一种超声波辅助酶解制备花生抗氧化肽的方法

摘要

本发明公开了一种超声波辅助酶解制备花生抗氧化肽的方法，包括以下步骤：花生饼粕粉中加入石油醚，恒温浸提除脂，干燥得到脱脂的花生饼粕粉；脱脂的花生饼粕粉中加入蒸馏水，超声波中溶解，得到花生饼粕粉悬浮液；用盐酸溶液调节花生饼粕粉悬浮液的pH值，加入复合植物水解酶ViscozymeL，超声波辅助酶解，得到酶解液，灭酶，冷却到室温；用氢氧化钠溶液调节酶解液的pH值，加入蛋白酶，超声波辅助酶解，灭酶，冷却到室温，离心，冷冻干燥得到花生抗氧化肽。本发明利用超声波辅助酶解，可提高酶解过程中肽的释放量，并使所得花生抗氧化肽的抗氧化活性增强，为花生饼粕蛋白的开发和应用提供理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种超声波辅助酶解制备花生抗氧化肽的方法，属于食品蛋白加工领域。

背景技术

1956年Harman提出自由基理论，认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老、肿瘤和一些其它疾病的根本原因。在食品体系中，过多的自由基存在也会严重影响体系的稳定性，如脂肪氧化使食品在感官特性上不能被人们所接受，另外脂肪氧化产物具有很强生理毒性，危害人体健康。因此，需要抗氧化剂来清除自由基和抑制脂质过氧化。化学合成抗氧化剂如BHA、BHT，虽抗氧化效果良好，但对人体肝、脾、肺有害，具有蓄积性致癌作用。因此，安全、健康、天然的抗氧化剂受到人们的青睐。蕴藏于蛋白质长链中的肽类物质被发现具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功效，其抗氧化活性强于蛋白质和氨基酸，这类活性肽称为抗氧化肽。抗氧化肽的制备主要通过酶解法从天然动植物蛋白质中得到。如Hwang 等研究了脱脂和烘烤花生仁水解物的抗氧化活性，证实花生仁水解物具有良好的抗氧化性能。

花生提取油脂后的副产品花生饼粕，每年产生300多万吨，主要用于饲料。而花生饼粕富含蛋白质，仅以花生饼粕作为饲料并不能充分利用这种蛋白资源。酶解花生蛋白制备抗氧化肽的研究及其产品开发不仅可以充分利用花生蛋白资源，而且可以拓展花生精深加工的领域，具有很大的经济、社会效益。然而，目前状况下，传统的酶解方法存在水解效率低、目标产物活性小、水解时间长以及成本高等问题。因此，急需一种新的酶解方法来替代传统酶解法。

超声波辅助酶解法是近些年新发展起来的一种酶解方法。超声波是一种频率大于20kHz的声波。超声波在作用过程中，会产生空化作用、机械作用、热效应和化学效应。超声波辅助酶解的作用机理是：超声波具有空化作用，产生的气泡经挤压破裂，可以瞬间产生极强的机械剪切力，使蛋白质降解，或者改变蛋白质构象，促使其亲水基团更多地暴露出来，提高蛋白质在水中的溶解度，有利于酶和蛋白质底物结合，最终提高酶解效率。目前，国内外采用超声辅助酶解花生蛋白制备抗氧化肽的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种超声波辅助酶解制备花生抗氧化肽的方法，以本方法所提供的超声波辅助酶解工艺，可提高酶解过程中肽的释放量，并使所得花生抗氧化肽的抗氧化活性增强，为花生饼粕蛋白的开发和应用提供理论基础。

为达到上述目的，本发明采用以下步骤：

（1）花生饼粕粉中加入石油醚，恒温浸提除脂，干燥得到脱脂的花生饼粕粉；

（2）脱脂的花生饼粕粉中加入蒸馏水，超声波溶解得到花生饼粕粉悬浮液；

（3）调节花生饼粕粉悬浮液的pH值，加入Viscozyme L（复合植物水解酶），超声波辅助酶解，得到花生饼粕粉Viscozyme L酶解液，灭酶，冷却到室温；

（4）调节花生饼粕粉Viscozyme L酶解液的pH值，加入蛋白酶，超声波辅助酶解，灭酶，冷却到室温，得到花生饼粕粉蛋白酶酶解液，离心，冷冻干燥得到花生抗氧化肽。

优选地，步骤（1）所述的花生饼粕粉与石油醚的质量与体积比例为：1:10（g/ml），恒温浸提除脂的温度为50℃，时间为2h，通风橱中干燥，干燥时间为5h；

优选地，步骤（2）所述的脱脂的花生饼粕粉与蒸馏水的质量与体积比例为：1:8～1:15，超声波功率为300w，超声波频率为28kHz、45kHz或100kHz，温度为45℃，时间为10min；

优选地，步骤（3）所述的调节花生饼粕粉悬浮液的pH值所用的溶液为1.0mol/L的盐酸溶液，pH值调节至4.2～4.8，Viscozyme L加入量为8～12FBG/g花生饼粕粉（FBG为Viscozyme L的酶活单位），超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为45℃，时间为10min，灭酶的水浴温度为90℃，灭酶时间为20min；

优选地，步骤（4）所述的调节花生饼粕粉Viscozyme L酶解液的pH值所用的溶液为1.0mol/L的氢氧化钠，pH值调节至8.0～9.0，蛋白酶为Alcalase（碱性蛋白酶）、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶以3:1:0.4:0.6比例混合的复合酶，蛋白酶的加入量为5000U/g花生饼粕粉（U为蛋白酶的酶活单位），超声波功率为150～300w，超声波频率为28kHz，温度为40～65℃，时间为10～35min，灭酶的水浴温度为100℃，灭酶时间为15min，离心条件为20℃，4500r/min转速离心10min。

本发明的有益之处在于：利用本发明方法制备的花生抗氧化肽产品具有较好的体外抗氧化活性，可作为一种天然抗氧化剂用于消除机体内多种生理功能障碍，延缓机体衰老，减少各种老年性疾病发生；本方法充分利用了花生蛋白资源，为拓展花生精深加工，提高社会效益和经济效益提供了新途径，适合工业化生产。

具体实施方式

实施例1

以1:10（g/mL）的比例，在花生饼粕粉中加入石油醚，50℃水浴恒温浸提2h，通风橱中干燥5h，得到脱脂的花生饼粕粉；以1:10（g/mL）的比例，在脱脂的花生饼粕粉中加入蒸馏水，在超声波功率为300w，超声波频率为100kHz，温度为45℃条件下，超声波溶解10min，得到花生饼粕粉悬浮液；用浓度为1.0mol/L的盐酸溶液调节花生饼粕粉悬浮液的pH值至4.2，加入Viscozyme L（复合植物水解酶）10 FBG/g（FBG为Viscozyme L的酶活单位），在超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为45℃条件下，超声波辅助酶解10min，酶解反应结束后，将酶解液放入90℃恒温水浴中，灭酶20min，冷却到室温，得到花生饼粕粉Viscozyme L酶解液；用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节花生饼粕粉Viscozyme L酶解液的pH值至8.5，加入Alcalase（碱性蛋白酶）、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶以3:1:0.4:0.6比例混合的复合酶5000U/g花生饼粕粉（U为蛋白酶的酶活单位），在超声波功率为150w，超声波频率为28kHz，温度为60℃条件下，超声波辅助酶解25min，酶解反应结束后，将酶解液放入100℃恒温水浴中，灭酶15min，冷却到室温，得到花生饼粕粉蛋白酶酶解液，在20℃条件下，以4500r/min转速离心10min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC₅₀值为4.25mg/mL，清除羟自由基的IC₅₀值为1.11mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC₅₀值为2.53mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为12.32mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为9.91mg/mL，铁离子螯合力的IC₅₀值为3.68mg/mL，铜离子螯合力的IC₅₀值为1.82mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC₅₀值为2.79mg/mL抑制脂质过氧化能力的IC₅₀值为4.06mg/mL。

实施例2

以1:10（g/mL）的比例，在花生饼粕粉中加入石油醚，50℃水浴恒温浸提2h，通风橱中干燥5h，得到脱脂的花生饼粕粉；以1:12.5（g/mL）的比例，在脱脂的花生饼粕粉中加入蒸馏水，在超声波功率为300w，超声波频率为45kHz，温度为45℃条件下，超声波溶解10min，得到花生饼粕粉悬浮液；用浓度为1.0mol/L的盐酸溶液调节花生饼粕粉悬浮液的pH值至4.55，加入Viscozyme L（复合植物水解酶）11.8 FBG/g（FBG为Viscozyme L的酶活单位），在超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为45℃条件下，超声波辅助酶解10min，酶解反应结束后，将酶解液放入90℃恒温水浴中，灭酶20min，冷却到室温，得到花生饼粕粉Viscozyme L酶解液；用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节花生饼粕粉Viscozyme L酶解液的pH值至8.65，加入Alcalase（碱性蛋白酶）、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶以3:1:0.4:0.6比例混合的复合酶5000U/g花生饼粕粉（U为蛋白酶的酶活单位），在超声波功率为180w，超声波频率为28kHz，温度为62℃条件下，超声波辅助酶解27.5min，酶解反应结束后，将酶解液放入100℃恒温水浴中，灭酶15min，冷却到室温，得到花生饼粕粉蛋白酶酶解液，在20℃条件下，以4500r/min转速离心10min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC₅₀值为3.76mg/mL，清除羟自由基的IC₅₀值为0.79mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC₅₀值为1.57mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为8.84mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为5.80mg/mL，铁离子螯合力的IC₅₀值为1.42mg/mL，铜离子螯合力的IC₅₀值为0.59mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC₅₀值为1.88mg/mL抑制脂质过氧化能力的IC₅₀值为1.96mg/mL。

实施例3

以1:10（g/mL）的比例，在花生饼粕粉中加入石油醚，50℃水浴恒温浸提2h，通风橱中干燥5h，得到脱脂的花生饼粕粉；以1:14（g/mL）的比例，在脱脂的花生饼粕粉中加入蒸馏水，在超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为45℃条件下，超声波溶解10min，得到花生饼粕粉悬浮液；用浓度为1.0mol/L的盐酸溶液调节花生饼粕粉悬浮液的pH值至4.35，加入Viscozyme L（复合植物水解酶）9.6 FBG/g（FBG为Viscozyme L的酶活单位），在超声波功率为300w，超声波频率为28kHz，温度为45℃条件下，超声波辅助酶解10min，酶解反应结束后，将酶解液放入90℃恒温水浴中，灭酶20min，冷却到室温，得到花生饼粕粉Viscozyme L酶解液；用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液调节花生饼粕粉Viscozyme L酶解液的pH值至8.8，加入Alcalase（碱性蛋白酶）、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶以3:1:0.4:0.6比例混合的复合酶5000U/g花生饼粕粉（U为蛋白酶的酶活单位），在超声波功率为150w，超声波频率为28kHz，温度为58℃条件下，超声波辅助酶解28min，酶解反应结束后，将酶解液放入100℃恒温水浴中，灭酶15min，冷却到室温，得到花生饼粕粉蛋白酶酶解液，在20℃条件下，以4500r/min转速离心10min，取上清液冷冻干燥得到花生抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性如下：清除DPPH自由基的IC₅₀值为2.96mg/mL，清除羟自由基的IC₅₀值为0.68mg/mL，清除超氧阴离子自由基的IC₅₀值为1.13mg/mL，铁还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为5.64mg/mL，钼还原力的吸光值为0.5时所需花生抗氧化肽的浓度为2.77mg/mL，铁离子螯合力的IC₅₀值为0.94mg/mL，铜离子螯合力的IC₅₀值为0.92mg/mL，抑制亚油酸过氧化能力的IC₅₀值为1.28mg/mL抑制脂质过氧化能力的IC₅₀值为1.07mg/mL。