针对在细胞表面表达的蛋白质的抗体制作方法

摘要

本发明的目的是提供针对细胞表面表达的蛋白质、特别是跨膜蛋白的抗体制作方法。本发明是提供将在细胞膜上表达抗原蛋白质的细胞(抗原分子表达细胞)和以抗体表达细胞、病毒为代表的各种抗体文库混合，仅将在构成该抗体文库的抗体表达细胞、病毒等内与该抗原分子表达细胞结合的物质浓缩、离析，从而获得所需的抗体的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及从抗体文库离析针对在细胞表面表达的蛋白质的抗体 的方法以及利用该方法制作的抗体。

背景技术

抗体通过识别特定的抗原，引发各种生物体内现象，作为生物体内 防御的中坚力量发挥着重要的作用。特别是利用抗体的抗体依赖性细胞 毒性(ADCC；antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)活性、补体 依赖性细胞毒性(CDC；complement dependent cytotoxicity)活性对癌细胞 等的清除有效，因此用于作为抗癌剂的用途。着眼于这样的抗体的作用而 实用化的抗体制剂也很多，显示良好的治疗效果的制剂也不少。进而，除 了作为医药制剂的用途以外，例如作为各种诊断检查试剂、或者研究开发 上有效的工具而广泛使用。因此需要制作将在各种生物体内现象中发挥重 要作用的蛋白质作为抗原来识别的抗体。

作为在生物体内现象中发挥重要作用的蛋白质，可以举出贯通细胞膜 的蛋白质(以下称为跨膜蛋白)。跨膜蛋白可以举出例如各种受体蛋白、 离子通道蛋白等。由于其中的大多数与细胞内外的信息、物质的传递、移 动相关，从而对细胞的生存、增殖、分化等发挥重要的作用，因此，制作 能够识别该跨膜蛋白的抗体对上述医药制剂、诊断检查试剂或研究开发工 具具有极大的意义。

目前，作为针对任意抗原的抗体制作方法已经开发了各种方法(杂 交瘤制作法、DNA免疫法、噬菌体展示法等)。特别是近年来，作为大 量且容易地生产具有高特异性的抗体的技术，被称为ADLib体系(或 ADLib法)的方法正在受到关注(参照专利文献1、非专利文献1)。根 据该方法，可以利用简便的方法提供具有所需的特异性和亲和性的抗 体。

但是，利用上述各种抗体制作方法的针对跨膜蛋白的抗体制作存在 如下的问题。

将表达了跨膜蛋白的细胞作为抗原对免疫动物直接给药而引起免 疫反应的方法中，该跨膜蛋白在表达细胞膜上表达生理性的立体结构， 但是该表达细胞在生物体内受到蛋白质分解，所以对生理条件下的跨膜 蛋白难以制成抗体。

DNA免疫法是将跨膜蛋白的cDNA整合到适当的用于哺乳类动物 细胞的表达载体，将该载体直接对免疫动物进行给药的方法(参考非专 利文献2)。根据该方法，虽然具有在生物体内再现该跨膜蛋白的细胞膜 上的立体结构的可能性，但是该蛋白质的作用机理的不清楚的点很多， 不清楚对生理条件下的跨膜蛋白是否能够制作抗体。

噬菌体展示法是在作为大肠杆菌病毒的一种的纤维状噬菌体的外 壳蛋白质上以不失去噬菌体的感染能力的方式将抗体的可变区域基因 表达为融合蛋白的体系(参考非专利文献3、4)。在该方法中，使噬菌 体粒子与跨膜蛋白反应而选择所需的抗体时，需要使用纯化的跨膜蛋 白，并且不能保证作为目标的跨膜蛋白是否保持着生理功能。

这些问题在通过在免疫细胞中促进体细胞同源重组而在该免疫细 胞表面呈示多样的抗体分子的ADLib法中也同样存在，并且针对生理 状态下的纯化困难的跨膜蛋白的抗体的选择不一定容易。

如上所述，针对跨膜蛋白的抗体制作在任何制作方法中都困难。

专利文献

专利文献1：国际公开公报WO2004/011644

非专利文献

非专利文献1：Seo等，Nature Biotech.23：731-735，2005

非专利文献2：Tang等，Nature 356：152，1992

非专利文献3：McCafferty等，Nature 348：552-554，1990

非专利文献4：Marks等，J.Mol.Biol 222：581-597，1991

发明内容

本发明的发明人鉴于上述情况进行了深入研究，结果在利用在细胞 表面上表达跨膜蛋白和标记蛋白的细胞，从抗体集团制备针对跨膜蛋白 的抗体上取得了成功。

因此，本发明的目的在于提供针对在细胞表面上表达的蛋白质、特 别是跨膜蛋白的抗体制作方法。

本发明的发明人在制作针对跨膜蛋白的抗体时，代替在采用ADLib 法的抗体制作方法中以往使用的、包覆有纯化抗原的磁珠，准备在细胞 表面表达了跨膜蛋白和标记蛋白的细胞，通过将该细胞作为抗原使用， 进行了自ADLib文库的抗体呈示细胞的筛选。然后，使用与该标记蛋 白质特异性结合的分子离析该细胞-抗体呈示细胞的复合体。虽然不能 预知仅通过这样的方法是否能够确实地选择针对生理状态下的跨膜蛋 白的特异性抗体，但是解析的结果，意外地确认了可以获得具有有效的 特异性和亲和性的抗体。根据该方法，可以得到利用以往的方法制作困 难的针对跨膜蛋白的抗体，通过在生理状态下呈示该跨膜蛋白，可以提 高获得对该跨膜蛋白的功能带来影响的功能性抗体的准确度。另外，通 过在细胞中表达任意的跨膜蛋白，还具有对任何跨膜蛋白均无需纯化就可 以进行筛选的优点。

即，本发明涉及以下(1)～(6)的内容。

(1)本发明的第1方式是“使抗体文库与在细胞表面上表达了靶抗 原蛋白质的细胞接触，通过离析该细胞，分离与该靶蛋白质形成复合体 的抗体文库的构成物的方法”。

(2)本发明的第2方式是“根据上述(1)所述的方法，其中，抗体文 库是在细胞表面呈示抗体的细胞集团”。

(3)本发明的第3方式是“根据上述(1)所述的方法，其中，离析在 细胞表面上表达了靶抗原蛋白质的细胞的方法利用标记抗原和针对标 记抗原的抗体的结合，所述标记抗原是该细胞表达的靶抗原蛋白质以外 的细胞表面上的抗原”。

(4)本发明的第4方式是“根据上述(3)所述的方法，其中，标记抗 原是外来蛋白质”。

(5)本发明的第5方式是“根据上述(4)所述的方法，其中，靶抗原 蛋白质是外来蛋白质”。

(6)本发明的第6方式是“根据上述(2)～(5)中任一项所述的方法， 其中，在细胞表面呈示抗体的细胞集团是DT40”。

在本发明中，使用整合了在细胞膜上表达的任意的蛋白质、特别是 跨膜蛋白的基因的表达载体，使成为抗原的该蛋白质在任意细胞(抗原 分子表达细胞)的表面表达，将本细胞与以ADLib法中的抗体表达细 胞为代表的各种抗体文库混合，仅将在构成该抗体文库的抗体表达细 胞、病毒等中，与该抗原分子表达细胞结合的物质浓缩、离析，由此可 以获得抗体。

与以往的抗体制作方法相比时，由于不需要纯化抗原蛋白质，所以 对于纯化困难的多次跨膜蛋白也能够进行抗体制作。另外，通过在生理 状态下呈示该跨膜蛋白，不仅可以识别该跨膜蛋白，还可以提高获得对 该跨膜蛋白的功能也带来影响的所谓的功能性抗体的准确度。

附图说明

图1表示使用了在细胞表面表达的跨膜蛋白的ADLib选择的流程。

图2表示用FACS解析对使用人EGFR和CD4共表达CHO-S细胞 选择的ADLib文库构成细胞和阴性对照细胞中表达鸟IgM和抗人 EGFR抗体两者的细胞的比例进行解析的结果。

图3表示用FACS解析对从ADLib文库筛选的抗人EGFR抗体产 生细胞和非产生细胞中表达鸟IgM和抗人EGFR抗体两者的细胞的比 例进行解析的结果。

图4表示体现由抗人EGFR抗体产生细胞产生的抗体的抗原特异性 的ELISA的结果。

图5表示使用了抗EGFR抗体产生细胞的培养上清的A431细胞和 CHO-S细胞的FACS染色的结果。

图6表示使用抗Claudin2抗体产生细胞的培养上清，用细胞ELISA 检查对Claudin2表达CHO和未处理CHO细胞的反应性的结果。

具体实施方式

1.抗体文库

在本发明中使用的抗体文库只要是呈示一组抗体的抗体文库就可 以使用任意的抗体文库，可以是在细胞表面上呈示抗体的细胞，也可以 是在外壳蛋白质上呈示抗体的病毒，本领域技术人员可以容易地进行选 择适合的文库。优选使用产生抗体的B细胞，特别优选来自鸡的B细 胞的株化培养细胞DT40细胞。特别优选的抗体文库是利用ADLib法 制作的抗体文库(ADLib法的详细内容参照例如专利文献1)。

本发明中使用的抗体文库的维持条件是根据在该技术领域中公知 的方法进行的，当然是在适合所选择的抗体文库的条件下进行。但是所 选择的抗体文库为DT40细胞集团构成的情况下，例如使用用于维持该 细胞集团的培养基IMDM培养基(Invitrogen公司)，在5％的CO₂存 在下以39.5℃进行培养。

进而，上述的DT40细胞还包括增加了促进体细胞同源重组、在细 胞表面呈示多种抗体分子的处理的细胞。促进体细胞同源重组的方法包 括只要是本领域技术人员就能容易选择的方法，例如可以举出通过与曲 古霉素A等组蛋白去乙酰化酶抑制剂接触等，使该DT40细胞的抗体基因 位点中的染色质结构松解，从而促进该抗体基因位点中的体细胞同源重组 的方法，例如ADLib法等。

2.抗原蛋白质和标记抗原

在实施本发明时，作为目标的抗原蛋白质只要是在细胞内表达后在 细胞表面呈示的蛋白质，可以使用细胞中原本存在的蛋白质、外来性的 蛋白质中的任意的蛋白质，优选为贯通细胞膜的蛋白质，可以举出例如 EGFR、IGF-1R等增殖因子受体蛋白质群、CD81等4次跨膜蛋白群、 包括CXCR4等趋化因子受体和鞘脂受体等的7次跨膜蛋白群等。

使该细胞与上述抗体文库结合后，用于将抗原蛋白质和抗体(或者 呈示抗体的细胞)的复合体离析的标记抗原只要是用于特异性地识别表 达抗原蛋白质的细胞的、发挥所谓的标签之类功能的分子均可使用。能 够作为标记抗原使用的分子，可以举出例如蛋白质或糖链等在该细胞膜 上存在的分子等，可以是在该细胞膜上原本存在的分子，或者在该细胞 上原本不存在的外来性的分子。在该细胞膜上原本存在的标记抗原只要 是能够为了识别表达抗原蛋白质的细胞而使用的标记抗原，不一定非要 鉴定其分子。例如，如果针对表达了抗原蛋白质的细胞的细胞表面上存 在的生物体分子群得到了抗体(群)等，则由于使用这些抗体可以识别 或选择抗原蛋白质，因此可以不清楚这些生物体分子群的来历。作为标 记抗原使用外来性的分子的情况下，可以使用例如在细胞表面上表达的 蛋白质等。作为标记抗原使用外来性的蛋白质的情况下，只要是在细胞 内表达后在细胞表面呈示的蛋白质均可使用，理所当然地可以使用在细 胞表面上表达的膜蛋白质等，即使是分泌蛋白质等本来在膜上没有出现 的分子，也可以通过融合跨膜区域而作为标记抗原而使用。作为标记抗 原可以使用例如CD4、MHC-Ⅱ类分子等。

上述的抗原蛋白质和标记蛋白质(作为标记抗原使用蛋白质的情 况)的基因的制备可以基于该技术领域中的通常的技术常识来进行。例 如，可以利用RT-PCR法等由适当的细胞等扩增作为目标的抗原蛋白 质和标记蛋白质的基因区域，在适当的载体等上进行克隆。另外，标记 蛋白是融合蛋白的情况下，可以以同样的方法扩增将融合的各个蛋白质 进行编码的基因，将各自分别或以融合的状态用适当的载体等进行克 隆。此时，可以从关于作为目标的抗原蛋白质和标记蛋白质(融合蛋白 的情况下是融合的各蛋白质)的基因的公知的数据库等获得序列信息， 基于该信息容易地设计用于RT-PCR法的引物。

3.共表达抗原蛋白质和标记蛋白质的细胞

实施本发明时，将蛋白质用作标记的情况下，共表达上述抗原蛋白 质和标记蛋白质的细胞只要是这些蛋白质在细胞内表达后，在该细胞的 表面呈示的细胞均可使用，本领域技术人员可以容易地进行选择。特别 是，该抗原蛋白质和标记蛋白质来自人的情况下，优选能够期待生理翻 译后引发修饰、细胞内局部存在的来自人的细胞，而且优选操作简便的 株化培养细胞(例如CHO-S细胞等)。

通过将制作的抗原蛋白质基因和标记蛋白质基因整合到适当的表 达载体，可以在上述的细胞表达所需的抗原蛋白质和标记蛋白。作为标 记蛋白质使用融合蛋白的情况下，调整各基因的阅读框来进行表达，从 而表达具有作为目标的氨基酸序列的所需融合蛋白。作为表达载体，优 选具有在该细胞内能够表达目标蛋白质的启动子、增强子等构成要素的 表达载体。

向上述细胞导入制作的表达载体，可以使用DEAE葡聚糖法、电穿 孔法、磷酸钙法、利用阳离子性脂质的方法等公知的方法来容易地进行。

4.利用抗原蛋白质和标记蛋白质共表达细胞的抗体文库内的所需 库构成物的选择

实施本实验时，将共表达上述抗原蛋白质和标记蛋白质的细胞与抗 体文库在适当的条件下(例如生理离子强度、pH)进行悬浮、混合， 以适当的时间(例如1小时至一晚)和温度(例如4℃～37℃左右)进 行孵育，从而进行与抗体文库中的与该抗原蛋白质具有特异性的特定抗 体对应的抗体文库构成物(例如抗体表达细胞)的结合反应。

进行了结合反应后，将该共表达细胞和抗体文库构成物的结合体以 介由标记的适当方法离析。此时，优选对于回收的抗体文库构成物、例 如抗体表达细胞为非侵袭性的方法，包括只要是本领域技术人员就能够 容易选择的全部的方法。例如，如果是标记蛋白质或糖链等生物体分子 的情况下，可以使用包覆有针对这些生物体分子的特异性的抗体的磁 珠、例如MACS珠(Miltenyi Biotech公司)、或Dynabeads(Veritas 公司)，将其与该结合体在适当的条件下混合后，利用使用了MACS法 或Dynabeads架(スタンド)法的方法进行离析。另外，使用了Dynabeads 的情况下，还可以使用King Fisher磁粒子处理器(Thermo Fisher  Scientific公司)进行离析。

以下，示出实施例，但是本发明不限于此。

实施例

1.细胞培养

DT40细胞的细胞培养基本按以下的方法进行。培养机使用CO₂恒 温槽，在5％的CO₂存在下以39.5℃进行培养。培养基使用IMDM培 养基(Invitrogen公司)，并加入10％牛血清、1％鸡血清、青霉素100 单位/mL、链霉素100μg/mL、2-巯基乙醇55μM而使用。另外，曲古 菌素A(和光纯药)以在DMSO中溶解成2mg/mL的浓度的溶液作为 贮存液，用适合的培养基稀释至最终浓度为1.25ng/mL、2.5ng/mL后使 用。

CHO-S细胞的细胞培养基本按以下的方法进行。培养机使用CO₂恒温槽，在5％的CO₂存在下以37℃进行培养。培养基使用CHO-S SFM 培养基(Invitrogen公司)。

EGFR#36克隆使用EGFR-Fc重组蛋白(R&D systems公司)，根 据利用ADLib体系的选择，离析产生抗EGFR IgM的克隆。

ADLib体系的文库是将曲古霉素A(和光纯药社)以每天最终浓度 为1.25ng/mL、2.5ng/mL的方式添加到培养基中并维持，从使用前日开 始用不含曲古霉素A的培养基进行培养。

2.对CHO-S细胞的EGFR、CD4基因的转染

利用Pyrobest聚合酶(Takara BIO公司)使用PCR由以下方法制 作EGFR的表达载体。将Human EGFR cDNA克隆(Open Biosystems 公司，Clone ID 30528231，Accession No.BC094761)作为模板，引物使 用NheI_EGFR-F、hEGFRcDNA-3’(BC094761)，扩增全长cDNA。反 应条件如下。95℃30秒后，将95℃30秒、58℃30秒、72℃3分钟进行 30循环后，在72℃反应8分钟。这里得到的Human EGFR cDNA通过 加入ExTaq(Takara BIO公司)并在72℃反应15分钟，从而添加了“A”， 利用DH5α株(Takara BIO公司)亚克隆到pGEM-T easy vector (Promega公司)(克隆1)。由于该克隆1缺少exon4，因此，利用 QuickGene RNA cultured cell kit S(FUJIFILM公司)，从A431细胞 提取总RNA，利用Superscript III first strand synthesis system (Invitrogen公司)，以50℃50分钟、85℃5分钟进行逆转录反应。将 所得first strand cDNA作为模板，用PCR进行cDNA合成，亚克隆到 pGEM-T easy vector。引物使用NheI_EGFR-F、 EGFR-R(NM_005228)。

该克隆(克隆2)含有Exon4，但由于其它序列具有大量的突变， 所以利用PCR，将克隆2的Exon4插入克隆1。利用引物hEGFR_ex4-5’ 和hEGFR_ex4-3’，由克隆2合成Exon4片段。将合成的Exon4片段和 克隆1混合的混合物作为模板，利用引物NheI_EGFR-F和 hEGFR_ex4-3’(用于克隆1.1的合成)、以及hEGFR_ex4-5’和 hEGFRcDNA-3’(BC094761)(用于克隆1.2的合成)，分别进行PCR。 将混合了所得PCR产物(克隆1.1和克隆1.2)的混合物作为模板，利 用引物NheI_EGFR-F和hEGFRcDNA-3’(BC094761)进行PCR，亚克 隆到pGEM-T easy vector(Promega公司)(克隆3)。序列的确认是利 用ABI公司ABIprism377序列分析仪来进行的。

将克隆3用HindIII剪切后，利用Klenow fragment(Takara BIO 公司)进行平滑化，进而利用NheI进行剪切，得到了插入片段。同样 将pIRESpuro3(Takara BIO公司)用EcoRI剪切后，进行平滑化后， 利用NheI进行剪切，得到载体片段。载体、插入片段均用Qiaquick  GelExtraction Kit(Qiagen公司)进行纯化后，利用 Ligation-Convenience Kit(NIPPON GENE公司)进行连接，转化到 DH5α株，得到pIRESpuro3EGFR表达载体。

(引物序列)

NheI_EGFR-F；TTGCTAGCCCAGTATTGATCGGGAGAGC(序 列号1)

hEGFRcDNA-3’(BC094761)；CAGGCTCGGTCATGTGTTTA(序 列号2)

EGFR-R(NM_005228)；GCACCTGTAAAATGCCCTGT(序列号3)

hEGFR_ex4-5’；GCCCATGAGAAATTTACAGGAAATC(序列号 4)

hEGFR_ex4-3’；CAGCTTGGATCACACTTTTGGCA(序列号5)

hEGFR_ex4-5’；GCCCATGAGAAATTTACAGGAAATC(序列号 6)

hEGFR_ex4-3’；CAGCTTGGATCACACTTTTGGCA(序列号7)

CD4的表达载体使用Miltenyi Biotech公司的MACselect  transfected cell selection试剂盒的pMACS4.1质粒。

转染是利用Cell Line Nucleofector Kit V(Amaxa biosystems公 司)，基本按照附加方案进行。回收1×10⁶个细胞并悬浮在100μL的PBS 中。在悬浮的液体中分别加入1μg的pIRESpuro3EGFR、pMACS4.1， 利用程序U-024进行转染，回收细胞，用CHO-S-SFM培养基培养16 小时。

3.利用表达EGFR和CD4的CHO-S细胞的ADLib文库中的抗 EGFR抗体表达细胞的选择

3-1.表达EGFR和CD4的CHO-S细胞与ADLib文库中的抗 EGFR抗体表达细胞的结合：

将表达EGFR和CD4的CHO-S细胞与ADLib文库中的1×10⁸细 胞悬浮于含有2％牛血清(invitrogen公司)的DMEM(invitrogen公 司)中，进行混合，在4℃一边振动1小时一边孵育，进行ADLib文库 中的抗EGFR抗体表达细胞的结合反应。孵育的细胞以120×g离心5 分钟进行回收，并悬浮于含有10％的鸟血清的MACS缓冲液(Miltenyi  Biotech公司)中。

3-2.利用MACS的抗EGFR表达DT40和EGFR、CD4共表达CHO 细胞结合体的浓缩：

基本按照Miltenyi Biotech公司的方案进行。在上述悬浮于MACS 缓冲液的细胞中加入抗CD4微珠200μL并混和，在冰上静置15分钟。 LS colomn(Miltenyi Biotech公司)先用含有10％鸟血清的MACS缓 冲液3mL进行平衡化。接着，在上述的细胞·微珠混合物中加入含有 10％鸟血清的MACS缓冲液1mL，使总量为2mL，并上柱。上柱3 次含有10％鸟血清的MACS缓冲液5mL，将非特异性地结合于柱的 细胞清洗而除去。然后，从磁架上卸下柱，利用不含有10％鸟血清的 MACS缓冲液5mL回收与CD4微珠结合的细胞。该操作重复2次。 回收的细胞用上述的DT40培养用的培养基培养一晚。

3-3.利用FACS解析确认抗EGFR表达DT40和EGFR、CD4共 表达CHO细胞结合体的浓缩：

将5×10⁵个3-2中培养一夜的细胞，在4℃下，以1100g离心5分 钟而进行回收，用FACS缓冲液(含有0.3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲 生理盐水)清洗1次后，用EGFR-Fc蛋白(R&D systems公司：用磷 酸缓冲生理盐水制成0.2μg/mL而使用)使细胞悬浮，在冰上静置20分 钟。此时，每隔10分钟进行轻叩以促进细胞的重悬。与上述同样地回 收细胞，用FACS缓冲液清洗2次后，用FITC结合抗人IgG抗体 (eBioscience公司，稀释200倍后使用)和PE结合抗鸟IgM抗体 (Beckmann courlter公司：200倍稀释后使用)使细胞悬浮，在冰上静 置20分钟。此时，每隔10分钟进行轻叩以促进细胞的重悬。与上述同 样地回收细胞，用FACS缓冲液清洗2次后，将细胞悬浮在含有1μg/mL 碘化丙啶的FACS缓冲液400μL中后提供给FACS解析，解析FITC和 PE两者为阳性的细胞(表达鸟IgM、抗EGFR抗体这两者的细胞)的 比例。FACS使用Cell Lab Quanta SP MPL(Beckmann coulter公司)， 使用Flowjo(Tree Star公司)作为解析软件。图2表示该实验结果的 一个例子。图2B是对不含有与EGFR反应的DT40克隆的细胞集团进 行该操作的情况，完全没有发现在四边形中表示的EGFR特异性的细胞 的浓缩。与此相对，将使用了ADLib文库细胞的实验结果示于图2A， 在四边形中发现了直到0.32％的细胞的浓缩，这表示正确地进行了该实 验。

4.抗鸟IgM抗体、EGFR Fc嵌合体阳性细胞的FACS分选和离析 的细胞的FACS解析

从文库中回收的细胞中，对在3-3的FACS解析中对抗鸟IgM抗体 和EGFR-Fc蛋白均显示阳性信号的细胞群(图2A中用四边形框围着 的部分)进行FACS分选。分选仪使用Beckmann coulter公司EPICS  Elite ESP。将图2的框内的细胞分配到装满了DT40用介质的96孔板 (Nunc公司)。将其培养约1周，从而形成来自1个细胞的集落。回收 了55个集落。对于这些，利用FACS解析进行关于抗EGFR抗体的表 达的确认。染色、解析方法按照3-2进行。其结果，对55个克隆中的 53个克隆看到了EGFR Fc嵌合体导致的染色，可以确认是产生针对 EGFR的抗体的克隆。将其中的1个克隆(克隆#33)示于图3A。对于 2个克隆没有看到抗EGFR的产生。将属于其的克隆之一(克隆#11) 示于图3B。

5.用于离析的克隆的特异性研究的ELISA解析

ELISA如下进行。

首先，对于4中离析的55克隆，将各1×10⁶细胞分别用1mL的、 不含鸟血清的DT40用培养基培养2天，使其产生IgM，回收其培养上 清。培养上清中的IgM浓度是利用Chicken IgM ELISA Quantification  Kit(BETHYL公司)，按照附加方案进行。ELISA解析是对各克隆以 1μg/mL的IgM浓度进行。

将EGFR-Fc以1μg/mL向96孔免疫板U-96Maxisorp(Nunc公 司)分别注入各100μL，并孵育一晚。应予说明，作为用于研究抗体的 特异性的对照，将人IgG、BSA也同样地固定在板上。次日，弃掉板的 内容物，加入封闭缓冲液(含0.5％脱脂牛奶的PBS)200μL，在室温 下孵育2小时。用ELISA清洗缓冲液(含0.05％Tween20的PBS)200μL 清洗3次。分别加入来自该抗EGFR表达候补克隆53克隆和CL18克 隆的培养上清各100μL，在室温下孵育1小时。用ELISA清洗缓冲液 200μL清洗5次后，加入将二次抗体(anti-chicken IgM-HRP：BETHYL 公司)用PBS稀释至5000倍的液体100μL，在室温下孵育45分钟。应 予说明，二次抗体使用anti-chicken IgM-HRP(BETHYL公司)。用 ELISA清洗缓冲液200μL清洗5次后，加入TMB+(Dako公司)100μL， 孵育10分钟。此后，用1N的硫酸100μL使反应停止，测定450nm的 吸光度，解析对EGFR产生特异性抗体的克隆的数量和编号。将针对克 隆#33、#11和非特异性的克隆(CL18M+)的结果分别表示在图4A、4B、 4C。由此明确了克隆#33产生的抗体是EGFR特异性的抗体。在其它的 52克隆的EGFR特异性克隆中也看到了同样的结果。

6.用于离析的克隆的特异性研究的FACS解析

为了进一步研究离析的克隆的特异性，利用已知高水平表达EGFR 的来自扁平上皮癌的细胞株A431细胞进行FACS解析。

A431的细胞培养基本上按照以下的方法进行。培养机使用CO₂恒 温槽，在5％的CO₂存在下以37℃进行培养。培养基使用DMEM培养 基(Invitrogen公司)，并加入10％牛血清、青霉素100单位/mL、链霉 素100μg/mL来使用。

FACS解析按照以下的要点来进行。每1个样品将5×10⁶个A431细 胞回收到1.5mL管中，用FACS缓冲液清洗1次。然后用5)中制备的 55个克隆的培养上清使细胞悬浮，在冰上放置20分钟。然后用FACS缓 冲液清洗2次，用FITC结合抗鸟IgM抗体(BETHYL公司，稀释至 1000倍而使用)悬浮，在冰上放置20分钟。然后用FACS缓冲液清洗 2次后，将细胞悬浮在含1μg/mL碘化丙啶的FACS缓冲液400μL中， 然后提供给FACS解析。使用的55个克隆的培养上清中，对A431细胞 显示结合的克隆的例子示于图5。FACS使用Cell Lab Quanta SC MPL (Beckmann coulter公司)，使用Flowjo(Tree Star公司)作为解析软 件。将其结果示于图5。将使用了克隆#33和#11的培养上清的实验表示 在图5A和5B，另外图5C表示使用了市售的抗EGFR抗体的结果。由 此，明确了克隆#33产生的抗体对A431细胞上的EGFR分子在生理条 件下进行反应。对于其它的52个克隆的EGFR特异性克隆也可以得到 相同的结果。作为阴性对照，代替A431细胞使用浮游系CHO细胞进 行同样的解析。

7.Claudin2表达载体制作和Claudin2稳定表达CHO细胞的制作

将相当于作为4次跨膜型蛋白质的人Claudin2基因的编码区域的序 列整合到pMC1neo载体(Stratagene公司)的多克隆位点，从而作为 Claudin2表达载体来构建pMC-CL2。

将其转染到CHO细胞，接着通过实施利用Geneticin(Invitrogen 公司)的试剂选择，确立CLCN2/CHO作为Claudin2稳定表达CHO 细胞。

8.使用了Claudin2一过性表达CHO-S细胞的选择

8-1.利用阴性选择的ADLib文库中的不需要抗体表达DT40的去 除：

使用Cell Line Nucleofector Kit V对CHO-S 1×10⁷细胞转染作为 CD4表达载体的pMACS4.1质粒2.5μg。重复该操作5次，回收细胞， 用CHO-S-SFM培养基培养16小时。接着，添加丝裂霉素C(Nacalai  Tesque公司)，使其终浓度为10μg/mL，进一步继续培养3小时。经过 丝裂霉素C处理，CHO-S细胞膜上的CD4的表达仍然得到维持，但细 胞的增殖被抑制。

回收丝裂霉素C处理后的细胞，使其与将针对作为活细胞的1×10⁷细胞的CD4表达CHO-S预先制备的生物素标记抗CD4鼠单克隆抗体 (BioLegend公司)固定化的链霉亲和素标记Dynabeads(Veritas公司) 5×10⁷个反应。将这样制备的结合有Dynabeads的CD4表达CHO-S总 量(1×10⁷细胞)悬浮于ADLib文库1×10⁸细胞中，并混合，一边在4℃ 振动30分钟一边进行孵育，使CD4表达CHO-S与ADLib文库中所含 的不需要抗体表达DT40反应。将反应结束后的细胞悬液安置在King  Fisher磁粒子处理器(Thermo Fisher Scientific公司)中，通过用磁石 吸附由作为磁珠的Dynabeads与细胞构成的复合体，去除ADLib文库 中所含的不需要抗体表达DT40(阴性选择)。将没有吸附的DT40细胞 集团作为用于下一步骤阳性选择的ADLib文库。

8-2.利用阳性选择的抗Claudin2抗体产生DT40的离析：

使用Cell Line Nucleofector Kit V对CHO-S 1×10⁷细胞共转染作为 CD4表达载体的pMACS4.1质粒2.5μg和作为Claudin2表达载体的 pMC-CL22.5μg。回收细胞，用CHO-S-SFM培养基培养16小时。接 着，添加丝裂霉素C(nacalai tesque公司)，使其终浓度为10μg/mL， 进一步继续培养3小时。经过丝裂霉素C处理，CHO-S细胞膜上的CD4 和Claudin2的表达仍然维持，而细胞的增殖被抑制。

回收丝裂霉素C处理后的细胞，使其与将针对作为活细胞的1×10⁶细胞的CD4和Claudin2共表达CHO-S预先制备的生物素标记抗CD4 鼠单克隆抗体(BioLegend公司)固定化的链霉亲和素标记Dynabeads (Veritas公司)5×10⁶个反应。对这样制备的结合有Dynabeads的CD4 和Claudin2共表达CHO-S总量(1×10⁶细胞)悬浮于实施了上述阴性 选择处理的ADLib文库(约1×10⁸细胞)中，并混合，一边在4℃振动 30分钟一边进行孵育，使CD4和Claudin2共表达CHO-S与ADLib 文库反应。

将反应结束后的细胞悬液安置在King Fisher磁粒子处理器 (Thermo Fisher Scientific公司)中，在清洗液中重复进行用磁石吸附 并解吸由作为磁珠的Dynabeads与细胞构成的复合体的步骤，从而清洗 除去非特异性地反应的DT40。将清洗后回收的细胞总量播入2块96孔 板，约10天后回收培养上清，通过细胞ELISA检查该培养上清中所含 抗Claudin2抗体的存在。

细胞ELISA按照以下的方法实施。准备将作为Cladin2稳定表达细 胞的CLDN2/CHO或未处理的CHO细胞以3×10⁴细胞/孔播种并在5％ 的CO₂存在下以37℃培养2天的板。除去该板的培养上清后，加入阳 性选择后的细胞培养上清100μL，在室温下反应1小时。用含0.05％ Tween20的PBS清洗孔，接着将稀释至10000倍的anti-chicken  IgM-HRP(BETHYL公司)100μL作为二次抗体进行反应。用含0.05％ Tween20的PBS清洗后，作为显色液加入TMB+(Dako公司)100μL， 孵育30分钟。此后，用1N的硫酸100μL使反应停止，通过测定450nm 的吸光度，检查阳性选择中回收的细胞培养上清中的抗Claudin2抗体 的存在。对播入了阳性选择回收后的细胞的2块96孔板进行检查的结 果，如图6所示，以高比例看到了与未处理的CHO不反应、与Claudin2 稳定表达细胞CLDN2/CHO特异性地反应的孔。图中，PC是将相当于 Claudin2的细胞外环(ル一プ)之一的合成肽作为抗原，通过ADLib 选择而确立的抗体，作为阳性对照使用。另外，NC是通过ADLib选择 确立的针对链霉亲和素的抗体，作为阴性对照使用。

以上证明了本发明不仅可以适用于1次跨膜型蛋白EGFR，而且还 可以适用于抗体获得困难的4次跨膜型蛋白的抗体制作。

产业上的利用可能性

本发明可以制作针对以往抗体获得困难的所需的跨膜蛋白的抗体， 并且，还可以提高获得对该跨膜蛋白的功能也带来影响的所谓的功能性 抗体的准确度，因此，在抗体制剂、抗体诊断试剂等领域，或者作为研 究上的工具能够广泛利用。