。例如，所述官能团可以直接连接(例如共 价地)到本发明的纳米抗体上，或者任选地通过适当的接头或间隔臂连接， 这也为专业技术人员所清楚。

关于增加药物蛋白的半衰期和/或减少免疫原性最广泛应用的一种技 术包括附着适当的药用聚合物，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸 如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般地，可以应用聚乙二醇化作用的 任何适当的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单) 结构域抗体和ScFv’s)的聚乙二醇化作用；例如，参考Chapman，自然生 物技术(Nat.Biotechnol.)，54，531-545(2002)；Veronese和Harris，高级药 物递送综述(Adv.Drug Deliv.Rev.)54，453-456(2003)，Harris和Chess，自 然药物发现评论(Nat.Rev.Drug.Discov.)，2，(2003)以及在WO 04/060965 中。用于蛋白聚乙二醇化的各种试剂还可以商购，例如从美国Nektar治 疗公司(Nektar Therapeutics)购得。

优选地，应用位点定向聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸-残基(参 见例如Yang等，蛋白质工程(Protein Engineering)，16，10，761-770 (2003))。例如，为了这一目的，PEG可以附着到在本发明的纳米抗体中 天然存在的半胱氨酸残基上，本发明的纳米抗体可以这样进行修饰，以适 当地引入一个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基，或者可以将包括一 个或多个用于PEG附着的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的纳 米抗体的N-和/或C-端，其全部使用本身为专业技术人员所了解的蛋白质 工程技术。

优选地，对于本发明的纳米抗体和蛋白，使用具有分子量大于5000， 诸如大于10,000并且小于200,000，诸如小于100,000；例如在 20,000-80,000范围内的PEG。

另一种通常较不优选的修饰包括N-连接的或O-连接的糖基化，通常 作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，其取决于为了表达本发明的纳米 抗体或多肽所用的宿主细胞。

另一种修饰可以包括引入一种或多种可检测的标记或其它信号-产生 基团或结构部分，其取决于所标记纳米抗体的目的用途。适宜的标记以及 附着、使用和检测它们的技术是专业技术人员所清楚的，并且例如包括但 不限于，荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝 蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)、以及荧光胺和荧光素金 属诸如¹⁵²Eu或其它来自镧系的金属)、磷光性标记、化学发光标记或生物 发光标记(诸如鲁米那、异鲁米诺、theromatic acridinium酯(theromatic  acridinium ester)、咪唑、acridinium盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及 其类似物)、放射性-同位素(诸如³H，¹²⁵I，³²P，³⁵S，¹⁴C，⁵¹Cr，³⁶Cl，⁵⁷Co，⁵⁸Co， ⁵⁹Fe和⁷⁵Se)、金属、金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子诸如^99mTc， ¹²³I，¹¹¹In，¹³¹I，⁹⁷Ru，⁶⁷Cu，⁶⁷Ga和⁶⁸Ga，或其它特别适合用于体内、体外或 原位诊断和成像的金属或金属阳离子，诸如(¹⁵⁷Gd，⁵⁵Mn，¹⁶²Dy，⁵²Cr和 ⁵⁶Fe)、以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-V-类 固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、生物 素-抗生物素蛋白过氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、 葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI- 磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其它适宜的标记为专业技术 人员所清楚，并且例如包括可以应用NMR或ESR光谱检测的结构部分。

例如，这样标记的本发明的纳米抗体和多肽可以用于体外、体内或原 位检测(包括本身已知的免疫检测，诸如ELISA，RIA，EIA和其它“夹心 式检测”等)，以及体内诊断和成像目的，这取决于特定的标记的选择。

专业技术人员应该清楚，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以 螯合上文提到的金属或金属阳离子中的一种。例如，适当的螯合基团包括 但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

另一种修饰可以包括引入作为特异性结合对诸如生物素-(链霉)抗 生物素蛋白结合对的一部分的官能团。这样的官能团可以用来将本发明的 纳米抗体与另一种蛋白、多肽或化学化合物结合，所述另一种蛋白、多肽 或化学化合物与所述结合对的另一半结合，即，通过形成所述结合对。例 如，本发明的纳米抗体可以缀合到生物素上，并且连接到与抗生物素蛋白 或链霉抗生物素蛋白缀合的另一种蛋白、多肽、化合物或载体上。例如， 这样缀合的纳米抗体可以用作报道子，例如在产生可检测的信号的试剂与 抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白缀合的诊断系统中用作报道子。例如， 这种结合对还可以用来将本发明的纳米抗体与载体结合，所述载体包括适 用于药物目的的载体。一个非限制性的实例是Cao和Suresh，药物靶向杂 志(Journal of Drug Targetting)，8，4，257(2000)所述的脂质体制剂。这种 结合对还可以用来将治疗活性剂与本发明的纳米抗体结合。

对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的 靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生 长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与毒素或者毒性残 基或结构部分连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供细胞毒性 化合物的毒性结构部分、化合物或残基的实例对于专业技术人员是清楚 的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找 到。一个实例是记述在WO 03/055527中的所谓的ADEPTTM技术。

专业技术人员应该清楚其它潜在的化学和酶促修饰。这种修饰还可以 为研究目的引入(例如，为了研究功能-活性关系)。例如，参考Lundblad 和Bradshaw，生物技术和应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.)，26， 143-151(1997)。

优选地，所述衍生物是这样的，以致它们以如本文关于本发明的纳米 抗体所定义的亲和力(适当测量和/或表示为K_D-值(实际的或表观的)，K_A- 值(实际的或表观的)，k_on速率和/或k_off-速率，或备选地为IC₅₀值，如本 发明进一步所述)结合Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2。

如上文提及，本发明还涉及基本上由至少一个本发明的纳米抗体组成 或包括至少一个本发明的纳米抗体的蛋白或多肽。“基本上由……组成” 意指本发明的多肽的氨基酸序列与本发明纳米抗体的氨基酸序列完全相 同，或者与本发明纳米抗体的氨基酸序列相对应，其将有限数目的氨基酸 残基，诸如1-20个氨基酸残基，例如1-10个氨基酸残基并且优选地1-6 个氨基酸残基，诸如1，2，3，4，5或6个氨基酸残基添加到所述纳米抗体的 氨基酸序列的氨基末端、羧基末端或者氨基末端和羧基末端两端。

所述氨基酸残基可以或者可以不变化、改变或者另外影响所述纳米抗 体的(生物学)特性，并且可以或者可以不为所述纳米抗体添加其它的官 能性。例如，所述氨基酸残基：

-可以包括N-端Met残基，例如，作为在异源宿主细胞或宿主生物体 内表达的结果；

-可以形成信号序列或前导序列，其引导所述纳米抗体在合成后从宿主 细胞中分泌。适宜的分泌性前导肽应该是专业技术人员所清楚的，并且可 以如本文进一步所述。通常，这样的前导序列与所述纳米抗体的N端连 接，尽管本发明在其最广泛意义上不限于此；

-可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许所述纳米抗体 导向和/或透过或进入特异性的器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区 室，和/或所述序列或信号允许所述纳米抗体透过或穿过生物屏障诸如细 胞膜、细胞层(诸如上皮细胞层)、肿瘤(包括实体瘤)、或血脑屏障。所 述氨基酸序列的实例对于专业技术人员是清楚的。一些非限制性的实例是 在WO 03/026700和Temsamani等，生物学治疗的专家观点(Expert Opin. Biol.Ther.)，1，773(2001)；Temsamani和Vidal，今日药物发现(Drug Discov. Today)，9，1012(004)以及Rousselle，药理学和实验治疗学杂志(J. Pharmacol.Exp.Ther.)，296，124-131(2001)中所述的小肽载体(“Pep-trans 载体”)，和由Zhao等，凋亡(Apoptosis)，8，631-637(2003)所述的膜易位 体序列。例如，用于抗体片段细胞内靶向的C端和N端氨基酸序列由 Cardinale等，方法(Methods)，34，171(2004)所述。关于细胞内靶向的其 它适宜的技术包括所谓的“细胞内抗体(intrabody)”的表达和/或应用，所 述“细胞内抗体”包括本发明的纳米抗体，如下文所提及；

-可以形成“标记”，例如允许或促进所述纳米抗体的纯化的氨基酸序 列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术进行纯化。然后，所 述序列或残基可以被去除(例如，通过化学或酶促裂解)，以提供纳米抗 体序列(为了这一目的，所述标记可以任选地通过可裂解的接头序列与所 述纳米抗体序列连接或包含可裂解的基序)。这种残基的一些优选的但非 限制性的实例是多个组氨酸残基、谷胱甘肽残基以及myc-标记(例如参 见WO 06/12282的SEQ ID NO：31)；

-可以是已经被官能化和/或可以作为用于官能团附着的位点的一个或 多个氨基酸残基。适宜的氨基酸残基和官能团应该是专业技术人员所清楚 的，并且包括但不限于，本文关于本发明的纳米抗体的衍生物提及的氨基 酸残基和官能团。

按照另一个方面，本发明的多肽包括本发明的纳米抗体，所述多肽在 其氨基末端、在其羧基末端、或者在其氨基末端和其羧基末端两端融合至 少一个其它氨基酸序列，即，以提供包括所述本发明的纳米抗体和一个或 多个其它氨基酸序列的融合蛋白。这种融合体在本文还叫作“纳米抗体融 合体”。

所述一个或多个其它氨基酸序列可以是任何适宜的和/或理想的氨基 酸序列。所述其它氨基酸序列可以或可以不变化、改变或另外影响所述纳 米抗体的(生物学)特性，并且可以或可以不为本发明的纳米抗体或多肽 加入其它的官能性。优选地，所述其它氨基酸序列是这样的，以致它赋予 本发明的纳米抗体或多肽一种或多种理想的特性或官能性。

例如，所述其他氨基酸序列也可以提供第二结合位点，所述结合位点 可以针对任何需要的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位(包括但不限 于与本发明的纳米抗体所针对的相同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或 表位，或不同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位)。

这样的氨基酸序列的实例是专业技术人员所清楚的，并且通常可以包 括基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv’s和单结构域抗体)的用 于肽融合的所有氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson，自然生物技 术(Nature Biotechnology)，23，9，1126-1136(2005)的综述。

例如，与本发明的纳米抗体本身相比，这样的氨基酸序列可以是这样 的氨基酸序列，即，其增加本发明的多肽的半衰期、溶解性、或吸收，减 少本发明的多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明的多肽的不理想的 副作用，和/或赋予本发明的多肽以其它有利的特性和/或减少本发明的多 肽的不理想特性。所述氨基酸序列的一些非限制性实例为血清蛋白，诸如 人血清白蛋白(参见，例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如被循环抗 体识别的半抗原，参见例如WO 98/22141)。

特别地，在本领域中已经描述，免疫球蛋白(如V_H结构域)与血清 白蛋白或与其片段的连接片段可以用来增加半衰期。参考WO 00/27435 和WO01/077137。根据本发明，本发明的纳米抗体优选地与血清白蛋白 (或与其适当的片段)直接连接，或通过适当的接头连接，且特别地通过 适当的肽连接，以致本发明的多肽可以作为遗传融合体(蛋白)表达。按 照一个具体的方面，本发明的纳米抗体可以与血清白蛋白片段连接，所述 血清白蛋白片段至少包括血清白蛋白的结构域III或其部分。例如，参考 埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的于2006年3月31日提交的题 目为“白蛋白来源的氨基酸序列，其用于增加治疗性蛋白和其他治疗性蛋 白和实体的半衰期的用途，以及包括其的构建体(Albumin derived amino  acid sequence，use thereof for increasing the half-life of therapeutic proteins  and of other therapeutic proteins and entities，and constructs comprising the  same)”美国临时申请60/788,256。

备选地，所述其它的氨基酸序列还可以提供第二结合位点或结合单 位，所述结合位点或结合单位针对血清蛋白(诸如例如，人血清白蛋白或 另一种血清蛋白，诸如IgG)，以在血清中提供增加的半衰期。例如，所 述氨基酸序列包括下述纳米抗体，以及在WO 91/01743，WO 01/45746和 WO 02/076489中所述的小肽和结合蛋白，和在WO 03/002609和WO 04/003019所述的dAb’s。还参考Harmsen等，疫苗(Vaccine)，23(41)； 4926-42，2005，以及EP 0 368 684，以及下述本文提及的埃博灵克斯股份 有限公司(Ablynx.N.V.)的美国临时申请60/843,349，60/850,774， 60/850,775和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx.N.V.)于2006年12月5 日提交的题目为“Peptides capable of binding to serum proteins(能够结合 血清蛋白的肽)”的美国临时申请(也在本文中提及)。

所述氨基酸序列可以特别针对血清白蛋白(并且更特别是人血清白蛋 白)和/或针对IgG(并且更特别是人IgG)。例如，所述氨基酸序列可以是 下列氨基酸序列：针对(人)血清白蛋白的氨基酸序列，和可以结合在(人) 血清白蛋白上不参与血清白蛋白与FcRn结合的氨基酸残基的氨基酸序列 (例如，参见WO 06/0122787)，和/或能够结合在血清白蛋白上不形成血清 白蛋白结构域III的一部分的氨基酸残基的氨基酸序列(例如，同样参见 WO 06/0122787)；具有或可以提供增加的半衰期的氨基酸序列(例如，参见 埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的于2006年9月8日提交的题 目为“具有长半衰期的血清白蛋白结合蛋白(Serum albumin binding  proteins with long half-lives)”的美国临时申请60/843,349)；与来自至少一 个哺乳动物物种的、并且特别是与至少一个灵长类物种(诸如但不限于， 来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macaca  fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒 (Papio ursinus))，同样参考美国临时申请60/843,349)的血清白蛋白交叉反 应的针对人血清白蛋白的氨基酸序列；可以以不依赖pH的方式结合血清 白蛋白的氨基酸序列(参见，例如，埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.) 于2006年10月11日提交的题目为“以基本上不依赖pH的方式结合血 清蛋白的氨基酸序列，包含其的化合物及其应用(Amino acid sequences that  bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH， compounds comprising the same，and uses theref)”的美国临时申请 60/850,774)，和/或是条件粘合剂的氨基酸序列(例如，参见埃博灵克斯股 份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年10月11日提交的题目为“以条件 方式结合需要的分子的氨基酸序列(Amino acid sequences that bind to a  desired molecule in a conditional manner)”的美国临时申请60/850,775)。

按照另一个方面，所述一个或多个其他氨基酸序列可以包括常规4- 链抗体(且特别是人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结 构域。例如，尽管通常较不优选，本发明的纳米抗体可以与常规(优选人) V_H或V_L结构域连接或与V_H或V_L结构域的天然或合成的类似物连接，同 样任选地通过接头序列(包括但不限于其他(单)结构域抗体，如Ward 等所述的dAb’s)连接。

所述至少一个纳米抗体还可以与一个或多个(优选人的)C_H1、C_H2和/ 或C_H3结构域连接，这任选地通过接头序列连接。例如，与适宜的C_H1 结构域连接的纳米抗体，可以例如——与适当的轻链一起——用来产生类 似于常规Fab片段或F(ab’)₂片段的抗体片段/结构，但是其中一个或者 (F(ab’)₂片段的情形中)一个或两个常规V_H结构域已被本发明的纳米抗 体取代。此外，两个纳米抗体可以与C_H3结构域(任选通过接头)连接， 以提供具有增加的体内半衰期的构建体。

根据本发明的多肽的一个具体方面，一个或多个本发明的纳米抗体可 以与一个或多个抗体部分、片段或结构域连接，其赋予本发明的多肽一种 或多种效应子功能，和/或可以赋予与一个或多个Fc受体结合的能力。例 如，为了这一目的，并且不限于此，所述一个或多个其它氨基酸序列可以 包括抗体、诸如来自重链抗体(如本文所述)并且更优选来自常规人4- 链抗体的一个或多个C_H2和/或C_H3结构域；和/或可以形成Fc区域的(部 分)和Fc区域，例如来自IgG，来自IgE或来自另一种人Ig。例如，WO 94/04678描述了包括骆驼科动物V_HH结构域或其人源化的衍生物的重链 抗体(即，纳米抗体)，其中所述骆驼科动物C_H2和/或C_H3结构域已被人 C_H2和C_H3结构域取代，以提供由2条重链组成的免疫球蛋白，其中每 条重链包括纳米抗体和人C_H2与C_H3结构域(但是无C_H1结构域)，所述 免疫球蛋白具有由所述C_H2和C_H3结构域提供的效应子功能，并且所述 免疫球蛋白可以在无需任何轻链的存在下行使功能。专业技术人员应该清 楚可以适当与本发明的纳米抗体连接以提供效应子功能的其它氨基酸序 列，并且可以基于所需要的效应子功能进行选择。例如，参考WO 04/058820，WO 99/42077和WO 05/017148，以及Holliger和Hudson的综 述，同前。与相对应的本发明的纳米抗体相比，本发明的纳米抗体与Fc 部分偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰 期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即，C_H2和 /或C_H3结构域)也可以是适当的或者甚至是优选的。专业技术人员应该清 楚包括具有增加的体内半衰期的一个或多个纳米抗体和一个或多个恒定 结构域的其它适当的构建体，并且例如，其可以包括与C_H3结构域连接的 两个纳米抗体，任选地通过接头序列连接。通常，具有增加的半衰期的任 何融合蛋白或衍生物将优选具有大于50kD的分子量，50kD是肾吸收的 截留值。

所述其它氨基酸序列还可以形成信号序列或前导序列，其引导本发明 的纳米抗体或多肽在合成后从宿主细胞中分泌(例如，以提供本发明的多 肽的前体-(pre-)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式，这取决于用来表 达本发明的多肽的宿主细胞)。

所述其它氨基酸序列还可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或 信号允许本发明的纳米抗体或多肽导向和/或透过或进入特异性的器官、 组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许本发明 的纳米抗体或多肽透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层(诸如上皮细 胞层)、肿瘤(包括实体瘤)、或血脑屏障。所述氨基酸序列的适当的实例 对于专业技术人员是清楚的，并且例如包括但不限于，上文提及的 “Peptrans”载体，Cardinale等描述的序列，以及本身已知的可以用来将 本发明的纳米抗体和多肽表达或生产为所谓的“细胞内抗体”的氨基酸序 列和抗体片段，例如，如在WO 94/02610，WO 95/22618，US-A-7004940， WO 03/014960，WO 99/07414；WO 05/01690；EP 1 512 696；和Cattaneo，A. 与Biocca，S.(1997)细胞内抗体：开发和应用(Intracellular Antibodies： Development and Applications).Landes和Springer-Verlag；以及在 Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170，以及本发明所述的其它 参考文献中所述。

对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的 靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生 长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与(细胞)毒性蛋 白或多肽连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供本发明的细胞 毒性多肽的所述毒性蛋白和多肽的实例对于专业技术人员是清楚的，并且 例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个 实例是在WO 03/055527中所述的所谓的ADEPT^TM技术。

根据一个优选但非限制性的方面，所述一个或多个其它氨基酸序列包 括至少一个其它的纳米抗体，以提供包括至少两个、诸如三个、四个、五 个或更多个纳米抗体的本发明的多肽，其中所述纳米抗体可以任选地通过 一个或多个接头序列(如本发明所定义)连接。包括两个或更多个纳米抗体 的本发明的多肽，其中至少一个是本发明的纳米抗体，在本发明中还将称 为本发明的“多价”多肽，并且在所述多肽中存在的纳米抗体还将在本发 明中称为处于“多价形式”。例如，本发明的“二价”多肽包括任选地通 过一个接头序列连接的2个纳米抗体，而本发明的“三价”多肽包括任选 地通过两个接头序列连接的3个纳米抗体；等等；其中在所述多肽中存在 的至少一个纳米抗体，并且多至在所述多肽中存在的所有纳米抗体，是本 发明的纳米抗体。

在本发明的多价多肽中，所述两个或更多个纳米抗体可以是相同的或 不同的，并且可以针对同一抗原或抗原决定簇(例如，针对相同部分或表 位或者针对不同部分或表位)，或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定 簇；或它们的任何适当的组合。例如，本发明的二价多肽可以包括：(a)两 个相同的纳米抗体；(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗 体，和针对所述蛋白或抗原的同一抗原决定簇的第二纳米抗体，所述第二 纳米抗体不同于所述第一纳米抗体；(c)针对蛋白或抗原的第一抗原决定 簇的第一纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的另一个抗原决定簇的第二纳 米抗体；或(d)针对第一蛋白或抗原的第一纳米抗体，和针对第二蛋白或 抗原(即，与所述第一抗原不同)的第二纳米抗体。类似地，本发明的三 价多肽可以，例如但不限于此，包括(a)3个相同的纳米抗体；(b)针对抗 原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体，和针对同一抗原的不同抗原 决定簇的第三纳米抗体；(c)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳 米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三纳米抗体；(d)针 对第一抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，针对所述第一抗原的第二 抗原决定簇的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第 三纳米抗体；或(e)针对第一抗原的第一纳米抗体，针对不同于所述第一 抗原的第二抗原的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一和第二抗原的第 三抗原的第三纳米抗体。

包含至少两个纳米抗体的本发明的多肽，其中至少一个纳米抗体针对 第一抗原(即，针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4， 或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2)，并且至少一个纳米抗体针对第二 抗原(即，不同于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选不同于Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选不同于Tie2或Ang2)，还叫作本发明的“多特 异性”多肽，并且存在于所述多肽中的纳米抗体还在本文中叫作处于“多 特异性形式”。因此，例如，本发明的“双特异性”多肽是包括至少一个 针对第一抗原(即针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2)的纳米抗体和至少一 个针对第二抗原(即，不同于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选不同于Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选不同于Tie2或Ang2)的其它纳米抗体的 多肽，而本发明的“三特异性”多肽是这样的多肽，即，其包括至少一个 针对第一抗原(即针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2)的纳米抗体，至少一 个针对第二抗原(即，不同于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选不同于Tie2，Ang2， Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选不同于Tie2或Ang2)的其它纳米抗体， 和至少一个针对第三抗原(即，不同于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选不同于 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选不同于Tie2或Ang2和不同于 所述第二抗原二者)的其它纳米抗体；等等。

因此，以其最简单的形式，本发明的双特异性多肽是本发明的二价多 肽(如本文所定义)，其包括针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针对Tie2， Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2的第一纳米抗体， 和针对第二抗原的第二纳米抗体，其中所述第一和第二纳米抗体可以任选 地通过接头序列(如本文所定义)而连接；而以其最简单形式存在的本发 明的三特异性多肽是本发明的三价多肽(如本文所定义)，其包括针对Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对 Tie2或Ang2的第一纳米抗体，针对第二抗原的第二纳米抗体，和针对第 三抗原的第三纳米抗体，其中所述第一、第二和第三纳米抗体可以任选地 通过一个或多个，并且特别是一个或多个特别是两个接头序列连接。

然而，从上文所述应该清楚，本发明并不限于此，在这种意义上，本 发明的多特异性多肽可以包括至少一个针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选针 对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对Tie2或Ang2的纳米抗 体，和任何数目的针对一个或多个不同于Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选不 同于Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选不同于Tie2或Ang2的抗 原的纳米抗体。

此外，尽管所述多个纳米抗体在本发明的多肽中的特定顺序或排列可 能对本发明最终的多肽的特性具有一些影响(包括，但不限于针对Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选针对Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选针对 Tie2或Ang2的或针对所述一个或多个其它抗原的亲和力、特异性或抗体 亲抗原性)也包括在本发明的范围内，但是所述顺序或排列通常不是关键 的，并且可以由专业技术人员适当选择，任选地基于本发明的公开内容在 一些有限的常规实验之后选择。因此，当提及本发明的特异性多价或多特 异性多肽时，应该注意到，这包括相关纳米抗体的任何顺序或排列，除非 另外明确指明。

此外，本发明的多肽包含两个或更多个纳米抗体以及一个或多个其它 氨基酸序列(如本文所提及)也在本发明的范围之内。

对于包含一个或多个V_HH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，还 参考Conrath等.，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，卷276，10.7346-7350， 2001，Muyldermans，Reviews in Molecular Biotechnology(分子生物技术综 述)74(2001)，277-302；以及例如WO 96/34103和WO 99/23221。本发明的 一些特定的多特异性和/或多价多肽的一些其它的实例可以在本文所引用 的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的申请中找到。

本发明的多特异性多肽的一个优选而非限制性的实例包括至少一个 本发明的纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体。例如，所述 纳米抗体可以是针对血清蛋白、且特别是人血清蛋白的纳米抗体，所述血 清蛋白诸如人血清白蛋白、甲状腺素结合蛋白、(人)转铁蛋白、凝血因 子I、免疫球蛋白如IgG、IgE或IgM、或WO 04/003019中列出的一种血 清蛋白。在这些中，可以结合血清白蛋白(且特别是人血清白蛋白)或结 合IgG(且特别是人IgG，例如，参见在Muyldermans，同前所述的综述 中记述的纳米抗体VH-1)的纳米抗体是特别优选的(尽管，例如，对于 在小鼠或灵长类动物中的实验，可以使用分别针对小鼠血清白蛋白(MSA) 或来自所述灵长类动物的血清白蛋白的纳米抗体或与之交叉反应的纳米 抗体。然而，对于药物应用，通常优选针对人血清白蛋白或人IgG的纳米 抗体)。提供增加的半衰期且可以用在本发明的多肽中的纳米抗体包括针 对血清白蛋白的纳米抗体，其记述在埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 04/041865，WO 06/122787和其他专利申请中，如上文所述 的那些。

例如，提供增加的半衰期以用于本发明的所述一些优选的纳米抗体包 括可以与(人)血清白蛋白上不参与血清白蛋白与FcRn结合的氨基酸残 基结合的纳米抗体(例如，参见WO 06/0122787)；能够与血清白蛋白上 不形成血清白蛋白结构域III的一部分的氨基酸残基结合的纳米抗体(例 如，参见WO 06/0122787)；具有或可以提供增加的半衰期的纳米抗体(例 如，参见本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的美国临时 申请60/843,349)；针对与来自至少一个哺乳动物物种、且特别是至少一个 灵长类物种(诸如但不限于，来自猕猴属(Macaca)的猴子(诸如，并且 特别地，食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca  mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus))，例如，参见埃博灵克斯股 份有限公司(Ablynx N.V.)的美国临时申请60/843,349)的血清白蛋白交 叉反应的针对人血清白蛋白的纳米抗体；可以以不依赖pH的方式结合血 清白蛋白的纳米抗体(例如，参见本文提及的埃博灵克斯股份有限公司 (Ablynx N.V.)的美国临时申请60/850,774)和/或是条件粘合剂的纳米抗 体(例如，参见埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的美国临时申请 60/850,775)。

一些特别优选的提供增加的半衰期且可以用于本发明的多肽中的纳 米抗体包括WO 06/122787中公开的纳米抗体ALB-1至ALB-10(参见表 II和III)，其中ALB-8(WO 06/122787中的SEQ ID NO：62)是特别优选的。

本发明的多肽的一些优选的但非限制性的实例，其包括至少一个本发 明的纳米抗体和至少一个提供增加的半衰期的纳米抗体。

根据本发明的一个具体的但非限制性的方面，除了一个或多个本发明 的纳米抗体之外，本发明的多肽还包含至少一个针对人血清白蛋白的纳米 抗体。

一般地，包含一个或多个本发明的纳米抗体的具有增加的半衰期的任 何本发明的多肽，和具有增加的半衰期的本发明的纳米抗体的任何衍生物 或所述多肽的任何衍生物，优选地具有是相对应的本发明的纳米抗体本身 半衰期的至少1.5倍、优选至少2倍、如至少5倍、例如至少10倍或多 于20倍的半衰期。例如，与相对应的本发明的纳米抗体本身相比较，所 述具有增加的半衰期的衍生物或多肽可以具有增加超过1小时、优选超过 2小时、更优选超过6小时、如超过12小时、或甚至超过24、48或72 小时的半衰期。

在本发明的一个优选的但非限制性的方面中，所述衍生物或多肽可以 在人中表现出至少约12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、 甚至更优选至少72小时或更多的血清半衰期。例如，所述衍生物或多肽 可以具有至少5天(如约5-10天)、优选至少9天(如约9-14天)、更优 选至少约10天(如约10-15天)、或至少约11天(如约11-16天)、更优 选至少约12天(如约12-18天或更多)、或大于14天(如约14-19天) 的半衰期。

根据本发明的一个方面，所述多肽能够与可以增加所述多肽的体内半 衰期的一个或多个分子结合。

本发明的多肽在体内是稳定的，并且它们的半衰期通过与抗降解和/ 或清除或隔离(sequestration)的分子结合来增加。典型地，所述分子是本身 具有长久的体内半衰期的天然存在的蛋白。

本发明的多特异性多肽的另一个优选而非限制性的实例包括至少一 个本发明的纳米抗体和至少一个这样的纳米抗体，即，所述纳米抗体是本 发明的多肽所针对的，和/或允许本发明的多肽透过或进入特定的器官、 组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或允许所述纳米抗体透过或穿 过生物屏障诸如细胞膜、细胞层(诸如上皮细胞层)、肿瘤(包括实体瘤)、 或血脑屏障。所述的纳米抗体的实例包括针对所需要的器官、组织或细胞 的特异性的细胞表面蛋白、标记或表位(例如，与肿瘤细胞相关的细胞表 面标记)的纳米抗体，和在WO 02/057445和WO 06/040153中描述的单 结构域靶向脑的抗体片段，其中FC44(WO 06/040153中的SEQ ID NO： 189)和FC5(WO 06/040154中的SEQ ID NO：190)是优选的实例。

在本发明的多肽中，所述一个或多个纳米抗体和所述一个或多个多肽 可以直接彼此连接(例如在WO 99/23221中所述)和/或可以通过一个或 多个适宜的间隔臂或接头或其任意组合而彼此连接。

用于多价和多特异性多肽的适宜的间隔臂或接头应该是专业技术人 员所清楚的，并且通常可以是本领域用来连接氨基酸序列的任何接头或间 隔臂。优选地，所述接头或间隔臂适合用于构建意欲药用的蛋白或多肽。

一些特别优选的间隔臂包括本领域中用于连接抗体片段或抗体结构 域的间隔臂和接头。这些包括上文所引用的公知背景技术中提及的接头， 以及例如在本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(在这一方面， 然而，应该注意，尽管在双抗体和在ScFv片段中，所用的接头序列应该 具有某种长度、某种程度的柔性以及允许相关的V_H和V_L结构域靠近在一 起形成完整的抗原-结合位点的其它特性，但是，由于每一纳米抗体本身 形成完整的抗原-结合位点，所以对于用于本发明的多肽的接头的长度或 柔性没有特别的限制)。

例如，接头可以是适当的氨基酸序列，并且特别是1-50、优选1-30、 诸如1-10个氨基酸残基的氨基酸序列。所述氨基酸序列的一些优选实例 包括gly-ser接头，例如，(gly_xser_y)_z型的，诸如(例如(gly₄ser)₃或(gly₃ser₂)₃， 如在WO 99/42077中所述，和在本文提及的Ablynx的申请中描述的 GS30、GS15、GS9和GS7接头(例如，参见WO 06/040153和WO 06/122825)，以及铰链样区域如天然存在的重链抗体的铰链区或类似的序 列(如在WO 94/04678中所述)。

一些其他特别优选的接头是聚丙氨酸(如AAA)，以及接头GS30(在 WO 06/122825中的SEQ ID NO：85)和GS9(在WO 06/122825中的SEQ ID  NO：84)。

其它适宜的接头通常包括有机化合物或聚合物，特别是适用于药用 蛋白的那些。例如，聚(乙二醇)结构部分已经用来连接抗体结构域，参 见例如WO 04/081026。

下列情形也在本发明范围内，所用的接头的长度、柔性程度和/或其 他特性(尽管不是关键的，由于它通常是用在ScFv片段中的接头)可以 对本发明最终的多肽的特性具有一些影响，包括但不限于针对Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或 Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2， 或针对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或抗体亲抗原性。基于本文 的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后，专业技术人员应该能够 确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。

例如，在包括针对多聚体抗原(诸如多聚体受体或其他蛋白)的纳米 抗体的本发明的多价多肽中，所述接头的长度和柔性优选是这样的，以致 其允许在所述多肽中存在的每一个本发明的纳米抗体结合在所述多聚体 每个亚基上的抗原决定簇。类似地，在包括针对在同一个抗原上的两个或 更多个不同抗原决定簇(例如，针对抗原的不同表位和/或针对多聚体受 体、通道或蛋白的不同亚单位)的纳米抗体的本发明的多特异性多肽中， 所述接头的长度和柔性优选是这样的，以致其允许每个纳米抗体与其目的 抗原决定簇结合。同样地，基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常 规实验之后，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳 接头。

下列情形也在本发明范围内：所用的接头赋予本发明的多肽一种或多 种其它有利特性或官能性，和/或提供用于形成衍生物和/或用于官能团附 着的一个或多个位点(例如，如本文关于本发明的纳米抗体的衍生物的描 述)。例如，包含一个或多个带电荷氨基酸残基(参见上表A-2)的接头 可以提供提高的亲水特性，而形成或包含小的表位或标记的接头可以用于 检测、鉴定和/或纯化目的。并且，基于本文的公开内容，任选地在一些 有限的常规实验之后，专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多 肽的最佳接头。

最后，当两个或更多个接头用于本发明的多肽时，这些接头可以相同 或不同。并且，基于本文的公开内容，任选地在一些有限的常规实验之后， 专业技术人员应该能够确定用于本发明的特异性多肽的最佳接头。

通常，为了使表达和生产容易，本发明的多肽将是线性多肽。然而， 本发明在其最广泛意义上不限于此。例如，当本发明的多肽包括三个或多 个纳米抗体时，可以利用具有三个或更多个“臂”的接头连接它们，所述 每个“臂”与纳米抗体连接，以提供“星形”的构建体。尽管通常较不优 选，但是还可以使用环形的构建体。

本发明还包括本发明多肽的衍生物，其可以基本上类似于本发明纳米 抗体的衍生物，即，如本文所述。

本发明还包括“基本上由”本发明的多肽组成的蛋白或多肽(其中措 辞“基本上由……组成”具有基本如上文所示相同的意思)。

根据本发明的一个方面，本发明的多肽基本上以分离的形式存在，如 本文所定义。

本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身已知的方式 制备，专业技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。例如，本发明的 纳米抗体和多肽可以以本身已知用于制备抗体且特别是用于制备抗体片 段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。制 备所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法 包括本文所述的方法和技术。

专业技术人员应该清楚，用于制备本发明的氨基酸序列、纳米抗体和 /或多肽的一种特别有用的方法通常包括下列步骤：

i)在适宜的宿主细胞或宿主生物体(本文还叫作“本发明的宿主”)中 或在另一种适宜的表达系统中，表达编码所述本发明的氨基酸序列、 纳米抗体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着 进行：

ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。 特别地，这样的方法可以包括下列步骤：

i)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以 致所述本发明的宿主表达和/或生产至少一种本发明的氨基酸序列、 纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行：

ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。

本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地 是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA 或合成的DNA(诸如具有特别适用于在目的宿主细胞或宿主生物体中表 达的密码子使用的DNA)。

根据本发明的一个方面，本发明的核酸是基本上分离的形式，如本文 所定义。

本发明的核酸还可以是这样的形式：存在于和/或是载体的一部分， 诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。

本发明的核酸可以以本身已知的方法制备或获得，其基于关于本文给 出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以从适当的天然来源分 离。为了提供类似物，例如，编码天然存在的V_HH结构域的核苷酸序列可 以进行位点定向诱变，以提供编码所述类似物的本发明的核酸。并且，专 业技术人员应该清楚，为了制备本发明的核酸，一些核苷酸序列，诸如至 少一种编码纳米抗体的核苷酸序列，以及例如编码一种或多种接头的核 酸，还可以以适当的方法连接在一起。

用于产生本发明的核酸的技术应该是专业技术人员所清楚的，并且例 如可以包括但不限于，自动DNA合成；位点定向诱变；将两个或多个天 然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)组合，引入引起 剪截表达产物表达的突变；引入一个或多个限制性位点(例如，以产生可 以使用适宜的限制性酶容易地消化和/或连接的盒和/或区)，和/或通过使 用一个或多个“错配”引物，使用例如Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2， Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的天然存在形式的序 列作为模板的PCR反应的方法引入突变。这些以及其它技术应该是专业 技术人员所清楚的，并且也参见上文提及的标准手册，诸如Sambrook等 和Ausubel等，以及下文的实施例。

本发明的核酸还可以是这样的形式：存在于和/或是遗传构建体的一 部分，这对于本领域的技术人员应该是清楚的。这样的遗传构建体通常包 括至少一种本发明的核酸，其任选地与本身已知的一个或多个遗传构建体 元件连接，诸如例如一个或多个适宜的调节元件(诸如适当的启动子、增 强子、终止子、等等)和本文提到的其它遗传构建体元件。包括至少一种 本发明的核酸的所述遗传构建体在本文也叫作“本发明的遗传构建体”。

本发明的遗传构建体可以是DNA或RNA，并且优选地是双链DNA。 本发明的遗传构建体还可以是适于转化目标宿主细胞或宿主生物体的形 式，适于整合到目标宿主细胞的基因组DNA中的形式，或者适于在要用 的宿主生物体中独立复制、维持和/或遗传的形式。例如，本发明的遗传 构建体可以是载体形式，诸如例如质粒、黏端质粒、YAC、病毒载体或转 座子。特别地，所述载体可以是表达载体，即，可以提供体外和/或体内 表达的载体(例如，在适宜的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)。

在一个优选的但非限制性的方面中，本发明的遗传构建体包括

i)至少一种本发明的核酸；其可操作性地连接于

ii)一个或多个调节元件，诸如启动子和任选地适宜的终止子；

并且任选地还有

iii)本身已知的一个或多个其它遗传构建体元件；

其中术语“调节元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作性地连接”具有 它们在本领域中的通用意思(如本文进一步所述)；并且其中存在于遗传 构建体中的所述“其它元件”，例如，可以是3’-或5’-UTR序列、前导序 列、选择标记、表达标记/报道基因、和/或可以促进或增加转化或整合(效 率)的元件。用于所述遗传构建体的这些和其它适宜的元件对于专业技术 人员应该是清楚的，并且例如可能取决于所用的构建体、目标宿主细胞或 宿主生物体的类型；本发明的目的核苷酸序列在其中表达的方式(例如， 通过组成型的、瞬时的或可诱导的表达)；和/或要用的转化技术。例如， 本身已知用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv 片段)表达和生产的调节序列、启动子和终止子可以以基本上相似的方式 使用。

优选地，在本发明的遗传构建体中，所述至少一种本发明的核酸和所 述调节元件，以及任选地所述一个或多个其它元件，彼此“可操作性地连 接”，这通常意指它们彼此是功能性关系。例如，如果所述启动子能够起 始或者另外控制/调节编码序列的转录和/或表达，那么启动子被视为与编 码序列“可操作性地连接”(其中所述编码序列应该理解为“受控于”所 述启动子)。一般地，当两个核苷酸序列可操作性地连接时，它们应该在 相同的方向，并且通常还在同一阅读框中。它们通常还应该基本上邻接， 尽管这也可以不是必需的。

优选地，本发明的遗传构建体的调节以及其它元件是这样的，即，它 们能够在目标宿主细胞或宿主生物体内提供它们需要的生物学功能。

例如，在目标宿主细胞或宿主生物体中，启动子、增强子或终止子应 该是“可操作的”，这意味着(例如)所述启动子应该能够起始或者另外 控制/调节与其可操作性地连接(如本文所定义)的核苷酸序列——例如， 编码序列——的转录和/或表达。

一些特别优选的启动子包括但不限于，本身已知用于在本文提及的宿 主细胞中表达的启动子；并且特别是用于在细菌细胞中表达的启动子，诸 如本文提及的那些和/或在实施例中所用的那些。

选择标记应该是这样的，即，其允许——即，在适当的选择条件下—— 已经(成功地)转化了本发明的核苷酸序列的宿主细胞和/或宿主生物体 与没有(成功地)转化的宿主细胞/生物体区分开来。所述标记的一些优 选的但非限制性的实例是提供针对抗生素(诸如卡那霉素或氨苄青霉素) 的抗性的基因，提供温度抗性的基因，或者在培养基中不存在某些因子、 化合物和/或(食物)成分时允许所述宿主细胞或宿主生物体维持的基因， 所述因子、化合物和/或(食物)成分是未转化的细胞或生物体生存所必 需的。

前导序列应该是这样的，以致——在目标宿主细胞或宿主生物体 中——其允许理想的翻译后修饰和/或以致其将转录的mRNA导向细胞的 理想部分或细胞器。前导序列还可以允许从所述细胞分泌表达产物。同样 地，前导序列可以是在所述宿主细胞或宿主生物体中可操作的任何原- (pro-)、前-(pre-)或前原-(prepro-)序列。对于在细菌细胞中表达， 前导序列可以不是必需的。例如，本身已知用于抗体和抗体片段(包括但 不限于单结构域抗体和ScFv片段)表达和生产的前导序列可以以基本上 相似的方式使用。

表达标记或报道基因应该是这样的，即，——在宿主细胞或宿主生物 体中——其允许检测所述遗传构建体(其上存在的基因或核苷酸序列)的 表达。表达标记任选地还可以允许表达产物的定位，例如，定位在细胞的 特定部分或细胞器中和/或在多细胞生物体的特定细胞、组织、器官或部 分中。所述报道基因还可以表达为与本发明的氨基酸序列融合的蛋白融合 体。一些优选的但非限制性的实例包括荧光蛋白如GFP。

适宜的启动子、终止子和其它元件的一些优选的但非限制性的实例包 括可以用于在本文提及的宿主细胞中表达的那些；并且特别是适用于在细 菌细胞中表达的那些，诸如本文提及的那些和/或在下述实施例中所用的 那些。关于可以存在于/用于本发明的遗传构建体的启动子、选择标记、 前导序列、表达标记和其它元件的一些(其它)非限制性的实例——诸如 终止子、转录和/或翻译增强子和/或整合因子——参考上文提及的通用手 册，诸如Sambrook等和Ausubel等，以及WO 95/07463，WO 96/23810，WO 95/07463，WO 95/21191，WO 97/11094，WO 97/42320，WO 98/06737，WO 98/21355，US-A-7,207,410，US-A-5,693,492和EP 1 085 089中给出的实例。 其它实例对于专业技术人员应该是清楚的。也参见上文引用的公知背景技 术和本文引用的其它参考文献。

本发明的遗传构建体通常可以通过将本发明的核苷酸序列与上文所 述的一个或多个其它元件适当地连接而提供，例如应用上文提及的通用手 册诸如Sambrook等和Ausubel等中所述的技术。

通常，本发明的遗传构建体通过将本发明的核苷酸序列插入到本身已 知的适当的(表达)载体中而获得。适当的表达载体的一些优选的但非限 制性的实例是下述实施例中所用的那些，以及本文提及的那些。

本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可以用于转化宿主细胞或宿 主生物体，即，用于表达和/或生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多 肽。适当的宿主或宿主细胞是专业技术人员所清楚的，并且例如可以是任 何适当的真菌的、原核的或真核的细胞或细胞系，或者任何适当的真菌的、 原核的或真核的生物体，例如：

-细菌菌株，其包括但不限于革兰氏-阴性菌株，诸如大肠杆菌 (Escherichia coli)菌株；变形菌属(Proteus)菌株，例如奇异变形 菌(Proteus mirabilis)菌株；假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，例 如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以及革兰氏-阳性 菌株，诸如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)菌株或短芽孢杆菌(Bacillus brevis)菌株；链霉菌属 (Streptomyces)菌株，例如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌 株；葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株，例如肉葡萄球菌 (Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌属(Lactococcus)菌株， 例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；

-真菌细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：木霉属 (Trichoderma)，例如Trichoderma reesei的物种；脉孢菌属 (Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；粪壳属 (Sordaria)，例如大孢粪壳(Sordaria macrospora)；曲霉菌 (Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)或酱油曲霉(Aspergillus  sojae)；或其它丝状真菌；

-酵母细胞，其包括但不限于来自下列各项物种的细胞：酵母属 (Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖 酵母属(Schizosaccharomyces)，例如粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)；毕赤酵母属(Pichia)，例如巴斯德 毕赤酵母(Pichia pastoris)或Pichia methanolica；汉逊酵母属 (Hansenula)，例如多形汉逊酵母(Hmsenula polymorpha)；克鲁维 酵母属(Kluyveromyces)，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)； Arxula，例如Arxula adeninivorans；Yarrowia，例如Yarrowia lipolytica；

-两栖类细胞或细胞系，诸如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)；

-来源于昆虫的细胞或细胞系，诸如衍生于鳞翅目(lepidoptera)的细 胞/细胞系，包括但不限于贪夜蛾(Spodoptera)SF9和Sf21细胞， 或者衍生于果蝇属(Drosophila)的细胞/细胞系，诸如Schneider和 Kc细胞；

-植物或植物细胞，例如在烟草(tobacco)植物中；和/或

-哺乳动物细胞或细胞系，例如来源于人的细胞或细胞系、来源于哺乳 动物的细胞或细胞系，包括但不限于CHO-细胞、BHK-细胞(例如 BHK-21细胞)，以及人细胞或细胞系，诸如HeLa，COS(例如COS-7) 和PER.C6细胞；

以及本身已知的用于表达和生产抗体及抗体片段(包括但不限于(单)结 构域抗体和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主细胞，这对于专业技术人 员应该是清楚的。还参见上文引用的公知背景技术，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等，(1998)，同前所述； Riechmann和Muyldermans，(1999)，同前所述；van der Linden，(2000)，同 前所述；Thomassen等，(2002)，同前所述；Joosten等，(2003)，同前所述； Joosten等，(2005)，同前所述；以及本文所引用的其它参考文献。

本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以被引入多细胞生物体的 一个或多个细胞、组织或器官中并且在其中表达，例如用于预防和/或治 疗目的(例如，作为基因治疗)。为了这一目的，可以将本发明的核苷酸 序列以任何适当的方式引入到细胞或组织中，例如照原样(例如使用脂质 体)或者在它们插入到适当的基因治疗载体(例如，衍生于反转录病毒诸 如腺病毒，或者细小病毒诸如腺伴随病毒)中之后。同样对于专业技术人 员应该是清楚的，这样的基因治疗可以在体内进行和/或在患者体内原位 进行，其通过给患者或患者的特定细胞或特定组织或器官施用本发明的核 酸或者编码其的适当的基因治疗载体而进行；或者适宜的细胞(通常取自 要治疗的患者的身体，诸如移植的淋巴细胞、骨髓吸出物或活组织切片) 可以用本发明的核苷酸序列在体外进行治疗，然后适当地(重新)引入回 到所述患者的身体内。所有这些可以使用专业技术人员公知的基因治疗载 体、技术和递送系统进行，例如，在下列各项中所述：Culver，K.W.，″基 因治疗(Gene Therapy)″，1994，p.xii，Mary Ann Liebert公司，出版，纽约， 纽约)；Giordano，自然F医学(Nature F Medicine)2(1996)，534-539； Schaper，循环研究(Circ.Res).79(1996)，911-919；Anderson，科学 (Science)256(1992)，808-813；Verma，自然(Nature)389(1994)，239；Isner， 柳叶刀(Lancet)348(1996)，370-374；Muhlhauser，循环研究(Circ.Res). 77(1995)，1077-1086；Onodera，血液学(Blood)91；(1998)，30-36；Verma， 基因治疗(Gene Ther).5(1998)，692-699；Nabel，纽约科学院年刊(Ann. N.Y.Acad.Sci.)：811(1997)，289-292；Verzeletti，人类基因治疗(Hum.Gene  Ther.)9(1998)，2243-51；Wang，自然医学(Nature Medicine)2 (1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；US 5,5895466； 或Schaper，现代生物技术观点(Current Opinion in Biotechnology)7(1996)， 635-640。例如，在本领域中已描述ScFv片段(Afanasieva等，基因治疗 (Gene Ther.)，10，1850-1859(2003))和双抗体(Blanco等，免疫学杂志(J. Immunol)，171，1070-1077(2003))的原位表达。

对于纳米抗体在细胞中的表达，它们还可以作为所谓的“细胞内抗体” 表达，例如在WO 94/02610，WO 95/22618和US-A-7004940；WO 03/014960 中所述；在Cattaneo，A.和Biocca，S.(1997)细胞内抗体：开发和应用 (Intracellular Antibodies：Development and Applications).Landes和 Springer-Verlag；以及在Kontermann，方法(Methods)34，(2004)，163-170 中所述。

例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在转基因哺乳动 物的乳中产生，例如在兔、母牛、山羊或绵羊的乳中(对于将转基因引入 哺乳动物的通用技术参见例如US-A-6,741,957，US-A-6,304,489和 US-A-6,849,992)，在植物中或植物的部分中产生，所述植物部分包括但 不限于它们的叶、花、果实、种子、根或块茎(例如在烟草、玉米、大豆 或苜蓿中)中，或者例如在蚕家蚕(Bombix mori)的蛹中。

此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以在不含细胞的表 达系统中表达和/或生产，并且这样的系统的适当的实例应该是专业技术 人员所清楚的。一些优选的但非限制性的实例包括在麦芽胚系统中的表 达；在兔网织红细胞裂解物中表达；或者在大肠杆菌(E.coli)Zubay系 统中表达。

如上文提及，应用纳米抗体的一个优点在于，基于此的多肽可以通过 在适宜的细菌系统中表达而制备，并且适宜的细菌表达系统、载体、宿主 细胞、调节元件等对专业技术人员是清楚的，例如参考上文引用的参考文 献。然而，应该注意，本发明在其最广泛意义上并不限于在细菌系统中表 达。

优选地，在本发明中，应用(体内或体外)表达系统，诸如细菌表达 系统，其以适于药用的形式提供本发明的多肽，并且所述表达系统也是专 业技术人员所清楚的。专业技术人员还应该清楚，适于药用的本发明的多 肽可以使用肽合成技术制备。

对于工业规模的生产，用于纳米抗体或包含纳米抗体的蛋白治疗物的 (工业)生产的优选的异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichia  pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)的菌株，其适用于大规模表达/生产/ 发酵，并且特别适用于大规模药物(即，GMP级别)表达/生产/发酵。所 述菌株的适当的实例是专业技术人员所清楚的。所述菌株以及生产/表达 系统也可从公司诸如Biovitrum(Uppsala，瑞典)获得。

备选地，哺乳动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以用 于大规模表达/生产/发酵，并且特别用于大规模药物表达/生产/发酵。并且， 所述表达/生产系统也可从上文提及的一些公司获得。

具体的表达系统的选择部分取决于特定的翻译后修饰的需要，更具体 地是糖基化的需要。生产包含纳米抗体的重组蛋白，对于所述重组蛋白糖 基化是理想的或者必需的，将使得应用具有将所表达的蛋白糖基化的能力 的哺乳动物表达宿主成为必要。在这一方面，专业技术人员应该清楚，获 得的糖基化模式(即，附着的残基的种类、数量和位置)将取决于表达所 用的细胞或细胞系。优选地，使用人细胞或细胞系(即，形成基本上具有 人糖基化模式的蛋白)，或者使用另种哺乳动物细胞系，其可以提供基 本上和/或功能上与人糖基化作用相同的糖基化模式或者至少模拟人糖基 化作用。一般地，原核宿主诸如大肠杆菌不具有将蛋白糖基化的能力，并 且应用更低等真核细胞诸如酵母通常导致与人糖基化作用不同的糖基化 模式。不过，应该理解，所有前述宿主细胞和表达系统可以用于本发明， 这取决于要获得的理想的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。

因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米 抗体或多肽被糖基化。根据本发明的另一个非限制性方面，本发明的氨基 酸序列、纳米抗体或多肽未被糖基化。

根据本发明的一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、 纳米抗体或多肽在细菌细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的细菌 细胞，诸如上文提及的菌株的细胞中生产。

根据本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、 纳米抗体或多肽在酵母细胞中生产，特别是在适于大规模药物生产的酵母 细胞，诸如上文提及的物种的细胞中生产。

根据本发明另一个优选的但非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、 纳米抗体或多肽在哺乳动物细胞中生产，特别是在人细胞或人细胞系的细 胞中，并且更特别是在适于大规模药物生产的人细胞或人细胞系的细胞 中，诸如上文提及的细胞系中生产。

当应用在宿主细胞中的表达来生产本发明的氨基酸序列、纳米抗体和 多肽时，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以在细胞内产生(例如， 在细胞溶质中，在周质或在内含体中)，然后从宿主细胞分离，并且任选 地进一步纯化；或者可以在细胞外产生(例如，在培养所述宿主细胞的培 养基中)，然后从培养基分离，并且任选地进一步纯化。当使用真核宿主 细胞时，由于极大地促进进一步的分离以及获得的纳米抗体和蛋白的下游 处理，所以通常优选细胞外生产。除了少数种类的蛋白诸如毒素和溶血素 之外，细菌细胞诸如上文提及的大肠杆菌的菌株一般不向细胞外分泌蛋 白，并且在大肠杆菌内的分泌生产是指蛋白穿过内膜易位到周质空间。周 质生产相对于细胞溶质生产提供一些优点。例如，在通过特异的信号肽酶 将分泌信号序列裂解之后，所分泌的产物的N-端氨基酸序列可以与天然 基因产物相同。此外，在周质中比在细胞质中似乎存在少得多的蛋白酶活 性。另外，由于在周质中更少的污染蛋白，所以蛋白纯化更简单。另一个 优点是，由于周质提供比细胞质更加具有氧化性的环境，所以可以形成正 确的二硫键。在大肠杆菌中过量表达的蛋白通常在不溶的聚集体，即所谓 的内含体中发现。这些内含体可以位于细胞溶质中或在周质中；从这些内 含体回收生物活性蛋白需要变性/重折叠步骤。许多重组蛋白，包括治疗 性蛋白，是从内含体回收的。备选地，专业技术人员应该清楚，可以使用 细菌的重组菌株，其已被遗传修饰，以分泌理想的蛋白，并且特别是本发 明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。

因此，根据本发明的一个非限制性方面，本发明的氨基酸序列、纳米 抗体或多肽是在细胞内产生并且从宿主细胞分离，并且特别是从细菌细胞 或者从细菌细胞中的内含体中分离的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。根据 本发明的另一个非限制性的方面，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽 是在细胞外产生并且从培养宿主细胞的培养基中分离的氨基酸序列、纳米 抗体或多肽。

与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的启动子包括，

-用于在大肠杆菌中表达：lac启动子(及其衍生物，诸如lacUV5启动子)； 阿拉伯糖启动子；噬菌体λ的左向-(PL)和右向(PR)启动子；trp操纵子 的启动子；杂合lac/trp启动子(tac和trc)；T7-启动子(更具体地是T7- 噬菌体基因10的启动子)以及其它T-噬菌体启动子；Tn10四环素抗性 基因的启动子；上述启动子的工程变体，其包括一个或多个拷贝的外 来调节操纵基因序列；

-用于在酿酒酵母中表达：组成型：ADH1(醇脱氢酶1)，ENO(烯醇化 酶)，CYC1(异-1细胞色素c)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；PGK1 (磷酸甘油酸激酶)，PYK1(丙酮酸激酶)；调节型：GAL1，10，7(半乳糖 代谢酶)，ADH2(醇脱氢酶2)，PHO5(酸性磷酸酶)，CUP1(铜金属硫蛋 白)；异源型：CaMV(花椰菜花叶病毒35S启动子)；

-用于在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达：AOX1启动子(醇氧 化酶I)；

-用于在哺乳动物细胞中表达：人巨细胞病毒(hCMV)即时早期增强子/ 启动子；人巨细胞病毒(hCMV)即时早期启动子变体，其包含两个四 环素操纵基因序列，以致所述启动子可以受Tet阻抑物调节；单纯疱 疹病毒胸苷激酶(TK)启动子；劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)增 强子/启动子；来自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子1α(hEF-1α) 启动子；SV40早期启动子；HIV-1长末端重复启动子；β-肌动蛋白启动 子；

与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的载体包括：

-用于在哺乳动物细胞中表达的载体：pMAMneo(Clontech)，pcDNA3 (Invitrogen)，pMClneo(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo (ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)， pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)和1ZD35(ATCC 37565)，以及基于病毒的表达系统，诸如基于腺病毒的那些；

-用于在细菌细胞中表达的载体：pET载体(Novagen)和pQE载体 (Qiagen)；

-用于在酵母或其它真菌细胞中表达的载体：pYES2(Invitrogen)和毕赤 表达载体(Invitrogen)；

-用于在昆虫细胞中表达的载体：pBlueBacII(Invitrogen)和其它杆状病 毒载体；

-用于在植物或植物细胞中表达的载体：例如基于花椰菜花叶病毒或 烟草花叶病毒的载体，适宜的农杆菌(Agrobacterium)菌株，或基于 Ti-质粒的载体。

与这些宿主细胞一起使用的一些优选的但非限制性的分泌序列包括；

-用于细菌细胞诸如大肠杆菌：PelB，Bla，OmpA，OmpC，OmpF，OmpT， StII，PhoA，PhoE，MalE，Lpp，LamB，等；TAT信号肽，溶血素C-端分 泌信号；

-用于酵母：α-交配因子前原-序列(α-mating factor prepro-sequence)， 磷酸酶(pho1)，转化酶(Suc)，等；

-用于哺乳动物细胞：在靶蛋白是真核起源的情形中固有的信号 (indigenous signal)；鼠Igκ-链V-J2-C信号肽；等。

用于转化本发明的宿主或宿主细胞的适宜的技术对专业技术人员是 清楚的，并且可以取决于目标宿主细胞/宿主生物体和要用的遗传构建体。 也参见上文提及的手册和专利申请。

转化后，可以进行检测并且选择已经成功转化了本发明的核苷酸序列 /遗传构建体的那些宿主细胞或宿主生物体的步骤。例如，这可以是基于 存在于本发明的遗传构建体中的选择标记的选择步骤，或者是包括检测本 发明的氨基酸序列的步骤，例如，使用特异的抗体进行。

转化的宿主细胞(其可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物体(其 可以是稳定的突变系或株系的形式)形成本发明的另一方面。

优选地，这些宿主细胞或宿主生物体是这样的，以致它们表达或者(至 少)能够表达(例如，在适宜的条件下)本发明的氨基酸序列、纳米抗体 或多肽(并且在宿主生物体的情形中：在它的至少一种细胞、部分、组织 或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物体的其它世代、 后代和/或子代，例如，其可以通过细胞分裂或者通过有性或无性生殖获 得。

为了生产/获得本发明的氨基酸序列的表达，所述转化的宿主细胞或 转化的宿主生物体通常可以在本发明(理想的)氨基酸序列、纳米抗体或 多肽得到表达/生产的条件下保存、维持和/或培养。适宜的条件对专业技 术人员是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物体，以及取 决于控制本发明的(相关)核苷酸序列表达的调节元件。此外，参见在上 文关于本发明的遗传构建体段落中提及的手册和专利申请。

一般地，适宜的条件可以包括使用适宜的培养基，存在适宜的食物来 源和/或适宜的营养素，使用适当的温度，并且任选地存在适当的诱导因 子或化合物(例如，在本发明的核苷酸序列在可诱导启动子的控制下的情 形中)；所有这些可以由专业技术人员选择。此外，在这样的条件下，本 发明的氨基酸序列可以以组成型方式、以瞬时方式、或者只在适当地诱导 时表达。

专业技术人员还应该清楚，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可 以(首先)以不成熟的形式(如上文提及)产生，其然后可以进行翻译后 修饰，这取决于所用的宿主细胞/宿主生物体。并且，本发明的氨基酸序 列、纳米抗体或多肽可以被糖基化，这也取决于所用的宿主细胞/宿主生 物体。

然后，本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽可以从宿主细胞/宿主 生物体和/或从培养所述宿主细胞或宿主生物体的培养基中分离，这使用 本身已知的蛋白分离和/或纯化技术，诸如(制备级)层析和/或电泳技术、 差别沉淀技术、亲和技术(例如，使用与本发明的氨基酸序列、纳米抗体 或多肽融合的特异性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备级免疫学技术 (即，使用针对要被分离的氨基酸序列的抗体)进行。

通常，对于药物应用，本发明的多肽可以配制成药物制剂或组合物， 其包括至少一种本发明的多肽和至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/ 或佐剂，和任选地一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。通过非限 制性实例的方式，这样的制剂可以是适于下列各项的形式：口服给药，肠 胃外给药(诸如通过静脉内、肌内或皮下注射或静脉内输注)，局部给药， 通过吸入、皮肤贴片、植入物、栓剂给药，等等。所述适宜的给药形式—— 其可以是固体、半固体或液体，取决于给药的方式——以及制备其所用的 方法和载体，对专业技术人员是清楚的，并且在本文中进一步描述。

因此，在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一 种本发明的氨基酸，至少一种本发明的纳米抗体或至少一种本发明的多 肽，以及至少一种适当的载体、稀释剂或赋形剂(即，适于药用)，以及 任选地一种或多种其它活性物质。

通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以本身已知的任何 适当的方法配制和施用，例如，关于其的参考文献参见上文引用的公知背 景技术(并且特别参见WO 04/041862，WO 04/041863，WO 04/041865和 WO 04/041867)，以及参见标准手册，诸如雷明顿药物科学(Remington’s  Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack出版公司，美国(1990)或雷明顿， 制药科学和实践(Remington，the Science and Practice of Pharmacy)，第21 版，Lippincott Williams和Wilkins(2005)。

例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以本身已知的用于常 规抗体及抗体片段(包括ScFv’s和双抗体)和其它药物活性蛋白的任何 方法配制和施用。所述制剂以及制备其的方法对于专业技术人员是清楚 的，并且例如，包括适于肠胃外给药(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、 腔内、动脉内或鞘内给药)或适于局部(及透皮的或皮内)给药的制剂。

例如，用于肠胃外给药的制剂可以是适于输注或注射的无菌溶液、混 悬液、分散液或乳剂。例如，用于所述制剂的适宜的载体或稀释剂包括但 不限于，无菌水以及水性缓冲液和溶液，诸如生理磷酸盐缓冲液、林格溶 液、葡萄糖溶液、和Hank′s溶液；水油(water oils)；甘油；乙醇；二醇 诸如丙二醇，或者以及矿物油，动物油和植物油例如花生油、豆油，及它 们的适宜的混合物。通常优选水性溶液或混悬液。

本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以使用递送的基因治疗方 法进行施用。参见，例如，美国专利号5,399,346，其完全结合作为参考。 使用递送的基因治疗方法，转染了编码本发明的氨基酸序列、纳米抗体或 多肽的基因的原代细胞另外可以用组织特异性启动子转染，以靶向特异的 器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且另外可以使用用于亚细胞定位表 达的信号和稳定序列进行转染。

因此，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以全身施用，例如， 口服地，与药用赋形剂诸如惰性稀释剂或可同化的食用载体组合。它们可 以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患 者日常饮食的食物结合。对于口服治疗剂施用，本发明的氨基酸序列、纳 米抗体和多肽可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可吸收的片剂、颊含 片剂、药片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。所述 组合物和制剂应该包含至少0.1％的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多 肽。当然，它们在所述组合物和制剂中的百分数可以变化，并且可以便利 地在所给单位剂型的约2-约60重量％之间。本发明的氨基酸序列、纳米 抗体或多肽在这样的治疗有效组合物中的量是这样的，以致获得有效的剂 量水平。

所述片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含下列各项：粘合剂，诸如 黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂， 诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；并且可 以加入甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或者调味剂，诸如薄 荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质之 外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以 作为涂层存在，或者另外修饰所述固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、 丸剂、或胶囊可以用胶、蜡、紫胶或糖等包被。糖浆或酏剂可以包含本发 明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐 剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯类，染料和调味剂诸如樱桃或 橙味调味剂。当然，在制备任何单位剂型中所用的任何物质都应该是药物 可接受的，并且在所用的量上基本上无毒。另外，本发明的氨基酸序列、 纳米抗体和多肽可以结合在持续释放的制剂和装置中。

用于口服给药的制备物和制剂还可以被提供以肠衣，所述肠衣允许本 发明的构建体抵抗胃环境，并且进入肠内。更一般地，用于口服给药的制 备物和制剂可以适当地配置成用于递送到胃肠道的任何理想的部分。另 外，适宜的栓剂可以用于递送到胃肠道内。

本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽还可以通过输注或注射进行静 脉内或腹膜内施用。本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽或者它们的盐 的溶液可以在水中制备，任选地与无毒表面活性剂混合。分散体还可以在 甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备。在普通的保 存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。

适于注射或输注的药物剂型可以包括包含活性成分的无菌的水溶液 或分散液或者无菌粉剂，其适合即时制备无菌注射或输注溶液或分散体， 任选地包封在脂质体中。在所有情形中，在制备和保存条件下，最终剂型 必须是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或赋形剂可以是溶剂或液体分 散介质，例如，其包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚 乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其适当的混合物。可以保持适当的流 动性，例如，通过形成脂质体，在分散剂的情形中通过保持需要的颗粒大 小或者通过使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过各种抗细菌和抗真 菌试剂获得，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳 汞(thimerosal)等。在许多情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖、缓 冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延 迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶而获得。

无菌注射溶液通过将需要量的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽 结合在适当的溶剂中，当需要时，与上文列举的各种其它成分一起结合， 然后进行过滤除菌而制备。在用无菌粉剂制备无菌注射溶液的情形中，优 选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加上在先前无 菌过滤的溶液中存在的任何其它理想的成分的粉剂。

对于局部给药，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以以纯的形 式应用，即，在它们是液体的情形中。然而，通常理想地将它们作为与皮 肤病学可接受的载体结合的组合物或制剂施用到皮肤上，所述载体可以是 固体或液体。

有用的固体载体包括细碎分裂的固体，诸如滑石、粘土、微晶纤维素、 硅石、矾土等。有用的液体载体包括水、羟烷类或二醇类或水-醇/二醇掺 合剂，其中任选地在无毒表面活性剂的帮助下，本发明的氨基酸序列、纳 米抗体和多肽可以以有效水平溶解或分散。可以添加佐剂诸如香味剂和其 它抗微生物剂，以将给定用途的特性最优化。得到的液体组合物可以通过 吸收衬垫应用，用于浸渍的绷带及其它敷料，或者使用泵型或气溶胶喷雾 器喷到感染区域。

增稠剂诸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐及酯、脂肪醇、改性纤 维素或改性的矿物质还可以与液体载体一起使用，以形成易涂开的糊剂、 凝胶、药膏、皂剂等，用于直接涂覆到使用者的皮肤。

可以用于将本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽递送到皮肤的有用 的皮肤病用组合物的实例是本领域已知的；例如，参见Jacquet等(美国专 利号4,608,392)，Geria(美国专利号4,992,478)，Smith等(美国专利号 4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。

本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的有用剂量可以通过比较它们 的体外活性和在动物模型中的体内活性而确定。将在小鼠和其它动物中的 有效剂量外推至人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号 4,938,949。

通常，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽在液体组合物诸如洗液 中的浓度约0.1-25重量-％，优选地约0.5-10重量-％。在半固体或固体组 合物诸如凝胶或粉剂中的浓度约0.1-5重量-％，优选地约0.5-2.5重量-％。

治疗中需要使用的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽的量不但随 着所选的特定的氨基酸序列、纳米抗体或多肽而变化，而且随着施用途径、 要治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终取决于随从 医生或临床医生的判断力。此外，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽 的剂量变化取决于靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官。

理想的剂量可以便利地以单一剂量或作为在适当的时间间隔施用的 分剂量而存在，例如，作为每天2、3、4次或更多的亚剂量。所述亚剂量 本身可以进一步分割，例如，分割成许多次不连续的宽松间隔的施用；诸 如从吸入器多次吸入，或者通过使用多滴到眼睛中。

施用方案可以包括长期的、日常的治疗。“长期”意指至少2周，并 且优选地数周、数月或数年的持续时间。在这一剂量范围的必要的修改可 以由本领域的普通技术人员仅仅使用本文的教导所给的常规实验而确定。 参见雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Martin，E.W.， 第4版)，Mack出版公司，Easton，PA。在任何并发症情形中，剂量还可以 由个别医生进行调整。

在另一方面中，本发明涉及预防和/或治疗至少一种选自由下述疾病 组成的组的疾病的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药 物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和 /或包括其的药物组合物，其中所述疾病与下述相关：i)过度的血管发生， 诸如癌症、糖尿病失明、年龄相关的黄斑变性(age-related macular  degeneration)、类风湿性关节炎、银屑病、和多于70种其它病症，并且 与下述相关ii)不足的血管发生，诸如冠状动脉疾病、中风、和延迟的伤 口愈合。

在本发明的内容中，术语“预防和/或治疗”不但包括预防和/或治疗 疾病，而且通常包括预防所述疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，防止或 减缓与所述疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与所述疾 病相关的一种或多种症状，减少所述疾病和/或与之相关的任何症状的严 重性和/或持续时间，和/或防止所述疾病的严重性和/或与之相关的任何症 状的进一步增加，防止、减少或逆转由所述疾病引起的任何生理损害以及 通常对被治疗的患者有益的任何药理作用。

待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更 特别是人类。专业技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有 危险患有本文提及的疾病和病症的人。

本发明还涉及预防和/或治疗至少一种下述疾病或病症的方法，所述 方法包括给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序 列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物，所 述疾病或病症与Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angpt11，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选Tie2或Ang2相关，与其生物学或药学活性相关，和/或 与其中涉及Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4， 更优选Tie2或Ang2的生物学途径或信号传导相关。特别地，本发明涉及 一种用于预防和/或治疗至少一种下述疾病或病症的方法，所述方法包括 给需要所述方法的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明 的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物，其中所述疾病 或病症可以通过调节Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选Tie2或Ang2，其生物学或药学活性，和/或其中涉及Tie1， Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或 Ang2的生物学途径或信号传导而治疗。特别地，所述药用有效量可以是 足以调节Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4， 更优选Tie2或Ang2，其生物学或药学活性，和/或其中涉及Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的生物学 途径或信号传导的量；和/或在循环中提供足以调节Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优 选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Fie2或Ang2，其生物学或 药学活性，和/或其中涉及Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的生物学途径或信号传导的本发 明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽的水平的量。

本发明还涉及预防和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的 氨基酸序列、本发明的纳米抗体或本发明的多肽而预防和/或治疗的疾病 或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法的受试者施用药物活性量 的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本发明的多肽、和/或包括 其的药物组合物。

更特别地，本发明涉及预防和/或治疗选自由本文列出的疾病和病症 组成的组的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括，给需要所述方法 的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、本 发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。

在另一个方面中，本发明涉及免疫治疗的方法，并且特别涉及被动免 疫治疗的方法，所述方法包括给患有或者有危险患有本文提及的疾病和病 症的受试者施用药物活性量的本发明的氨基酸序列、本发明的纳米抗体、 本发明的多肽、和/或包括其的药物组合物。

在上述方法中，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或包含 其的组合物可以以任何适当的方式施用，这取决于要用的特定的药物制剂 或组合物。因此，例如，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或 包含其的组合物可以口服、腹膜内(例如，静脉内、皮下、肌内、或者通 过避开胃肠道的任何其它施用途径)、鼻内、透皮地、局部施用，通过栓 剂、通过吸入方式施用，这也取决于要用的特定药物制剂或组合物。临床 医生能够选择适当的施用途径和用于所述施用的适当的药物制剂或组合 物，这取决于要预防或治疗的疾病或病症以及临床医生公知的其它因素。

本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽和/或包含其的组合物按照 治疗方案进行施用，所述治疗方案适于预防和/或治疗要被预防或治疗的 疾病或病症。临床医生通常能够确定适宜的治疗方案，所述适宜的治疗方 案取决于下列因素，诸如要被预防或治疗的疾病或病症，要被治疗的疾病 的严重性和/或其症状的严重性，要用的本发明的特定的氨基酸序列、纳 米抗体或多肽，要用的特定的施用途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、 性别、体重、饮食、一般状况，以及临床医生公知的类似因素。

一般地，所述治疗方案包括以一种或多种药物有效量或剂量施用一种 或多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽，或者包含其的一种或 多种组合物。施用的具体量或剂量可以由临床医生同样基于上文引用的因 素确定。

通常，对于预防和/或治疗本文提及的疾病和病症，并且取决于要治 疗的具体疾病或病症，要用的特定的本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多 肽的功效，具体的施用途径和使用的特定的药物制剂或组合物，本发明的 氨基酸序列、纳米抗体和多肽一般以每天每kg体重1克-0.01微克的量施 用，优选地每天每kg体重0.1克-0.1微克，诸如每天每kg体重约1，10，100 或1000微克，作为单一的每日剂量连续施用(例如，通过输注)或者在 一天内作为多次分剂量施用。临床医生通常能够确定适宜的日常剂量，这 取决于本文提及的因素。还应该清楚，在具体的情形中，临床医生可以选 择偏离这些量，例如，基于上文引用的因素以及他的专业判断。一般地， 关于施用量的一些指导可从通过基本上相同的途径通常施用的相当的针 对相同施用靶标的常规抗体或抗体片段的量而获得，但是要考虑亲和性/ 抗体亲抗原性、功效、生物分布、半衰期以及专业技术人员公知的类似因 素的不同。

通常，在上述方法中，将使用单一的本发明的氨基酸序列、纳米抗体 或多肽。然而，使用组合的两种或更多种本发明的氨基酸序列、纳米抗体 和/或多肽也在本发明范围之内。

本发明的纳米抗体、氨基酸序列和多肽还可以与一种或多种其它药物 活性化合物或成分(principles)组合应用，即，作为组合治疗方案，其可 以或者可以不引起增效效应。并且，基于上文所引用的因素及其专业判断， 临床医生能够选择所述的其它化合物或成分，以及适宜的组合治疗方案。

特别地，本发明的氨基酸序列、纳米抗体和多肽可以与其它药物活性 化合物或成分组合应用，所述其它药物活性化合物或成分是或者能够用于 预防和/或治疗本文所引用的疾病和病症，结果可以或不可以获得增效效 应。所述化合物和成分的实例，以及施用其的途径、方法和药物制剂或组 合物是临床医生所清楚的。

当两种或更多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，它们可以 通过相同的施用途径或者通过不同的施用途径在基本上相同的时间或在 不同时间(例如，基本上同时地、连续地、或者按照交替方案)施用。当 所述物质或成分通过相同的施用途径同时施用时，它们可以作为不同的药 物制剂或组合物或者作为组合的药物制剂或组合物的一部分进行施用，这 是专业技术人员所清楚的。

此外，当两种或更多种活性物质或成分作为组合治疗方案的一部分使 用时，每一物质或成分可以以相同的量施用，并且按照与当所述化合物或 成分单独使用时相同的方案施用，并且所述组合应用可以或可以不引起增 效效应。然而，当所述两种或更多种活性物质或成分的组合应用引起增效 效应时，还可以可能地减少要施用的一种、多种或全部物质或成分的量， 同时仍旧获得理想的治疗作用。例如，这可以用于避免、限制或减少当以 它们的常规用量使用时与一种或多种所述物质或成分的应用相关的任何 不需要的副作用，同时仍旧获得理想的药物或治疗效果。

根据本发明所用的治疗方案的效果可以以本身已知的用于所涉及的 疾病或病症的任何方式进行确定和/或跟踪，这是临床医生所清楚的。在 适当的并且基于病例/病例基础的情形中，临床医生还应该能够改变或改 进特定的治疗方案，以便获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不需 要的副作用，和/或实现一方面获得理想的治疗效果与另一方面避免、限 制或减少不理想的副作用之间的适当的平衡。

通常，应该遵循所述治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或只要 维持所述理想的治疗效果。并且，这可以由临床医生确定。

在另一方面中，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在 制备用于预防和/或治疗下述i)和ii)中的至少一种的药物组合物中的应用： i)过度的血管发生，诸如癌症，糖尿病失明，年龄相关的黄斑变性，类风 湿性关节炎，银屑病，及其他，ii)不足的血管发生，诸如冠状动脉病、 中风、和延迟的伤口愈合；和/或用于一种或多种本文所提及的治疗方法 中的应用。

待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，并且更 特别是人类。专业技术人员应该清楚，待治疗的受试者特别是患有或者有 危险患有本文提及的疾病和病症的人。

本发明还涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备用于预防 和/或治疗至少一种可以通过给患者施用本发明的氨基酸序列、纳米抗体 或多肽而得到预防和/或治疗的疾病或病症的药物组合物中的应用。

更特别地，本发明涉及本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽在制备 用于预防和/或治疗i)过度的血管发生，诸如癌症，糖尿病失明，年龄相 关的黄斑变性，类风湿性关节炎，银屑病，及其他，ii)不足的血管发生， 诸如冠状动脉病、中风、和延迟的伤口愈合，且特别是用于预防和治疗本 发明列出的一种或多种疾病和病症的药物组合物的应用。

同样地，在这样的药物组合物中，所述一种或多种本发明的氨基酸序 列、纳米抗体或多肽还可以适当地与一种或多种其它活性成分如本发明提 及的那些组合。

最后，尽管更优选本发明的纳米抗体(如本文所定义)和本发明的多肽 的应用，但是基于本发明内容应该清楚，专业技术人员还应该能够以类似 的方式设计和/或产生针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1， Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的其它氨基酸序列且特别地(单) 结构域抗体，以及包括所述(单)结构域抗体的多肽。

例如，专业技术人员应该清楚，可以可能地将上文提及的用于本发明 的纳米抗体的一个或多个CDR’s“移植”到所述(单)结构域抗体或其它 蛋白支架上，所述支架包括但不限于人支架或非-免疫球蛋白支架。用于 这种CDR移植的适宜的支架和技术是专业技术人员所清楚的，并且是本 领域公知的，参见，例如US-A-7,180,370，WO 01/27160，EP 0 605 522，EP 0 460 167，US-A-7,054,297，Nicaise等，蛋白质科学(Protein Science)(2004)， 13：1882-1891；Ewert等，方法(Methods)，2004年10月；34(2)：184-199； Kettleborough等，蛋白质工程(Protein Eng.)1991年10月；4(7)：773-783； O’Brien和Jones，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)2003：207：81-100； 和Skerra，分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)2000：13：167-187，和Saerens 等，分子生物学杂志(J. Mol.Biol.)2005年9月23日；352(3)：597-607，以 及本文引用的其它参考文献。例如，可以以相似的方式应用本身已知的关 于将小鼠或大鼠的CDR’s移植到人构架和支架上的技术，以提供包括一 个或多个本发明的纳米抗体的CDR’s和一个或多个人构架区或序列的嵌 合蛋白。

还应该注意，当本发明的纳米抗体包含除上文提及的优选的CDR序 列之外的一个或多个其它CDR序列时，这些CDR序列可以以本身已知的 任何方法获得，例如，从纳米抗体(优选)、来自常规抗体(并且特别来 自人抗体)的V_H结构域、重链抗体、常规4-链抗体(诸如常规的人4-链 抗体)或针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4， 更优选Tie2或Ang2的其它免疫球蛋白序列获得。针对Tie1，Tie2，Ang1， Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6， 更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的这种免 疫球蛋白序列可以以任何本身已知的方法产生，如专业技术人员所清楚 的，即，通过用Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2， Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或 Angptl4，更优选Tie2或Ang2免疫或通过用Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选 Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2或其任何适当的 组合筛选免疫球蛋白序列的适宜的文库进行。任选地，这可以接着进行诸 如随机或位点定向诱变的技术和/或其它本身已知的用于亲和力成熟的技 术。产生这样的免疫球蛋白序列的适宜的技术是专业技术人员所清楚的， 并且例如包括Hoogenboom，自然生物技术(Nature Biotechnology)，23，9， 1105-1116(2005)综述的筛选技术。产生针对指定的靶标的免疫球蛋白的其 它技术包括，例如，Nanoclone技术(例如，在公布的美国专利申请 2006-0211088中所述)，所谓的SLAM技术(例如欧洲专利申请0 542 810 中所述)，应用表达人免疫球蛋白的转基因小鼠或者公知的杂交瘤技术(参 见，例如Larrick等，生物技术(Biotechnology)，卷7，1989，第934页)。 所有这些技术可以用来产生针对Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2， Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2的免疫球蛋白，并且 这种免疫球蛋白的CDR’s可以用于本发明的纳米抗体，即，如上文列出 的。例如，这样的CDR序列可以被确定、合成和/或分离，并且插入到本 发明的纳米抗体的序列中(例如，以便取代相对应的天然CDR)，均使用 本身已知的技术，诸如本文所述的那些，或者包含所述CDR’s的本发明 的纳米抗体(或编码其的核酸)可以从头合成，也应用本文提及的技术。

基于本文的公开内容，本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽、核酸、 遗传构建体以及宿主与宿主细胞的其它应用是专业技术人员所清楚的。例 如，并且不限于，本发明的氨基酸序列可以连接在适当的载体或固体支持 物上，以提供一种可以以本身已知的从包含其的组合物和制备物中纯化 Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4， Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选 Tie2或Ang2的方式使用的介质。包括适当的可检测标记的本发明的氨基 酸序列的衍生物也可以用作(定性或定量)确定Tie1，Tie2，Ang1，Ang2， Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优 选Tie2，Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2在组合物或制 备物中存在的标记，或作为选择性检测Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4， Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，或Angptl6，更优选Tie2， Ang2，Ang1，Ang4，或Angptl4，更优选Tie2或Ang2在细胞或组织表面存 在的标记(例如，与适当的细胞分选技术结合)。

现在，借助于下列非限制性附图进一步描述本发明：

图1.用于选择克隆的Tie2结合测定。阴性对照是加入针对病毒抗原 选择的不相关的噬菌体和不加入噬菌体。

图2.所选的P.E.的Tie2-Ang1阻断测定。阴性对照是加入针对病毒 抗原选择的不相关的P.E.和不加入P.E.。5个克隆(家族I，II，III和IV) 表现出显著的对Ang-1结合的阻断。

图3.在稀释系列中进行的纯化的纳米抗体的Tie2-Ang1阻断测定。 阴性对照是加入针对病毒抗原选择的不相关的纳米抗体和不加入纳米抗 体。

图4.在稀释系列中进行的纯化的纳米抗体的Tie2-Ang2阻断测定。 阴性对照是加入针对病毒抗原选择的不相关的纳米抗体和不加入纳米抗 体。没有一种Tie2-Ang1阻断纳米抗体能够阻断Ang2与Tie2的结合。

图5.用于选择克隆的Ang2结合测定。阴性对照是加入针对病毒抗 原选择的不相关的噬菌体和不加入噬菌体。

图6.用于选择克隆的Ang2-Tie2阻断测定。阴性对照是加入针对病 毒抗原选择的不相关的P.E和不加入P.E.。6个克隆(家族I)表现出显著 的对Ang-2与Tie2结合的阻断。

图7.在稀释系列中进行的纯化的纳米抗体的Ang2-Tie2阻断测定。 阴性对照是加入针对病毒抗原选择的不相关的纳米抗体和不加入纳米抗 体。

图8.用于选择克隆的Ang1结合测定。阴性对照是加入针对病毒抗 原选择的不相关的噬菌体和不加入噬菌体。

图9.用于选择克隆的Ang4结合测定。阴性对照是加入针对病毒抗 原选择的不相关的噬菌体和不加入噬菌体。

图10.用于选择克隆的Angptl4结合测定。阴性对照是加入针对病毒 抗原选择的不相关的噬菌体和不加入噬菌体。

图11和12.报道了磷酸-Akt∶Akt的比例(图11)和磷酸-ERK∶ERK 的比例(图12)。指示无Ang-1刺激的样品。在所检测的抗-Tie2 NBs中， 仅有纳米抗体163E9能够在7,5ug/ml(～500nM)和1ug/ml(～67nM)阻断 Ang1-诱导的Akt和Erk磷酸化。其它Tie-2纳米抗体无一抑制AKt和Erk 的磷酸化。

图13和14.报道了磷酸-Akt∶Akt的比例(图13)和磷酸-ERK∶ERK 的比例(图14)。纳米抗体163E9剂量依赖性抑制Ang-1诱导的Akt和Erk 磷酸化。

图15.Tie-2纳米抗体163E9逆转Ang-1的抗凋亡作用。

图16.纳米抗体163E9剂量依赖性抑制Ang-1诱导的Tie-2磷酸化。

图17.纳米抗体163E9剂量依赖性抑制Ang-1诱导的内皮细胞的出 芽。

现在，将通过下述非限制性实验部分进一步描述本发明。

实验部分：

实施例1：动物免疫

将两头美洲驼(161和166)按照标准方法用含有重组人Tie2/Fc嵌合体 (R&D系统(R&D Systems)目录号313-TI，货号BKC06)的混合物121进 行6次加强而进行免疫。在第6次加强后5和8天从这些动物收集血液。 另外，在第6次加强后5天从每头动物收集约1g淋巴结。

实施例2：文库构建

根据供应商的使用说明书使用Ficoll-Hypaque从血液样品制备外周血 单核细胞。下一步，从这些细胞中以及淋巴结组织中提取总RNA，并用 作RT-PCR的起始原料以扩增编码纳米抗体的基因片段。将这些片段克隆 到噬菌粒载体pAX50中(见下)。根据标准方法(参见例如本文引用的现 有技术和申请人提交的各个申请)制备噬菌体。

pAX50-一种由pUC119衍生的表达载体，其包含LacZ启动子，大 肠杆菌噬菌体pIII蛋白编码序列，氨苄青霉素或羧苄青霉素抗性基因，多 克隆位点和gen3前导序列。与纳米抗体编码序列处于同一阅读框，该 载体编码C-端c-myc标签和(His)6标签。

实施例3：选择展示Tie2结合纳米抗体的噬菌体

将噬菌体文库161和166用于选择重组人Tie2/Fc嵌合体(R&D系 统，目录号313-TI，货号BKC06)。将Tie2/Fc以5ug/ml，0.5ug/ml和0ug/ml (对照)直接固定在Maxisorp 96孔微量滴定板(Nunc)上。为了使与Tie2/Fc 的Fe-部分结合的噬菌体数目最少，将噬菌体预先用250ug/ml人IgG温 育。在用噬菌体文库温育和彻底洗涤后，用胰蛋白酶洗脱结合的噬菌体。 扩增洗脱的噬菌体并且用在对2ug/ml，0.2ug/ml，0.02ug/ml和0ug/ml(对 照)固定的Tie2/Fc的第二轮选择中。为了使与Tie2/Fc的Fc-部分结合的噬 菌体数目最少，将噬菌体预先用100ug/ml人IgG加100ug/ml rh B7.2/Fc (R&D系统，目录号141-B2，货号BOT 075031)温育。培养从洗脱的噬菌 体库中获得的单个菌落，并且按照标准方法(参见例如，本文引用的现有 技术和中请人提交的申请)i)进行诱导产生新的噬菌体，和ii)用IPTG诱 导纳米抗体表达和提取(周质提取物)。

实施例4：筛选Tie2结合纳米抗体

为了确定与Tie2的结合特异性，使用单克隆噬菌体库，在ELISA结 合测定设置中检测克隆。检测与Tie2/Fc嵌合体(R&D系统，目录号313-TI， 货号BKC06)结合的噬菌体。简言之，将0.2ug/ml受体固定在Maxisorp  ELISA板(Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱脂奶封闭游离的结 合位点。接着，允许在100ul 2％ Marvel PBS中的来自不同克隆的单克隆 噬菌体诱导物的10ul上清与固定的抗原结合。在温育和洗涤步骤后，使 用HRP-缀合的单克隆-抗-M13抗体(Gentaur，目录#27942101)揭示噬菌体 结合。基于与以下两个对照相比较的OD值确定结合特异性，一个对照没 有接受任何噬菌体，和在另一个对照中，在相似的ELISA结合测定中， 检测相同单克隆噬菌体与0.2ug/ml固定的人IgG和0.2ug/ml rh B7.2/Fc 的结合。

图1和表B-1显示与Tie2结合的克隆的选择(参见表B-1对克隆的 定义)。

表B-1：针对Tie2的纳米抗体。

实施例5：筛选阻断Tie2-Ang1相互作用的纳米抗体

针对它们阻断Ang1与Tie2/Fc结合的能力而筛选在Tie2结合测定中 检测为阳性的克隆。对于此，将包含纳米抗体的周质提取物(P.E.)用于基 于ELISA的配体竞争设置中。简言之，将0.75ug/ml人Ang1(R&D系统， 目录号923-AN/CF，货号FHW073091)包被在96孔Maxisorp微量滴定板 (Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱脂奶封闭。平行地，将0.2ug/ml Tie2/Fc用在100ul 2％ Marvel/PBS中的不同克隆的10ul包含纳米抗体的 周质提取物P.E.温育。1小时后，将受体-纳米抗体预混合物用包被的配体 温育1小时。用HRP-缀合的山羊-抗-人IgG(Jackson Immunoresearch(杰 克逊免疫研究)，目录#109-035-098)检测结合的Tie2/Fc。阻断活性确定 为与没有加入P.E.或加入不相关的P.E.的孔相比较的OD信号的降低。

图2显示使用选择与Tie2结合的克隆的这一阻断测定的结果。

162-E1，162-E9，162-F11，162-H10，163-E7(见下表B-2)表现出对Ang1 与Tie2结合的显著阻断。

表B-2：针对Tie2并且能够阻断Ang1与Tie2的结合的纳米抗体。

因为上述纳米抗体能够阻断Ang1与Tie2的结合，因此它们被认为是 Tie2的拮抗剂。在本实验部分的后面部分可以找到证实这一功能的功能性 测定。

实施例6：通过滴定纯化的纳米抗体确定Tie2-Ang1相互作用阻断效率

为了确定针对Ang1竞争检测为阳性的克隆的受体阻断效率，在基于 ELISA的配体竞争设置中检测纯化的纳米抗体的稀释系列。简言之，将 0.75ug/ml人Ang1(R&D系统，目录号923-AN/CF，货号FHW073091) 包被在96孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel 脱脂奶封闭。平行地，将0.2ug/ml Tie2/Fc用纯化的纳米抗体的稀释系列 物温育。1小时后，将受体-纳米抗体预混合物用包被的配体温育1小时。 用HRP-缀合的山羊-抗-人IgG(Jackson Immunoresearch(杰克逊免疫研究)， 目录#109-035-098)检测结合的Tie2/Fc。阻断活性确定为与没有加入P.E. 或加入不相关的P.E.的孔相比较的OD信号的降低。图3显示这一测定的 结果。

实施例7：在纯化的Tie2-Ang1阻断纳米抗体中筛选Tie2-Ana2阻断

为了研究针对Ang1竞争检测为阳性的克隆是否还可以阻断Ang2与 受体的结合，在新的基于ELISA的配体竞争设置中检测先前纯化的纳米 抗体。简言之，将0.75ug/ml人Ang2(R&D系统，目录号923-AN/CF)包 被在96孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel 脱脂奶封闭。平行地，将0.2ug/ml Tie2/Fc用150nM纯化的纳米抗体温 育。1小时后，将受体-纳米抗体预混合物用包被的配体温育1小时。用 HRP-缀合的山羊-抗-人IgG(Jackson Immunoresearch(杰克逊免疫研究)， 目录# 109-035-098)检测结合的Tie2/Fc。阻断活性确定为与没有加入P.E. 或加入不相关的P.E.的孔相比较的OD信号的降低。图4显示本实施例的 结果。没有一种Tie2-Ang1阻断纳米抗体能够阻断Ang2与Tie2的结合。

Tie2结合纳米抗体的序列比对(FRs以小写字母表示，CDRs以大写字母表示)：

163-G8        evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfgSNGMRwvrqapgkgpewvsSINSDGTSAFY

163-H8        evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfgSNGMRwvrqapgkgpewvsSINSDGTSTYY

163-E9        evqlvesggglvqpgdslrlscaasgftfgSNGMRwvrqapgkgpewvsSINSDGTSTYY

163-E7        evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsDYSMSwvrqapgkglewvsAISGGGEVTTY

162-E1^＊      evqlvesggglvqaggslrlscaasgsifsINAMGwyqqapgkqrelvaFITSVG-TTNY

162-F3        evqlvesggglvqagdslrlscttsgrtfsDDTMGwfrqaprkerefvaAILWDSIKTYY

162-E9        evqlvesggglvqpggslrlscaasgftldDYAIGwfrqapgkereavsCISSVDGSTHY

162-H10       evqlvesggglvqpggslrlscaasgftldDYAVGwfrqapgkeregvsCIGSSYGSTYY

162-F11       evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfdDYAIGwfrqapgkeregvaCISSSDGSTYY

163-G8        AESVKGrftisrdnakntlylqmnslkpedtavyycttTM-----NPN----------Pr

163-H8        AESVKGrftisrdnakntlylqmhslkpedtavyycttTE-----NPN----------Pr

163-E9        ADSVKGrftisrdnakntlclqmnslkpedtavyycttTE-----DPY----------pr

163-E7        ADSVKGrftisrdnakntlylqmsslkpedtalyycaeHL-----NFYSV---SVRSSPt

162-E1        ADSVKGrfiisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaa-------DLHYS-----GPNYw

162-F3        ADSVKGrftisrdnakntvylqmdslkpedtavyycaaTPTAYGTDWYRN-----NYHYw

162-E9        ADSVKGrftisrdnakdtvylqmnslkpedtaayycavQG--YSGGYYYTCEDSADFGFw

162-H10       ADSVKGrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycavQG--YSGGYYYTCEDSADFGFw

162-F11       ADSVKGrftissdnakntvylqmnslkpedtavyscsaGS--VAGCIPY---------Yw

163-G8        gqgtqvtvss

163-H8        gpgtqvtvss

163-E9        gqgtqvtvss

163-E7        sqgtqvtvss

162-E1        gqgtqvtvss

162-F3        gqgtqvtvss

162-E9        gqgtqvtvss

162-H10       gqgtqvtvss

162-F11       gqgtqvtvss

^＊来自Amber终止密码子的在162-E1的FR2中的q

成员：

结合剂家族(一个纳米抗体家族具有相同的CDR3)：

成员：

-I            162-E1

-II           162-E9，162-H10

-III          163-E7

-IV           162-F11

-V            162-F3

-VI           163-E9，163-G8，163-H8

实施例8：动物免疫

将两头美洲驼(171和172)按照标准方法用包含下述的混合物121进 行6次加强而进行免疫：

重组人血管生成素-1(R&D系统，目录号923-AN/CF)，

重组人血管生成素-2(R&D系统，目录号623-AN/CF)，

重组人血管生成素-4(R&D系统，目录号964-AN/CF)，

重组人血管生成素-样-4(R&D系统，目录号3485-AN)

在第6次加强后8天从这些动物收集血液。

实施例9：文库构建

根据供应商的使用说明书使用Ficoll-Hypaque从血液样品中制备外周 血单核细胞。下一步，从这些细胞中提取总RNA，并用作RT-PCR的起 始原料以扩增编码纳米抗体的基因片段。将这些片段克隆到噬菌粒载体 pAX50中。根据标准方法(参见例如本文引用的现有技术和申请人提交 的各个申请)制备噬菌体。该实施例产生噬菌体文库171(来自美洲驼171) 和172(来自美洲驼172)。

实施例10：选择展示结合Ang2的纳米抗体的噬菌体

将噬菌体文库171和172用于选择重组人Ang2(R&D系统，目录号 623-AN/CF)。将Ang2以5ug/ml，0.5ug/ml和0ug/ml(对照)直接固定在 Maxisorp 96孔微量滴定板(Nunc)上。在用噬菌体文库温育和彻底洗涤后， 用胰蛋白酶洗脱结合的噬菌体。扩增洗脱的噬菌体并且用在对2ug/ml，0.2 ug/ml，0.02ug/ml和0ug/ml(对照)固定的Ang2的第二轮选择中。培养从 洗脱的噬菌体库中获得的单个菌落，并且按照标准方法(参见例如，本文 引用的现有技术和申请人提交的申请)i)进行诱导产生新的噬菌体，和ii) 用IPTG诱导纳米抗体表达和提取(周质提取物)。

实施例11：筛选结合Ang2的纳米抗体

为了确定与Ang2的结合特异性，使用单克隆噬菌体库，在ELISA结 合测定设置中检测克隆。检测与Ang2(R&D系统，目录号623-AN/CF)结 合的噬菌体。简言之，将0.2ug/ml Ang2固定在Maxisorp ELISA板(Nunc) 上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱脂奶封闭游离的结合位点。接着， 允许在100ul 2％ Marvel PBS中的来自不同克隆的单克隆噬菌体诱导物的 10ul上清与固定的抗原结合。在温育和洗涤步骤后，使用HRP-缀合的单 克隆-抗-M13抗体(Gentaur，目录# 27942101)揭示噬菌体结合。基于与接 受不相关的噬菌体或没有接受噬菌体的对照相比较的OD值确定结合特 异性。

图5和表B-3显示选择结合Ang2的克隆。

表B-3：针对Ang2的纳米抗体

实施例12：筛选阻断Ang2-Tie2相互作用的纳米抗体

针对它们阻断Ang2与Tie2/Fc结合的能力而筛选在Ang2结合测定中 检测为阳性的克隆。对于此，将包含纳米抗体的周质提取物(P.E.)用于基 于ELISA的配体竞争设置中。简言之，将4ug/ml人Tie2/Fc嵌合体(R&D 系统，目录号313-TI，货号BKC06))包被在96孔Maxisorp微量滴定板 (Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱脂奶封闭。平行地，将0.05ug/ml 生物素化的rh Ang2(R&D系统，目录号BT623，货号BNR174091)用在 100ul 2％ Marvel/PBS中的不同克隆的10ul包含纳米抗体的周质提取物 温育。1小时后，将生物素化的Ang2-纳米抗体预混合物用包被的配体温 育1小时。用HRP-缀合的extravidin(SIGMA(西格玛)E2886-1ML， 126K4801)检测结合的生物素化的Ang2。阻断活性确定为与没有加入P.E. 或加入不相关的P.E.的孔相比较的OD信号的降低。图6显示使用选择结 合Ang2的克隆的这一阻断测定的结果。

166-D7，166-G4，166-H4，166-C10，166-C1，166-F8(见下表B-4)表现 出对Ang2与Tie2结合的显著阻断。

表B-4：针对Ang2并且能够阻断Ang2与Tie2的结合的纳米抗体。

实施例13：通过滴定纯化的纳米抗体确定Ang2-Tie2相互作用阻断效率

为了确定针对Ang2阻断检测为阳性的克隆的受体阻断效率，在基于 ELISA的配体竞争设置中检测纯化的纳米抗体的稀释系列物。简言之，将 4ug/ml人Tie2/Fc嵌合体(R&D系统，目录号313-TI，货号BKC06))包被 在96孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱 脂奶封闭。平行地，将0.05ug/ml生物素化的rh Ang2(R&D系统，目录 号BT623，货号BNR174091)用纯化的纳米抗体的稀释系列物温育。1小 时后，将生物素化的Ang2-纳米抗体预混合物用包被的配体温育1小时。 用HRP-缀合的extravidin(SIGMA(西格玛)E2886-1ML，126K4801)检测 结合的生物素化的Ang2。阻断活性确定为与没有加入P.E.或加入不相关 的P.E.的孔相比较的OD信号的降低。图7显示这一测定的结果。

Ang2结合纳米抗体的序列比对(FRs以小写字母表示，CDRs以大写字母表示)：

166-D7    evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfsDTTIGwfrqapgkeregisCISTGDGSTYY

166-G4    evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfsDTTIGwfrqapgkeregisCISTGDGSTYY

166-H4    evqlvesggdlvqaggslrlscaasgftfgDFTIGwfrqapgkeregvsCINTGDGSTNY

166-E12   kvqlvesggglvqaggslrlscaasgftfgSTTIGwfrqapgkeregvsCISTGDGSTYY

166-C10   evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfgTTTIGwfrqapgKeregvsCISTGDGSTNY

166-C1    evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfgSTTIGwfrqapgkeregvsCISTGDGSTYY

166-F8    evqlvesggglvqaggslrlscaasgftfgTTTIGwfrqapgkerevvsCISTGGGSTYY

166-D4    evqlvesggglvqaggslrlscvasgriftNTAMGwyrqapgkwrelva.TIYSGGSTKY

166-H5    evqlvesggglvqaggslslacvvsgrfsrINSMAwsrqvpgnqrelva.SVTSGGYTNY

166-D7    AESVKGrftissdnakntvylqmnslnpedtavyycalDQAPLWSTWSAPYEYDYwgqgt

166-G4    AESVKGrftissdnakntvylqmnslnpedtavyycalDQAPLWSTWSAPYEYDYwgqgt

166-H4    AESVKGrftissdnakntvylqmnslkpedtavyycalDQAPMWSSWSAPYEYDYwgqgt

166-E12   AESVKGrftissdnakntvylgmnslkpedtavyycalDQAPMWSSWSAPYEYDYwgqgt

166-C10   AESVKGrftissdnakntvylqnnslkpedtavyycalDQAPMWSSWSAPYEYDYwgqgt

166-C1    AESVKGrftissdnakntvylqmnslkpedtavyycalDQAPMWSSWSAPYEYDYwgqgt

166-F8    TESVKGrftissdnakntvylqmnslkpedtavyycalDQAPMWSNWSAPYEYDYwgqgt

166-D4    IDSVKGrfiisrdntrntvhlqmnslkpedtavyycnt.......VGAGSY....wgqga

166-H5    VDSVKGrftisrdnaknaiylqmnslksedtavyycna...RVVVRTAHGFEDNYwgqgt

166-D7    qvtvss

166-G4    qvtvss

166-H4    qvtvss

166-E12   qvtvss

166-C10   qvtvss

166-C1    qvtvss

166-F8    qvtvss

166-D4    qvtvss

166-H5    qvtvss

成员：

结合剂家族(一个纳米抗体家族具有相同的CDR3)：

成员：

-I    166-D7，166-G4，166-H4，166-E12，166-C10，166-C1，166-F8

-II   166-D4

实施例14：选择展示Ang1结合纳米抗体的噬菌体

将噬菌体文库171和172(实施例9)用于选择重组人Ang1(R&D系 统，目录号923-AN/CF，货号FHW073091)。将Ang1以5ug/ml，0.5ug/ml 和0ug/ml(对照)直接固定在Maxisorp 96孔微量滴定板(Nunc)上。在用噬 菌体文库温育和彻底洗涤后，用胰蛋白酶洗脱结合的噬菌体。扩增洗脱的 噬菌体并且用在对2ug/ml，0.2ug/ml，0.02ug/ml和0ug/ml(对照)固定的 Ang1的第二轮选择中。在该第二轮中，并且在用噬菌体文库温育和彻底 洗涤后，结合的噬菌体用胰蛋白酶和100倍过量的(与包被的Ang1相比， nM)重组人Tie2/Fc嵌合体(R&D系统，目录号313-TI，货号BKC06)洗 脱。培养从洗脱的噬菌体库中获得的单个菌落，并且按照标准方法(参见 例如，本文引用的现有技术和申请人提交的申请)i)进行诱导产生新的噬 菌体，和ii)用IPTG诱导纳米抗体表达和提取(周质提取物)。

实施例15：筛选结合Ang1的纳米抗体

为了确定与Ang1的结合特异性，使用单克隆噬菌体库，在ELISA结 合测定设置中检测克隆。检测与Ang1(R&D系统，目录号923-AN/CF，货 号FHW073091)结合的噬菌体。简言之，将0.2ug/ml Ang1固定在Maxisorp ELISA板(Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱脂奶封闭游离的结 合位点。接着，允许在100ul 2％ Marvel PBS中的来自不同克隆的单克隆 噬菌体诱导物的10ul上清与固定的抗原结合。在温育和洗涤步骤后，使 用HRP-缀合的单克隆-抗-M13抗体(Gentaur Cat# 27942101)揭示噬菌体结 合。基于与接受不相关的噬菌体或没有接受噬菌体的对照相比较的OD值 确定结合特异性。

图8和表B-5显示选择结合Ang1的克隆。

表B-5：针对Ang1的纳米抗体

结合Ang1的纳米抗体的序列比对(FRs以小写字母表示，CDRs以大写字母表示)：

185-H5    evqlvesggglvqpggslrlscaasgftld.YYAIGwfrqapgkeregvsYISSSDGRTY

173-H9    evqlvesggglvqpggslrlscaasgftlsGNWMY.wlrqapgkglewis.TITPRGLTA

184-B6    evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfs.NYAMTwvrqapgkglewvsDISWDGDITT

185-H5    YADSVKGrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycatDLSGRGDVSEYEYDYwgqgtq

173-H9    YADSVKGrftisrdiaentlylqmnslksgdtavyycarDKTGER.........rgqgtq

184-B6    YAASVKGrftisrdnakktlylqmnslkpedsavyycnt..YGYDSGRYYSY..wgqgtq

185-H5    vtvss

173-H9    vtvss

184-B6    vtvss

成员：

结合剂家族(一个纳米抗体家族具有相同的CDR3)：

成员：

-I        173-H9

-II       184-B6

-III      185-H5

实施例16：选择展示结合Ang4的纳米抗体的噬菌体

将噬菌体文库171和172(参见实施例9)用于在重组人血管生成素-4 (R&D系统，目录号964-AN/CF)上选择。将Ang4以5ug/ml，0.5ug/ml和 0ug/ml(对照)直接固定在Maxisorp 96孔微量滴定板(Nunc)上。在用噬菌 体文库温育和彻底洗涤后，用胰蛋白酶洗脱结合的噬菌体。扩增洗脱的噬 菌体并且用在对2ug/ml，0.2ug/ml，0.02ug/ml和0ug/ml(对照)固定的 Ang4的第二轮选择中。在该第二轮中，并且在用噬菌体文库温育和彻底 洗涤后，结合的噬菌体用胰蛋白酶洗脱。培养从洗脱的噬菌体库中获得的 单个菌落，并且按照标准方法(参见例如，本文引用的现有技术和申请人 提交的申请)i)进行诱导产生新的噬菌体，和ii)用IPTG诱导纳米抗体表 达和提取(周质提取物)。

实施例17：筛选结合Ang4的纳米抗体

为了确定与Ang4的结合特异性，使用单克隆噬菌体库，在ELISA结 合测定设置中检测克隆。检测与血管生成素-4(R&D系统，目录号 964-AN/CF)结合的噬菌体。简言之，将0.2ug/ml Ang1固定在Maxisorp  ELISA板(Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱脂奶封闭游离的结 合位点。接着，允许在100ul 2％ Marvel PBS中的来自不同克隆的单克隆 噬菌体诱导物的10ul上清与固定的抗原结合。在温育和洗涤步骤后，使 用HRP-缀合的单克隆-抗-M13抗体(Gentaur，目录#27942101)揭示噬菌体 结合。基于与接受不相关的噬菌体或没有接受噬菌体的对照相比较的OD 值确定结合特异性。

图9和表B-6显示选择结合Ang4的克隆。

表B-6：针对Ang4的纳米抗体

结合Ang4的纳米抗体的序列比对(FRs以小写字母表示，CDRs以大写字母表示)：

169-F11    evqlvesggglvqpggslrlscatsgftfsTSWMYwlrqapgkglewvs..TITPRGLTD

169-C8     evqlvesggglvqpggslrlscatsgftfsTSWMYwlrqapgkglewvs..TITPRGLTD

169-A10    evqlvesggglvqpggslrlscatsgftfsPSWMYwlrqapgkglewvs..TITpRGLTE

168-E5     evqlvesggglvqpggslrlscaasgftlsSNWMYwlrqapgkglewis..TITPRDLTA

168-A3     evqlvesggglvqpggslrlscaasgftlsGNWMYwlrqapgkglewis..TITPRGLTA

168-G3     evqlvesggglvqpggslrlscaasgstldYYAIGwyrqapgkerewvsCISSSNYGITT

169-B12    evqlvesggglvqaggslrlscaasgsifsINAMGwyrqapgnqrdlva..AITSGDSTK

169-E12    evqlvesggglvqaggslrlscaasgsifsINTMGwyrqapgnqrdlva..AITNGGSTK

169-A12    evqlvesggglvqpgqslrlscvasgsirsIIHMGwyrqapgnerdlva..VIIDSRTTK

169-C12    evqlvesggglvqpggslrlscaasgsirsIIHMGwyrqtpgnerdmva..VIIDSRTTK

169-F11    YTNSVKGrftvsrdnakntlylqmnslksedtavyyctk..........DKNGPP.....

169-C8     YTDSVKGrftisrdsakntlylqmnslksedtadyyctr..........DKNGPP.....

169-A10    YANSVKGrftiskdnakntlylqmnslksedtavyyctr..........DKNGPP.....

168-E5     YADSVKGrftisrdnaentlylqmnslksedtavyycak..........DKAGER.....

168-A3     YADSVKGrftisrdiaentlylqmnslksgdtavyycar..........DKTGER.....

168-G3     YADSVKGrftisrdnakntvylqmnslkpedtaiyycatNTRRKYGRLCDLNADY.....

169-B12    YADFVKGrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaa..........ELLGKWY....

169-E12    YVDSVKGrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycaa..........ESLGRWG....

169-A12    YSESVKGrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycna..........LALGTDQSSTF

169-C12    YAESVKGrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycna..........LALGTDQSSTF

169-F11    ..mgqgtqvtvss

169-C8     ..mgqgtqvtvss

169-A10    ..mgqgtqvtvss

168-E5     ..rgqgtqvtvss

168-A3     ..rgqgtqvtvss

168-G3     ..wgqgtqvtvss

169-B12    ..wgqgtqvtvss

169-E12    ..wgqgtqvtvss

169-A12    DSwgqgtqvtvss

169-C12    DSwgqgtqvtvss

成员：

结合剂家族(一个纳米抗体家族具有相同的CDR3)：

成员：

-I         169-F11，169-C8，169-A10

-II     168-A3，168-E5

-III    168-G3

-IV     169-B12，169-E12

-V      169-A12，169-C12

实施例18：选择展示结合Angptl4的纳米抗体的噬菌体

将噬菌体文库171和172(参见实施例9)用于选择重组人血管生成素 -样-4(R&D系统，目录号3485-AN)。

将Angptl4以5ug/ml，0.5ug/ml和0ug/ml(对照)直接固定在Maxisorp 96孔微量滴定板(Nunc)上。在用噬菌体文库温育和彻底洗涤后，用胰蛋白 酶洗脱结合的噬菌体。扩增洗脱的噬菌体并且用在对2ug/ml，0.2ug/ml， 0.02ug/ml和0ug/ml(对照)固定的Angptl4的第二轮选择中。在该第二轮 中，并且在用噬菌体文库温育和彻底洗涤后，结合的噬菌体用胰蛋白酶洗 脱。培养从洗脱的噬菌体库中获得的单个菌落，并且按照标准方法(参见 例如，本文引用的现有技术和申请人提交的申请)i)进行诱导产生新的噬 菌体，和ii)用IPTG诱导纳米抗体表达和提取(周质提取物)。

实施例19：筛选结合Angptl4的纳米抗体

为了确定与Angptl4的结合特异性，使用单克隆噬菌体库，在ELISA 结合测定设置中检测克隆。检测与重组人血管生成素-样-4(R&D系统， 目录号3485-AN)结合的噬菌体。简言之，将0.2ug/ml Ang1固定在 Maxisorp ELISA板(Nunc)上，并且用在PBS中的4％ Marvel脱脂奶封闭 游离的结合位点。接着，允许在100ul 2％ Marvel PBS中的来自不同克隆 的单克隆噬菌体诱导物的10ul上清与固定的抗原结合。在温育和洗涤步 骤后，使用HRP-缀合的单克隆-抗-M13抗体(Gentaur，目录# 27942101) 揭示噬菌体结合。基于与接受不相关的噬菌体或没有接受噬菌体的对照相 比较的OD值确定结合特异性。

图10和表B-7显示选择结合Angptl4的克隆。

表B-7：针对Angptl4的纳米抗体

Angptl4纳米抗体的序列比对(FRs以小写字母表示，CDRs以大写字母表示)：

171-G4    evqlvesggglvqaggslrlscvasgdtfn...WYAMGwfrqqapgkerefv.SAISGGG

171-E2    evqlvesggglvqagaslrlscvdsgdtfs...WYAMGwfrqqapgkerefv.SSISGGG

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170-E2    evqlvesggglvqaggslrlscaasgsiss...INVMGwyr.qapgkqrdlva..TITRA

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171-C4    evqlvesggglvqpggslrlscaasgrtfsTFNTYSMGwfr.qapgkerefva.AISRGG

170-F2    evqlvesggglvqaggslrlscaasgifii....DTMGwyr.qapgkqrelva..SITPT

170-B1    evqlvesggglvqaggslrlscaasesifs...LYVTGwyr.qapgkqrelva..SITSG

171-F3    evqlvesggglvqtggslrlscaasgrsfn...LYYMGwfr.qapgrerefva.GISGSG

171-H4    evqlvesgggqvqagdslrlsckasrrtis...TYGMGwfr.qapgdkrdlvs.SISASG

171-A2    evqlvesgggqvqagdslrlsckasrrtis...TYGMGwfr.qapgdkrdlvs.SISASG

171-A3    evqlvesgggqvqagdslrlsckasrrtis...TYGMGwfr.qapgdkrdlvs.SISASG

171-D2    evqlvesggglvqaggslrlscaasvltfg...TYTVGwfr.qapgkerefvs.IITGSG

170-G3    evqlvesggglvqaggslrlscaasetifa....SAMGwyr.qppgkqrelva..RITRG

170-C2    evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfs...LNAMTwvr.qapgkglewvs.TISSGG

171-G2    evqlvesggglvqaggslrlsctasgltfs...MYAMAwir.lapgkerevia.AIDWSG

171-G4    SNIVYVDSVKGrftvsrdrikntvylqmnslkpedsgvyycav...DKRWGSPATSRSTH

171-E2    SNTVYADSVKGrftvsrdrakntvylqmnslkpedsgvyycaa...DKRWGSPATSRSTH

170-H1    LNTNYATSVKGrftisrddfkdtvylqmnslepedtavyycna......GGYYTNLRTGG

170-E2    LNTAYATSVKGrftisrdnftntvylqmnslepedtavyycna......GGYYTNLRTGG

171-H2    GSTYYADSVKGrftiskdiakntvylqmnslkpddmavyycaa......ARRYGNLYNTN

171-E4    NVTPYADSVKGrfaisrdnakntltlqmnslkpedtavyycaa....SKIGIASTIRYYD

171-C4    NVTPYADSVKGrfaisrdnakntvalqmnslkpedtavyycaa....SKIGIASTIRYYD

170-F2    GNTNYVDSVKGrfaisrdnnkntmhlqmnslkpedtavyycna...VYPRYYGDDDRPPV

170-B1    GSLTYADSVKGrftisrdnakntvhlqmhslkpedtavyfcng......RSIGVDDMPYV

171-F3    GSTFYGDSVKGrftisrdnlkntmylqmnslkpedtavyycqs.....SRRIITNPREYG

171-H4    ASTYYVDSVKGrftisrdnikntvylqmnslkpedaavyycaa....APNGRFITMSTHV

171-A2    ASTYYVDSVKGrftisrdnikntvylqmnslkpedaavyycaa....APNGRFITMSAHV

171-A3    ASTYYVDSVKGrftisrdnikntvylqmnslkpedaavyycaa....APNGRFITMSTHV

171-D2    TYNDYADSVKGrftvsrdnakntvylqmnslksedtavyycaa....RHWGMFSRSENDY

170-G3    GSTNYAESVKGrfaisrdnadstlylrmnnlkpedtavyycna.......DTIGHSSSYI

170-C2    WTTSYADSVKGrftisrdnakntlylqmnslkpedmavyycak.......GSEFNGYEV.

171-G2    GSTFYGDSVKGrftisrdnakntvylemnslkpedtavyycaaNRRIYSSGSSLSDNSLY

171-G4    DYDFwgqgtqvtvss

171-E2    DYDFwgqgtgvtvss

170-H1    NY..wgqgtqvtvss

170-E2    NY..wgqgtqvtvss

171-H2    NYDYwgqgtqvtvss

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171-C4    Y...wgqgtqvtvss

170-F2    DS..wgqgtrvtvss

170-B1    Y...wgqgtqvtvss

171-F3    Y...wgqgtqvtvss

171-H4    DS..wgqgtqvtvss

171-A2    DS..wgqgtqvtvss

171-A3    DY..wgqgtqvtvss

171-D2    NY..wgqgtqvtvss

170-G3    TY..wgqgtqvtvss

170-C2    ....rgqgtqvtvss

171-G2    NF..wgqgtqvtvss

成员：

结合剂家族(一个纳米抗体家族具有相同的CDR3)：

成员：

-I       171-A3，171-A2

-II      170-E2，170-H1

-III     171-H2

-IV      171-E2，171-G4

-V       171-E4，171-C4

-VI      170-G3

-VII     170-B1

-VIII    170-F2

-IX      171-F3

-X       171-D2

-XI      170-C2

-XII     171-G2

实施例20：常用的体外、基于细胞的或体内测定的列表：

-体外结合测定：ELISA，Biacore

-体内结合测定：流式细胞术

-固相受体结合和阻断测定(Onliner等.，2004，同前所述)：使用固定的配 体或受体的基于ELISA的测定，其中确定对受体/配体结合的抑制。例如， 适于Tie2，Ang1或/和Ang2纳米抗体的基于细胞的测定。

-受体激活/失活测定(Fiedler等.，2003，Harfouche和Hussain，2006；均同前所述)：蛋白质印迹检测磷酸化的受体(激活的)或下游信号传导途径的成 分的磷酸化。例如，适于Tie2，Ang1或/和Ang2纳米抗体的基于细胞的测 定。

-细胞增殖测定(Onliner等.，2004，同前所述)：对加入或不加入中和纳米 抗体的肿瘤细胞测定肿瘤内皮细胞(例如，特定的肿瘤细胞系或“通用的” 内皮细胞，诸如人脐带内皮细胞(HUVECs))增殖的抑制。通过FACS分 析计数活细胞数目而确定细胞增殖。

-体内血管发生测定(Onliner等.，2004，同前所述)：在异种移植研究中通 过加入中和纳米抗体确定对肿瘤生长的影响的测定。例如，适于Tie2，Ang1 或/和Ang2纳米抗体的体内测定。

-体内直接的抗血管发生作用(Onliner等.，2004，同前所述)：通过大鼠角 膜血管发生模型在体内确定直接的抗新血管形成作用的测定。例如，适于 Tie2，Ang1或/和Ang2纳米抗体的体内测定。

脂蛋白脂肪酶(LPL)测定：使用³H-油酸作为底物测量LPL活性(Yoshida 等.，2002，同前所述)。例如，适于Angptl4的体外测定。

-体内CAM (鸡尿囊绒膜)测定：使用CHO-Angptl4表达细胞系通过加入 Angptl4结合纳米抗体而确定是否抑制血管化的测定(Le Jan等.，2003，同 前所述)。例如，适于Angptl4的体内测定。

-体内动物模型研究：确定注射Angptl4纳米抗体对过表达h Angpt14的转 基因小鼠的脂质代谢的作用的测定(Koster等.，2005，同前所述)。例如， 适于Angptl4的体内测定。

实施例21：本发明的氨基酸序列的特别优选的实施方案的列表：

包括例如2种纳米抗体(具有针对相同靶标(例如Tie2)的拮抗作 用，针对两种不同的表位，或针对相同的表位)的氨基酸序列：

●包括针对Tie2受体的纳米抗体和针对血管生成素1的纳米抗体 的氨基酸序列。

●包括针对Tie2受体的纳米抗体和针对血管生成素2的纳米抗体 的氨基酸序列。

●包括细胞毒性化合物(例如，肽毒素，例如，免疫毒素)和纳 米抗体的氨基酸序列，其中所述纳米抗体能够中断Tie/Ang或Angptl 相互作用中的至少一种，例如，Ang1/Tie2或Ang2/Tie2相互作用。本 发明的氨基酸序列，诸如例如在SEQ ID NOs：455-501中列出的那些， 可以用于靶向特定类型的癌症。

实施例22：本发明的靶蛋白的列表(与核酸和氨基酸序列联系)：

实施例23：Tie-2纳米抗体163E9的进一步分析

所用的试剂

重组人血管生成素-1(R&D系统，目录号：923-AN)；重组人血管生成 素-2(R&D系统，目录号：623-AN)；抗-总Erk p44/42MAPK(Cell Signaling  Technology(细胞信号传导技术)目录号#9102)；抗-磷酸Erk p44/42 MAPK(Thr 202/Tyr 204)(E10)(Cell Signaling Technology(细胞信号传导 技术)目录号#9106S)；抗-总Akt(C67E7)(Cell Signaling Technology(细 胞信号传导技术)目录号#4691)；抗-磷酸-Akt(Ser473)(D9E)(Cell  Signaling Technology(细胞信号传导技术)目录号#4060)；抗Tie-2/TEK， 克隆Ab33(UPSTATE目录号#05-584)；抗-磷酸酪氨酸，4G10(Platinum  Millipore)

实施例23a：通过Bioplex分析确定，Tie-2纳米抗体163E9抑制Ang-1诱导的Akt和Erk的磷酸化

为了鉴定抑制Ang-1-诱导的Tie-2信号传导途径的激活的Tie-2纳米 抗体，使用Bio-Plex磷蛋白和总靶标测定。在该测定中，分别确定在来自 细胞培养物或组织样品的裂解物中的蛋白的磷酸化和表达。Bio-Plex总靶 标测定报告了在一个孔中的靶蛋白的丰度，而Bio-Plex磷蛋白测定报告了 同种蛋白在不同孔中的磷酸化水平。

方法：

Bio-Plex测定使用具有不同光谱地址(spectral addresses)的珠子的选 择，每个与针对不同靶标的抗体偶联，(在总靶标测定中，Akt和ERK 1/2； 在磷蛋白测定中，Akt(Ser⁴⁷³)和ERK 1/2(Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴，Thr¹⁸⁵/Tyr¹⁸⁷))。将 偶联的珠子加入到96-孔半板中。将来源于适当处理的HUVECs的蛋白浓 度范围在200-900μg/ml的细胞裂解物加入到含有偶联的珠子的孔中。温 育15-18小时。向孔中加入对每个靶标上的二级表位特异性的生物素-标 记的检测抗体。温育30分钟。向孔中加入荧光标记的链霉抗生物素蛋白 报道子，其能够结合生物素-标记的检测抗体。温育10分钟。漂洗后，将 复合物重悬在测定缓冲液中。在Bio-Plex阵列读数仪中，红色经典激光和 绿色报道子激光照亮每个珠子，以鉴定每个珠子的光谱地址和相关的报道 子信号。染色的珠子通过它们内部的荧光信号而鉴定，与珠子结合的靶标 的水平通过报道子信号的强度显示。同时报道多种数据。

通过用胶原蛋白酶处理人脐带静脉而获得HUVECs(人脐静脉内皮细 胞)并且在包含20％FCS的M199(2％青霉素-链霉素，脑提取物和25μg 硫酸肝素钠(Heparin sodium sulfate))中培养。在含有0.5％BSA的M199 中饥饿3-4小时后，将细胞用所示浓度的Tie-2纳米抗体处理10分钟，然 后用100ng/ml h-Ang-1刺激10分钟。将细胞在冰冷的细胞洗涤缓冲液中 漂洗，并且在缓冲液中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂裂解。通过BCA(双金 鸡宁酸(Bicinchoninic acid))测定测量蛋白浓度，并且将在200-900μg/ml 范围内的每种样品等量的蛋白用于Bio-plex分析。在图11和12中分别报 道磷酸-Akt∶Akt和磷酸-ERK∶ERK的比例。表示非Ang-1刺激的样 品。在所检测的抗-Tie2NBs中，仅纳米抗体163E9能够在7,5ug/ml(～500 nM)和1ug/ml(～67nM)阻断Ang1-诱导的Akt和Erk磷酸化。其它Tie-2 纳米抗体没有一种抑制AKt和Erk的磷酸化。

实施例23b：通过蛋白质印迹确定，纳米抗体163E9剂量依赖性抑制Ang-1诱导的Akt和Erk的磷酸化。

通过用胶原蛋白酶处理人脐带静脉而获得HUVEC(人脐静脉内皮细 胞)并且在包含20％ FCS的M199(2％青霉素-链霉素，脑提取物和25μg 硫酸肝素钠(Heparin sodium sulfate))中培养。

将HUVECs涂布在6-孔平板中，并且在亚汇合条件(1，5±2 10⁵/ 9,6mm培养皿)下使用。在含有0,5％BSA的M199中饥饿3-4小时后， 将细胞用所示浓度的纳米抗体处理10分钟，然后用100ng/ml h-Ang-1刺 激10分钟。将细胞在冰冷的PBS中漂洗，并且在煮沸的缓冲液(500mM Tris HCl，ph 6,8；10％ SDS，甘油)中裂解。通过离心使裂解物澄清，并且通 过BCA(双金鸡宁酸(Bicinchoninic acid))测定确定蛋白浓度。通过10％ SDS-PAGE分离10μg蛋白，转移到硝基纤维素膜上，并且用抗-总Erk 1/2， 抗-磷酸-Erk 1/2，抗总Akt和抗-磷酸-Akt进行蛋白质印迹分析。通过CCD 照相机获得并且定量相对应的化学发光信号。报道磷酸-Akt∶Akt的比例 (图13)和磷酸-ERK∶ERK的比例(图14)。纳米抗体163E9剂量依赖性抑 制Ang-1诱导的Akt和Erk的磷酸化。

实施例23c：Tie-2纳米抗体163E9逆转Ang-1的抗-凋亡作用

已知HUVECS的血清饥饿导致凋亡性细胞死亡，该过程可以被Ang-1 抑制。为了进一步证实Tie-2纳米抗体163E9通过Tie-2干扰Ang-1诱导 的活性，研究纳米抗体163E9是否能够逆转Ang-1的抗凋亡活性。

凋亡实验使用评估核小体相关的DNA片段的水平的细胞死亡检测 ELISA^PLUS试剂盒(罗氏(Roche))进行。将HUVECs细胞接种在24孔(210⁴个细胞/孔)或6孔(9,810⁴个细胞/孔)中，并且用所示的不同生长因子处理 过夜。在该步骤中使用的缓冲剂和试剂为试剂盒提供。将细胞在室温下用 200μl或980μl裂解缓冲液裂解30分钟，并且将裂解物以200g离心10 分钟。ELISA测定用20μl样品上清和80μl免疫试剂进行。通过将1/20 体积的抗-DNA-HRP和1/20抗-histon-生物素与18/20体积的温育缓冲液 混合而制备免疫试剂。允许免疫测定结合反应进行2小时，然后用温育缓 冲液洗涤两次(每次200μl)去除过量的试剂。通过评估免疫复合物保留 的HRP(辣根过氧化物酶)而评估核小体的量的定量确定，HRP用ABTS 作为底物进行光度测量。最后，在使用ABST终止溶液10-15分钟后阻断 比色反应。

在用Ang-1(300ng/ml)刺激过夜的HUVECs细胞中或用生长因子-饥 饿(SF)的HUVECs细胞(作为对照)中检测针对Fie-2的纳米抗体。如在 图15中所示，Ang-1强烈抑制血清饥饿后的凋亡。重要地，纳米抗体163E9 剂量依赖性抑制Ang-1的抗凋亡活性。事实上，纳米抗体浓度的降低导致 减少的细胞凋亡。

实施例23d：纳米抗体163E9剂量依赖性抑制Ang-1诱导的Tie-2的磷酸化

在Ang-1结合Tie-2后，Tie-2的细胞质尾被磷酸化。为了进一步证明 Tie-2纳米抗体163E9通过Tie-2干扰Ang-1-诱导的活性，研究纳米抗体 163E9是否能够抑制Tie-2的磷酸化。

通过用胶原蛋白酶处理人脐带静脉而获得HUVEC(人脐静脉内皮细 胞)并且在包含20％FCS的M199(2％青霉素-链霉素，脑提取物和25μg 硫酸肝素钠(Heparin sodium sulfate))中培养。

在含有0,5％BSA的M199中饥饿3-4小时后，将细胞用所示浓度 (ng/ml)的纳米抗体处理10分钟，然后用h-Ang-1刺激10分钟。将细胞在 冰冷的PBS 1x中漂洗，并且在4℃在EB缓冲液(10mM TrisHCl，ph 7,5， 150mM NaCl，5mM EDTA，1％ Triton X100，10％甘油)中用蛋白酶和磷酸 酶抑制剂(50μg/ml胃蛋白酶抑制剂，50μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑肽 酶，1mM苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，100μM ZnCl₂， 1mM Na₃VO₄)裂解。将裂解物(450-800μg)在4℃用蛋白质G-琼脂糖和抗 -Tie-2抗体(1μg)温育2小时。在洗涤后，将免疫沉淀物在6％SDS-PAGE 中分离，并且针对P-Tyr和Tie-2进行免疫印迹。如在图16中所示，在所 用的纳米抗体163E9的最高浓度，确实减少了Tie-2的磷酸化。

实施例23e：纳米抗体163E9剂量依赖性抑制Ang-1诱导的内皮细胞出芽。

将HUVECS用胰蛋白酶消化，计数，并且以4个细胞/μl的密度悬浮在 含有20％甲基纤维素(Methocel)(西格玛(Sigma))的培养基中(20ml甲 基纤维素储液加80ml M-199 20％FCS，0.1mg/ml肝素，和0.1mg/ml脑提 取物)。将800个细胞接种在无黏附的圆底96孔板中，并且在37℃温育过夜。 次日，收集形成的球形体，在室温下以300g离心15分钟，然后包埋到胶 原凝胶中。在使用前通过混合7体积的胶原(在无菌0.2％乙酸pH 3中平衡 至3mg/ml，4℃)，1体积的10×M-199，1体积的0.1 N NaOH，和1体积的0.2 M HEPES pH 7.3而制备稀释的胶原-I(西格玛(Sigma)，来自大鼠尾)。 将EC球形体悬浮在200μl含有40％FCS的M-199培养基中，其具有或不具 有100ng/ml Ang1和所示浓度的纳米抗体163E9，并且用等体积的稀释的胶 原溶液混合。将球形体迅速转移到96-孔板(400μl/孔)中以允许聚合。

用倒置相差显微镜(Leica Microsystem，Heerbrugg，瑞士)检查毛细 管样出芽，并且照相。用图像软件winRHIZO Pro(Regent Instruments Inc.) 量化毛细管样结构的长度和突出的面积。

如在图17中所示，纳米抗体163E9剂量依赖性抑制Ang-1诱导的 HUVEC细胞的出芽。

使用不超过常规的实验，本领域的技术人员应该认识到，或者能够确 定本文所述的本发明的具体实施方案的多种等价物。所述等价物意欲包含 在后附的权利要求中。

本文公开的所有参考文献通过引用完全结合用于本说明书所示的目 的和信息。

优选的实施方案：

1.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由下列各项组成的组的蛋白和/或特异性结合选自由下列各项组成的 组的蛋白：Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，和Angptl6。

2.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由Tie1和Tie2组成的组的蛋白和/或特异性结合选自由Tie1和Tie2 组成的组的蛋白。

3.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由Ang1，Ang2，Ang3，和Ang4组成的组的蛋白和/或特异性结合选自 由Ang1，Ang2，Ang3，和Ang4组成的组的蛋白。

4.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，和Angptl6组成的组的 蛋白和/或特异性结合选自由Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5， 和Angptl6组成的组的蛋白。

5.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其以基本上分离的形 式存在。

6.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由下列各项组成的组的蛋白和/或特异性结合选自由下列各项组成的 组的蛋白：人Tie1，人Tie2，人Ang1，人Ang2，人Ang3，人Ang4，人 Angptl1，人Angptl2，人Angptl3，人Angptl4，人Angptl5，和人Angptl6。

7.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由人Tie1和人Tie2组成的组的蛋白和/或特异性结合选自由人Tie1 和人Tie2组成的组的蛋白。

8.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由人Ang1，人Ang2，人Ang3，和人Ang4组成的组的蛋白和/或特异 性结合选自由人Ang1，人Ang2，人Ang3，和人Ang4组成的组的蛋白。

9.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由人Angptl1，人Angptl2，人Angptl3，人Angptl4，人Angptl5，和 Angptl6组成的组的蛋白和/或特异性结合选自由人Angptl1，人Angptl2， 人Angptl3，人Angptl4，人Angptl5，和人Angptl6组成的组的蛋白。

10.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域 针对选自由人Tie2，人Ang1，人Ang2，人Ang4，和人Angptl4组成的组 的蛋白和/或特异性结合选自由人Tie2，人Ang1，人Ang2，人Ang4，和人 Angptl4组成的组的蛋白。

11.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域 针对选自由人Tie2和人Ang2组成的组的蛋白和/或特异性结合选自由人 Tie2和人Ang2组成的组的蛋白。

12.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域i)针对人Tie2和/或特异性结合人Tie2；并且ii)阻断人Tie2和至少 一种Ang，例如人Ang之间的相互作用。

13.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域i)针对人Tie2和/或特异性结合人Tie2；并且ii)阻断人Tie2和仅一 种Ang，例如人Ang之间的相互作用。

14.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域i)针对人Tie2和/或特异性结合人Tie2；并且ii)阻断人Tie2和人 Ang1之间的相互作用。

15.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域i)针对人Tie2和/或特异性结合人Tie2；并且ii)阻断人Ang1和人 Tie2之间的相互作用；并且iii)不阻断人Ang2和人Tie2之间的相互作用。

16.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域i)针对人Ang2和/或特异性结合人Ang2；并且ii)阻断人Tie2和人 Ang2之间的相互作用。

17.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域具有针对由Tie1和Tie2组成的组的蛋白中的至少一个成员的拮抗作 用。

18.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域具有针对由Tie1和Tie2组成的组的蛋白中的至少一个成员的激动作 用。

19.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域具有针对人Tie2的拮抗作用。

20.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域具有针对人Tie2的激动作用。

21.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域能够抑制人Tie2同源二聚体的装配。

22.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域能够增加人Tie2同源二聚体的装配。

23.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其中所述可变结 构域能够抑制血管发生，如例如在本文公开的基于细胞的体外或动物模型 的任一种测量的。

24.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其可以以 10^-5-10^-12摩尔/升或更小、并且优选地10^-7-10^-12摩尔/升或更小、并且更优 选地10^-8-10^-12摩尔/升的解离常数(K_D)特异性结合由下列各项组成的组的 蛋白中的至少一个成员：Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，和Angptl6。

25.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其可以以10²M^-1s^-1-约10⁷M^-1s^-1，优选10³M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，更优选10⁴M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1，诸如10⁵M^-1s^-1-10⁷M^-1s^-1的缔合速率(k_on-速率)特异性结合由下 列各项组成的组的蛋白中的至少一个成员：Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3， Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，和Angptl6。

26.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其可以以1s^-1- 10^-6s^-1，优选10^-2s^-1-10^-6s^-1，更优选10^-3s^-1-10^-6s^-1，诸如10^-4s^-1-10^-6s^-1的解离速率(k_off速率)特异性结合由下列各项组成的组的蛋白中的至少 一个成员：Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，和Angptl6。

27.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其可以以小于 500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和 力特异性结合由下列各项组成的组的蛋白中的至少一个成员：Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，和 Angptl6。

28.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其是天然存在的 氨基酸序列(来自任何适当的物种)或合成的或半合成的氨基酸序列。

29.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其包括免疫球蛋 白折叠或者其在适当的条件下能够形成免疫球蛋白折叠。

30.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由4个 构架区(分别为FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别为CDR1-CDR3)组成。

31.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其是免疫球蛋白 序列。

32.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其是天然存在的 免疫球蛋白序列(来自任何适当的物种)或是合成的或半合成的免疫球蛋 白序列。

33.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其是人源化的免 疫球蛋白序列，骆驼源化的免疫球蛋白序列或已经通过诸如亲和力成熟 技术获得的免疫球蛋白序列。

34.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由轻链 可变结构域序列(例如，V_L-序列)组成；或由重链可变结构域序列(例如， V_H-序列)组成。

35.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由来源 于常规4-链抗体的重链可变结构域序列组成或其基本上由来源于重链抗 体的重链可变结构域序列组成。

36.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由结构 域抗体(或适于用作结构域抗体的氨基酸序列)组成，由单结构域抗体(或 适于用作单结构域抗体的氨基酸序列)组成，由″dAb″(或适于用作dAb 的氨基酸序列)组成，或由纳米抗体^TM(包括但不限于V_HH序列)组成。

37.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由纳米 抗体^TM组成。

38.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由纳米 抗体^TM组成，所述纳米抗体

i)与SEQ ID NO’s：1-22中的至少一种氨基酸序列具有80％的氨基酸 同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序 列的氨基酸残基；

并且其中：

ii)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104 和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-3中提及的标志残基。

39.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由纳米 抗体^TM组成，所述纳米抗体

i)与SEQ ID NO’s：455-501中的至少一种氨基酸序列具有80％的氨基 酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR 序列的氨基酸残基；

并且其中：

ii)优选地，在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104 和108的氨基酸残基中的一个或多个选自表A-3中提及的标志残基。

40a.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其包括至少一个 可变结构域，所述可变结构域交叉阻断具有SEQ ID NOs 455-501的至少 一种氨基酸序列与Tie，Ang和/或Angptl的结合。

40b.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其包括至少一个 可变结构域，所述可变结构域与Tie，Ang和/或Angptl(的结合)被具有 SEQ ID NOs 455-501的至少一种氨基酸序列交叉阻断。

40c.按照实施方案40a或40b的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列交 叉阻断或被交叉阻断的能力在Biacore测定中检测。

40d.按照实施方案40a或40b的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列交 叉阻断或被交叉阻断的能力在ELISA测定中检测。

40.按照任意前述或下述实施方案的氨基酸序列，其基本上由人源 化的纳米抗体^TM组成。

41.按照任意下述实施方案的构建体，其包括一种或多种按照实施 方案1-40中任一项所述的氨基酸序列或基本上由一种或多种按照实施方 案1-40中任一项所述的氨基酸序列组成，并且任选地还包括任选地通过 一个或多个接头连接的一种或多种其它基团、残基、结构部分或结合单位。

42.按照任意前述或下述实施方案的构建体，其包括一种或多种按 照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列或基本上由一种或多种按照 实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列组成，并且其中所述构建体能 够抑制血管发生，如例如在本文公开的基于细胞的体外或动物模型的任一 种测量的。

43.按照任意前述或下述实施方案的构建体，其中所述一种或多种 其它基团、残基、结构部分或结合单位是氨基酸序列。

44.按照任意前述或下述实施方案的构建体，其中所述一个或多个 接头，如果存在的话，是一个或多个氨基酸序列。

45.按照实施方案42-44的构建体，其中所述一种或多种其它基团、 残基、结构部分或结合单位是免疫球蛋白。

46.按照实施方案42-45的构建体，其中所述一种或多种其它基团、 残基、结构部分或结合单位是选自由下列各项组成的组：结构域抗体，适 于用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体，适于用作单结构域抗体 的氨基酸序列，″dAb″’s，或适于用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体。

47.按照实施方案42-46的构建体，其中所述一种或多种本发明的 氨基酸序列是免疫球蛋白序列。

48.按照实施方案42-47的构建体，其中所述一种或多种本发明的 氨基酸序列选自由下列各项组成的组：结构域抗体，适于用作结构域抗体 的氨基酸序列，单结构域抗体，适于用作单结构域抗体的氨基酸序列， ″dAb″’s，或适于用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体。

49.构建体，其包括一种或多种按照实施方案42-48中任一项所述 的纳米抗体或基本上由一种或多种按照实施方案42-48中任一项所述的纳 米抗体组成，其中所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位 是纳米抗体。

50.按照实施方案41利下述任一项中的构建体，其是多价构建体。

51.按照实施方案41和下述任一项中的构建体，其是多特异性构建 体。

52.按照实施方案29-38中任一项的构建体，其与按照实施方案1-40 中任一项所述的相对应氨基酸序列本身相比，具有增加的半衰期。

53.按照实施方案39的构建体，其中与按照实施方案1-40中任一 项所述的相对应氨基酸序列本身相比，所述一个或多个其它基团、残基、 结构部分或结合单位为所述化合物或构建体提供增加的半衰期。

54.按照实施方案53的构建体，其中为所述化合物或构建体提供增 加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自 由下列各项组成的组：血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单位， Fc部分，和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。

55.按照实施方案54的构建体，其中为所述化合物或构建体提供增 加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自 由人血清白蛋白或其片段组成的组。

56.按照实施方案55的构建体，其中为所述化合物或构建体提供增 加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自 由可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG) 的结合单位组成的组。

57.按照实施方案56的构建体，其中为所述化合物或构建体提供增 加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位选自 由下列各项组成的组：结构域抗体，适于用作结构域抗体的氨基酸序列， 单结构域抗体，适于用作单结构域抗体的氨基酸序列，″dAb″’s，或适于 用作dAb的氨基酸序列，或可以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白) 或血清免疫球蛋白(诸如IgG)的纳米抗体。

58.按照实施方案57的构建体，其中为所述化合物或构建体提供增 加的半衰期的所述一个或多个其它基团、残基、结构部分或结合单位是可 以结合血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)或血清免疫球蛋白(诸如IgG) 的纳米抗体。

59.按照实施方案53-58中任一项的构建体，其具有是按照实施方 案1-21中任一项所述的相对应的氨基酸序列本身的半衰期的至少1.5倍、 优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的血清半衰 期。

60.按照实施方案53-59中任一项的构建体，与按照实施方案1-21 中任一项所述的相对应的氨基酸序列本身相比，其具有增加超过1小时， 优选超过2小时，更优选超过6小时，诸如超过12小时，或甚至超过 24、48或72小时的血清半衰期。

61.按照实施方案53-60中任一项的构建体，其在人中具有至少约 12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时、甚至更优选至少72小 时或更多的血清半衰期，例如，至少5天(诸如约5-10天)、优选至少9 天(诸如约9-14天)、更优选至少约10天(诸如约10-15天)、或至少 约11天(诸如约11-16天)、更优选至少约12天(诸如约12-18天或更 多)、或超过14天(诸如约14-19天)的血清半衰期。

62.按照实施方案53-61中任一项的构建体，其包括两种按照实施 方案1-28中任一项所述的氨基酸序列或基本上由两种按照实施方案1-28 中任一项所述的氨基酸序列组成。

63.按照实施方案62的构建体，其中所述两种氨基酸序列针对相同 的靶蛋白和/或特异性结合相同的靶蛋白，所述靶蛋白选自由Tie1，Tie2， Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，和 Angptl6组成的组，所述结合针对两种不同的表位或针对相同的表位。

64.按照实施方案63的构建体，其中所述靶蛋白选自由下列各项组 成的组：人Tie1，人Tie2，人Ang1，人Ang2，人Ang3，人Ang4，人Angptl1， 人Angptl2，人Angptl3，人Angptl4，人Angptl5，和人Angptl6。

65.按照实施方案64的构建体，其中所述第一氨基酸序列针对人 Tie2和/或特异性结合人Tie2，并且其中所述第二氨基酸序列针对人Ang1 和/或特异性结合人Ang1。

66.按照实施方案64的构建体，其中所述第一氨基酸序列针对人 Tie2和/或特异性结合人Tie2，并且其中所述第二氨基酸序列针对人Ang2 和/或特异性结合人Ang2。

67.按照实施方案64的构建体，其中所述第一氨基酸序列针对人 Tie2和/或特异性结合人Tie2，并且其中所述第二氨基酸序列针对人Ang4 和/或特异性结合人Ang4。

68.按照实施方案53-67的构建体，其包括一种或多种按照实施方 案1-40中任一项所述的氨基酸序列或基本上由一种或多种按照实施方案 1-40中任一项所述的氨基酸序列组成，并且任选地还包括任选地通过一个 或多个接头连接的一个或多个毒性基团、毒性残基、毒性结构部分或毒性 结合单位。

69.按照实施方案68的构建体，其中所述毒性基团选自由免疫毒素 组成的组。

70.按照任意前述或下述实施方案的构建体，其包括至少3个可变 结构域，例如，纳米抗体。

71.按照任意前述或下述实施方案的构建体，其包括至少3个可变 结构域，例如，纳米抗体，并且其能够抑制过度的血管发生和/或肿瘤发 生，其中所述生物学作用可以在诸如本文所述的适当的基于细胞和/或动 物模型中检测。

72.按照任意前述或下述实施方案的构建体，其包括至少3个可变 结构域，例如，纳米抗体，并且其能够抑制Tie2簇集形成或者能够簇集 Tie2但是并不诱导任何或者仅诱导部分的一种或多种生物学作用，诸如抑 制过度的血管发生和/或肿瘤发生至正常水平，其中所述生物学作用可以 在诸如本文所述的适当的基于细胞和/或动物模型中检测。

73.单价构建体，其包括一种按照实施方案1-40中任一项所述的氨 基酸序列或基本上由一种按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列 组成。

74.按照实施方案57的单价构建体，其中所述本发明的氨基酸序列 选自由下列各项组成的组：结构域抗体，适于用作结构域抗体的氨基酸序 列，单结构域抗体，适于用作单结构域抗体的氨基酸序列，″dAb″’s，或 适于用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体。

75.单价构建体，其包括一种按照实施方案1-40中任一项所述的纳 米抗体或基本上由一种按照实施方案1-40中任一项所述的纳米抗体组成。

76.核酸或核苷酸序列，其编码按照实施方案1-40中任一项所述的 氨基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按 照实施方案73-75中任一项所述的单价构建体。

77.按照实施方案76的核酸或核苷酸序列，其以遗传构建体的形式 存在。

78.宿主或宿主细胞，其表达或者是适宜的条件下能够表达按照实 施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所 述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75中任一项所述的单价构建体； 和/或其包括按照实施方案76或77所述的核酸或核苷酸序列。

79.用于生产按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照 实施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75 中任一项所述的单价构建体的方法，所述方法至少包括下述步骤：

a)在适宜的宿主细胞或宿主生物体中或在另种适宜的表达系统中，表 达按照实施方案76所述的核酸或核苷酸序列，或按照实施方案77所 述的遗传构建体；任选地接着进行：

b)分离和/或纯化按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实 施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75 中任一项所述的单价构建体。

80.用于(生产)按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按 照实施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75 中任一项所述的单价构建体的方法，所述方法至少包括下述步骤：

a)在某种条件下培养和/或维持按照实施方案78所述的宿主或宿主细胞， 所述条件是这样的，以致所述的宿主或宿主细胞表达和/或生产至少 一种按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实施方案 41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75中任 一项所述的单价构建体；任选地接着进行：

b)分离和/或纯化按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实 施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75 中任一项所述的单价构建体。

81.组合物，其包括至少一种按照实施方案1-40中任一项所述的氨 基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照 实施方案73-75中任一项所述的单价构建体，或按照实施方案76或77所 述的核酸或核苷酸序列。

82.按照实施方案81的组合物，其是药物组合物。

83.按照实施方案82的组合物，其是药物组合物，其还包括至少一 种药用载体，稀释剂或赋形剂和/或辅剂，并且其任选地包括一种或多种 其它药物活性多肽和/或化合物。

84.用于预防和/或治疗至少一种与过量或不足的血管发生相关的 疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药学活性量的至 少一种按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实施方案 41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75中任一项 所述的单价构建体，或按照实施方案81-83中任一项所述的组合物。

85.用于预防和/或治疗至少一种下述疾病或病症的方法，所述疾病 或病症与下述相关：选自由Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1， Angptl2，Angptl3，Angptl4，Angptl5，和Angptl6组成的组的蛋白，与其生物 学或药学活性相关，和/或与其中涉及所述蛋白的生物学途径或信号传导 相关，所述方法包括向需要其的受试者施用药学活性量的至少一种按照实 施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所 述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75中任一项所述的单价构建体， 或按照实施方案81-83中任一项所述的组合物。

86.用于预防和/或治疗至少一种与下述癌症相关的疾病或病症的 方法，所述癌症可以通过向需要其的受试者施用按照实施方案1-40中任 一项所述的氨基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所述的化合物或构 建体，或按照实施方案73-75中任一项所述的单价构建体，或按照实施方 案81-83中任一项所述的组合物而预防和/或治疗，所述方法包括向需要其 的受试者施用药学活性量的至少一种按照实施方案1-40中任一项所述的 氨基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按 照实施方案73-75中任一项所述的单价构建体，或按照实施方案81-83中 任一项所述的组合物。

87.按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实施方案 41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75中任一项 所述的单价构建体在治疗用于预防和/或治疗至少一种与过度的或不足的 血管发生相关的疾病或病症的药物组合物中的应用。

88.按照实施方案1-40中任一项所述的氨基酸序列，按照实施方案 41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75中任一项 所述的单价构建体的用途，其用于预防和/或治疗至少一种与过度的或不 足的血管发生相关的疾病或病症。

89.按照实施方案1-4D中任一项所述的氨基酸序列，按照实施方案 41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按照实施方案73-75中任一项 所述的单价构建体用于治疗过度的血管发生是基本原因的疾病的用途，并 且其中所用的给药方案以这样的方式控制，以致在患者血清中，功能性 Ang1∶功能性Ang2的比例为0.5-2，优选地0.6-1.67，更优选地0.7-1.4，更 优选地0.8-1.25，更优选地0.9-1.1。

90.按照实施方案89的用途，其中认为所述功能性Ang2的浓度是 血清中Ang2的总浓度减去血清中针对Ang2的氨基酸序列的总浓度。

91.用于预防和/或治疗至少一种与下述癌症相关的疾病或病症的 方法，所述癌症可以通过向需要其的受试者施用按照实施方案1-40中任 一项所述的氨基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所述的化合物或构 建体，或按照实施方案73-75中任一项所述的单价构建体，或按照实施方 案81-83中任一项所述的组合物而预防和/或治疗，所述方法包括向需要其 的受试者施用药学活性量的至少一种按照实施方案1-40中任一项所述的 氨基酸序列，按照实施方案41-72中任一项所述的化合物或构建体，或按 照实施方案73-75中任一项所述的单价构建体，或按照实施方案81-83中 任一项所述的组合物；并且其中所用的给药方案以这样的方式控制，以致 以致在患者血清中，功能性Ang1∶功能性Ang2的比例为0.5-2，优选地 0.6-1.67，更优选地0.7-1.4，更优选地0.8-1.25，更优选地0.9-1.1。

92.按照实施方案91的方法，其中认为所述功能性Ang2的浓度是 血清中Ang2的总浓度减去血清中针对Ang2的氨基酸序列的总浓度。

甚至更优选的方法：

1.包含至少一种单可变结构域的氨基酸序列，所述单可变结构域针对 选自由Tie1，Tie2，Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，Angptl1，Angptl2，Angptl3， Angptl4，Angptl5，和Angptl6组成的组的蛋白。

2.按照任意前述方面的氨基酸序列，其以基本上分离的形式存在。

3.按照任意前述方面的氨基酸序列，其中所述单可变结构域针对选自 由下列各项组成的组的蛋白：人Tie1，人Tie2，人Ang1，人Ang2，人Ang3， 人Ang4，人Angptl1，人Angptl2，人Angptl3，人Angptl4，人Angptl5，和 人Angptl6，优选地人Ang1，人Ang2，人Ang4，人Angptl4和人Tie2。

4.按照任意前述方面的氨基酸序列，其中所述单可变结构域具有针对 由Tie1和Tie2组成的组的至少一种成员的拮抗作用。

5.按照任意前述方面的氨基酸序列，其中所述单可变结构域具有针对 人Tie2的拮抗作用。

6.按照任意前述方面的氨基酸序列，其中所述单可变结构域具有针对 人Tie2的拮抗作用，并且不阻断人Ang2和人Tie2之间的相互作用。

7.按照任意前述方面的氨基酸序列，其中所述单可变结构域具有SEQ  ID NO 461的CDRs。

8.按照任意前述方面的氨基酸序列，其中所述单可变结构域与SEQ  ID NO：461具有80％，优选90％，更优选95％的序列同一性。

9.多肽，其包括至少2个相同的或不同的方面1-8中任一项的氨基酸 序列。

10.单可变结构域，其具有方面1-8中任一项的任一种单可变结构 域的CDR组合，例如，SEQ ID NO：461的CDR组合。

11.单可变结构域，其与方面1-8中任一项的任一种单可变结构域， 例如SEQ ID NO：461，具有80％，优选90％，更优选95％的序列同一性。

12.药物组合物，其包括至少一种药用载体、稀释剂或赋形剂和/ 或辅剂，和按照任一前述方面所述的氨基酸序列、多肽、或单可变结构域。

13.用于预防和/或治疗至少一种与过度的或不足的血管发生相关 的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药学活性量的 至少一种按照方面1-11中任一项所述的氨基酸序列、多肽、或单可变结 构域。

14.按照方面1-11中任一项所述的氨基酸序列、多肽、或单可变结 构域用于预防和/或治疗至少一种与过度的或不足的血管发生相关的疾病 或病症的用途。

15.用于生产按照方面1-11中任一项所述的氨基酸序列、多肽、或 单可变结构域的方法，所述方法至少包括下述步骤：

i.在某种条件下培养和/或维持适宜的宿主或宿主细胞，所述条 件是这样的，以致所述的宿主或宿主细胞表达和/或生产至少 一种按照方面1-11中任一项所述的氨基酸序列、多肽、或单 可变结构域；任选地接着进行：

ii.分离和/或纯化按照方面1-11中任一项所述的氨基酸序列、 多肽、或单可变结构域。