牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品及其制备方法

摘要

本发明涉及一种牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品及其制备方法。本发明所涉及的牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品是利用由我国田间自然感染牛布鲁氏菌病的阳性血清作为候选物，通过效价筛选、分装、冻干等工艺过程制备牛布鲁氏菌病阳性血清，并以VLA获得的牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品为参比进行补体结合试验、试管凝集试验和虎红平板凝集试验测定其效价，经过均一性检验、稳定性试验、协作标定和数据统计，保证效价定值准确而制备出牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品。

说明书

技术领域  本发明涉及牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品及其制备方法，属于标准物质 技术和兽用生物制品技术领域。

背景技术  牛布鲁氏菌病通常由牛型布鲁氏菌(前称流产布鲁氏菌)引起，其感染呈全 球趋势，给世界上很多国家和地区带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列 为三类动物传染病。目前，血清学检查是牛布鲁氏菌病诊断的常用方法，为了促进牛布鲁氏 菌病诊断试验的国际一体化和抗原标准化，OIE已经研制出国际标准血清(可从OIE的布鲁氏 菌参考实验室即英国卫桥VLA获得)，也称之为基准标准品，各国实验室用国际标准品溯源制 备各自的国家标准品，用于标定牛布鲁氏菌病补体结合试验、试管凝集试验和虎红平板凝集 试验。目前，可从VLA获得的牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品是通过实验室免疫一头牛6年 后制备完成的(The Second International Standard for Anti-Brucella abortus Serum.Ian Davidson，C.Nancy Hebert & W.J.Brinley Morgan.Bull.Org.mond.Sante，Bull.Wld HIthi Org.1969，40，129-140)。本发明是通过采集田间自然感染牛布鲁氏菌病的阳性血清制备完 成的，使得制备周期缩短，节约了成本。而且，标准品的质量要求高，制备方法和检验或标 定方法严格，有关的制备程序和标定方法至今未见报道。

发明内容：

本发明的目的是建立国家级牛布鲁氏菌病阳性血清标准品，用于标定我国的牛布鲁氏菌 病补体结合试验、试管凝集试验和虎红平板凝集试验。

本发明是通过以下技术路线来实现的，即是通过采集田间自然感染牛布鲁氏菌病的阳性 血清作为候选物，通过效价筛选、分装、冻干等工艺过程制备牛布鲁氏菌病阳性血清，以补 体结合试验、试管凝集试验和虎红平板凝集试验测定其效价，经过均一性检验、稳定性试验 和协作标定定值以制备出牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品。

本发明的详细描述：

一、牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品候选物的制备

田间自然感染牛布鲁氏菌病的牛数头，分别按常规方法无菌采取血液并收集到经过灭菌 的量筒中，置20℃左右室温4小时，待血液凝固后每个盛血量筒无菌操作加压铜。静置，待 血清析出后，取上清，4000r/min离心20min分离血清。

二、牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品候选物的鉴定

1、无菌检验

按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用 生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，本发明以下简称《规程》)规定方法 进行。

2、效价测定：

按以下“附录A”、“附录B”、“附录C”的方法分别进行补体结合试验、试管凝集试 验和虎红平板凝集试验进行效价测定。在2次以上重复测定效价均相同的基础上，根据效价 测定试验结果确定该阳性血清的补体结合试验效价、试管凝集试验效价和虎红平板凝集试验 效价。

附录A  牛布鲁氏菌病补体结合试验(Complement Fixation Test，CFT)血清效价测定

1工作液制备

1.12个单位溶血素稀释按溶血素使用说明进行稀释。

1.22个单位补体稀释。

1.2.1补体滴度测定(每次试验当天都要测定补体滴度)。

1)1∶10补体稀释。

2)制备致敏红细胞：在烧杯中加20mL 2.5％绵羊红细胞悬液，在磁力搅拌下将20mL 2 个单位溶血素慢慢加入，为了充分致敏，混合后在室温下用磁力搅拌器搅拌15分钟。

3)按表1进行补体滴度程序。

表1  补体滴度程序

4)判定结果：产生完全溶血且补体量最少的管号定为一个恰定单位，前一管(含有较多 补体的管)为一个完全单位，按照公式1计算出补体稀释倍数X。

1个单位补体量(Y)/10＝40(最终反应补体体积)/补体稀释倍数(X)

式中Y为一个完全单位补体量

1.2.22个单位补体稀释：按一个单位补体稀释倍数X进行2个单位补体稀释。

1.3抗原稀释：按抗原使用说明进行稀释。

2补体结合试验：

2.1被检阳性血清及国际标准阳性血清稀释及灭能：

2.1.1被检阳性血清灭能，即在58～59℃水浴中加温30min。试验时将被检阳性血清10 倍稀释后再进行对倍稀释，即1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640(备注：如 果稀释阳性血清浓度不合适，需要根据试验结果做适当调整)。

2.1.2VLA国际标准阳性血清以生理盐水进行10倍稀释，即阳性血清20μL+生理盐 水180μL，灭能，即在58～59℃水浴中加温30分钟。试验时10倍稀释血清再进行5倍稀释， 即1∶10阳性血清200μL+生理盐水800μL，获得1∶50倍稀释的国际标准阳性血清，50 倍稀释的国际标准阳性血清再分别进行1∶2、1∶3、1∶4、1∶6、1∶8和1∶12倍稀释获得 最终稀释倍数为1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400和1∶600倍的国际标准阳性血 清稀释液。

2.2按表2进行补体结合试验

表2  补体结合试验程序

2.3补体对照：2个单位补体对倍稀释为1个单位和1/2个单位

表3  补体对照配制表

2.4补体结合试验结果判定

判定标准：100％溶血即反应孔完全溶血，且底部无红细胞沉积，记做#；75％溶血即反 应孔大部分溶血，且底部有少许红细胞沉积，75度倾斜反应板时沉积红细胞不流淌，记做+ ++；50％溶血即反应孔有部分溶血，且底部有红细胞沉积，75度倾斜反应板时沉积红细胞 不马上流淌，记做++；25％溶血即反应孔有部分溶血，且底部有红细胞沉积，75度倾斜反 应板时沉积红细胞马上流淌，记做+；不溶血即反应孔不溶血，且底部有红细胞沉积，75度 倾斜反应板时沉积红细胞马上流淌，记做-。

反应后观察各对照孔结果如下时，即可记录试验结果，否则，补体效价应重新测定，并 重新进行补体结合试验。即2个单位补体对照孔呈100％溶血，1个单位补体对照孔呈50％ 溶血，1/2个单位补体对照孔呈不溶血。

判定试验结果时，与国际标准阳性血清1/200倍稀释孔反应结果一致的被检血清反应孔 的稀释倍数即为被检血清的效价。

附录B牛布鲁氏菌病血清凝集试验(Serum agglutination Test，SAT)(试管法)

1工作液制备

1.1工作用抗原稀释：按抗原使用说明进行稀释。

1.2被检阳性血清国家标准品候选物及VLA国际标准阳性血清稀释：

1.2.1被检阳性血清稀释：试验时将被检阳性血清以0.5％石炭酸生理盐水10倍稀释后 再进行连续对倍稀释，即1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640(备注：如果稀 释阳性血清浓度不合适，需要根据试验结果做适当调整)。

1.2.2VLA国际标准阳性血清稀释：试验时将VLA国际标准阳性血清以0.5％石炭酸生理 盐水进行10倍稀释，即阳性血清20μL+0.5％石炭酸生理盐水180μL。试验时10倍稀释 血清再进行20倍稀释，即1∶10阳性血清200μL+0.5％石炭酸生理盐水3800μL，获得 1∶200倍稀释的国际标准阳性血清，再分别进行1∶2、1∶3、1∶4和1∶6倍稀释获得1∶400、1∶600、 1∶800和1∶1200倍的国际标准阳性血清稀释液。

2试管凝集试验方法

被检血清各稀释液和工作用试管凝集试验用抗原用1mL移液管各加0.5mL于试管中，摇 匀，置37℃温箱反应24小时后取出观察试验结果。

试验同时，20倍稀释抗原用0.5％石炭酸生理盐水对倍稀释后按表1制作标准比浊管。

表4  标准比浊管配制表

  管号   1   2   3   4   5   1/40倍抗原稀释液(mL)   0   0.25   0.5   0.75   1   0.5％石炭酸生理盐水(mL)   1   0.75   0.5   0.25   0   记录符号   #   +++   ++   +

3试验结果判定标准

将试验试管与标准比浊管对比，观察试管中液体柱的透明程度。与用标准比浊管的透明 度一致的，则以相应比浊管的“+、-”符号记录试验管结果。若与标准比浊管的透明度不 一致的，则以透明度相近比浊管的“+、-”符号记录试验管结果，并根据对透明度相差程 度的判定，在上述符号的左上角用“+、-”号作角标作为辅助表志，其中“+”号表示透 明度强，“-”号表示透明度差。

判定试验结果时，与国际标准阳性血清1∶600倍稀释孔反应结果一致的被检阳性血清反 应孔的稀释倍数即为被检阳性血清的效价。

附录C牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(Rose-Bengal Plate Agglutination Test，RBT)

1工作液制备

1.1被检阳性血清的稀释试验时以0.5％石炭酸生理盐水将被检阳性血清进行10倍稀 释，即阳性血清50μL+0.5％石炭酸生理盐水450μL。再将10倍稀释血清对倍稀释，即 1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640(如果稀释阳性血清浓度不合适，需要根据 试验结果做适当调整)。

1.2VLA国际标准阳性血清以0.5％石炭酸生理盐水进行10倍稀释，即阳性血清20μL+ 0.5％石炭酸生理盐水180μL。试验时10倍稀释血清再进行对倍稀释至80倍。

2虎红平板凝集试验方法(每个血清样品每次试验时做2个重复)

备一矩形洁净的玻板或白瓷板，划分成每格约为4cm2的方格，分别加入30μL每一稀释 度的血清与30μL虎红平板凝集抗原于各格中，用牙签将各格的血清和抗原混匀，混匀时每一 小格换1支牙签。抗原和血清混匀后，于4min内记录反应结果。

3反应结果判定标准

“-”表示无凝集，呈均匀粉红色；“+”表示稍能查到凝集，稍有卷边形成，凝集物 间液体呈红色；“++”表示形成较明显卷边，凝集块间液体稍清亮；“+++”表示凝集 反应较强；“#”表示凝集块呈菌丛状，凝块间液体清亮明显。

与标准阳性血清1/40倍稀释孔反应结果一致为“+”的被检血清反应孔的稀释倍数即为 被检血清的效价。

3、候选物的选择

若连续重复测定3次以上，试验结果完全一致，且阳性血清的补体结合试验效价达1∶200 倍以上、试管凝集试验效价达1∶600倍以上和虎红平板凝集试验效价达1∶40倍以上则该阳性 血清即可作为牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的候选物。

4、分装、冻干、熔封

将符合要求的候选物先经0.4μm无菌滤膜加压过滤，再经0.22μm无菌滤膜加压过滤； 随后用瓶颈分液器(分装精度为±0.01mL)无菌分装至1mL灭菌长安瓿，按常规方法冻干后 抽真空、熔封。

三、牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的检验

1.物理性状冻干阳性血清国家标准品为淡黄色疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅 速溶解。

2.无菌检验按照《规程》规定的方法进行无菌检验或纯粹检验，应无菌生长。

3.真空度测定按照《规程》规定的方法进行真空度检验，应符合规定。

4.剩余水分测定依据《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○ ○五年版三部.中国农业出版社，2006，本发明简称《中国兽药典》)以真空烘干法进行剩 余水分测定，应不超过标准规定的4％。

5.效价测定随机抽取规定数量的样品以英国卫桥(Veterinary Laboratories Agency， VLA)牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品为参比，分别进行RBT试验、SAT试验和CFT试验测 定其虎红平板凝集效价、试管凝集效价和补体结合试验效价。

6.均一性检验随机抽取规定数量的样品，用英国卫桥(VLA)牛布鲁氏菌病阳性血清国 际标准品作参比，分别进行RBT、SAT试验和CFT试验测定其虎红平板凝集效价、试管凝集效 价和补体结合试验效价，试验结果应一致。

7.稳定性试验用热加速稳定性试验测定，检查在高温条件下，样品放置的时间，并以 此数据作为依据，为下一批稳定性试验作基础。

8.定值(协作标定)中国兽医药品监察所相关部门作为组织单位负责协作标定工作， 制定方案后，选择3个以上具有对布鲁氏菌病血清学试验富有经验的实验室，每个实验室用 3个样品，每个样品重复2次，同时用国际标准品做参比，各协作标定单位按照协作标定方 案的要求进行标定，并将实验结果交给组织单位。

(1)组织单位将实验结果进行整理后，确定协作标定数值。

(2)国际单位确定通过协作标定结果，计算出1mL牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品 的国际单位含量，以此作为国家标准品的确定值。

本发明的积极意义：

本发明涉及一种牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品及其制备方法。本发明所涉及的牛布 鲁氏菌病阳性血清国家标准品是通过利用由我国田间自然感染牛布鲁氏菌病的阳性血清作为 候选物，通过效价筛选、分装、冻干等工艺过程制备牛布鲁氏菌病阳性血清，并通过以VLA 获得的牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品为参比进行补体结合试验、试管凝集试验和虎红平 板凝集试验测定其效价而制备出牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品。本发明的方法使标准品 制备更加科学、严谨、完善，按照标准品制备程序使每一个步骤科学严谨，经过协作标定， 数据统计，保证效价定值准确。本发明是通过采集田间自然感染牛布鲁氏菌病的阳性血清制 备完成的，使得制备周期大大缩短(省去了数年的免疫血清的制备时间)，节约了成本。

实施例1

牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的制备

1候选物的制备

黑龙江省某农场田间自然感染牛布鲁氏菌病的奶牛4头，以颈动脉采血法采血于无菌的大 量筒中，置20℃左右室温4h，待血液凝固后每个盛血量筒无菌操作加压铜。静置，待血清析 出后，取上清，4000r/min离心20min分离血清。

2候选物筛选

2.1无菌检验：按照《规程》的规定的方法进行无菌检验或纯粹检验，为无菌生长。

2.2效价测定

以国际标准血清为参比进行RBT试验测定4份血清的虎红平板凝集效价，试验结果见表 5。结果表明：4份血清均为牛布鲁氏菌病阳性，而且3#血清的虎红平板凝集效价最高。

表5  候选物筛选虎红平板凝集效价测定结果

#，完全凝集；+++，75％凝集；++，50％凝集；+，25％凝集；-，完全不凝集

以国际标准血清为参比进行SAT试验测定4份血清的试管凝集效价，试验结果见表2。 结果表明：4份血清均为牛布鲁氏菌病阳性，而且3#血清的试管凝集效价最高。

表6  候选物筛选试管凝集效价测定结果

#，完全凝集；+++，75％凝集；++，50％凝集；+，25％凝集；-，完全不凝集

以国际标准血清为参比进行CFT试验测定4份血清的试管凝集效价，试验结果见表7。 结果表明：4份血清均为牛布鲁氏菌病阳性，而且3#血清的补体结合效价最高。

表7  候选物筛选补体结合试验效价测定结果

#，完全不溶血；+++，25％溶血；++，50％溶血；+，75％溶血；-，完全溶血

综合上述RBT、SAT和CFT结果发现，4份牛血清均为牛布鲁氏菌病阳性血清，其中的3 #血清的虎红平板凝集效价、试管凝集效价和补体结合效价均最高，所以选择编号为3#的牛 布鲁氏菌病阳性血清来制备牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品

3分装、冻干、熔封

将符合要求的候选物先经0.4μm无菌滤膜加压过滤，再经0.22μm无菌滤膜加压过滤； 随后用瓶颈分液器(分装精度为±0.01mL)无菌分装至1mL灭菌长安瓿，按常规方法冻干后 抽真空、熔封。

实施例2  牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准物质的成品检验和协作标定

1.成品检验

(1)物理性状所有安瓿冻干阳性血清为淡黄色疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后 迅速溶解，溶解后为淡黄色澄明液体。

(2)无菌检验按照《规程》规定的方法进行无菌检验或纯粹检验，无菌生长。

(3)真空度测定按照《规程》规定的方法进行真空度检验，符合规定。

(4)剩余水分测定依据《中国兽药典》的规定以真空烘干法进行剩余水分测定，结果 水分含量分别为2.8％、2.9％、2.4％和2.4％，均低于4％，符合要求。

(5)效价测定随机选取5支冻干血清以国际标准血清为参比分别进行RBT、SAT和CFT 试验测定其效价，结果见表8。

表8  牛布鲁氏菌病阳性血清冻干后效价测定结果

(6)均一性检验随机选取15支冻干血清以国际标准血清为参比分别进行RBT、SAT和 CFT试验测定其效价，结果见表9。试验结果表明，15支冻干血清的虎红平板凝集效价、试 管凝集效价和补体结合效价分别为1∶160“+”、1∶2400“++”、1∶800“++”，说明该冻 干血清的均匀性良好。

表9  牛布鲁氏菌病阳性血清冻干后均一性检验结果

(7)稳定性试验随机选取规定数量的样品分别放56℃温箱、37℃温箱和25℃温箱在 规定时间取样品分别进行CFT和SAT试验测定其效价。试验结果见表10。稳定性试验结果表 明，冻干血清56℃温箱保存3周时其补体结合效价和试管凝集效价开始逐渐下降，37℃温箱 保存8周时其补体结合效价和试管凝集效价开始逐渐下降，25℃温箱保存9周时其补体结合 效价和试管凝集效价开始逐渐下降。

表10  牛布鲁氏菌病阳性血清冻干后稳定性试验结果

-，未检测

2.协作标定

汇总四家协作标定单位的试验结果表明(见表11)，以国际标准品为参比测得该牛布鲁 氏菌病阳性血清国家标准品的补体结合效价为1∶800“++”、试管凝集效价为1∶2400“++”、 虎红平板凝集效价为1∶160“+”，该标定结果与研制该国家标准品时标定的结果一致。

表11  成品检验协作标定结果

以国际标准品为溯源标化待检牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的补体结合效价、试管 凝集效价和虎红平板凝集效价分别为1∶800“++”、1∶2400“++”、1∶160“+”，国际 标准品含有1000IU/安瓿，根据国际标准，按其试管凝集试验计算其国际单位含量为4800IU/ 安瓿。