红曲菌丝体提取物在制备预防骨质疏松保健食品及药品的应用

摘要

本发明涉及采用红曲液态发酵工艺提取红色素后剩下的红曲菌丝体的提取物在制备预防骨质疏松保健食品及药品方面的应用。研究证明采用大米等原料用红曲霉经液体深层发酵后，产生的红曲发酵产物，经用60～70％乙醇提取红曲红色素后，剩余的红曲霉菌丝体经酸处理或碱处理后的提取物具有降血脂和预防骨质疏松的作用，可作为药品或食品添加剂，用于制备预防骨质疏松的药品或保健食品。

说明书

技术领域  本发明涉及采用红曲液态发酵工艺提取红色素后剩下的红曲菌丝体的提取 物在制备预防骨质疏松保健食品及药品方面的应用。

背景技术  骨质疏松症是老年人最常见的疾病，其发病率居常见病、多发病的第七位， 全世界约2亿人患有骨质疏松。在美国和西方国家中，在年龄超过55岁绝经后的女性中， 有一半的人患程度不同的骨质疏松症，而在65岁以上的老年人中患骨质疏松者高达95％ 以上。随着科学的发展和人类的进步，人均寿命不断延长，老年人口迅速增加，骨质疏 松的发病率也随着出现迅速的增加。据欧美一些国家的统计结果表明，目前骨折的发病 率每10年约增长40％～60％。预计至2050年全世界65岁以上的老年人将由目前3.23亿增 加到15.55亿，届时髋骨骨折发生人数也将由目前的166万增加到626万，其中亚洲、 拉丁美洲、中东和非洲国家的患者将占70％以上。我国是世界上人口最多的国家，其中老 年人口占亚洲老年人口的1/2和世界人口的1/5。北京、上海和成都3市的骨质疏松流行 病学调查结果显示，60-69岁年龄段骨质疏松的发生率女性与男性分别为60％和30％左右。 我国人口基数大，骨质疏松患者估计已达6000万～8000万例，这给家庭和社会带来严重 的负担。另据统计2000年全国65岁以上的人有1.3亿，占全国人口的10.7％，已成为典 型的老年型国家。而患有骨质疏松症的患者在这些人群中约占90％，而髋骨骨折的病人在 1年内将有12％～40％死于各种合并症。在存活者中也有50％的人行动不便。这不但给 病人造成了严重的身心摧残，同时也给家庭和社会增加了巨大的人力及财力负担。因此， 防治骨质疏松是抗衰老，延长寿命，保证人民的生活质量的一个十分迫切的研究课题。

红曲霉的应用在中国已有上千年历史，它是生产红曲酒、红曲米、功能性红曲和天 然色素的主要菌种。近年来，随着人们对合成食品添加剂和化学药物对人体毒副作用的 认识，世界各国掀起了食用绿色食品和使用天然药物的热潮，红曲作为药食兼用的天然 制品，引起了极大的关注。自1979年，日本学者远藤章从红曲霉(monaseusruber)中发现 洛伐他汀生理活性物质后，引起全世界科学家的关注，1980～1990年代红曲功能性研究达 到高峰，红曲的降血脂、降胆固醇、降血压、降血糖、抗菌性等功能相继被发现。美国 默克公司开发成功第一个用于临床的洛伐他汀调血脂药物，于1987年上市，目前他汀类 药物己成为高血脂、冠心病人的首选药物，降脂药已成为世界第二大治疗药物。红曲目 前的生产工艺主要是为提取红曲红色素而设计，一般均是选择优质大米为原料，采用现 代生物技术分离出优质的红曲霉菌，再经液体深层发酵，产生红曲发酵产物，这些产物 经过脱水，压干等工艺，用60～70％乙醇提取红色素，通常这些提取工艺提纯红色素后连 红曲中降血脂成分洛伐他汀也一起提走，剩下的渣(红曲菌丝体)留下来的洛伐他汀极 少或几乎没有，这一生产过程中会产生大量的红曲菌丝体渣，这些红曲菌丝体渣一般视 为无用废弃物丢弃掉，这不仅造成了环境的污染，更是对资源的极大浪费。我们在对东 莞天益生物科技公司生产的两批红曲菌丝体的检测中发现，其废弃的红曲菌丝体虽然没 有找到能特异性对抗抑制HMC-CoA还原酶活性的洛伐他汀，但红曲菌丝体提取物中的还 有脂肪酸和多糖类成分，采用这些废弃的红曲菌丝体，经过酸处理或碱处理后，提取出 的红曲菌丝体提取物进行降血脂和预防骨质疏松的动物实验，意外发现这些红曲菌丝体 提取物也有很好的降血脂作用和预防骨质疏松的作用，我们的研究发现这些红曲菌丝体 提取物不但有非常显著的降低血清胆固醇的作用及升高高密度脂蛋白的作用，而且对高 脂血症诱发的骨质疏松有明显的预防作用，提示了这些提取了红曲红色素的红曲菌丝体 中，必定还有一些成分对骨质疏松有预防作用，这些红曲红曲菌丝体提取物应该是预防 骨质疏松的一种非常好的药品或食品添加剂，把这些红曲菌丝体提取物进一步提纯后， 按传统的中药生产工艺，做成片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂等可供临床应用的药物剂型， 可供患有骨质疏松疾病的患者临床应用。此外，把这些红曲菌丝体提取物添加进饼干原 料中，生产出的饼干进行降血脂及预防骨质疏松的动物实验，也证明了这些饼干有明显 的降血脂及预防骨质疏松的作用，可作为一种预防骨质疏松的良好的保健食品。

发明内容  发明采用大米等原料用红曲霉经液体深层发酵后，产生的红曲发酵产物，经 用60～70％乙醇提取红曲红色素后，剩余的红曲霉菌丝体经酸处理或碱处理后的提取物具 有降血脂和预防骨质疏松的作用，可作为药品或食品添加剂，用于制备预防骨质疏松的 药品或保健食品。

本发明提到的红曲菌丝体提取物可以通过下述方法制备：

(1)取大米等原料用红曲霉经液体深层发酵7到10天后，产生的红曲霉发酵的液 体产物，通过压榨机把水分压去，然后，60～70％乙醇提取红色素，提取完红色素的红曲 菌丝体，烤干，按每公斤加入1％的醋酸0.1～0.5升，在25℃室温下维持24小时以上，按 总重量5～8倍加水提取，提取两次，每次1小时，回收两次提取液，浓缩为干膏，粉碎 为细粉，室温保存；

(2)取大米等原料用红曲霉经液体深层发酵7到10天后，产生的红曲霉发酵的液 体产物，通过压榨机把水分压去，然后，60～70％乙醇提取红色素，提取完红色素的红曲 菌丝体，烤干，按每公斤加入1％的碳酸氢钠0.1～0.5升，在25℃室温下维持24小时以上， 按总重量5～8倍加水提取，提取两次，每次1小时，回收两次提取液，浓缩为干膏，粉 碎为细粉，室温保存；

(3)取大米等原料用红曲霉经液体深层发酵7到10天后，产生的红曲霉发酵的液体 产物，通过压榨机把水分压去，然后，60～70％乙醇提取红色素，提取完红色素的红曲菌 丝体，烤干，按总重量5～8倍加水提取，提取两次，每次1小时，回收两次提取液。浓缩 为干膏，粉碎为细粉，室温保存。

本发明按上述方法制备的红曲霉菌丝体提取物，可以按传统的中药生产工艺，做成 片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂等可供临床应用的药物剂型，供患有骨质疏松疾病的患者 临床应用。

本发明按上述方法提取的红曲霉菌丝体提取物，可作为饼干添加剂加入饼干的生产 配方中，生产出含有红曲渣的饼干食品或保健食品，供有患有骨质疏松疾病的患者作为 健康食品应用。在饼干产品的添加量在5～30％范围，以10～20％为佳。

本发明按上述方法提取的红曲渣产品，可作为饮料添加剂加入饮料的配方中，生产 出含有红曲提取物的饮料，供有患有骨质疏松疾病的患者作为健康食品应用。在饼干产 品的添加量在5～30％范围，以10～20％为佳。

具体实施方式：

实施例一：

1材料与方法

1.1实验动物及饲养条件

SPF级3月龄雄性SD大鼠62只，体重(251.8±18.3)g，由广东省医学实验动物中心 提供，医学实验动物合格证号：粤监证字2008A020。

饲养条件：饲养时室内温度保持24℃～28℃，湿度在50％～60％，专室分笼饲养， 隔日更换垫料，自由摄水，摄食(标准饲料喂养)，每周称体重一次。

1.2实验设计与分组

选取3月龄清洁级雄性SD大鼠62只，将大鼠的体重应用Microsoft Excel产生随机数列， 并利用产生的随机数列进行随机分成7组(见表1.1)：

表1.1  实验动物分组及给药剂量

分组说明：

BAS组：基础年龄对照组，实验0天，不给用，按后面的实验方法取出检测，做基础 对照；

除BAS和Cont组外，其余组均于实验第53～55d期间连续3d灌胃维生素D₃注射液 (1×10⁶U·kg^-1·d^-1)；

(1)Cont组：实验开始时按表1.1给药方法连续灌胃，灌胃时间与V.H组同步；

(2)V.H组：实验开始时按表1.1给药方法连续灌胃38d。常规饲养2w后，维生素D₃注射 液(1×10⁶U·kg^-1·d^-1)连续灌胃3d。观察5d后按表1.1给药方法灌胃，连续4w；

(3)V.H+XZK组：实验开始时按表1.1给药方法连续灌胃，灌胃时间与V.H组同步；

(4)V.H+RK组：实验开始时按表1.1给药方法连续灌胃，灌胃时间与V.H组同步；

(5)V.H+Epi.组：实验开始时按表1.1给药方法连续灌胃，灌胃时间与V.H组同步；

(6)V.H+R.E组：实验开始时按表1.1给药方法连续灌胃，灌胃时间与V.H组同步。

1.3药物的制备与配制

1.3.1血脂康颗粒混悬液

将市售血脂康药物颗粒配制成实验所需的血脂康颗粒混悬液，每1粒市售血脂康胶 囊药物(0.3g/粒)加蒸馏水14ml。4℃冰箱保存备用。一周内使用。

1.3.2红曲菌丝体提取物混悬液

取本发明制备的红曲菌丝体提取物粉碎为细粉，每2g红曲细粉加7ml蒸馏水配制成 实验所需的红曲菌丝体提取物混悬液。4℃冰箱保存备用，一周内使用。

1.3.3淫羊藿醇提液

淫羊藿醇提液的制备：淫羊藿，粉碎，加15倍70％乙醇浸泡24小时，加热回流提 取2次，过滤，保留滤液。滤渣再加40％乙醇浸泡24小时，加热回流提取1次，过滤， 保留滤液，合并3次滤液，回收乙醇，浓缩至100％。(1g生药/ml)浓度。4℃冰箱保存备 用。

1.3.4红曲菌丝体提取物与淫羊藿混悬液

淫羊藿醇提液和红曲菌丝体提取物混悬液制成后等体积混合，4℃冰箱保存备用。

1.4实验方法

1.4.1大鼠体内荧光标记方法及动物取材

所有动物每周称量体重一次；根据体重调整灌胃剂量。在实验结束前第14d、13d各行 颈部皮下注射盐酸四环素(37.5mg·kg^-1·d^-1)，作为第1次荧光标记，在实验结束前第4d、3d 各行颈部皮下注射calcein(10mg·kg^-1·d^-1)作为第2次荧光标记，以在骨表面形成黄色和绿色 双荧光标志，两次荧光标记间隔时间为10d。实验结束时，用3％戊巴比妥钠(4mg·kg^-1)腹 腔注射麻醉大鼠，心脏取血处死大鼠后，沿主动脉瓣至髂动脉分支处剥离全长动脉，取 胸主动脉，用于形态学检查；迅速取下双侧股骨、左侧胫骨，去除肌肉，按下述方法进 行骨形态计量学指标、骨生物力学参数、骨有机质和矿物质含量测定。

1.4.2大鼠胸主动脉切片的制作

取胸主动脉下段约1cm立即用10％中性福尔马林缓冲液固定24h，按照以下顺序进行 梯度脱水，透明，包埋：95％乙醇(1.5h)，95％乙醇(1.5h)，100％乙醇(0.5h)，100％乙醇(0.5h)， 二甲苯(15min)，浸蜡(3h)，包埋。修整蜡块，备用。切片：石蜡块固定于切片机上，切4μm 厚度切片，展片于甘油蛋白涂抹过的载玻片上，欲行HE染色及von Kossa染色。

1)HE染色过程如下：

二甲苯I(10min)，二甲苯II(10min)，100％乙醇(3min)，100％乙醇(3min)，95％乙醇 (2min)，80％乙醇(2min)，70％乙醇(2min)，蒸馏水洗，苏木素(10min)，蒸馏水洗，盐酸 乙醇(3s)，立即流水洗(30min～2h)，蒸馏水洗，70％乙醇(2min)，80％乙醇(2min)，伊红 (5min)，蒸馏水洗，风筒吹干，二甲苯浸润，封片。

2)von Kossa染色过程如下：

二甲苯I(10min)，二甲苯II(10min)，100％乙醇(3min)，100％乙醇(3min)，95％乙醇 (2min)，80％乙醇(2min)，70％乙醇(2min)，蒸馏水洗，5％AgNO₃水溶液(10min)，紫外灯 下照射(1～2h)，蒸馏水洗，1％中性红(3min)，蒸馏水洗，风筒吹干，二甲苯浸润，封片。

1.4.3血清生化指标的测定方法

实验第29d、39d眼眶取血动态监测血清指标确认血脂水平，末次给药后禁食12h， 称量体重，3％戊巴比妥钠腹腔注射(4mg/kg)麻醉后，经心脏取血8～10ml，静置4h后， 3500rpm/min离心10min，分离上层血清，分装血清，分别用于检测：血清总胆固醇(TC)、 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、甘油三酯(TG)、钙(Ca)、磷 (P)的含量，采取比色法进行检测，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4.4不脱钙骨组织切片制备

取血后迅速取出大鼠右胫骨，分离、除净附着肌肉及结缔组织，用慢速锯在近端作 矢状打开髓腔，放入10％中性福尔马林缓冲液固定，不超过24h。然后按以下方法脱水， 脱脂作塑料包埋。用硬组织切片机分别切下不脱钙4μm和9μm切片，4μm切片用硝酸银 染色封片，进行骨计量学静态参数(static paramet-ers)测量。9μm切片不染色封片，作荧 光观察进行骨计量学动态参数(dynamicpara-meters)测量。制备详细方法：

(1)包埋前单体(甲基丙烯酸甲酯)的洗脱方法

①将1500ml的甲基丙烯酸甲酯倒入分液漏斗(3L)中。②加入5％NaOH溶液500ml， 充分摇匀，静置，待溶液分层后，放出下层溶液，弃去。③重复操作①三次，三次的总 量与单体量相当(洗脱阻滞剂)。④加等量的水重复操作②三次(洗脱NaOH)。⑤将上述处 理过的单体放入无水CaCl₂(1000ml/500g)中脱水2次。滤纸过滤，收集滤液。⑥-20℃保 存备用，第二天取出看有无冰晶漂浮，无，表明无水可备用，有，则需重新脱水。

(2)胫骨上段包埋前的制备过程

①暴露骨髓腔：将固定液中的胫骨用低速锯锯开，暴露骨髓腔；

②固定与脱水：分别通过70％乙醇1d、70％乙醇1d、95％乙醇2d、100％乙醇1d、 100％乙醇1d五个脱水过程，二甲苯透明1d。

③渗透：先后用浸液I(甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，磁力搅拌 器上搅拌3h。)、浸液II(甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，过氧化笨甲 酰1.0g，磁力搅拌器上搅拌4.5h。)、浸液III(甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯 10ml，过氧化苯甲酰2.5g，磁力搅拌器上搅拌6h。)分别浸透3d。

(3)包埋

用新鲜配置的浸液III(当日新鲜配置)倒入装有浸润好的骨头块容积约为15ml的小瓶 中，倒入的包埋剂约1.5cm高，盖好瓶盖，并在瓶盖上插一注射器针头(注意：针头不可 没入浸液中)，室温过夜。第二天把包埋瓶置入25℃的恒温烤箱中聚合，开始每隔1.5h 上调烤箱温度1℃，最高调至39℃，调整时越往后间隔时间越长，直至包埋块形成，如 包埋过程中产生气泡，可用1ml注射器吸入包埋液打入气泡中，将气泡推出。胫骨上段， 需将其锯开面贴瓶底中央包埋，倒入约3.5cm高的包埋剂即可。

(4)载玻片的制备

①清洗：把玻片在酸缸中浸泡48h，取出，先用自来水冲洗3遍，后用单蒸水冲洗2 遍，双蒸水冲洗4遍，晾干，75％酒精消毒，烘干备用(或者紫外线照射2h，备用)。

②上胶：1000ml蒸馏水中加入9g明胶，加热使明胶溶解，将另配制的4％澄明硫酸 铬钾溶液加入到沸腾的明胶溶液中，不断搅拌混合液，待溶质溶解后，停止加热，待溶 液冷却到50℃左右即可运用；将装入提篮的载波片在50℃的胶液中浸泡2分钟，取出放 入凉片板，凉干备用(可视实际情况调整上胶次数)。

(5)切片

①用石膏打磨机将包埋块打磨成合适大小，并暴露切面，把切面打磨到合适位置。② 将打磨好的包埋块固定在切片机上，滴一滴40％酒精于包埋块待切面润滑一下，右手慢 慢切下，左手用一软毛刷轻轻拨下切片，注意不要弄烂切下的片，然后用毛刷把片转移 到滴有一滴70％酒精的载玻片上，再滴一滴70％酒精，然后慢慢展平切片，盖上一张薄 塑料片，并用滤纸将多余的酒精吸干。③将切好的一组片，用夹子夹紧，放入40℃左右 的鼓风烤箱中烤24～48h左右，取出用橡皮筋绑好备用。④一个标本切两种厚度的片 4μm(薄片)和9μm(厚片)，薄片用于Masson-Goldner Trichrome染色或硝酸银染色，厚片直 接二甲苯透明封片。

(6)骨片染色

4μm的薄片常采用硝酸银染色或Masson-Goldner Trichrome染色，经后者染色后，骨 质为绿色，骨髓为红色，用于观察骨小梁表面的破骨细胞和测量其周长。下面是 Masson-Goldner Trichrome染色过程。

①工作液的准备

A.Weigert he matoxylin工作液：溶液A含Mematoxylin(苏木素精)1g加入95％酒精 100ml中过滤备用；溶液B含29％氯化铁4ml、稀盐酸1ml(用40％的盐酸加蒸馏水1∶4 稀释)，然后加蒸馏水至100ml。将等份的溶液A和溶液B混合即得工作液。

B.Poncean Fuchsin Stock工作液：配制溶液A含Poncean(丽春红)1g加蒸馏水100ml， 溶液B含Acid Fuchsin(品红)1g加蒸馏水100ml；将3份的溶液A和1份的溶液B混合 配成原液，然后将原液用0.2％的醋酸按5∶1的比例稀释成工作液。

C.Phosphotungstic acid-Orange G工作液：将Orange G 2g和Phosphotungstic acid 4g 加入100ml蒸馏水中，用前过滤。

D.Light green工作液：将Light green(亮绿)0.2g和醋酸0.2ml加入100ml蒸馏水中， 用前过滤

②染色过程

①已脱塑的切片放在Weigerts hematoxylin工作液染色，25min，蒸馏水漂洗；② 自来水漂洗，10min；③蒸馏水漂洗；④PoNSean-Fuchsin工作液染色，13-15min；⑤ 1％醋酸漂洗2次，每次1min；⑥新鲜过滤的Orange G液染色7min；⑦新鲜过滤的Light  green染色15-20min；⑧蒸馏水洗，风筒吹干；⑨二甲苯清洗2次，每次2min，封片。

1.4.5皮质骨不脱钙骨磨片制备方法

磨片是将胫骨中段先用锯片机锯成200μm厚的骨片，锯骨时从胫腓韧带联合近侧端 以胫骨干下端与腓骨完全分离为有效骨片，这可尽量减少切片时所造成的误差[47]。共锯 三片，胫腓骨结合处为第一片，接着往下依次为第二片和第三片。用粗糙玻璃将第二片 磨成30μm-50μm的薄片，再用风筒吹干，二甲苯透明后中性树脂封片。测量皮质骨的各 项参数。

1.4.6骨组织形态计量学指标测定

(1)胫骨上段测量范围

从生长板往下画出2.0mm，以避开初级海绵体，再从2.0mm处往下画3.0mm作为 胫骨上段测量范围。

(2)动、静态参数测量和计算

本实验所有参数采用国际通用标准骨组织形态计量学术语命名，用半自动图象数字 化仪直接测出参数的中英文名称、符号及单位等如表1.2所示。但这些参数还不能直接用 于分析骨量、骨结构、骨形成和骨吸收等，要通过国际通用的公式直接测得的参数计算， 才能用于分析。计算参数的中英文名称、符号及计算公式等如表1.2和表1.3所示。

表1.2  松质骨测量参数

1.3松质骨计算参数及计算公式

(3)参数的意义

①静态参数：用来评价药物防治效果，描述骨量多少和骨小梁的形态结构。

骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)：指骨小梁面积占骨组织面积的百分率，反映骨量的多 少。从数学公式上推算，它等于骨小梁宽度与数量的乘积的1/10，也就是说，骨量多少 由宽度和数量二者共同决定。

骨小梁厚度(Tb.Th)：用于描述骨小梁结构形态，解释骨量变化。其变化可影响骨量， 在数量一定的条件下，宽度越宽，骨量越多。

骨小梁数量(Tb.N)：用于描述骨小梁结构形态，解释骨量变化。其变化可影响骨量， 在宽度一定的条件下，数量越多，骨量越多。

骨小梁分离度(Tb.Sp)：指骨小梁之间的平均距离，用来描述骨小梁结构形态。分离 度越大，骨小梁之间距离就越大，骨就越疏松。

②动态参数：动态参数包括骨形成参数和骨吸收参数，通过动态参数，可以了解骨 表面矿化的量和速率，并解释静态参数变化的原因。

骨内膜荧光周长百分率(％L.Pm)：反映进行矿化的骨周长占骨表面总周长的百分率， 也反映成骨细胞的数量。

骨内膜矿化沉积率(MAR)：指每天矿化的宽度。反映骨矿化的快慢，代表成骨细胞的 活性。

骨形成率(BFR/BS)：％L.Pm与MAR的乘积，代表骨表面形成的活跃程度。

骨形成率(BFR/BV)：每年新形成的骨小梁面积占骨小梁总面积的百分比，代表骨形 成和骨转换的活跃程度。此参数越高，表示骨转换也越高。是反映骨形成的一个重要指 标。

骨形成率(BFR/TV)：每年新形成的骨小梁面积占骨组织面积的百分比，代表每年骨 小梁表面新形成骨的总量。此参数与BFR/BS、BFR/BV不同，它受两个因素影响，一是 骨量的多少，骨量越多就提供越多的新骨形成所需的骨小梁表面；二是骨形成活跃程度， 骨形成越活跃，在单位长度上形成的新骨就越多。所以有时虽然骨形成很活跃，但由于 骨量太少，此参数也会下降。从公式推理可得出，BFR/TV等于％Tb.Ar与BFR/BV乘积 的1/100。

1.4.7股骨重量的测定方法

取左侧股骨，除净附着骨上的肌肉和软组织，用AE240电子天平称其湿重后于80℃ 烤箱烘考72h至恒重，称此时骨重可得出股骨干重。

1.4.8骨羟脯氨酸(Hyp)及骨钙(Ca)、骨磷(P)、骨镁(Mg)测定方法

测量左侧股骨重量后，然后将每份骨标本置于10ml安瓿瓶中加入6mol/LHCl 5ml， 酒精喷灯火烧安瓿瓶口密封后置于烤箱中，108℃恒温消化24h后取出过滤，取滤液，然 后将滤液分成两份，一份以1∶400稀释后用ICP(电感偶合等离子体直读光谱仪)测定骨Ca、 骨P、骨Mg等元素的浓度，根据标准品浓度及样品稀释倍数计算出骨Ca、骨P、骨Mg 等元素的含量。另一份滤液稀释10倍后调节pH值至6.8～7.0后按照羟脯氨酸测定试剂 盒方法用酶标仪测定样品中羟脯氨酸的吸光度，依据公式计算出羟脯氨酸的含量。

1.4.9骨密度检测方法

处死大鼠后取大鼠右侧股骨，用生理盐水湿纱布包裹保湿，保存于-20℃。测试时， 将保存的股骨常温解冻，用生理盐水复湿，然后在广州华侨医院核医学科用PRODIGY 型骨密度仪(测量精密度小于1％)测定股骨骨密度得出骨密度值(BMD)。此次实验选取股 骨全作为BMD测量点。将测量后的大鼠股骨依旧用纱布封好，用锡纸包裹后放于-20℃ 保存，待测骨生物力学指标。

1.4.10骨生物力学测定方法

三点弯曲实验

测试时，将-20℃保存的股骨常温解冻，生理盐水复湿。用858Mini Bionix型材料 测试系统分析右侧股骨(三点弯曲实验)的生物力学性能(由南方医科大学生物力学国家重 点实验室协助完成)。

(1)实验方法

将大鼠右侧股骨置于MTS试验机上，用1mm直径的压头，加载速度为0.01mm/s， 跨距(L)为15mm。仪器自动记录每个时刻点的载荷(F)和桡度(d)变化值，绘制载荷-绕度 曲线，并获得弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、弹性模量和刚度系数等。

(2)参数的测量与计算

表1.4  三点弯曲法中生物力学性能参数的计算公式

(3)参数意义

骨强度：骨的结构力学特性，与骨的材料特性有关，也受骨的几何特性(形状、尺寸) 影响。包括：弹性载荷：骨在弹性范围所能承受的最大外力；最大载荷：骨断裂前所承 受的最大外力；断裂载荷：骨断裂时所承受的外力；刚度：又称为外在硬度，为弹性变 形区的斜率，指抵抗骨标本变形的能力，受骨尺寸大小的影响，主要反映骨组织的材料 特性；弹性模量：又称内在硬度。弹性限度内应力和对应的线应变的比值，代表材料的 抗变形的能力。

压缩实验

(1)实验方法

取大鼠脊柱第五腰椎，去除椎骨棘突、横突和关节软骨(注意保护椎体外皮质壳免于 损害，因为它对椎骨力学性能有重要影响。将椎体制做成具有平行末端的约6mm高的圆 柱体，这样制做的标本去除了软骨生长板和初级松质骨，仅由中心的小梁骨和外周的皮 质壳组成。用浮力法测量其体积和高度，并计算横截面积(J)。最后腰椎放在在MTS试验 机上，用1mm直径的压头，以0.01mm/s的速度压入锥体的松质骨中，记录载荷-变形曲线， 获得最大压缩载荷、最大应变、弹性模量、骨硬度等性能指标。

参数的测量与计算

表1.5  压缩法中生物力学性能参数的计算公式

(3)参数意义

最大压缩载荷：试件所能承受的最大外力，是对骨小梁的骨质，结构连续性、皮质 厚度、横截面积和材料质量的综合反映；弹性模量：弹性限度内应力和对应的线应变的 比值，代表材料的抗变形的能力；骨强度：单位骨量所能承受的最大外力，反映骨的材 料质量；骨硬度：单位骨量的弹性模量，反映骨材料的内在抗变形能力，与骨量无关； 最大吸收能量：使标本压缩骨折所需吸收的能量，代表骨材料的韧性，受骨矿盐含量， 胶原纤维走向等骨基质成分变化的影响。

1.5统计学分析

实验数据均用表示，采用SPSS16.0软件，正态分布数据的组间比较采用单因素 方差分析(ANOVA)，方差齐的数据采用LSD检验；方差不齐的数据则采用Tamhane’s T2 检验，以P＜0.05，P＜0.01表示具有统计学意义。

2结果

2.1实验大鼠一般状况

实验大鼠一般状况良好，各组大鼠活动、饮水、摄食正常，凡给予超生理剂量维生 素D3注射液灌胃组，大鼠出现不同程度的精神萎靡不振，食欲不佳，不喜动，个别大鼠 眼眶出血或死亡，但组内个体总数符合统计学要求。

2.2红曲菌丝体提取物对大鼠体重的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠体重的影响见表2.1：

表2.1  红曲菌丝体提取物对大鼠体质量的影响(g)

如表2.1结果所示，除对照组外，其余组在实验开始后，体重较对照组增幅加大，到 第12d、24d时已超过对照组，在实验第52d开始连续3d给予各组大鼠灌服超生理剂量 的维生素D₃注射液后，大鼠体重急剧下降，并表现为食欲不振，精神萎靡等状态，此时 对照组体重高于其余组大鼠，观察5d后，各组大鼠状态好转，继续灌胃高脂乳剂，体重 开始回升，到第74d后，均已基本超过对照组。但大鼠体重各组间无统计学意义。

2.3红曲菌丝体提取物对大鼠血清脂质的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠血清脂质的影响见表2.2和表2.3：

表2.2  红曲菌丝体提取物对大鼠血清脂质的影响

注：^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01 与V.H+XZK组比较。

表2.3  红曲菌丝体提取物对大鼠血清脂质的影响

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01 与V.H+XZK组比较

如表2.2和表2.3所示，

(1)模型+血脂康组与模型组比较，血清总胆固醇、血清低密度脂蛋白胆固醇含量分别 降低约43.6％(P＜0.01)、39.4％(P＜0.01)；血清高密度脂蛋白与血清总胆固醇的比值、血 清高密度脂蛋白与血清低密度脂蛋白胆固醇的比值分别升高约77.8％(P＜0.01)、 237.5％(P＜0.01)。

(2)模型+红曲菌丝体提取物组与模型组比较，血清总胆固醇、血清低密度脂蛋白胆固 醇含量分别降低约49.4％(P＜0.01)、78.0％(P＜0.01)，甘油三酯、血清高密度脂蛋白胆固醇 含量、血清高密度脂蛋白与血清总胆固醇的比值、血清高密度脂蛋白与血清低密度脂蛋 白胆固醇的比值分别升高约9.4％(P＜0.05)、34.0％(P＜0.01)、177.8％(P＜0.01)、 1012.5％(P＜0.01)。

(3)模型+红曲菌丝体提取物组与模型+血脂康组相比，血清低密度脂蛋白胆固醇含量 降低约63.8％(P＜0.01)，血清高密度脂蛋白胆固醇含量、血清高密度脂蛋白与血清总胆固 醇的比值分别升高约50.0％(P＜0.05)、56.3％(P＜0.05)。

(4)模型+淫羊藿组与模型组比较，血清总胆固醇、血清低密度脂蛋白胆固醇含量分别 降低约50.4％(P＜0.01)、81.8％(P＜0.01)；甘油三酯、血清高密度脂蛋白胆固醇含量、血 清高密度脂蛋白与血清总胆固醇的比值、血清高密度脂蛋白与血清低密度脂蛋白胆固醇 的比值分别升高约46.9％(P＜0.01)、27.7％(P＜0.01)、177.8％(P＜0.01)、1575.0％(P＜0.01)。

(5)模型+淫羊藿组与模型+血脂康组相比，血清低密度脂蛋白胆固醇含量降低约 70.0％(P＜0.01)，血清高密度脂蛋白胆固醇含量、血清高密度脂蛋白与血清总胆固醇的比 值分别升高约42.9％(P＜0.05)、56.3％(P＜0.05)。

(6)模型+红曲菌丝体提取物+淫羊藿组与模型组比较，血清总胆固醇、血清低密度脂 蛋白胆固醇含量分别降低约51.6％(P＜0.01)、84.1％(P＜0.01)；甘油三酯、血清高密度脂 蛋白胆固醇含量、血清高密度脂蛋白与血清总胆固醇的比值、血清高密度脂蛋白与血清 低密度脂蛋白胆固醇的比值分别升高约28.1％(P＜0.05)、38.3％(P＜0.01)、188.9％(P＜0.01)、 1862.5％(P＜0.01)。

(7)模型+红曲菌丝体提取物+淫羊藿组与模型+血脂康组相比，血清低密度脂蛋白胆 固醇含量降低约73.8％(P＜0.05)，血清高密度脂蛋白胆固醇含量、血清高密度脂蛋白与血 清总胆固醇的比值分别升高约54.8％(P＜0.01)、62.5％(P＜0.01)。

2.4红曲菌丝体提取物对大鼠血清钙、磷浓度的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠血清钙、磷浓度的影响见表2.4：

表2.4  红曲菌丝体提取物对大鼠血清钙、磷浓度变化

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01 与V.H+XZK组比较

如表2.4结果所示，

(1)模型+血脂康组与模型组比较，血清钙含量无显著性差异，血清磷含量升高约 7.2％(P＜0.01)。

(2)模型+红曲菌丝体提取物组与模型组比较，血清钙含量降低了22.3％(P＜0.05)，血 清磷含量降低约9.6％(P＜0.01)。

(3)模型+红曲菌丝体提取物组与血脂康组相比，血清磷含量降低15.6％(P＜0.01)。

(4)其余组与模型组、模型+血脂康组比较，血清钙、磷含量均无显著性差异。

2.5红曲菌丝体提取物对大鼠动脉病理形态学的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠胸主动脉血管壁影响的形态学变化如下：

对照组：血管壁完整，平滑肌排列整齐而紧密；

模型组：胸主动脉内膜部分已被破坏，细胞排列紊乱；中膜部分区域明显萎缩，弹 性纤维层结构不清，排列疏松，延展性降低，纤维组织增生伴片状或点状钙化，呈较典 型的钙化斑块；

模型+血脂康组，内外壁轮廓尚算完整，弹性纤维收缩或断裂。

模型+红曲菌丝体提取物组，外膜松散，弹力纤维层结构清晰完整，层次分明但延 展性降低；

模型+淫羊藿组：内膜和外膜结构不清，细胞排列紊乱，中膜部分区域弹性纤维层 与肌纤维层结构不清，延展性降低，纤维组织增生伴点状钙化；

模型+红曲菌丝体提取物+淫羊藿组：内膜结构清晰，外膜破损，中膜弹力纤维层结 构清晰，部分断裂，延展性降低，有片状钙化出现；

2.6红曲菌丝体提取物对大鼠胫骨骨形态计量学静态参数的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠胫骨骨形态计量学静态参数的影响见表2.5：

表2.5  红曲菌丝体提取物对大鼠胫骨近端形态计量学静态参数

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01 与V.H+Epi.组比较

如表2.5结果所示：

(1)模型+淫羊藿组与模型组比较，骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)、骨小梁数目(Tb.N) 分别增加约53.8％(P＜0.01)、36.9％(P＜0.05)，骨小梁分离度(Tb.Sp)降低了38.8％(P＜0.01)， 骨小梁厚度(Tb.Th)有增加趋势，但不明显；

(2)模型+红曲菌丝体提取物组与模型组比较，骨小梁面积百分数、骨小梁厚度分别增 加约30.1％(P＜0.01)、19.2％(P＜0.05)；

(3)模型+红曲菌丝体提取物组与模型+淫羊藿组相比，骨小梁面积百分数、骨小梁数 目分别降低了15.42％(P＜0.05)、19.08％(P＜0.05)，骨小梁分离度升高了34.03％(P＜0.05)；

(4)模型+红曲菌丝体提取物+淫羊藿组与模型组比较，骨小梁面积百分数、骨小梁厚 度分别增加约37.8％(P＜0.01)、12.7％(P＜0.05)，骨小梁分离度降低了25.3％(P＜0.05)。

2.7红曲菌丝体提取物对大鼠胫骨骨形态计量学动态参数的影响

红曲菌丝体提取物引起大鼠胫骨骨形态计量学动态参数的变化见表2.6：

表2.6  胫骨近端形态计量学动态参数

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01与V.H+ Epi.组比较

如表2.6所示：

(1)模型+淫羊藿组与模型组比较，骨内膜荧光周长百分率(％L.Pm)、骨内膜矿化沉 积率(MAR)、骨形成率(BFR/TV)、骨形成率(BFR/BS)分别增加约51.8％(P＜0.01)、 83.9％(P＜0.05)、71.0％(P＜0.05)、106.7％(P＜0.05)。

(2)模型+红曲菌丝体提取物组与模型组比较，骨内膜荧光周长百分率、骨形成率 (BFR/TV)、骨形成率(BFR/BS)分别增加约48.6％(P＜0.01)、94.3％(P＜0.05)、70.4％(P＜0.05)。

(3)模型+红曲菌丝体提取物+淫羊藿组与模型组比较，骨内膜荧光周长百分率、骨内 膜矿化沉积率分别增加约37.6％(P＜0.05)，61.3％(P＜0.05)、71.0％(P＜0.05)。

(4)模型+红曲菌丝体提取物+淫羊藿组与模型+淫羊藿组相比，骨形成率(BFR/TV)降 低了39.67％(P＜0.05)。

2.8红曲菌丝体提取物对大鼠股骨骨矿物质和骨有机质含量的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠股骨骨矿物质和骨有机质含量的变化见表2.7：

表2.7  红曲菌丝体提取物对大鼠股骨骨矿物质和骨有机质含量的影响

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H细比较；·P＜0.05··P＜0.01与V.H+ Epi.组比较

如表2.7结果所示，

(1)模型+淫羊藿组与模型组比较，骨钙含量增加约11.3％(P＜0.05)。

(2)模型+功能红曲制剂组与模型组比较，骨钙、骨镁含量分别增加约4.9％(P＜0.05)、 6.3％(P＜0.05)。

(3)模型+功能红曲制剂+淫羊藿组与模型组比较，骨镁含量增加约7.2％(P＜0.05)。

2.9红曲菌丝体提取物对大鼠股骨骨密度的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠股骨骨密度的变化见表2.8：

表2.8  红曲菌丝体提取物对大鼠股骨密度的影响(n＝10)

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01与 V.H+Epi.组比较

如表2.8结果所示，

(1)模型+淫羊藿组与模型组比较，腰椎骨密度升高了22.7％(P＜0.01)

(2)模型+功能红曲制剂组与模型+淫羊藿组相比，腰椎骨密度降低了11.11％(P＜0.05) 与模型组比较，股骨骨密度各组间无显著性差异。

2.10红曲菌丝体提取物对大鼠生物力学参数的影响

红曲菌丝体提取物对大鼠生物力学参数的变化见表2.9和表2.10：

表2.9  红曲菌丝体提取物对大鼠生物力学参数的影响

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；^▲P＜0.05^▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01与V.H+Epi.组比较

表2.10  红曲菌丝体提取物对大鼠生物力学参数的影响

^*P＜0.05^**P＜0.01与Cont组比较；▲P＜0.05▲▲P＜0.01与V.H组比较；·P＜0.05··P＜0.01与 V.H+Epi.组比较

如表2.9和表2.10所示，

(1)模型+淫羊藿组与模型组比较，弹性载荷、最大载荷、弹性模量分别增加了14.9％ (P＜0.05)、12.8％(P＜0.05)、37.5％(P＜0.05)。

(2)模型+红曲菌丝体提取物组与模型组比较，最大载荷、断裂载荷、刚度系数分别 增加了13.2％(P＜0.05)、19.4％(P＜0.05)、31.9％(P＜0.05)。

3讨论

3.1红曲菌丝体提取物对高脂+维生素D3大鼠动脉粥样硬化防治作用的探讨

由实验结果来看：红曲菌丝体提取物治疗高脂+维生素D3大鼠，实验结束后与模型 组大鼠相比，血清TC、LDL-c明显下降，HDL-c、HDL-c/TC、HDL-c/LDL-c明显升高 (P＜0.05)，血管内外壁轮廓基本完整，弹性纤维松散，少数断裂，粥样斑块形成较少；与 血脂康组比，功能红曲制剂降低LDL-c，升高HDL-c作用更明显，血管内钙化斑块更小、 更少。

由此，我们认为红曲菌丝体提取物能有效降低高脂+维生素D3大鼠血脂，防治动脉 粥样硬化。

红曲菌丝体提取物经本课题组其他老师鉴定其中不含洛伐他汀，可能含有多种不饱 和脂肪酸、胆甾醇、辅酶Q₁₀、多种微量元素、氨基多糖、γ-氨基丁酸、膳食纤维等多 种降血压、降血糖成分。实验结果表明，红曲菌丝体提取物可显著降低TC、LDL-c，升 高HDL-c、HDL-c/TC、HDL-c/LDL-c，保护血管，减少动脉粥样硬化斑块的形成。推测 其抗动脉粥样硬化作用机制可能为：1)抑制HMG-CoA还原酶。该红曲菌丝体提取物可 能含有除洛伐他汀外的Monacolins类物质，是羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制 剂活性成分，限制了胆固醇合成的速度；2)通过对胆固醇生物合成限速酶活性的抑制， 从而减少肝细胞内胆固醇的浓度，通过负反馈调节，抑制了肝细胞表面的LDL受体表达 数目和活性，结果使LDL及其前体中间密度脂蛋白(Intermediate density lipoprotein，IDL) 生成减少；改变超低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein，VLDL)的组成，并使其生成 减少，从血清中清除增加；还升高HDL水平，从而达到调脂和降脂作用；3)在调脂的同 时，可能降低冠心病患者体内的炎症因子水平，有利于防止动脉粥样硬化的发生；4)辅 酶Q10的辅助作用。红曲使胆固醇合成减少，则供给细胞膜的胆固醇亦相应减少，致细 胞膜的通透性及不稳定性增加，细胞功能异常，加重了在血液循环中主要靠LDL-c为载 体蛋白进行运输的辅酶Q10的缺乏。该功能红曲制剂中含有辅酶Q10，具有抗氧化、清 除自由基、修复损伤神经元、提高机体免疫力等重要功效^[81]，一定程度上也阻止了动脉 粥样硬化斑块形成。

据此，我们认为红曲菌丝体提取物具有潜在的防治动脉粥样硬化病变发生、发展的 能力，可降低心脑血管疾病的发病率及死亡率，红曲菌丝体提取物的作用可能是多方面 的，其抗动脉粥样硬化的机制还需要进一步探讨，为临床上防治动脉粥样硬化心血管疾 病的产生提供新的理论依据。

3.2红曲菌丝体提取物对高脂+维生素D₃大鼠骨质疏松防治作用

由本实验的结果可知红曲菌丝体提取物灌胃给药高脂+维生素D₃大鼠，实验结束后 与模型组大鼠相比，骨量增加，尤其对松质骨的作用明显，通过增加骨小梁厚度改善了 骨小梁的微观结构，腰椎骨密度增加，骨的生物力学性能有所改善。故我们认为红曲菌 丝体提取物可有效防治高脂+维生素D₃大鼠的骨质疏松。

3.3淫羊藿醇提液对高脂+维生素D₃大鼠骨质疏松防治作用

由实验结果来看：淫羊藿醇提液治疗高脂+维生素D₃大鼠，实验结束后与模型组大 鼠相比，血清TC、LDL-c明显下降(P＜0.01)，HDL-c、HDL-c/TC、HDL-c/LDL-c明显升 高(P＜0.01)，血管弹性纤维较松散，粥样斑块形成较少；与血脂康组比，淫羊藿醇提液组 LDL-c明显下降(P＜0.01)，HDL-c、HDL-c/TC明显升高(P＜0.05)，但纤维组织增生伴点状 钙化，这可能是由于血脂康对血管的保护作用更强所致。实验的结果可知淫羊藿醇提液 治疗高脂+维生素D₃大鼠，与模型组大鼠相比，骨矿物质含量增加，骨矿化作用增强， 骨小梁数目增多，说明淫羊藿醇提液可增加骨量，改善了骨小梁的微观结构。还可使腰 椎骨密度明显增加，骨的生物力学性能有所改善。故此，我们认为淫羊藿醇提液可有效 防治高脂+维生素D₃大鼠的骨质疏松，具有促进骨矿化和骨形成的作用。

3.4红曲菌丝体提取物与淫羊藿醇提液混悬液对高脂+维生素D₃大鼠骨质疏松防治作用

由本实验的结果可知红曲菌丝体提取物与淫羊藿醇提液混悬液灌胃对高脂+维生素 D₃大鼠，实验结束后与模型组大鼠相比，骨形成和骨矿化作用增强，骨小梁结构变粗变 厚，骨钙和腰椎骨密度增加，一定程度上骨的生物力学性能有所改善。故我们认为红曲 菌丝体提取物与淫羊藿醇提液混悬液可有效防治高脂+维生素D₃大鼠的骨质疏松。

实施例二：

按本发明方法制备的红曲霉菌丝体提取物，按传统的中药生产工艺，压成片剂，或 分装为胶囊剂，或制成颗粒剂，冲剂时，按临床服用的剂量供给骨质疏松的动物服用， 可证明其对骨质疏松有明显的预防作用。

实施例三：

本发明按上述方法提取的红曲霉菌丝体提取物，按10％和20％添加剂加入饼干的生 产配方中，生产出含有红曲菌丝体提取物的饼干，经动物实验证明，这种饼干，具有很 好的预防骨质疏松的作用，可供有患有骨质疏松疾病的患者作为健康食品服用。

实施例四：

本发明按上述方法提取的红曲霉菌丝体提取物，按5％、10％和20％添加剂加入饮料 的生产配方中，生产出含有红曲菌丝体提取物的饮料，经动物实验证明，这种饮料，具 有很好的预防骨质疏松的作用，可供有患有骨质疏松疾病的患者作为健康食品应用。