肽衍生物及其以结合物形式作为分子载体的应用

摘要

本发明涉及肽衍生物(肽和伪肽)及其作为目标分子的载体的应用。本发明还涉及结合物，其含有与目标分子结合的本发明的肽衍生物。本发明的肽和前体药物结合物可用于运载具有药物或诊断目的的分子例如治疗分子、成像或诊断药剂或分子探针跨过细胞膜，并显著促进它们跨过血脑屏障(BBB)的运输。

说明书

本发明涉及肽衍生物(肽和伪肽)及其作为目标分子的载体的应 用。本发明还涉及结合物(conjugates)，其含有与目标分子结合的本 发明的肽衍生物。本发明的肽和前体药物结合物可用于运载具有药物 或诊断重要性的分子例如治疗分子、成像或诊断药剂或分子探针跨过 细胞膜，并显著促进它们跨过血脑屏障(BBB)的运输。

发明背景

根据IMS Health，用于治疗中枢神经系统(CNS，脑和脊髓)病 变的药物的全球市场在2007年约为700亿美元，其中由药物递送技术 产生的产品占该量中的近90亿美元(Jain，2008，Jain PharmaBiotech  Report，Drug Delivery in CNS disorders)。因此，目前，CNS是三个最 大的治疗领域之一，其余两个是心血管医学和肿瘤学。尽管在全世界 患有CNS病症和病变的人数超过患有心血管疾病或癌症的人数，但神 经学仍是未充分开发的市场。这可以由下述事实解释，即98％的用于 治疗CNS病变的潜在药物不能跨过血脑屏障或BBB(Pardridge，2003， Mol.Interv.，3，90-105)。

事实上，存在两个重要的生理屏障系统保护脑抵抗可能有毒的物 质：BBB以及血-脑脊液屏障(BCSFB)。BBB被视为摄取血浆配体的 主要途径。它的表面积比BCSFB的大接近5000倍。构成BBB的血管 的总长度约为600km。每cm³的大脑皮层含有相当于1km的血管。BBB 的总面积据估计为20m²(De Boer等，2007，Clin.Pharmacokinet.，46(7)， 553-576)。因此，构成BBB的大脑内皮对于应用针对许多CNS病症 的可能药物构成了主要障碍，但是也为血液与神经组织之间的潜在交 换提供了巨大的表面。

一般来说，只有几种约450至600道尔顿的小亲脂性分子能够跨 过BBB(仅为药物候选物的2％)，也就是说从血液通向脑。许多在治 疗CNS病症的动物研究中显示出有希望的结果的药物候选物，其分子 量和尺寸相当大。因此，大多数分子例如治疗性肽或蛋白质，由于脑 的毛细血管内皮细胞(BCEC)对这些药物候选物的低通透性，一般不 能从血液通向/运输到脑。在血管中组织起来的BCEC被基底层、星形 胶质细胞终足、周细胞和小神经胶质和神经元细胞包围。内皮细胞与 星形胶质细胞终足的紧密联结造成了BBB对大多数分子不透性的发生 和维持，因此确保了血液与脑之间分子交换的严格有效的控制，以便 维持脑稳态。BCEC被紧密连接牢固束缚，与此相比，其他器官的其他 内皮细胞则是有孔的。因此，这些紧密连接阻止了跨过BBB的任何细 胞旁路运输。

在用于治疗脑病变的新疗法的开发中，特别是对于可能治疗CNS 病症的分子的使用来说，BBB被视为待克服的主要障碍(Neuwelt等， 2008，Lancet Neurol.，7，84-96)。

可能解释为什么对于重要脑病变(脑癌、帕金森氏(Parkinson) 病和阿兹海默氏(Alzheimer)病、中风/脑血管意外(CVA)等)来说 目前没有可用的有效疗法的原因之一，是用于治疗脑病变的药物候选 物的开发者们执行内部研究计划(脑药物发现计划)，而在穿过BBB 的问题和CNS、尤其是脑的倾向性靶向(脑药物靶向计划)中投资少 (Pardridge，2003，Mol.Interv.，3，90-105)。事实上，为了有最好的机 会变成用于治疗CNS病变或病症的药物，药物候选物必须服从某些结 构、物理化学、药物化学和药理学规则(Pajouhesh等，2005，NeuroRx， 2(4)，541-553)。在药物候选物的开发中，分子对其靶的选择性和特异 性(药理学情况)对于其治疗活性(功效疗效)是至关重要的。分子 的生物可利用性和潜在毒性(药物学情况)对于其作为药物的前景来 说是决定性的。换句话说，任何可能变成用于治疗CNS病变或病症的 药物的分子，必须移过BBB，维持其生物活性，并表现出适合的药物 动力学(PK)、吸收、分布、代谢和排泄/消除(ADME)和药效学(PD) 性质，以及低毒性(Tox)。因此，在CNS治疗领域中，对于药物化 学家来说，特别难以发现所开发分子的亲水/亲脂平衡。

因此，在CNS病症和病变治疗中的主要问题在于被给药的分子不 能穿过BBB，因此不能到达它们在CNS中的靶这一事实。构成BBB 的CNS的血管和毛细血管的内皮细胞，对于不能从血液通往神经组织 的分子来说是一种病症。事实上，这些内皮细胞以及围绕它们的星形 胶质细胞终足，既构成了尤其与内皮细胞之间紧密连接的存在相关的、 限制/阻止了通过细胞旁路途径的任何通过/运输的物理屏障，也构成了 生理屏障，因为这些细胞具有有效的外流系统，其限制了通过跨细胞 途径的任何通过/运输。因此，这些性质严重限制了物质从血液血浆通 向脑的细胞外空间。

事实上，一些能够穿过BBB的分子被多药物抗性(MDR)转运蛋 白从脑向血流主动排出/外排。这些主动外排转运(AET)系统一般控 制小分子从脑向血流的主动外排。BBB中的典型AET系统是ATP结 合盒(ABC)转运蛋白，即P-糖蛋白(P-gp)；但是，在BBB中还存 在其他AET系统，例如MDR相关蛋白1(MRP1)。主要位于脑毛细 血管内皮细胞的腔表面上的P-gp，是BBB的生理屏障功能中必不可少 的元件，所述生理屏障功能阻止大多数异生物质、但还有药物候选物 和能够在CNS中具有活性的其他治疗重要分子进入脑。

因此，在脑病症或病变的治疗、诊断或成像的分子的发现中，研 究的重点之一是找出增加活性物质通过BBB的效率的手段。

在这方面，目前被药物候选物的开发者们研究和使用、以使治疗 重要分子能够到达CNS的运载分子穿过BBB的策略，可以分成三种主 要策略(图1)(Pardridge，2007，Pharm.Res.，24(9)，1733-1744；De Boer 等，2007，Clin.Pharmacokinet.，46(7)，553-576；De Boer等，2007，Annu. Rev.Pharmacol.Toxicol.，47，327-355；Jones等，2007，Pharm.Res.，24(9)， 1759-1771)。

神经外科方法

神经外科方法可以通过活性物质在脑内的直接脑室内注射、脑内 注射或鞘内输注，或通过破坏BBB(暂时破坏BBB的完整性)来执行。

通过脑室内注射的神经外科方法的主要问题，除了与神经外科操 作相关的花费之外，还在于药物不是直接递送在脑实质中，而是在脑 脊液中。事实上，脑室内输注涉及将导管放置在脑室中(Aird，1984，Exp. Neurol.，86，342-358)。这种高度侵入性的技术对于将活性物质运输到 脑实质中不太有效。事实上，在药物通过脑室内输注进行递送的过程 中，从脑脊液到脑实质的体积流量由其传送(运输)的异常缓慢的扩 散所控制，因为脑不具有实质内体积流速。

同样，对于脑内注射来说，活性物质在脑中的扩散从注射位点到 病灶位点非常快地降低。事实上，活性物质的脑浓度在距其注射位点 500μm的距离处降低90％。

鞘内输注包括将置于脑内的导管与泵相连，所述泵以预定流速递 送活性物质。由于脑是唯一不具有通常用于将细胞外流体运回到总循 环的淋巴系统的器官这一事实，通过鞘内输注的活性物质在脑中的分 布非常缓慢。这降低了病灶位点处活性物质的浓度。

此外，在这样的神经外科操作过程中，尤其是由于导管的存在， 感染的风险是显著的。在这些情况下，患者的舒适性不佳。

暂时破坏BBB的不透性涉及短暂打开脑毛细血管内皮细胞的紧密 连接。其实例是使用血管活性物质例如白三烯或缓激肽(Baba等，1991， J.Cereb.Blood Flow Metab.，11，638-643)。这种策略同样是侵入性的， 并在使用镇静剂的对象/患者中需要到达颈动脉的动脉通路。暂时破坏 BBB的完整性所遇到的主要问题，除了与通向颈动脉的放射学操作相 关的费用之外，还在于BBB只保持开放短的时间段，因此限制了在较 长时期内递送药物的可能性。此外，暂时破坏BBB允许血浆蛋白进入 脑(而这些蛋白可能对脑有毒)，并且也能便于感染性因子的进入。 因此，这种类型的BBB破坏可能引起慢性神经病理性破坏，并伴有感 染的高风险(Salahuddin等，1988，Acta Neuropathol.，76，1-10)。

运载的药理学方法

用于运输分子的药理学策略包括通过在活性物质上添加脂类基团 而制成更亲脂性的分子的跨细胞扩散(跨细胞亲脂性扩散或TLD)或 使用脂质体(Zhou等，1992，J.Control.Release，19，459-486)，以及 经带正电荷的载体分子通过离子吸附或通过活性分子的阳离子化进行 运输(吸附介导的运输或AMT)。

添加脂类基团能够将亲水性分子化学转变成更亲脂性的分子，尤 其是通过前体药物方法。然而，这些化合物的合成产生的分子超过了 穿过BBB的最适运输阈值，尤其是在分子量方面，变得超过了450道 尔顿的最适限度(Pajouhesh等，2005，NeuroRx，2(4)，541-553)。出于 同样原因，脂质体或甚至小囊泡或纳米粒子(胶束、纳米球、纳米囊) 通常太大、对BBB不够特异，因此对于运输治疗重要分子(或成像或 诊断药剂，或任何其他分子例如分子探针)穿过BBB来说相对低效 (Levin，1980，J.Med.Chem.，23，682-684；Schackert等，1989，Selective  Cancer Ther.，5，73-79)。因此，脂质化技术(TLD)所遇到的主要问 题是它们特异性靶向和穿过BBB与其他细胞膜相比的特异性低，药物 的曲线下面积(AUC)的血浆值降低，以及它们通常限于用来运载小 分子。

在AMT方法中，遇到的主要问题是特异性靶向和穿过BBB与其 他细胞膜相比的特异性低。事实上，AMT是基于阳离子分子吸附在膜 带有负电荷的细胞上，而大多数细胞都带有负电荷。药物的AUC的血 浆值降低，它们通常限于用来运载小分子，并且它们的细胞毒性，是 使AMT运载方法处于不利境地的附加因素。

运载的生理学方法

基于生理学运载方法的策略包括利用BBB的各种天然运输机制。 这些将分子主动运输穿过BBB的机制，通过与特异性受体底物结合或 通过特异性受体底物的分子模拟(载体介导的运输或CMT)、或通过 与特异性靶向受体的配体的结合或融合(受体介导的运输或RMT)来 发挥作用。

例如，分子例如L-DOPA(帕金森氏病)、美法仑(脑癌)、α- 甲基-DOPA(高动脉压)和加巴喷丁(癫痫)通过CMT经大型中性氨 基酸转运蛋白(LAT1)进入脑(Pardridge，2003，Mol.Interv.，3，90-105)。 这些分子具有与LAT1的天然底物之一——苯丙氨酸接近的化学结构。 然而，通过CMT方法所遇到的主要问题是它们对紧密模仿/模拟内源受 体/运输蛋白的底物的结合物的选择性/特异性宽，因此它们的应用仍限 于运载小分子。

RMT要求受体依赖性运输系统。运载通过靶向脑毛细血管中存在 的内源受体/转运蛋白，经胞吞作用机制来进行。在参与RMT的各种人 类BBB受体中，值得注意的实例包括：转铁蛋白受体(TfR)，胰岛 素受体(IR)，能够运输胆固醇的低密度脂蛋白(LDL)受体、包括 LDL受体(LDLR)和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)家族的成员， 或胰岛素样生长因子受体(IGFR)，白喉毒素受体(DTR)或肝素结 合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)，以及清道夫受体(SCAV-R) 包括B类I型清道夫受体(SR-BI)。在RMT中，BBB内皮细胞膜上 的受体与它们的配体结合，其导致在细胞表面上形成的由受体/转运蛋 白及其配体构成的复合物在囊泡中胞吞，然后穿透BBB内皮细胞。配 体/受体复合物能够通过内皮细胞(转胞吞作用)，因此能够穿过BBB 在神经组织中起作用。该RMT过程不依赖于胞吞作用所吞食的分子的 大小。因此，RMT是能够将分子例如胰岛素、铁转运蛋白、胆固醇、 各种肽衍生物和蛋白等从血液运输到脑的机制。例如，转铁蛋白被用 作BBB上存在的TfR的配体载体(Jefferies等，1984，Nature，312， 162-163；Friden等，1983，Science，259，373-377；Friden，1994， Neurosurgery，35，294-298)，并且待运输的分子(活性物质)与转铁 蛋白(配体载体)相结合。尽管这种使用大分子的运载策略能够增加 目标结合物分子穿过BBB，但它具有几个缺点。首先，分子一般通过 基因表达方法(融合)与载体相连，从而将被运输分子的数量限制到 仅仅是多肽或蛋白。其次，用于连接分子与载体的系统相当复杂；传 统的化学或生物化学连接，从结构和分子的观点来看不能产生定义明 确的大分子系统

发明概述

本发明克服了这些缺点。本发明显示，可以设计出能够穿过细胞 膜、更具体来说穿过BBB运输的尺寸减小的肽或伪肽，具有高分子量 和/或大体积的物质。因此，本发明提出了新的肽、结合物和组合物， 其改进了目标分子的生物利用度，尤其是改进了它们对CNS的接近(靶 向)。

更具体来说，本发明人开发了能够结合人类LDLR的肽衍生物。 本发明人显示，这些衍生物能够穿过BBB。本发明人还显示，这些衍 生物能够在BBB细胞中运输治疗或诊断重要的分子。此外，本发明人 开发了能够结合LDLR而不与天然配体竞争、因此不干扰LDL运输的 肽。因此，这些肽衍生物代表了对于药物或诊断药剂的设计和运载、 尤其是到达CNS来说特别有利的新产品(载体)。

因此，本发明涉及包含天然和/或非天然氨基酸序列的肽或伪肽， 其特征在于含有最多30个氨基酸残基，并且与细胞膜表面的人类 LDLR结合。肽包含至少5个、优选至少6、7或8个氨基酸残基。在 优选实施方案中，本发明的肽也结合鼠类LDLR。在特别有利和优选的 方式中，本发明的肽具有穿过BBB以及可能穿过癌性或感染性细胞的 膜的能力。

本发明还涉及结合物，其包含与目标物质连接的例如上面定义的 肽或伪肽。正如将在下文中描述的，有利的连接是共价的，并可以被 执行成使得在穿过细胞膜后解离，以便在目标位点处释放目标物质。 根据连接的性质，物质可以例如被动地或在酶或给定生理条件的作用 下释放。

本发明还涉及例如上面所定义的结合物的制备方法/过程。

本发明还涉及包含本发明的结合物的药物或诊断组合物。

本发明还涉及例如上面所定义的肽或伪肽或结合物在制备药物或 诊断或成像药剂中的应用。

本发明还涉及用于改进或使分子能穿过BBB的方法，所述方法包 含将该分子与例如上面所定义的肽或伪肽相连。

本发明还涉及通过药物在对象中治疗病变的改进方法，所述改进 包括将该药物与例如上面定义的肽或伪肽相连。

本发明可用于任何哺乳动物、尤其是任何人类中。

附图描述

图1

显示了天然或药物分子穿过BBB的各种方式的图，根据Abbott  and Romero，1996，Mol.Med.Today，2(3)，106-113改编。

图2

载体/治疗重要分子的结合物的串联合成与通过连接物合成的比 较图。

图3

A-用于克隆hLDLR和mLDLR的质粒的图。

B-表示由转染细胞所表达的融合蛋白的图。

图4

在组成型表达hLDLR-GFP或GFP(对照)融合蛋白的CHO细胞 系上进行的Western印迹。使用抗hLDLR抗体检测到与hLDLR-GFP 融合蛋白的大小对应的190kDa的条带。

图5

稳定表达A-单独的GFP(对照)或B-hLDLR-GFP构建物、非通 透化的CHO细胞上的免疫细胞化学。细胞核用Hoechst染色(蓝色； A1和B1)。GFP荧光可看到是绿色的(A2和B2)，hLDLR的细胞 外结构域被抗hLDLR抗体染色的荧光可看到是红色的(A3和B3)， 红色与绿色染色的叠加可看到是黄色/橙色的(A4和B4)。注意只有 用hLDLR-GFP构建物稳定转染的细胞才表达膜受体(B3)。

图6

A-与DiI-LDL(红色)温育的表达hLDLR-GFP(绿色)的 CHO-hLDLR-GFP细胞系的细胞，红色与绿色染色的叠加可看到是黄 色/橙色的：注意细胞的强染色。

B-与DiI-LDL(红色)温育的表达hTfR-GFP(绿色)的 CHO-TfR-GFP细胞系的细胞：不存在DiI-LDL结合和胞吞作用。

C-与结合有德克萨斯红(红色)的转铁蛋白温育的表达 hLDLR-GFP(绿色)的CHO-hLDLR-GFP细胞系的细胞：不存在Tf 配体结合和胞吞作用。

注意在一方面是A、另一方面是B和C之间染色强度的差异，其 中只检测到与GFP融合的hTfr和hLDLR受体的染色。

图7

稳定表达A-单独的GFP(绿色)和B-hLDLR-GFP(绿色)、并 用表达对hLDLR具有亲和性的肽(SEQ ID NO：1)的细菌病毒的克隆 的抗病毒包膜蛋白抗体进行免疫染色的CHO细胞系(红点)。细胞核 用Hoechst染色(蓝色；A1和B1)。GFP荧光可看到是绿色的(A2 和B2)，细菌病毒的病毒包膜被病毒抗蛋白抗体染色的荧光可看到是 红色的(A3和B3)，红色与绿色染色的叠加可看到是黄色/橙色的(A4 和B4)。注意A中不表达hLDLR的细胞不与细菌病毒结合。

图8

通过免疫细胞化学比较对照细菌病毒(A-C)和表达对hLDLR具 有亲和性的肽(SEQ ID NO：1)的细菌病毒(B、D)在人类成纤维细 胞上(A-B)和猪脑微血管内皮细胞上(C-D)的结合。细菌病毒使用 抗病毒包膜蛋白抗体进行可视化。

图9

通过FACS评估CHO-hLDLR-GFP细胞与表达对hLDLR具有亲和 性的肽SEQ ID NO：11的细菌病毒克隆之间的相互作用，并与不表达对 该受体具有亲和性的肽的对照细菌病毒进行比较。Q2中细胞上的信号 显示了两种信号的组合，一方面如果hLDLR-GFP被表达(GFP荧光， 水平轴)，另一方面如果对该受体具有亲和性的细菌病毒通过它们所 表达的肽与细胞结合(免疫细胞化学染色，垂直轴)，则所述信号是 阳性的。

A-与抗病毒包膜蛋白抗体及其第二抗体APC温育的 CHO-hLDLR-GFP细胞。

B-与阴性对照细菌病毒、抗病毒包膜蛋白抗体及其第二抗体 APC温育的CHO-hLDLR-GFP细胞。

C-与表达对hLDLR具有亲和性的肽(SEQ ID NO：11)的细菌 病毒克隆、抗病毒包膜蛋白抗体及其第二抗体APC温育的 CHO-hLDLR-GFP细胞。在Q2中观察到显著的信号偏移。

图10

通过FACS评估人类成纤维细胞与表达对hLDLR具有亲和性的肽 SEQ ID NO：12的细菌病毒克隆之间的相互作用，并与不表达对该受体 具有亲和性的肽的对照细菌病毒进行比较。Q2中细胞上的信号显示了 两种信号的组合，一方面如果hLDLR被表达(免疫细胞化学染色，水 平轴)，另一方面如果对该受体具有亲和性的细菌病毒通过它们所表 达的肽与细胞结合(免疫细胞化学染色，垂直轴)，则所述信号是阳 性的。

A-与抗病毒包膜蛋白抗体及其第二抗体APC温育的人类成纤维 细胞。

B-与抗LDLR抗体及其第二抗体Alexa 488温育的人类成纤维细 胞。

C-与阴性对照细菌病毒、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体 以及第二抗体APC和Alexa 488温育的人类成纤维细胞。

D-与表达对hLDLR具有亲和性的肽SEQ ID NO：12的细菌病毒 克隆、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体以及第二抗体APC和Alexa 488温育的人类成纤维细胞。在Q2中观察到显著的信号偏移。

图11

通过FACS评估HUVEC与两种表达对hLDLR具有亲和性的 肽——一种环状(SEQ ID NO：11)、另一种线状(SEQ ID NO：21)肽 的细菌病毒克隆之间的相互作用，并与不表达对该受体具有亲和性的 肽的对照细菌病毒进行比较。

A-与抗病毒包膜蛋白抗体及其第二抗体APC温育的HUVEC。

B-与抗LDLR抗体及其第二抗体Alexa 488温育的HUVEC。

C-与阴性对照细菌病毒、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体 以及第二抗体APC和Alexa 488温育的HUVEC。

D-与表达对hLDLR具有亲和性的环状肽(SEQ ID NO：11)的 细菌病毒克隆、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体以及第二抗体APC 和Alexa 488温育的HUVEC。在Q2中观察到显著的信号偏移。

E-与表达对hLDLR具有亲和性的线状肽(SEQ ID NO：21)的 细菌病毒克隆、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体以及第二抗体APC 和Alexa 488温育的HUVEC。在Q2中观察到显著的信号偏移。

图12

通过FACS评估由细菌病毒表达的对LDLR具有亲和性的肽与其 天然配体LDL之间对HUVEC的竞争。

A-与抗病毒包膜蛋白抗体及其第二抗体APC温育的HUVEC。

B-与抗LDLR抗体及其第二抗体Alexa 488温育的HUVEC。

C-与阴性对照细菌病毒、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体 以及第二抗体APC和Alexa 488温育的HUVEC。

D-与阴性对照细菌病毒、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体、 LDL以及第二抗体APC和Alexa 488温育的HUVEC。由于存在LDL， 没有观察到效应。

E-与表达对hLDLR具有亲和性的线状肽(SEQ ID NO：21)的 细菌病毒克隆、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体以及第二抗体APC 和Alexa 488温育的HUVEC。

F-与表达对hLDLR具有亲和性的线状肽(SEQ ID NO：21)的 细菌病毒克隆、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体、LDL以及第二 抗体APC和Alexa 488温育的HUVEC。LDL极大降低由细菌病毒表达 的SEQ ID NO：21肽的结合。

G-与表达对hLDLR具有亲和性的环状肽(SEQ ID NO：11)的 细菌病毒克隆、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体以及第二抗体APC 和Alexa 488温育的HUVEC。

H-与表达对hLDLR具有亲和性的环状肽(SEQ ID NO：11)的 细菌病毒克隆、抗病毒包膜蛋白抗体、抗LDLR抗体、LDL以及第二 抗体APC和Alexa 488温育的HUVEC。由于存在LDL，没有观察到效 应。

I-显示了通过FACS获得的图A-H的Q2区中荧光信号的偏移百 分率的图。对于不表达对hLDLR具有亲和性的肽的对照细菌病毒来说， 在Q2中没有检测到偏移。对于表达肽SEQ ID NO：21的细菌病毒来说， 在Q2中信号偏移了55.8％以上，表明了由这些细菌病毒表达的肽对 HUVEC hLDLR的亲和性。加入LDL导致在对照细菌病毒中Q2中的 信号损失85％，表明了对应于肽序列SEQ ID NO：21的细菌病毒与LDL 之间在LDL与hLDLR结合的位点处的竞争。加入LDL仅仅使表达肽 SEQ ID NO：11的细菌病毒的Q2中同样强的信号(与对照细菌病毒相 比偏移超过70％)轻微偏移(17％)。

图13

在C57BL6小鼠尾静脉注射对照细菌病毒(A-B)和表达对hLDLR 和mLDLR具有亲和性的肽(SEQ ID NO：1)的细菌病毒(C-D)后2 小时，小鼠脑的冷冻切片的双重免疫荧光染色。脑血管用抗小鼠IgG 抗体染成绿色(A-C)；细菌病毒用抗病毒包膜蛋白抗体染成红色(B-D)。

图14

具有C-端(C-term)间隔物/连接物、与罗丹明或S-Tag结合的合 成肽的总设计图。

图15

通过荧光和免疫细胞化学评估对hLDLR具有亲和性的肽(A中的 SEQ ID NO：1/罗丹明，以及C中的SEQ ID NO：2/S-Tag)与对照肽(B) 相比在CHO-hLDLR-GFP细胞系的细胞上的结合和胞吞作用。GFP荧 光可观察到是绿色的(A1、B1和C1)；与肽相关的荧光，通过罗丹 明或通过与偶联有Alexa594的抗S-Tag抗体结合进行可视化，可观察 到是红色的(A2、B2和C2)，红色与绿色染色的叠加可观察到是黄 色/橙色的(A3、B3和C3)。注意A2中的肽SEQ ID NO：1/罗丹明和 C2中的SEQ ID NO：2/S-Tag的高水平的细胞内红色染色，以及 hLDLR-GFP染色(绿色，A1、C1)与结合的或通过胞吞作用内化的肽 的叠加(A2、C2)。

图16

肽SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：2以及对照肽分别在 CHO-hLDLR-RFP细胞系(A-B)和人类成纤维细胞(C-D)上的结合 速率(A-C)和胞吞作用(B-D)的定量。

图17

CHO-hLDLR-GFP细胞与结合有S-Tag的对hLDLR具有亲和性的 肽SEQ ID NO：11之间的相互作用的免疫细胞化学评估，并与也结合有 S-Tag的对照肽进行比较。Q2中的信号显示了两种信号的组合，一方 面如果hLDLR-GFP被表达(GFP荧光，水平轴)，另一方面如果对照 肽和对该受体具有亲和性的肽SEQ ID NO：11结合到细胞上(免疫细胞 化学染色，垂直轴)，则所述信号是阳性的。

A-与第二抗体APC温育的细胞。

B-与结合有S-Tag的对照肽、抗S-Tag抗体和第二抗体APC温 育的细胞。

C-与结合有S-Tag的对LDLR具有亲和性的肽SEQ ID NO：11、 抗S-Tag抗体和第二抗体APC温育的细胞。在Q2中观察到了显著的 信号偏移。

图18

在体外BBB模型中，通过与萤光黄(LY，荧光分析)共温育， 并分析在不存在或存在都与罗丹明结合的对照肽和肽SEQ ID NO：1的 情况下LY的通过速率随着时间的变化，评估肽对内皮细胞屏障的毒 性。

图19

都与罗丹明结合的对照肽和肽SEQ ID NO：1与体外BBB模型的 内皮细胞结合和/或在这些细胞中内化的速率的裂解后细胞和荧光分析 的评估。

图20

都与罗丹明结合的对照肽和肽SEQ ID NO：1穿过体外BBB模型的 内皮细胞的通过速率(穿透性，Pe)的荧光评估。使用LY Pe测量值验 证体外BBB模型的完整性。

发明详述

本发明涉及能够结合人类LDLR的肽衍生物及其在药物领域的应 用，尤其是在BBB细胞中运输治疗或诊断重要分子的应用。

人类LDLR是839个氨基酸的跨膜蛋白，其包含三个区：细胞外 区(1-768)、跨膜区(768-790)和细胞质区(790-839)。细胞外区 分成两个亚区：LDL结合区(1-322)和LDL结合区外部的区域(322-768) (参见WO2007/014992)。

脑的正常功能非常需要LDL。LDLR的天然配体是LDL，更具体 来说是LDL粒子的载脂蛋白B(ApoB)和载脂蛋白E(ApoE)组分， 因此能够将这些粒子中包含的胆固醇跨过细胞膜、更具体来说跨过 BBB运输。

因此，已经显示LDLR能够通过RMT方法，在阻止与溶酶体融合 的特殊内体囊泡中进行LDL粒子穿过BBB的转胞吞作用(Dehouck等， 1997，J.Cell Biol.，138(4)，877-889)。然后这些已经通过转胞吞作用穿 过BBB的脂蛋白被神经元和/或星形胶质细胞摄取(Spencer等，2007， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104(18)，7594-7599)。这种性质曾用于通过 其上结合有完整载脂蛋白(LDL组分)的纳米粒子来运载治疗目的分 子(Kreuter等，2007，J.Control.Release，118，54-58)。然而，在该研 究中使用了完整载脂蛋白，并采用与纳米粒子连接的形式以模拟LDL 粒子结构。

本发明第一次显示了设计能够结合LDLR并穿过BBB的小肽的可 能性。本发明与现有技术的策略相比提供了许多优点，这些优点尤其 是通过选择受体和设计策略以及肽的性质而得到的。本发明显示，这 些肽或伪肽对于某些细胞膜具有选择性，并可用于递送小的化学分子 (不论是否亲脂)以及大分子例如治疗目的蛋白质。肽或伪肽载体能 够容易地化学合成，并且大多数治疗目的分子或成像或诊断药剂能够 简单高效地与肽或伪肽载体相连，这种连接通过经间隔物的前体药物 策略(通过连接物合成)或通过两种实体之间的直接连接(串联合成) 来实现(图2)。本发明的肽和伪肽可以被设计成采用环状构型，从而 对蛋白水解作用更有抗性。此外，本发明的肽和伪肽可以设计成结合 LDLR而不与天然配体竞争。事实上，本发明导致发现了LDLR上与 LDL结合位点不同的新的结合位点。结果，使用靶向该位点的本发明 的肽和伪肽能够进行有效运输，同时基本上不破坏天然配体的结合。

在本发明的范围内进行的研究能够使本申请人显示，由本申请人 开发的线状或环状肽或伪肽，能够在神经病变以及脑或其他组织/器官 的感染性或癌性病变的治疗、成像和/或诊断中，用作治疗目的分子的 载体、或成像或诊断药剂的载体、或任何其他分子例如分子探针的载 体。

本发明中描述的线状或环状肽或伪肽，具有靶向细胞受体/转运蛋 白和特定细胞类型和/或穿过细胞膜、尤其是脑的生理屏障、更具体为 BBB或血液-视网膜屏障(BRB)的细胞膜的能力。

本发明中描述的线状或环状肽或伪肽，具有靶向细胞受体/转运蛋 白和特定细胞类型尤其是癌细胞、神经或非神经组织和/或穿过细胞膜、 尤其是CNS的生理屏障、更具体为神经组织肿瘤的血液-肿瘤屏障 (BTB)的细胞膜的能力。

本发明中描述的线状或环状肽或伪肽，具有靶向细胞受体/转运蛋 白和特定细胞类型和/或穿过细胞膜、尤其是CNS的生理屏障的细胞 膜，以治疗更具体来说感染性脑病变或其他细菌、病毒、寄生虫或真 菌性质的病变的能力。

本发明中描述的线状或环状肽或伪肽，具有与鼠类或人类细胞膜 LDLR结合、并通过转胞吞作用经该受体穿过上述膜的能力。

本发明中描述的线状或环状肽或伪肽，具有与鼠类和人类脑的生 理屏障的细胞膜表面处的LDLR结合、并通过RMT经LDLR穿过上述 生理屏障的能力。

因此，更具体来说，本发明涉及对LDLR具有亲和性的肽和伪肽， 及其作为治疗目的分子的载体、或成像或诊断药剂的载体、或任何其 他分子例如分子探针的载体的应用。这样的肽可用于许多指征，尤其 是神经病变和脑或其他组织/器官的感染性或癌性病变的治疗、成像和/ 或诊断。

因此，本发明涉及包含天然和/或非天然氨基酸序列的肽或伪肽， 其特征在于含有最多30个、优选最多25个氨基酸残基，并且与细胞 膜表面的人类LDLR结合。在本发明的情形中，术语“肽”或“伪肽” 是指包含氨基酸残基链/序列的分子，所述氨基酸残基可以是天然或非 天然的，任选被修饰或官能化，并通过肽、非肽或修饰的肽键连接在 一起。肽可以是环状或非环状的，并且如果需要，可以具有一个或多 个被保护的末端(N-和/或C-端)。

更具体来说，本发明涉及例如上面所定义的肽或伪肽，其特征在 于它具有穿过BBB的能力。

在第一个实施方案中，本发明的肽或伪肽具有下面的通式(I)：

X-M-P-R-Y    (I)

其中：

-X是包含1至11个连续的天然和/或非天然氨基酸的基团，

-Y是包含1至11个连续的天然和/或非天然氨基酸的基团，

-X和/或Y含有至少一个能够在肽内形成环的氨基酸残基，

-M表示甲硫氨酸或其等构物或其类似物，

-P表示脯氨酸或其等构物或其类似物，

-R表示精氨酸或其等构物或其类似物，

并且其中氨基酸残基的总数小于或等于25。

有利的是，在式(I)的肽或伪肽中，X是式(Xaa)_iZ(Xaa)_j的基团， Y是式(Xaa)_kW(Xaa)_l的基团，其中Xaa表示天然或非天然氨基酸，包 括D-构型的氨基酸、非编码氨基酸或含有拟肽键的氨基酸，Z和W表 示能够使肽环化的两个相同或不同的氨基酸，并且i、j、k和l是0至 5之间的相同或不同的整数。

本发明尤其源自于通过肽配体序列的比较策略而鉴定到的确保 LDLR结合和运输但不与天然配体竞争的基序。不存在与天然配体的竞 争显示出由本发明人发现的结合基序包含在LDLR上的新结合位点， 其构成了体内运载化合物的背景中出人意料和特别有利的发现。

组成本发明的肽或伪肽的X和Y基团的天然或非天然氨基酸可以 是相同或不同的，并可以选自：

-甘氨酸(Gly，G)或2-氨基乙醇酸、肌氨酸(Sar)或N-甲 基甘氨酸(MeGly)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、烯丙基甘氨酸(allylGly) 或2-氨基戊-4-烯酸、2-环戊基甘氨酸(Cpg)、2-环己基甘氨酸(Chg)、 2，2-二丙基甘氨酸(Dpg)、2-(3-吲哚基)甘氨酸(IndGly)、2-茚满基 甘氨酸(Igl)、2-新戊基甘氨酸(NptGly)、2-辛基甘氨酸(OctGly)、 2-丙炔基甘氨酸(Pra)或2-氨基戊-4-炔酸、2-苯基甘氨酸(Phg)、2-(4- 氯苯基)甘氨酸、氮杂甘氨酸(AzGly)、甘氨醇或2-氨基乙醇，

-丙氨酸(Ala，A)或2-氨基丙酸、β-丙氨酸(β-Ala)或3-氨 基丙酸、脱氢丙氨酸、N-甲基丙氨酸、3-环丙基丙氨酸(Cpa)、3-环 己基丙氨酸(Cha)、3-环戊基丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸(1Nal)、3-(2- 萘基)丙氨酸(2Nal)、3-(3-吡啶基)丙氨酸、3-(2-噻吩基)丙氨酸(Thi)、 丙氨醇或2-氨基丙醇，

-缬氨酸(Val，V)或2-氨基-3-甲基丁酸、N-甲基缬氨酸 (MeVal)、正缬氨酸(Nva)及其甲基化和/或羟基化衍生物、5-羟基 正缬氨酸(Hnv)及其衍生物、3-巯基缬氨酸(青霉胺，Pen)、缬氨 醇或2-氨基-3-甲基丁醇，

-亮氨酸(Leu，L)或2-氨基-4-甲基戊酸、正亮氨酸(Nle)或 2-氨基己酸、3-羟基亮氨酸、6-羟基正亮氨酸、叔亮氨酸(Tle)或2- 氨基-3，3-二甲基丁酸、高亮氨酸或3-氨基-5-甲基己酸、2，3-脱氢亮氨酸、 亮氨醇或2-氨基-4-甲基戊醇，

-异亮氨酸(Ile，I)或2-氨基-3-甲基戊酸、别异亮氨酸(alle 或Allo-Ile)、N-甲基异亮氨酸(Melle)、异亮氨醇或2-氨基-3-甲基 戊醇，

-天冬氨酸(Asp，D)或2-氨基丁二酸及其侧链酯化或酰胺化 的衍生物、3-甲基天冬氨酸、天冬氨醇，

-天冬酰胺(Asn，N)或2-氨基-3-氨甲酰基丙酸或2-氨基琥珀 酰胺酸及其N-取代的衍生物、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、天冬酰胺醇，

-谷氨酸(Glu，E)或2-氨基戊二酸及其侧链酯化或酰胺化的衍 生物、焦谷氨酸(Pyr)或氧脯氨酸或5-氧脯氨酸、γ-羧基谷氨酸或4- 羧基谷氨酸(Gla)、谷氨醇，

-谷氨酰胺(Gln，Q)或2-氨基-4-氨甲酰基丁酸及其N-取代的 衍生物、谷氨酰胺醇，

-二氨基乙醇酸、2，3-二氨基丙酸(Dpr或Dap)、3-巯基丙酸 (Mpa)、2-氨基-3-胍基丙酸(Agp)、2-氨基丁酸(Abu)、4-氨基丁 酸(4Abu)或GABA、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(bAib)、 2，4-二氨基丁酸(Dab)、3，4-二氨基丁酸(Dbu)、2-氨基-4-氰基丁酸 (Cba)、2-氨基-4-胍基丁酸(Agb)、5-氨基戊酸(Ava)、4-氨基-3- 羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、 6-氨基己酸(Acp或Ahx)、对氨基苯甲酸(PABA)、间氨基甲基苯 甲酸或3-氨基甲基苯甲酸、对氨基甲基苯甲酸(PAMBA)或4-氨基甲 基苯甲酸、2-氨基己二酸(Aad)或2-氨基己烷二酸、3-氨基己二酸 (bAad)或3-氨基己烷二酸、2-氨基庚二酸(Apm)或2-氨基-庚烷二 酸(Ahe)、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸或抑胃酶氨酸(Sta)、2，2-二氨 基庚二酸(Dpm)或2，2-二氨基-庚烷二酸、锁链素(Des)或2-氨基 -6-[4-(4-氨基-4-羧基丁基)-3，5-双-(3-氨基-3-羧基丙基)-吡啶-1-基]己酸、 异锁链素(Ide)或2-氨基-6-[2-(4-氨基-4-羧基丁基)-3，5-双-(3-氨基-3- 羧基丙基)-吡啶-1-基]己酸，

-鸟氨酸(Orn)或2，5-二氨基戊酸及其ε-胺化或酰胺化衍生物、 副刀豆氨酸或2-氨基-4-(氨基氧基)丁酸、鸟氨醇，

-赖氨酸(Lys，K)或2，6-二氨基己酸及其ε-胺化或酰胺化衍 生物、高赖氨酸或2，7-二氨基庚酸(hLys)、5-羟基赖氨酸(Hyl)或 2，6-二氨基-5-羟基己酸、别羟基赖氨酸(aHyl)、6-N-甲基赖氨酸 (MeLys)、S-氨基乙基半胱氨酸或2-氨基-3-(2-氨基乙基硫代)丙酸，3- 甲基-S-氨基乙基半胱氨酸或2-氨基-3-(2-氨基乙基硫代)丁酸、赖氨醇，

-精氨酸(Arg，R)或2-氨基-5-胍基戊酸或2-氨基-5-(二氨基 亚甲基氨基)戊酸、高精氨酸或2-氨基-6-胍基己酸、N-羟基精氨酸、 瓜氨酸(Cit)或2-氨基-5-(氨甲酰基氨基)戊酸、2-氨基-5-(4-甲脒基苯 基)戊酸、2-氨基-5-(1H-咪唑-2-基氨基)戊酸、刀豆氨酸或2-氨基-4-(胍 基氧基)丁酸、精氨醇，

-组氨酸(His，H)或2-氨基-3-(1H-咪唑-4-基)丙酸及其N-取 代的衍生物、组氨醇，

-丝氨酸(Ser，S)或2-氨基-3-羟基丙酸及其O-取代的衍生物 (醚等)、2-氨基-4-羟基丁酸或高丝氨酸(Hse)及其O-取代的衍生物 (醚等)、丝氨醇或2-氨基-丙-1，3-二醇，

-苏氨酸(Thr，T)或2-氨基-3-羟基丁酸及其O-取代的衍生物 (醚等)、别苏氨酸(allo-Thr)及其O-取代的衍生物(醚等)、苏氨 醇(Thol)，

-苯丙氨酸(Phe，F)或2-氨基-3-苯基丙酸、2-氟苯丙氨酸、3- 氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3，4-二氟苯丙氨酸、五氟苯丙氨酸、2-氯 苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、4-溴苯 丙氨酸、3-碘苯丙氨酸，4-碘苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、2-甲氧基苯丙 氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-胍基 苯丙氨酸、3，4-二羟基苯丙氨酸或DOPA、2-氨基-4-苯基丁酸或高苯丙 氨酸、4-联苯基丙氨酸(Bip)、4-苯甲基苯丙氨酸(Bpa)、苯丙氨醇 (Phol)，

-酪氨酸(Tyr，Y)或2-氨基-3-(对羟基苯基)丙酸及其O-取代 的衍生物(醚等)、3-碘酪氨酸、3，5-二碘酪氨酸、2-溴酪氨酸、3，5- 二溴酪氨酸、2，6-二甲基酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3-磺基酪氨酸、酪氨 醇或2-氨基-4-羟基苯丙醇，

-色氨酸(Trp，W)或2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸及其N-取 代的衍生物、2-甲基色氨酸、5-羟基色氨酸(5-HTP)、色氨醇，

-半胱氨酸(Cys，C)或2-氨基-3-巯基丙酸及其S-取代的衍生 物、S-乙酰半胱氨酸或2-氨基-3-(乙酰硫代)丙酸、硒代半胱氨酸(Sec， U)或2-氨基-3-(硒代)丙酸、半胱氨醇，

-甲硫氨酸(Met或M)或2-氨基-4-(甲基硫代)丁酸、高甲硫 氨酸或3-氨基-5-(甲基硫代)戊酸、甲硫氨醇，

-脯氨酸(Pro，P)或吡咯烷-2-羧酸、高脯氨酸或2-(2-吡咯烷 基)乙醇酸、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、3-甲基 脯氨酸，3，4-脱氢脯氨酸、3，4-甲醇基脯氨酸、4-氨基脯氨酸、4-氧代脯 氨酸、硫代脯氨酸或噻唑烷-4-羧酸(Thz)、2-氧代噻唑烷-4-羧酸、二 氢吲哚-2-羧酸(Idc)、哌啶酸(Pip)或哌啶-2-羧酸、3-哌啶甲酸(Nip) 或哌啶-3-羧酸、4-氧代哌啶酸、4-羟基哌啶酸、氨基-1-环己烷羧酸、 脯氨醇。

正如所指出的，肽包含能够使所述肽环化的至少一个氨基酸残基、 优选两个氨基酸残基是优选的。这样的氨基酸典型地选自Cys、Mpa、 Pen、脱氢丙氨酸或allylGly。

环化典型地通过在两个半胱氨酸(或Pen)残基之间形成二硫桥 来获得，所述两个残基一个在基团X中，另一个在基团Y中。此外， 对于通过二硫桥的环化来说，在N-端(N-term)位置中的半胱氨酸可 以被Mpa取代。

对于通过羊毛硫氨酸桥的环化来说，半胱氨酸残基也可以被脱氢 丙氨酸取代，或者对于通过二卡巴(dicarba)桥经置换进行的环化来说， 可以被allylGly取代。

在Glu(或Asp)残基的侧链酸官能团与Lys上的侧链胺官能团或 N-端胺之间，可以产生内酰胺桥。同样地，N-端胺官能团与C-端或或 C-term酸官能团之间(头/尾)的环化可以通过酰胺键进行，正如同Lys 的侧链胺官能团与肽的C-端酸官能团之间的环化。

优选，在式(I)的肽或伪肽中，基团X和Y中的至少一个含有 半胱氨酸残基。

在特别优选的实施方案中，残基Z和W各自表示半胱氨酸。

正如所指出的，M表示甲硫氨酸残基或其等构物或其类似物。甲 硫氨酸等构物或类似物优选选自Nle、高甲硫氨酸、Pen和Mpa。

正如所指出的，P表示脯氨酸残基或其等构物或其类似物。脯氨 酸等构物或类似物优选选自环戊烯等构物、3，4-脱氢脯氨酸、3，4-甲醇 基脯氨酸、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、3-甲基脯氨酸、4-氨基脯氨酸、 4-氧代脯氨酸、Thz、2-氧代噻唑烷-4-羧酸、Idc、Pip、Nip、4-氧代哌 啶酸、4-羟基哌啶酸和氨基-1-环己烷羧酸。

正如所指出的，R表示精氨酸残基或其等构物或其类似物。精氨 酸等构物或类似物优选选自高精氨酸、N-羟基精氨酸、Agp、Agb、Cit、 2-氨基-5-(4-甲脒基苯基)戊酸、2-氨基-5-(1H-咪唑-2-基氨基)戊酸、Orn、 Lys及其等构物/类似物、S-氨基乙基半胱氨酸、3-甲基-S-氨基乙基半 胱氨酸、hLys、Hyl、aHyl、MeLys、His及其等构物/类似物、Nle、二 氨基乙醇酸、Dpr和Dbu。

在特别优选的式(I)的肽或伪肽中：

-i是选自0、1、3或4的整数；和/或

-j是选自0、3或4的整数；和/或

-k是选自0、1或3的整数；和/或

-l是选自0、1或3的整数。

在本发明的情形中，优选的肽或伪肽具有通式 (Xaa)_i-Cys-(Xaa)_j-Met-Pro-Arg-(Xaa)_k-Cys-(Xaa)_l，其中Xaa表示任何天 然或非天然氨基酸残基，i、j、k和l是0至5之间的相同或不同的整 数。优选，i＝0、1、3或4；j＝0、3或4；k＝0、1或3；和/或l＝0、 1或3。

式(I)的本发明肽的具体实例描述在如下的序列SEQ ID NO：1 到SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：30到SEQ ID NO：65中；

SEQ ID NO：1，HLDCMPRGCFRN；

SEQ ID NO：2，ACQVKSMPRC；

SEQ ID NO：3，ACTTPMPRLC；

SEQ ID NO：4，ACKAPQMPRC；

SEQ ID NO：5，ACLNPSMPRC；

SEQ ID NO：6，ACLVSSMPRC；

SEQ ID NO：7，ACLQPMPRLC；

SEQ ID NO：8，ACPVSSMPRC；

SEQ ID NO：9，ACQSPMPRLC；

SEQ ID NO：10，ACLTPMPRLC；

SEQ ID NO：11，DSGLCMPRLRGCDPR；

SEQ ID NO：30，ACMPRLRGCA；

SEQ ID NO：31，ASGLCMPRLRGCDPR；

SEQ ID NO：32，DAGLCMPRLRGCDPR；

SEQ ID NO：33，DSALCMPRLRGCDPR；

SEQ ID NO：34，DSGACMPRLRGCDPR；

SEQ ID NO：35，DSGLCMPRARGCDPR；

SEQ ID NO：36，DSGLCMPRLAGCDPR；

SEQ ID NO：37，DSGLCMPRLRACDPR；

SEQ ID NO：38，DSGLCMPRLRGCAPR；

SEQ ID NO：39，DSGLCMPRLRGCDAR；

SEQ ID NO：40，DSGLCMPRLRGCDPA；

SEQ ID NO：41，SGLCMPRLRGCDPR；

SEQ ID NO：42，GLCMPRLRGCDPR；

SEQ ID NO：43，CMPRLRGC；

SEQ ID NO：44，CMPRARGC；

SEQ ID NO：45，CMPRLAGC；

SEQ ID NO：46，CMPRLRAC；

SEQ ID NO：47，CMPRLKGC；

SEQ ID NO：48，(D)-CMPRLRGC；

SEQ ID NO：49，CMPR-(D)-LRGC；

SEQ ID NO：50，CMPRL-(D)-RGC；

SEQ ID NO：51，CMPRLRG-(D)-C；

SEQ ID NO：52，(D)-CMPRLRG-(D)-C；

SEQ ID NO：53，(D)-CMPRLRSarC；

SEQ ID NO：54，(D)-CMPRKRGC；

SEQ ID NO：55，(D)-CMPRLRCG；

SEQ ID NO：56，(D)-CMPRLCRG；

SEQ ID NO：57，(D)-CMPRCLRG；

SEQ ID NO：58，CMPRGC；

SEQ ID NO：59，PenMPRLRGC；

SEQ ID NO：60，(D)-PenMPRLRGC；

SEQ ID NO：61，(D)-CMPRLRGPen；

SEQ ID NO：62，PenMPRLRGPen；

SEQ ID NO：63，(D)-PenMPRLRGPen；

SEQ ID NO：64，(D)-PenMPRLRG-(D)-Pen；

SEQ ID NO：65，MpaMPRLRGC.

正如在实验部分中所说明的，这些肽不与LDL竞争结合LDLR， 表现出高亲和性，而且能够穿过BBB并运输目标分子。

在特别优选实施方案中，具有环状构型的式(I)的肽是优选的。 包含序列SEQ ID NO：11或从其衍生的序列例如SEQ ID NO：30或SEQ  ID NO：48的肽，是特别优选的。

根据另一个实施方案，本发明的肽或伪肽选自如下序列SEQ ID  NO：12到SEQ ID NO：29的肽：

SEQ ID NO：12，MTVMPTGLWNPLIPS；

SEQ ID NO：13，SASWFAVPIPPLRLE；

SEQ ID NO：14，MTPMSTPRMLPVYVA；

SEQ ID NO：15，MTATHLSTLFQPLTY；

SEQ ID NO：16，MSPIPPAASTWANTL；

SEQ ID NO：17，MTANPLQNAPGPLSL；

SEQ ID NO：18，MQTAPPPPLTRVQWS；

SEQ ID NO：19，GTPRMHIPLNVDHLP；

SEQ ID NO：20，LTLPPISGLSSYPLP；

SEQ ID NO：21，TPSAHAMALQSLSVG；

SEQ ID NO：22，LTLPPISGLSSYPLP；

SEQ ID NO：23，MGTLNAPTAYPQDSL；

SEQ ID NO：24，LTNPPAYLPQNTDPH；

SEQ ID NO：25，MGLPLPYIQTILHTP；

SEQ ID NO：26，SAALIAMSSFKSITA；

SEQ ID NO：27，SGFAFARSVPTESRR；

SEQ ID NO：28，MTSPYMSLPPSTDDM；

SEQ ID NO：29，LTNPPAYLPQNTDPH。

正如上面指出的，本发明的线状或环状肽或伪肽包含肽、非肽和/ 或修饰的肽键。在优选实施方案中，肽或伪肽包含至少一个模拟肽键， 其优选选自嵌入的亚甲基(-CH₂-)或磷酸(-PO₂-)基团、仲胺(-NH-) 或氧(-O-)、α-氮杂肽、α-烷基肽、N-烷基肽、烷基磷酰胺 (phosphonamidates)、酯肽、羟基亚甲基、羟基亚乙基、二羟基亚乙 基、羟乙胺、反向-翻转(retro-inverso)肽、亚甲基氧基、鲸蜡亚甲基 (cetomethylene)、酯、亚膦酸酯、次磷酸(phosphinics)、磷酰胺和 卡巴类似物。

此外，在特定实施方案中，本发明的肽或伪肽包含分别受到例如 酰化和/或酰胺化或酯化保护的N-端和/或C-端官能团。

本发明的肽或伪肽可以通过本技术领域的专业人员已知的任何技 术来合成(化学、生物或遗传合成等)。它们可以原样保存，或可以 在目标物质或任何可接受的赋形剂的存在下进行配制。

对于化学合成来说，使用商业化设备，其能够掺入天然以及非天 然氨基酸、例如D-对映异构体和侧链具有与它们的天然同源物不同的 疏水性和空间位阻的残基(所谓的外来、即非编码氨基酸)，或含有 一个或多个拟肽键的肽序列，所述模拟肽键可以包括尤其是嵌入的亚 甲基(-CH₂-)或磷酸(-PO₂-)基团、仲胺(-NH-)或氧(-O-)。

在合成过程中，可以引入各种化学修饰，例如在N-端或C-端位置 中或在侧链上连接脂(或磷脂)衍生物或纳米粒子的组成成分，以便 能够将本发明的肽或伪肽并入脂质膜内，例如由一个或多个脂质层或 双层构成的脂质体的脂质膜或纳米粒子的脂质膜。

本发明的肽或其蛋白质部分，也能从编码它的核酸序列获得。本 发明还涉及包含编码例如上面定义的肽的核酸序列或由所述核酸序列 构成的核酸分子。更具体来说，本发明涉及包含通式(I)或对应于序 列SEQ ID NO：12到SEQ ID NO：29之一或其蛋白质部分的化合物的至 少一个编码序列的核酸分子。这些核酸序列可以是DNA或RNA，并 可以与控制序列组合和/或插入到生物表达载体中。

使用的生物表达载体根据它将被转入的宿主进行选择。它可以是 例如质粒、黏粒、病毒等。本发明具体涉及了这些可用于在宿主细胞 中生产本发明的肽或其蛋白质部分的核酸和生物表达载体。可以通过 本技术领域的专业人员公知的分子生物和遗传工程技术，制备这些生 物表达载体，并在宿主中生产和表达肽。

正如所指出的，本发明的肽对于配制治疗或诊断重要的物质、尤 其是促进它们的生物分布和/或穿过BBB来说，是特别有用的。

在这方面，本发明涉及如上所定义的线状或环状肽或伪肽作为载 体转移/运输治疗目的分子或成像或诊断药剂或任何其他分子的应用。

本发明还涉及如上所定义的线状或环状肽或伪肽在制备能够穿过 BBB的药物中的应用。

本发明还涉及能够使或改进分子穿过BBB的方法，其包含将分子 与本发明的肽或伪肽相连。

本发明的线状或环状肽或伪肽使得能够带着正常情况下只能很少 或完全不能穿过BBB的活性物质穿过该屏障。因此它们可用于任何影 响CNS的疾病的治疗、预防或诊断中，而且在使用细胞膜模型、更具 体为BBB模型对各种分子家族进行研究的情况下，也可以用作生物物 质的转运蛋白(生物转运蛋白)。

在这方面，本申请描述了包含如上所定义的肽或伪肽的各种前体 药物结合化合物。术语“结合物”是指通过一种或多种本发明的肽或 伪肽与一种或多种目标分子之间的组合所得到的分子。正如将在下面 更详细描述的，结合可以是化学性质的，例如通过连接物或间隔物， 或是遗传性质的，例如遗传重组技术，例如在与例如标志物或示踪剂 分子(例如GFP、β-半乳糖苷酶等)或治疗分子(例如生长因子、神经 营养因子等)的融合蛋白中。

因此，本发明具体来说涉及如下式(II)的结合化合物：

VxDy    (II)

其中V表示本发明的线性或环状肽或伪肽，D表示活性物质或目标物 质，x和y是1至5之间的整数。在特定实施方案中，x和y等于1， 或x大于y。

作为实例，合成了其中V＝cMPRLRGC、x＝1、D＝Y-(D)-AGFLR 并且y＝1的结合物。在这个例子中，活性物质是止痛治疗肽达拉根。 将该治疗肽直接连接(串联合成)在肽载体SEQ ID NO：48的N-端， 得到结合物SEQ ID NO：66，Y-(D)-AGFLR-(D)-CMPRLRGC。

本发明还涉及如下的式(III)的结合化合物：

VxLzDy    (III)

其中V表示本发明的线性或环状肽或伪肽，L表示间隔物(或连接物)， D表示活性物质或目标物质，x和y是1至5之间的整数，z是1至10 之间的整数。在特定实施方案中，x＝z＝y＝1或x＝z＞y或z＞x＞y。

作为实例，通过连接物L＝GGG或GFLG或ALAL或β-Ala或Ahx 或GFAL(z＝1)，合成了其中V＝cMPRLRGC(x＝1)和D＝Y-(D)-AGFLR (y＝1)的结合物。

SEQ ID NO：67，Y-(D)-AGFLRGGG-(D)-CMPRLRGC

SEQ ID NO：68，Y-(D)-AGFLRGFLG-(D)-CMPRLRGC

SEQ ID NO：69，Y-(D)-AGFLRALAL-(D)-CMPRLRGC

SEQ ID NO：70，Y-(D)-AGFLR-β-Ala-(D)-CMPRLRGC

SEQ ID NO：71，Y-(D)-AGFLR-Ahx-(D)-CMPRLRGC

SEQ ID NO：72，Y-(D)-AGFLRGFAL-(D)-CMPRLRGC

本申请中包含的实例显示，在小鼠的脑灌注实验中，这些结合物 能够穿过BBB，说明了本发明的肽载体的作用机制。

活性物质或目标物质可以是任何药物重要的分子，尤其是治疗、 诊断或医学成像药剂、或分子探针。特别是，它可以是任何生物学重 要的化学实体，例如小的化学分子(抗生素、抗病毒剂、免疫调节剂、 抗肿瘤剂、抗炎剂等)、肽或多肽、蛋白质(酶、激素、细胞因子、 载脂蛋白、生长因子、抗原、抗体或抗体的部分)、核酸(人类、病 毒、动物、真核或原核生物、植物或合成来源等的核糖核酸或脱氧核 糖核酸，其大小可以在单个寡核苷酸到基因组或基因组片段的范围 内)、病毒基因组或质粒、核酶、标志物或示踪剂。一般来说，“目 标物质”可以是任何活性药物成分(API)，不论是化学、生物化学、 天然还是合成的化合物。“小的化学分子”的表述是指最高分子量为 1000道尔顿、典型在300道尔顿至700道尔顿之间的药物重要的分子。

本发明还涉及下式(IV)的化合物：

VxLz    (IV)

其中V表示本发明的线状或环状肽或伪肽，L表示间隔物(或连接物)， x是1至5的整数，z是1至10的整数。在特定实施方案中，x＝z＝1或 z＞x。

在本发明的结合化合物中，一方面V与D之间或V与L之间、 另一方面L与D之间的连接，可以根据相关活性物质和肽或伪肽的化 学性质、位阻和数量通过任何可接受的键合方式来进行。因此，连接 可以通过在生理介质中或细胞内可切开或不可切开的一个或多个共 价、疏水或离子键来进行。此外，D可以在各种反应性基团处与V连 接，如果需要的话通过L，并且尤其是在V的一个或多个N-末端和/ 或C-末端，和/或在构成V的天然或非天然氨基酸侧链所携带的一个或 多个反应性基团处。

连接可以在肽或伪肽中天然存在或已经导入官能团例如-OH、 -SH、-CO₂H、-NH₂、-SO₃H或-PO₂H的任何位点处进行。因此，治疗 性目标分子或诊断(或医学成像)药剂或任何其他分子例如分子探针， 可以在N-末端或C-末端处或该肽序列的天然或非天然氨基酸侧链所携 带的反应性基团处，通过共价键与本发明的线状或环状肽或伪肽载体 结合(连接)。

同样，连接可以在活性物质或目标物质(治疗目的分子、诊断或 医学成像药剂、任何其他分子例如分子探针)中例如天然存在或已经 导入官能团例如-OH、-SH、-CO₂H、-NH₂、-SO₃H、-PO₂H的任何位点 处进行。

优选，相互作用足够强，使得肽与活性物质在到达其作用位点之 前不解离。为此，本发明的优选连接是共价连接，但是非共价连接也 可以使用。目标物质可以在这些末端之一(N-端或C-端)处或在序列 的一个组成氨基酸的侧链处与肽直接连接(串联合成)(图2)。目标 物质也可以利用连接物或间隔物，在肽的一个末端处或序列的一个组 成氨基酸的侧链处间接连接(图2)。要求或不要求间隔物的共价化学 连接手段，包括选自含有烷基、芳基或肽基团的双功能或多功能试剂 通过酯、醛或烷基或芳基酸、酸酐、巯基或羧基、源自溴化氰或氯化 氰、羰二咪唑、琥珀酰亚胺酯或磺酰卤的基团的连接。

在这方面，本发明还涉及制备如上定义的结合物化合物的方法， 其特征在于它包含在肽或伪肽V与物质D之间进行连接的步骤，如果 需要的话所述连接通过L进行，优选通过化学、生物化学或酶途径或 通过遗传工程。

本发明还涉及药物组合物，其特征在于它包含至少一种如上定义 的结合物化合物以及一种或多种可药用赋形剂。

本发明还涉及诊断组合物，其特征在于它包含由如上定义的结合 物化合物构成的诊断或医学成像药剂。

可以使用任何可药用盐形式的结合物。“可药用盐”的表述是指 例如但不限于可药用碱或酸加成盐、水合物、酯、溶剂化物、前体、 代谢物或立体异构体，所述载体或结合物载有至少一种目标物质。

表述“可药用盐”是指一般可以通过将游离碱与适合的有机或无 机酸进行反应而制备的无毒性盐。这些盐保留了游离碱的生物功效和 性质。这些盐的代表性实例是水溶性和水不溶性盐，例如乙酸盐、N- 甲基葡萄糖胺铵盐、安索酸盐(4，4-二氨基芪-2，2’-二磺酸盐)、苯磺酸 盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、氢溴酸 盐、溴化物、丁酸盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、盐酸盐、氯化物、 柠檬酸盐、克拉维酸盐、二盐酸盐、二磷酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙 二胺四乙酸钙、乙二磺酸盐、依托酸盐(estolate)、乙磺酸盐、延胡 索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰对氨基苯砷酸 盐、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、羟基萘甲酸盐、碘化物、 异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、 扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、黏酸 盐、萘磺酸盐、硝酸盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈 酸盐、双羟萘酸盐(1，1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘磺酸盐或emboate)、泛 酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、 水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸 盐、suramate、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基 碘化物、三氟乙酸盐和戊酸盐。

有利的是，本发明的组合物包含可药用载体或赋形剂。可药用载 体可以选自根据每种给药方式所经典使用的载体。根据所设想的给药 方式，化合物可以是固体、半固体或液体形式。对于固体组合物例如 独立的或包含在明胶胶囊中的片剂、丸剂、粉剂或颗粒剂来说，活性 物质可以与下列物质组合：a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘 露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂例如二氧化硅、滑 石粉、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；c)黏合剂，例如硅酸镁 和硅酸铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠 和/或聚乙烯吡咯烷酮；d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐、 或泡腾混合物；和/或d)吸附剂、色素、调味剂和甜味剂。赋形剂可 以是例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维 素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和药品级的类似物。对于半固体组合物例 如栓剂来说，赋形剂可以是例如乳液或油状悬液，或基于聚乙二醇的 物质，例如聚丙二醇。液体组合物、特别是可注射或包含在软胶囊中 的液体组合物，可以通过例如将活性物质溶解、分散等在药物纯溶剂 例如水、生理盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇、油及其类似物 中来制备。

本发明的组合物或结合物可以通过任何适合的途径给药，非限制 性的途径有通过肠胃外途径，例如采用可以通过皮下、静脉内或肌肉 内途径注射的制剂形式；通过口服途径(或经口)，例如采用包衣或 未包衣片剂、明胶胶囊、粉剂、球粒、悬液或口服溶液的形式(一种 这样的口服给药形式可以具有立即释放或延长或延迟释放)；通过直 肠途径，例如采用栓剂形式；通过局部途径，特别是通过透皮途径， 例如采用贴片、膏剂或凝胶形式；通过鼻内途径，例如采用气溶胶和 喷剂形式；经舌途径；或通过眼内途径。

药物组合物典型地包含有效剂量的本发明的肽或伪肽或结合物。 本文中描述的“治疗有效剂量”是指对于给定病症和给药计划来说提 供治疗效果的剂量。典型情况下，给药的活性物质的平均剂量能够明 显改善与疾病或病理状态有关的某些症状。例如，在脑或其他组织/器 官的癌症、CNS的病变、病灶或病症的治疗中，减轻、阻止、延迟、 消除或停止疾病或病症的病因或症状之一的活性物质剂量，将是治疗 有效的。

活性物质的“治疗有效剂量”不必需治愈疾病或病症，但是将为 该疾病或病症提供治疗，使得其出现被延迟、阻碍或阻止，或其症状 被减轻，或其期限被改变或例如严重性降低，或患者的恢复加快。

应该理解，对于具体的人来说，“治疗有效剂量”将取决于各种 因素，包括活性物质的活性/功效、其给药时间、其给药途径、其消除 和代谢速率、药物组合/相互作用和在预防或治愈基础上被治疗疾病(或 病症)的严重性，以及患者的年龄、体重、总体健康、性别和/或饮食。

取决于所连接的物质，本发明的结合物和组合物可用于许多病变、 尤其是影响CNS的病变、感染性病变或癌症的治疗、预防、诊断或成 像。

在这方面，本发明涉及如上所述的药物结合物或组合物在治疗或 预防CNS病变或病症、脑肿瘤或其他癌细胞以及脑或其他组织/器官的 细菌、病毒、寄生虫或真菌感染性病变中的应用。

本发明还涉及如上所述的结合物或药物组合物在CNS病变或病 症、脑肿瘤或其他癌细胞以及脑或其他组织/器官的细菌、病毒、寄生 虫或真菌感染性病变的诊断或成像中的应用。

本发明还涉及如上所定义的结合物或组合物在脑肿瘤或其他类型 癌细胞的治疗、成像和/或诊断中的应用。事实上，研究已经显示患有 某些癌症的患者具有低胆固醇血症。这种低胆固醇血症是癌细胞过度 使用胆固醇的结果。癌细胞为了存活诱导了具有肿瘤的器官中LDLR 表达水平的增加(Henricksson等，1989，Lancet，2(8673)，1178-1180)。 因此，在细胞表达的LDLR水平增加与某些癌症之间存在关联性。最 近也已经显示，在某些病理细胞例如癌细胞的表面上，LDLR的数量非 常高。普遍接受的是，在非病理细胞表面上存在1,000至3,000个LDLR。 同样地，非病理性神经元仅具有很少的LDLR(Pitas等，1987，J.Biol. Chem.，262，14352-14360)。在胶质母细胞瘤的情况下，已经显示了 LDLR的过表达。因此，在脑肿瘤细胞的表面上，已经计数出125,000 (U-251细胞)至900,000(SF-767细胞)个LDLR(Malentiska等， 2000，Cancer Res.，60，2300-2303；Nikanjam等，2007，Int.J.Pharm.， 328，86-94)。还应该指出，许多肿瘤细胞过表达LDLR，例如前列腺 癌(Chen等，2001，Int.J.Cancer，91，41-45)、结肠癌(Niendorf等， 1995，Int.J.Cancer，61，461-464)、白血病(Tatidis等，2002，Biochem. Pharmacol.，63，2169-2180)、结肠直肠癌(Caruso等，2001，Anticancer  Res.，21，429-433)、乳腺癌(Graziani等，2002，Gynecol.Oncol.，85， 493-497)以及肝脏、胰腺、卵巢、肺和胃等的癌症的细胞。

本发明还涉及如上定义的结合物或组合物在脑或其他组织/器官 的细菌、病毒、寄生虫或真菌感染性病变的治疗、成像和/或诊断中的 应用，所述病变例如但不限于AIDS或脑膜炎等。LDLR也存在于肝细 胞上。现在知道，丙型肝炎病毒(HCV)的胞吞作用可以通过LDLR 发生。LDLR在人类肝细胞被HCV感染的早期阶段可以用作病毒受体 (Molina等，2007，J.Hepatol.，46(3)，411-419)。因此，本发明的 结合物可用于特异性靶向被表达LDLR和/或通过LDLR调节健康细胞 的病毒感染过程的病毒、例如乙型肝炎和丙型肝炎病毒所感染的病理 细胞。

本发明还涉及如上定义的结合物或组合物在治疗、成像和/或诊断 神经变性病变中的应用，所述病变例如但不限于阿兹海默氏病、帕金 森氏病、克雅(Creutzfeldt-Jakob)病、中风/脑血管意外(CVA)、牛 海绵状脑病、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化等。

本发明还涉及如上所定义的结合物或组合物在治疗、成像和/或诊 断神经病变中的应用，所述病变例如但不限于癫痫、偏头痛、脑炎、 CNS痛等。

本发明还涉及如上所定义的结合物或组合物在治疗、成像和/或诊 断神经精神病变中的应用，所述病变例如但不限于抑郁症、孤独症、 焦虑症、精神分裂症等。

术语“治疗”及类似的表述是指获得药理和/或生理效应，例如抑 制癌细胞生长、癌细胞死亡或疾病或神经病症的改善。效应可以是预 防性的，以便在患病的人中完全或部分阻止疾病或这种疾病的症状的 恶化或其在健康对象中的传播，和/或可以是治疗性的，以便完全或部 分治疗疾病和/或其相关的有害效应。在本文件中使用的术语“治疗” 覆盖了哺乳动物、更具体为人类疾病的任何治疗，并包含：(a)预防 病变或病症易感的人中可能发生、但还没有阳性诊断的疾病或病症(例 如癌症的预防)，(b)减缓疾病(例如通过阻止其发展)，或(c)减 轻疾病(例如通过减轻与疾病相关的症状)。该术语“治疗”还覆盖 了任何活性物质的给药以在个体或患者中管理、治愈、缓解、改善、 降低或抑制病症，包括但不限于向需要的人给药由本文件中所描述的 载体或结合物所构成的药物。

本发明还涉及本发明的线状或环状肽或伪肽用于增加与其相连的 活性物质或目标物质(治疗性目标分子、诊断或医学成像药剂或任何 其他分子例如分子探针)的生物活性的应用。

本发明还涉及本发明的线状或环状肽或伪肽用于降低与其相连的 活性物质或目标物质(治疗性目标分子、诊断或医学成像药剂或任何 其他分子例如分子探针)的毒性的应用。

在参考下面的实施例后，本发明的其他方面和优点将变得显而易 见，所述实施例在本质上仅仅是说明性的，其不对本申请的范围构成 限制。

实施例

实施例I

人类和鼠类LDLR在表达载体中的克隆

根据与明显参与胆固醇的胞吞作用和转胞吞作用(跨细胞、尤其 是跨BBB运输)的人类和鼠类低密度脂蛋白受体(hLDLR和mLDLR) 的相互作用和亲和性，对肽进行鉴定。对这些肽进行表征的前提条件 是在真核细胞(中华仓鼠卵巢细胞CHO)中建立高速率地组成型表达 hLDLR和mLDLR的稳定细胞系。这些细胞系被用于：i)与细胞表面 表达的hLDLR结合的肽在其天然构型下的表征；ii)验证hLDLR和 mLDLR能够通过胞吞作用内化所选的肽。

简要描述了这些细胞系的构建。

编码hLDLR和mLDLR的信使RNA序列可以在数据库中获得(登 记号分别为：NM_000527和NM_010700)。选择通过PCR进行cDNA 扩增所需的引物，其在末端包含(粗体)在pEGFP-N1表达载体 (Clontech)中进行克隆所需的限制性位点(用于人类LDLR的HindIII 和SalI，以及用于鼠类LDLR的HindIII和KpnI)：

hLDLR

正向引物：ATATATCGAGGACACAGCAGGTCGTGAT

反向引物：TTAATTCACGCCACGTCATCCTCCAGACT

mLDLR

正向引物：ATATATGACGCAACGCAGAAGCTAAG

反向引物：TTAATTGTTGCCACATCGTCCTCCAG

通过反转录将从人类和鼠类脑制备的总RNA转变成cDNA，用于 对编码hLDLR和mLDLR的DNA片段进行PCR扩增。在扩增后，将 PCR产物分别用HindIII-SalI和HindIII-KpnI限制性酶消化，并连接到 用同样限制性酶消化过的pEGFP-N1表达载体(Clontech)中。在转染 到真核细胞中后，该载体能够在CMV启动子控制下表达LDLR，所述 LDLR在其C-端、即其细胞内结构域末端融合有GFP(图3)。在转化 感受态大肠杆菌DH5α细菌、获得分离的菌落并制备质粒DNA后，对 构建物的两条链完全测序以进行验证。

实施例II 稳定表达人类和鼠类LDLR的CHO细胞系的建立

在各种细胞系(CHO、COS、N2A和HEK293)中进行了瞬时转 染，以确定在活的或固定细胞上hLDLR和mLDLR的表达水平和膜定 位。在活细胞上，受体不需免疫染色，而是利用在这些受体的C-端融 合的GFP所发射的绿色荧光，可以在荧光显微镜下直接观察到。通过 有限稀释法以及通过表达载体所携带的遗传霉素抗性基因(G418)， 选择稳定的转染子。在维持选择压力的条件下扩增这些细胞系。在本 文引证的实施例中，预期大小的hLDLR-GFP的表达通过在细胞裂解物 上使用针对人类LDLR和针对GFP的抗体进行Western印迹来验证。 通过抗hLDLR(图4)和抗GFP抗体，在从稳定细胞系制备的细胞提 取物中识别了对应于GFP和hLDLR的合并大小(190kDa)的蛋白。 组成型表达GFP的CHO细胞系被用作阴性对照。抗hLDLR抗体在GFP 细胞系中没有检测到蛋白。

在CHO-GFP(对照)和CHO-hLDLR-GFP细胞系的固定(PFA) 细胞上使用抗hLDLR抗体进行的免疫细胞化学显示出hLDLR-GFP融 合蛋白在转染的细胞中表达良好。在没有使用Triton X100通透化的细 胞上进行的免疫细胞化学实验，显示出LDLR的细胞外结构域可以在 细胞外水平上很好地检测(图5)。

显示了hLDLR与其通过吸附荧光标志物DiI而产生荧光的天然配 体LDL之间的共定位。正如在荧光显微镜下在固定细胞上所观察到的， 这种天然荧光配体(DiI-LDL)被快速内化(胞吞)(图6-A)。相反， DiI-LDL没有被对照CHO-GFP细胞系或被过表达参与转胞吞作用的另 一种受体例如人类转铁蛋白受体(hTfR，图6-B)的另一种对照CHO 细胞系通过胞吞作用摄入。此外，CHO-LDLR-GFP细胞系的胞吞活性 特异性针对LDLR配体，因为在该细胞系中，没有观察到对其不特异 的配体、例如用红色荧光染料(德克萨斯红，图6-C)染色的转铁蛋白 (Tf)的胞吞。

在视频荧光显微镜下通过实时实验证实了受体的功能性(胞吞能 力)，该实验显示，在表达hLDLR-GFP的细胞中，与只表达GFP的 细胞或表达参与胞吞作用的另一种受体例如hTfR的细胞(阴性对照) 相比，用DiI染色的hLDLR天然配体LDL事实上被快速和非常有效地 运输。相反，使用被表达hTfR-GFP的细胞通过胞吞作用非常有效地摄 入的、用德克萨斯红染色的Tf所进行的视频显微镜实验，证实了转铁 蛋白没有被对照GFP细胞系的细胞或hLDLR细胞系的细胞通过胞吞作 用摄入。

尽管在CHO-hLDLR-GFP细胞系中存在高hLDLR表达水平，但 胞吞系统不仅有效，而且保持其选择性。GFP融合蛋白的存在既不改 变hLDLR的膜插入性质、hLDLR细胞外结构域在细胞外的暴露，也不 改变受体在胞吞作用过程中的功能。

实施例III

在CHO-hLDLR-GFP细胞系上筛选由细菌病毒所表达的几十亿个随机 肽序列的数据库以及鉴定表现出对hLDLR的亲和性的细菌病毒和肽序 列

以细菌病毒表达的随机肽序列的数据库进行的筛选，在只表达 GFP的对照CHO-GFP细胞系上完成了细菌病毒数据库后，用在 CHO-hLDLR-GFP细胞系上。在充分清洗然后用酸洗脱后，通过在液体 培养基中或皮氏培养皿上感染大肠杆菌ER 2738细菌，对固定在细胞 系上的细菌病毒进行扩增。反复筛选细胞系上洗脱的细菌病毒，然后 再次扩增，能够对表现出对细胞表面上表达的hLDLR具有强亲和性的 细菌病毒进行表征。在这些细菌病毒中，只筛选也与鼠类细胞系 (CHO-mLDLR-GFP)结合的细菌病毒。

执行了5次独立的筛选，总共约200个细菌病毒克隆(延迟噬斑)， 在对细菌病毒基因组中编码这些细菌病毒所表达的肽的区域进行PCR 扩增后，对这些病毒克隆进行测序。许多细菌病毒具有同一的序列。 获得了两个肽序列家族：保守基序的环状肽SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：65，以及不具有保守基序的线 状肽SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：29(参见本文件的序列表)。

在细菌病毒表达的、并与稳定的CHO-hLDLR-GFP细胞系所表达 的hLDLR-GFP结合的肽结合后鉴定到细菌病毒克隆，与LDLR细胞放 置在一起，并且在充分清洗后使用针对细菌病毒的病毒包膜蛋白的抗 体、然后使用与Alexa 594偶联的第二抗体进行检测(图7)。这些细 菌病毒不与只表达GFP的对照CHO-GFP细胞系的细胞结合。

将具有相同滴度的纯化的细菌病毒批次在细胞系上进行竞争，并 且在充分清洗并用酸洗脱、对约50种细菌病毒进行克隆和测序后，鉴 定到在环状和线状肽中具有最高亲和性的细菌病毒。

没有被选上或留下用于其他实验的细菌病毒，绝不能被当作是无 用的；它们不能被视为没有功能。这些肽保有作为载体候选物的极大 潜力，因此，本发明也对它们进行权利要求。

实施例IV

细菌病毒所表达的肽与CHO-LDLR-GFP细胞系的hLDLR以及与非遗 传修饰细胞的hLDLR的相互作用

将表达对hLDLR具有亲和性的肽的细菌病毒，与非遗传修饰的、 已知以组成型或诱导型方式表达hLDLR的黏附细胞、尤其是人类成纤 维细胞、人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)或猪脑微血管内皮细胞进行 温育。使用针对细菌病毒的病毒包膜蛋白的抗体进行的免疫细胞化学 显示，由细菌病毒表达的对hLDLR具有亲和性的肽，也与非遗传修饰 的初级细胞例如人类成纤维细胞和猪脑微血管内皮细胞上存在的 LDLR结合(图8)。

在定性的免疫细胞化学分析上增添了使用悬浮细胞(GFP细胞系、 CHO-hLDLR-GFP细胞系、人类成纤维细胞、HUVEC)进行的定量的 流式细胞术(FACS)分析。将这些细胞在培养基中生长、机械解散并 分离(不使用胰蛋白酶)、离心、重悬浮，并在各种细菌病毒克隆和 抗LDLR抗体存在下，在4℃温育20分钟，以避免任何胞吞过程。在 清洗后，与细胞结合的细菌病毒使用抗病毒包膜蛋白抗体可视化。利 用FACSCanto系统(Becton Dickinson)，使用BD FACSDiva软件进 行FACS分析。将阳性细胞的数量用每次试验5,000个事件进行归一化。 结果表示成任意荧光单位。

这些方法显示了通过第二抗体Alexa 488可视化的抗hLDLR抗体 在各种细胞类型(图9-11)上测定到的hLDLR表达速率(水平轴)、 与通过Alexa 647抗体或别藻蓝蛋白(APC)抗体可视化的针对细菌病 毒包膜蛋白的抗体(垂直轴)之间的关联性。图9、10、11对应于使 用肽SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：21在 CHO-hLDLR-GFP细胞系(图9)、人类成纤维细胞(图10)和HUVEC (图11)的细胞上获得的结果。

通过与上面提出的相似的FACS实验，在各种细胞类型、尤其是 HUVEC上，评估了细菌病毒所表达的对hLDLR具有亲和性的肽能够 与hLDLR的天然配体——LDL结合结构域相互作用这一假说，在此示 出作为实例(图12)。首先，显示了表达对hLDLR具有亲和性的肽(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：11在这里用作实例)的细菌病毒的结合速率， 与HUVEC的LDLR表达水平成正比。在LDL存在下进行的FACS实 验能够显示并定量LDL被线状肽(例如SEQ ID NO：21)强烈偏移 (85％)，但是只被环状肽(例如SEQ ID NO：11)小偏移(17％)。

实施例V

细菌病毒所表达的对hLDLR具有亲和性的肽与小鼠脑血管内皮细胞在 体内的相互作用

将表达对hLDLR具有亲和性的肽(在此作为实例描述了SEQ ID  NO：1)的细菌病毒与对照细菌病毒(不表达对hLDLR具有亲和性的 肽)注射到用卤烷麻醉的C57BL6小鼠的尾静脉中。在注射后15分钟 和2小时后，将小鼠处死并用0.9％NaCl进行灌注。将脑、肝和肾在异 戊烷中冷冻，并制备冷冻切片用于双重免疫组织化学染色，使用抗小 鼠IgG抗体可视化血管，并使用抗病毒包膜蛋白抗体可视化在体内与 内皮细胞结合的细菌病毒。实验显示，表达对hLDLR具有亲和性的肽 SEQ ID NO：1的细菌病毒和mLDLR结合于血管壁内皮细胞，而对于 对照细菌病毒来说不是如此(图13)。

实施例VI

对hLDLR具有亲和性的细菌病毒对应肽的合成以及与示踪分子(生物 素、荧光素或具有酶活性的S-Tag)的连接

通过固相肽合成(SPPS)方法，在Advanced ChemTech Apex396 (AAPPTec)合成仪或Liberty^TM(CEM)微波合成仪上，使用Fmoc/tBu 策略，在聚苯乙烯-1％DVB上的Rink Amide AM树脂上、聚苯乙烯-1％ DVB上的Wang上、聚苯乙烯-1％DVB上的Barlos(2-氯三苯甲基氯) 上或聚苯乙烯-1％DVB上的Sieber Amide上合成肽。根据所使用的树 脂，载量(或置换)介于0.25mmol/g到1.6mmol/g之间。

N-端被Fmoc(或对于某些N-末端来说用Boc)保护和/或在其侧 链被正交官能团(尤其是对酸不稳定的官能团)保护的氨基酸、化学 连接和去保护试剂和溶剂从专业公司购买，并原样使用。

Rink Amide和Wang树脂能够合成在其侧链和C-末端完全去保护 的肽序列。因此这是2维(Fmoc/tBu)正交SPPS。

Barlos和Sieber超敏型酸不稳定(HAL)树脂能够释放端位(C- 端)酸或酰胺官能团，同时保留被合成的肽的各种氨基酸的正交侧链 保护基团以及其最后一个氨基酸的胺官能团的端位(N-端)胺保护基 团(例如针对新合成肽序列的稳定性问题的N-乙酰化)。这些类型的 树脂，通过Fmoc(Prot₁)合成策略，能够使用只在强酸介质中可切开 的酸不稳定性正交侧链保护基团(Prot₂：Boc、tBu、OtBu、Trt、Mmt、 Acm等)，而受保护的肽在非常弱的酸条件下脱开。这种类型的切割 能够回收在其侧链官能团(Prot₂)上完全被保护的肽序列，以便将治 疗性目标分子与肽相连。因此，这是三维(Barlos或Sieber/Fmoc/tBu) 正交SPPS。

在肽合成过程中用于每种氨基酸的标准正交侧链保护基团(Prot₂) 是：Arg(N-Pbf)、Arg(N-Pmc)、Asn(N-Trt)、Asp(O-tBu)、 Cys(S-Acm)、Cys(S-Mmt)、Cys(S-4MeBn)、Cys(S-tBu)、 Cys(S-Tmob)、Cys(S-Trt)、Glu(O-tBu)、Gln(N-Trt)、His

(N-Trt)、Lys(N-Boc)、Ser(O-tBu)、Thr(O-tBu)、Trp(N-Boc)、 Tyr(O-tBu)(Applied Biosystems，1998，《Fmoc合成后肽的切割、去 保护和分离，技术手册》(Cleavage，Deprotection，and Isolation of  Peptides after Fmoc Synthesis.Technical Bulletin)。Gly、Ala、Val、Leu、 Ile、Phe、Met和Pro不具有侧链保护基团，因为它们相应的化学结构 不需要它。

通过使用DMF中的DIEA/HBTU/HOBt或DIPC/HOBt对n+1氨基 酸的酸官能团进行活化，来连接氨基酸。

如此连接的新氨基酸的Fmoc(Prot₁)基团的去保护使用DMF中 的20％哌啶进行。

在肽测序过程中连接的最后一个氨基酸将被Boc官能团保护(以 便在合成结束时释放出其游离的端位胺官能团)，或被乙酰化(以便 使合成的新肽稳定，但是也降低治疗性目标分子在例如C-端位置共价 连接的过程中二次反应的风险)。

根据合成的肽，使用本技术领域的专业人员惯常使用的试剂： I₂/DMF、I₂/HFIP/DCM、TFA/DMSO/苯甲醚、I₂/DCM/MeOH/H₂O等， 通过两个受到适当保护的Cys(Acm、Trt、tBu等)的两个巯基官能团 在溶液中或树脂上的分子内环化，获得了二硫桥。有利的是，可以将 N-端位置中的Cys用Mpa代替，用于经二硫桥进行环化。羊毛硫氨酸 桥(通过经脱氢丙氨酸的环化)或二卡巴(通过经allylGly的环化)也 可以通过本技术领域的专业人员已知的合成途径来获得。内酰胺桥可 以在Glu(或Asp)残基的侧链酸官能团与N-端胺或Lys的侧链胺官能 团之间产生。同样地，N-端胺官能团和C-端酸官能团之间的环化(头/ 尾)可以经酰胺键进行，正如同Lys的侧链胺官能团与肽的C-端酸官 能团之间的环化。

通过本技术领域的专业人员经典使用的方法，使用DCM中的0.5％ TFA(v/v)、或使用AcOH/TFE/DCM(1/1/3)、或使用DCM中的HFIP (30％)或使用DCM中的TFE(30％)等，将肽从Barlos或Sieber树 脂上切下。

侧链的去保护和肽从Rink Amide或Wang树脂上的切下，通过本 技术领域的专业人员经典使用的方法来进行：使用TFA/H₂O/TIS或 TIPS(95/2.5/2.5)，或使用TFA/H₂O/EDT/TIS或TIPS(94/2.5/2.5/1)， 或使用TFA/茴香硫醚/H₂O(94/5/1)，或使用TFA/TIS/H₂O/茴香硫醚 (90/5/3/2)，或使用TFA/H₂O/苯酚/茴香硫醚/EDT(82.5/5/5/5/2.5) 等。

按照本技术领域的专业人员已知的经典合成和连接方法，将生物 素、荧光素或S-Tag(参见下面的实施例VII)导入C-端位置中。

肽的分离和纯化，通过HPLC在装备有Chromolith C18(4.6mm x 50mm)或Nucleosil C18(10mm x 250mm)柱的Beckman System Gold  126上进行，使用例如3.5min内在水性相(H₂O+0.1％TFA)中0％至 100％的乙腈梯度，然后在1.5min内100％至0％的乙腈梯度(流速： 1ml/min至5ml/min)，或在装备有Chromolith Speed ROD RP-18(4.6mm x 50mm)柱(固定相)的Waters 1525系统上进行，使用Waters 996PDA 检测器(190nm-400nm)检测，或在装备有Chromolith Performance  RP-18(3mm x 100mm)柱(固定相)的Waters Alliance 2690系统上进 行，使用Waters 996PDA检测器(190nm-400nm)检测。UV检测在 214nm和254nm处进行。

制备性纯化使用Waters Prep LC 4000系统、Guard-Pak^TM柱(固定 相)、Delta-Pak^TMC18保护柱(25mm x 10mm)进行，使用Waters 2487 双波长吸收检测器(Dual Wavelength Absorbance Detector)检测。

分子量使用电喷雾电离(ESI)质谱术在正离子模式下测定。谱图 使用能够进行LC-MS偶联的装备有Waters Alliance 2690HPLC系统的 Waters Micromass Quattro Micro(四极分析仪)获得。

使用的LC-MS分析条件如下：

-Chromolith Flash C18柱(4.6mm x 25mm)，

-3ml/min流速，

-在2.5min内B从0％至100％的线性梯度(A：0.1％H₂O/HCO₂H； B：0.1％ACN/HCO₂H)。

以100-200μl/min的流速获取正离子电喷雾模式下的质谱图。在 200-1700m/z的扫描方式下以0.1s的时间间隔获得数据。

实施例VII

合成的对hLDLR具有亲和性的肽在CHO-LDLR-GFP细胞系中的结合 和胞吞作用

合成了对hLDLR-GFP具有亲和性的肽和对照肽(随机肽，残基 与对hLDLR-GFP具有亲和性的肽同一但是没有特定次序)，并在C- 端位置中与由三个Gly残基构成的间隔物隔开的各种示踪分子——罗 丹明或S-Tag相连接/结合(图14)。S-Tag(源自于牛胰核糖核酸酶A 的序列1-15的15个氨基酸的肽)一方面可以被抗S-Tag抗体识别，用 于免疫细胞化学或FACS方法，另一方面能够通过与核糖核酸酶S-蛋 白(C-端部分21-124位氨基酸)结合，在使用FRETWorks S-Tag分析 试剂盒(Novagen 70724-3)的体外活性测试中重建酶活性。由此活化 的核糖核酸酶消化RNA底物，释放出被掩盖的荧光剂，荧光剂通过 FRET(荧光共振能量转移)可视化，并在Beckmann荧光分光光度计 中在96孔板中定量。对于这些FRET实验来说，在FRET使用的波长 处产生强背景噪音的对照CHO细胞和在C-端位置中融合有hLDLR和 mLDLR的GFP，被红色荧光蛋白(RFP)代替。因此，为FRET实验 而产生的稳定细胞系是CHO-RFP和CHO-hLDLR-RFP。

对于FRET方法来说，将细胞用2ml PBS清洗两次，然后与250μl 肽溶液在37℃下温育1小时。将它们再用2ml PBS清洗两次，然后用 1ml PBS清洗两次，然后刮到1ml PBS中，以1,250rpm离心5分钟。 然后吸出上清液，将细胞沉淀在80μl PBS+0.1％Triton X100中裂解。 在FRET反应后，通过测量荧光发射，对20μl每种细胞裂解物进行分 析。

进行了包含将肽在表达hLDLR的各种细胞上进行温育的实验。作 为实例显示了使用结合有罗丹明的肽SEQ ID NO：1或结合有S-Tag的 肽SEQ ID NO：2所获得的结果，该结果表明肽与CHO-LDLR-GFP细 胞很好地结合，并且它们通过胞吞作用摄入，以积累在表达hLDLR的 细胞系的细胞中，而在对照肽的情况下不是这样(图15)。在这些实 验中，将结合有S-Tag的肽与针对S-Tag的第一抗体(第一Ab)和针 对第一抗体的第二抗体(第二Ab)预备性温育，显示出SEQ ID NO： 2/S-Tag/第一Ab/第二Ab复合物与表达hLDLR的细胞结合并通过胞吞 作用内化。这些结果表明，SEQ ID NO：2家族的肽能够与表达hLDL 的细胞结合并运载大的装载物(两种抗体)，即这些装载物通过胞吞 作用内化。

将对hLDLR具有亲和性的肽的胞吞作用进行定量。为此，将SEQ ID NO：11/S-Tag和对照(随机)肽与CHO-hLDLR-RFP细胞在37℃下 温育1小时。清洗细胞以除去任何痕量的未固定肽。清洗使用PBS进 行，其使得能够通过FRET定量与细胞膜结合的肽和通过胞吞作用内化 的肽(图16-A)，并且清洗还使用酸溶液(0.2M甘氨酸、0.15M NaCl、 pH 3)进行，其使得能够解离与细胞膜上的hLDLR结合的肽。然后只 有通过胞吞作用被细胞摄入的肽能够通过FRET检测到(图16-B)。 对于肽SEQ ID NO：2/S-Tag在人类成纤维细胞上来说，情况也是如此 (图16-C-D)。

这些观察也通过FACS在非黏附细胞上得到证实。给出了肽SEQ ID NO：11与对照肽相反，在CHO-hLDLR-GFP细胞系的细胞上结合的 实例，这两种肽都结合有S-Tag(图17)。

实施例VIII

在体外BBB模型中对hLDLR具有亲和性的合成肽在内皮细胞上的毒 性、胞吞作用和转胞吞作用

在体外BBB模型上评估了肽对内皮细胞的潜在毒性效应、肽在这 些细胞中的结合/积累以及肽经转胞吞作用的通过。建立模型所需的细 胞(来自脑微血管的内皮细胞与星形胶质细胞的共培养物)是Cellial  Technologies销售(Lens，France)的牛的细胞(牛脑微血管内皮细胞， BBMEC)。该体外BBB模型被用于评估大量分子、尤其是药理学药剂 穿过BBB的被动通过/扩散或主动运输，并因此用于评估它们到达CNS 组织的能力。模型具有脑内皮的超微结构性质特点，尤其是紧密连接、 不存在孔隙、不存在跨内皮通道、对亲水性分子的低透过性和高电阻。 此外，该模型显示了在体外和体内评估的各种分子上获得的在它们穿 过BBB的性质方面的测量结果之间的坚实相关性。到目前为止，所有 获得的数据显示，该BBB模型通过再现体内存在的细胞环境的某些复 杂性近似模拟了体内的情况，同时保留了与组织培养实验相关的优点。 大量研究已经证实了该细胞共培养物是最具重复性的体外BBB模型之 一。

体外BBB模型使用BBMEC和星形胶质细胞的共培养物。在细胞 培养之前，将膜插入物(Millicell-PC 3.0μm；直径30mm)的上部用 大鼠尾胶原蛋白处理，以便能够实现BBMEC的最佳黏附并创建基底 层的条件。混合的星形胶质细胞的原代培养物从新生大鼠的大脑皮层 建(Dehouck等，1990，J.Neurochem.，54，1798-1801)。简单来说， 在除去脑膜后，将脑组织通过82μm尼龙筛。将星形胶质细胞以1.2x10⁵个细胞/ml的浓度与2ml补充有10％热失活胎牛血清的最适培养基 (DMEM)分配在微孔板的孔中。培养基每周更换两次。将从Cellial  Technologies获得的BBMEC在DMEM培养基的存在下进行生长，所 述培养基补充有10％(v/v)马血清和10％热失活牛血清、2mM谷氨 酰胺、50μg/ml庆大霉素，并每两天添加1ng/ml碱性成纤维细胞生长 因子。然后将BBMEC分配在2ml共培养物中滤膜的上表面上。该 BBMEC培养基每周更换3次。在这些条件下，分化的BBMEC在7天 后形成铺满细胞的单层。下面报告的实验在达到汇合后5至7天之间 进行。

将结合有罗丹明的肽SEQ ID NO：1和对照肽，在培养系统的上区 室中与内皮细胞接触温育1h、5h和24h。在各个不同时间收集下区 室的培养基，并通过荧光测量分析对荧光进行定量。结果被表示成内 皮表面通透性(Pe)，单位为10^-3cm/min。首先在所有被分析的孔中 使用一种几乎不能穿过BBB的小荧光分子——萤光黄(LY)来评估体 外BBB的完整性，然后进行肽的共温育，以评估肽对形成该BBB的 内皮细胞不存在毒性。如果LY的Pe值大于1x10^-3cm/min，该体外屏 障被认为是“通透的”或“开放的”。使用欧姆表测量并用ohm.cm²表示的跨内皮电阻(TEER)，也能在跨BBB的通过试验过程中检测 BBB完整性。定性阈值被设定为＞500ohm.cm²。

使用肽进行的分析显示出肽SEQ ID NO：1以及使用的对照肽不存 在毒性，并且对BBB的通透性质不存在有害影响，因为使用LY测量 到的Pe值在存在或不存在肽的情况下不增加，即使在温育24小时后 (图18)。

在如上所述的体外BBB模型上测定了均结合有罗丹明的对照肽和 肽SEQ ID NO：1的结合和/或内化速率。该分析通过在不同时间(2h、 5h、24h)裂解内皮细胞、并通过荧光测定法测量与细胞相关的(通 过在这些细胞裂解后离心获得的膜和细胞质区室)荧光(罗丹明)的 量来进行。测量到的值表明，在所有的分析时间，结合有罗丹明的肽 SEQ ID NO：1与对照肽相比对体外BBB模型中的内皮细胞具有更高亲 和性(图19)。

在上述的体外BBB模型上确定了均结合有罗丹明的对照肽和肽 SEQ ID NO：1的通过。该分析通过在不同的时间(1h、4h、24h)以 荧光测定法测量受体孔中积累的荧光的量来进行。在所分析的各个孔 中BBB的完整性，通过同时测量随着时间从一个区室传送到另一个区 室的LY的水平来评估。测量到的Pe值表明，在短时期内(1h和4h)， 通过转胞吞作用传送的肽SEQ ID NO：1的水平不能与用对照肽测量到 的非特异性或细胞旁路传送区别开。另一方面，在24h时，结合有罗 丹明的肽SEQ ID NO：1的传送速率与对照肽相比十分明显地更高。LY 的测量也显示在1h、4h和24h，BBB的完整性得到保存(图20)。 其他测量显示，在24h时，受体区室中结合有罗丹明的肽SEQ ID NO： 1的浓度与供体区室相比高得多，表明了肽肯定通过受体进行主动运 输，不用在两个区室之间达到浓度平衡。

实施例IX

肽载体SEQ ID NO：11的化学优化

通过丙氨酸扫描(Ala-scan)技术和N-和C-端截短，在肽载体SEQ  ID NO：11上进行了结构/活性(亲和性)关系的研究，以便确定该肽的 15个连续氨基酸中每个的重要性。通过荧光测定法，通过测量在C-端 经三个Gly的间隔物与S-Tag肽结合的肽SEQ ID NO：11(SEQ ID NO： 11/S-Tag)(参见实施例VII)的置换率，测定了从化学优化产生的每 种新合成的肽对hLDLR的亲和性。

简单来说，使用的CHO-hLDLR-RFP细胞是黏附性和汇合的。

将它们生长在6孔板中。每种条件使用三个细胞孔。

在HamF12-1％BSA培养基中制备含有10μM肽SEQ ID NO： 11/S-Tag的溶液。向该溶液添加10μM待评估的从Ala-sca获得的肽(竞 争)。

还制备几种对照溶液：

(i)HamF12-1％BSA培养基。

(ii)HamF12-1％BSA培养基+10μm对照肽CTRL-S-Tag(评 估任何包含S-Tag的肽的非特异性结合)。

(iii)HamF12-1％BSA培养基+10μm肽SEQ ID NO：11/S-Tag +10μm对照肽CTRL(评估目标肽与对照肽CTRL之间的“非特异性” 竞争)。

使用的FRET方法如实施例VII中所述。

通过这些方法测试了约60种肽。这些肽中的36种(SEQ ID NO：30 至SEQ ID NO：65)显示出对LDLR的体外亲和性。

本研究进一步证实了半胱氨酸的重要性以及因此环化和MPR三 肽基序的重要性。

本研究还能减小肽载体的大小，因为包含至少一个D-构型氨基酸 的8个氨基酸的环状肽(SEQ ID NO：48)表现出对LDLR的出色亲和 性。

按照同样的方案，将SEQ ID NO：48/S-Tag用作肽载体SEQ ID NO： 48的参比物，用于化学优化(研究环的大小、非天然氨基酸的引入) 和结合物对LDLR的亲和性的测量。

因此，在本申请中描述的结合物SEQ ID NO：66至SEQ ID NO：72， 也表现出对LDLR的体外亲和性。

实施例X

包含载体和治疗性目标分子或成像(或诊断)药剂或任何其他分子例 如分子探针的结合物的化学合成策略

治疗性目标分子或成像或诊断药剂或任何其他分子例如分子探 针，在运输并穿过细胞膜、更具体是BBB后，可以例如通过前体药物 策略，通过水解或酶法切开载体与活性物质之间的化学键，从载体上 释放/切下。

在其反应性侧链官能团上被完全保护(连接到C-端和N-端)或部 分保护(连接在侧链的反应性官能团上)的肽载体与治疗性目标分子 之间的共价连接，通过两种通用策略来进行(图2)：

-串联合成(即在两个实体之间没有中间物而直接连接)，

-通过连接物合成(Temsamani等，2004，Drug Discov.Today，23， 1012-1019)。

作为实例，按照在实施例VI中对肽合成的描述，在止痛治疗肽达 拉根与肽载体SEQ ID NO：48之间进行了肽结合物SEQ ID NO：66的串 联合成。

作为实例，按照在实施例VI中对肽合成的描述，在止痛治疗肽达 拉根与肽载体SEQ ID NO：48之间进行了肽结合物SEQ ID NO：67至 SEQ ID NO：72经肽连接物(GGG、GFLG、ALAL、β-Ala、Ahx、GFAL) 的合成。

根据所选的肽载体和目标治疗分子，在C-端上或N-端上或侧链反 应性官能团上使用各种策略中的一种或另一种。理想情况下，所选的 间隔物荧光应能够适当地释放出活性物质并提高结合物的溶解性 (Molema等，2001，《运载，器官特异性策略》(Vectorisation， organ-specific strategies.)，在《药物化学方法与原理》12卷中(In： Methods and principles in medicinal chemistry，vol.12))。因此，可以 在两个实体(载体与活性物质)之间经或不经间隔物产生各种不稳定 的共价化学键：酰胺、氨基甲酸酯、酯、硫酯、二硫键等。例如，在 文献中已经显示，在血浆中相对稳定的二硫键可以在脑内区室中被切 开，以恢复自由巯基官能团(Saito等，2003，Adv.Drug Deliv.Rev.，55， 199-215)。

其他目标化合物是其中间隔物是聚合物例如聚乙二醇(PEG)的 化合物。事实上，在文献中已经显示，生物学目的的有机分子与PEG 的结合能够增加该分子的血浆半衰期(Greenwald等，2003，Adv.Drug  Deliv.Rev.，55，217-250)并降低其清除率。

载体与活性物质或目标物质之间的结合物可在CNS病变、病灶或 病症的诊断、成像或治疗中，用于制备能够穿过BBB、脑肿瘤或其他 类型癌细胞的药物，用于制备能够穿过癌细胞膜的药物，和/或对于感 染病变来说用于制备能够穿过细胞膜并靶向脑或其他组织/器官的细 菌、病毒、寄生虫或真菌感染病的被感染细胞的药物。

实施例XI

单独的载体以及载体与治疗性目标分子或成像(或诊断)药剂或任何 其他分子例如分子探针之间的结合物的原位脑灌注，以及它们穿过 BBB的运输动力学及其在小鼠脑中的积累的研究

在这里使用了原位脑灌注技术(在成年雄性OF1小鼠中)来选择 最佳载体，并为它们在脑中穿过BBB运送的作用机制提供证据。

事先将肽载体用氚(³H)进行放射性标记，其为放射活性化合物 尤其在组织切片上的检测提供了最强的灵敏度。通过用氚化的丙酸酐 或氚化的N-丙酰基-琥珀酰亚胺(NPS)酰化N-端胺官能团的策略，制 备了具有高比放射活性(SRA，高达100Ci/mmol)的放射活性肽。这 种氚化方法可应用于所有肽，只要N-端的修饰不影响肽对靶受体(即 LDLR)的亲和性，或在治疗性肽的情况下不影响它们的生物活性即可。

肽载体SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：48在N-端位置中通过丙酰 化的氚化反应，在DMF中(根据溶解度，1mg肽在100μl至450μl 中)、通过加入0.1当量氚化的NPS在室温下5分钟，然后加入0.9 当量冷NPS(未氚化)1小时，然后再加入新的1当量冷NPS 5小时， 来进行。然后将反应介质留在4℃过夜，在第二天通过HPLC进行纯化。 每种氚化肽的SRA在5Ci/mmol至10Ci/mmol之间(理论上在 7.7Ci/mmol左右)。通过合成制备的放射活性的总量在600μCi至 950μCi之间。

在载体与活性物质之间的结合物的情况下，重要的是为了避免放 射性标记的化学合成需要开发长的、高成本的新合成途径，因此选择 了已经可商购的用碳-14(¹⁴C)标记的模型活性物质。按照实施例X中 的描述，将放射性标记的肽(例如用³H放射性标记)与放射性标记的 活性物质(例如用¹⁴C放射性标记)共价连接。正如前面提到的，该共 价连接根据活性物质的结构和物理化学性质、特别是可以被修饰而不 降低该物质的生物活性的功能性化学基团的存在来进行。放射性标记 的结合物通过从为非放射性标记的结合物开发的合成途径外推来合 成。

另一种策略包括经连接物(肽或有机性质的)或不经连接物合成 治疗性肽与肽载体之间的结合物，如同在本申请中描述的结合物SEQ  ID NO：66至SEQ ID NO：72的情况。因此，按照上述制备了N-端氚化 的结合物SEQ ID NO：72。

下面简要概述的技术被开发用于研究活性物质在脑中的分布，更 具体为BBB的作用，更具体为LDLR在这些分子穿透脑中的作用。原 位脑灌注技术是技术要求最高并且在小鼠中最难进行的技术之一。但 是，原位脑灌注(如同在体外模型中)能够完全控制人工灌注液的组 成，以便在动物体内的正常生理和解剖学条件下维持脑的细胞和血管 化，而没有全身性分布的破坏因素。

将这种通常在大鼠中执行的原位脑灌注策略进行改造用于小鼠 (Dagenais等，2000，J Cereb Blood Flow Metab.，20(2)，381-6)以拓 宽其应用，用于评估在转基因和KO突变小鼠中活性物质的受体、酶或 转运蛋白在BBB和血液-视网膜屏障处的运输动力学参数。它包含在麻 醉的OF1小鼠中进行颈动脉导管插入术，并将该颈动脉的某些分支(外 部、甲状腺、枕部分支)结扎，以便特异性灌注颈内和翼腭动脉，其 可用于评估载体和结合物在脑中的摄取。使用导管，通过用充分控制 的灌注液(碳酸氢盐缓冲液、血浆或血液)经颈动脉进行灌注，能够 代替大体循环。首先使用充氧的Krebs碳酸氢盐缓冲液来评估载体和结 合物进入脑的能力。在颈动脉导管插入术后，通过切开心室停止内源 血流，以避免缓冲液与血液混合和血压的升高。监测固定流速灌注的 持续过程。对于受体介导的运输(RMT)的研究来说，在存在氧转运 体(洗过的红细胞)的情况下缓冲液灌注可以延长到直至20分钟或直 至1小时。

肽载体SEQ ID NO：11的研究能够确定其脑运输或转移系数 (K_in)。这些实验的脑灌注持续时间是5分钟，灌注液流速为2ml/min。 因此，肽载体SEQ ID NO：11的K_in(脑灌注随时间的配送体积)的计 算给出了3.5±0.2x 10^-4ml/s/g的值。

应该指出，转铁蛋白(Tf)具有3.0x 10^-4ml/s/g的K_in(Demeule 等，2008，J.Neurochem.，106(4)，1534-1544)。RAP蛋白的K_in是1.0 x 10^-5ml/s/g(Pan等，2004，J.Cell Sci.，117，5071-5078)。

在优化的肽载体SEQ ID NO：48中进行的肽载体SEQ ID NO：11 的化学优化，能够使肽载体在脑中的通过增加1.37倍。对于该脑灌注 研究来说，使用肽SEQ ID NO：73——CMPRC作为对照。

SEQ ID NO：48的K_in＝4.8±0.4x 10^-4ml/s/g

SEQ ID NO：73的K_in＝1.5±0.2x 10^-4ml/s/g

正如前面所描述的，达拉根(SEQ ID NO：74，Y-(D)-AGFLR)经 N-端连接物与肽载体SEQ ID NO：48的化学连接能够获得结合物SEQ  ID NO：72。

对于该脑灌注研究来说，使用不被运载的游离达拉根(SEQ ID NO： 74)作为对照。

因此，被运载的达拉根(SEQ ID NO：72)与其不被运载的游离形 式(SEQ ID NO：74)相比，在脑中的通过增加了21.78倍。

SEQ ID NO：72的K_in＝19.6±3.9x 10^-4ml/s/g

SEQ ID NO：74的K_in＝0.9±0.1x 10^-4ml/s/g

此外，这种类型的原位脑灌注实验也能在保留在脑血管区室中的 化合物与已经穿过管腔内皮膜进入脑实质的化合物之间建立区别。事 实上，灌注后毛细血管排空技术能够测量分子是否实际上穿过内皮以 便进入脑实质。使用该技术，能够显示特定肽载体(或结合物)在脑 实质中积累的趋势。这种技术(Triguero等，1990，JNeurochem.，54(6)， 1882-8)被用来在通过内皮转运并经细胞外空间或脑细胞进入脑的载体 (或结合物)部分与剩余的与内皮细胞相伴的部分之间进行区分。

因此，对于所研究的载体和结合物来说，在小鼠中原位脑输注研 究的关键步骤可以概述如下：

i)评估BBB处载体和结合物的耐受性(无毒性)和该生理屏障 的完整性的保持。

ii)研究通过LDLR经RMT进行的脑摄入的动力学和线性。

iii)研究脑摄入速率随载体或结合物浓度的变化(T_max、K_m)。

iv)使用抑制或调节LDLR的物质研究运输机制。

v)在脑的区室中的分布：毛细血管排空(Triguero等，1990，J  Neurochem.，54(6)，1882-8)。

vi)评估载体和结合物与血浆蛋白(白蛋白等)的结合速率，并 研究它们对这些分子的脑摄入的影响。

vii)静脉内给药和评估随时间变化的组织分布(脑和其他器官)。

此外，还测定了这些各种肽穿过血液-视网膜屏障(BRB)的K_in。

SEQ ID NO：11的K_in＝1.2±0.2x 10^-4ml/s/g.

SEQ ID NO：48的K_in＝2.4±0.3x 10^-4ml/s/g

SEQ ID NO：73的K_in＝0.0±0.0x 10^-4ml/s/g

SEQ ID NO：72的K_in＝11.5±3.3x 10^-4ml/s/g

SEQ ID NO：74的K_in＝1.8±0.2x 10^-4ml/s/g

因此，通过运载的达拉根(SEQ ID NO：72)进行的BRB穿过与 其非运载的游离形式(SEQ ID NO：74)相比，增加了6.39倍。