一种利用RAPD快速区分枣品种的方法

摘要

本发明公开了一种利用RAPD快速区分枣品种的方法，属于分子生物学分子标记领域，该方法通过设计、筛选出5个11碱基的随机引物，用于扩增未知枣品种的DNA，通过统计凝胶电泳后的谱带，区分出具有唯一特异性谱带的品种，并构建被区分品种的图谱关系。本发明操作方便，快速准确，节省引物，5次PCR就能够将24个枣品种在分子水平上区分开，所得的品种鉴定图比聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现枣苗木的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种利用RAPD快速区分枣品 种的方法。

背景技术

枣原产中国，是我国特色果树，同时也是我国第一大干、鲜果兼用果树，并作为重 要的药用植物及生态经济林树种而被广泛种植，迄今已有7000多年的栽培历史。我国 枣种质资源丰富，国外的枣树都是直接或间接从我国引进的，现已在韩国、日本、俄罗 斯、英国等30多个国家和地区栽培。但由于长期的人工栽培和自然繁衍中，主要采用 根蘖繁殖，因而在品种品系上混杂现象比较严重，给枣的品种选育、品种资源鉴定、遗 传多样性及亲缘关系进行研究和评价带来了诸多不便，因此，建立枣品种快速可靠的鉴 定技术体系对于枣品种资源的研究与保护及枣产业的持续发展具有重要的意义。

目前传统单一的形态学品种鉴定方法已经无法满足当今诸多品种区分鉴定的要求。 分子标记以生物大分子的多态性为基础，直接反映个体差异，不受环境、发育阶段、取 样部位的影响，检出的多态位点是无限的，结果具有高度的可靠性，且鉴别力强，重复 性高。RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)是应用最 早的DNA标记技术之一，它以快捷、简便、不易受外界环境影响以及不需要预知基因 组序列的特点与优势，已被广泛应用于品种的分类研究、种质资源的遗传基础研究、基 因连锁标记、遗传图谱的构建等方面。

现有的利用RAPD进行品种区分的，多采用构建0-1矩阵，通过聚类分析得出聚类 树，但聚类树并不能直观显示出各个品种的区分过程，也无法表现出区分若干品种所用 到的引物，直观性、实用性不足，而且工作量大。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种利用RAPD快速区分枣品种的方法，用于快速 区分并鉴定枣品种，构建出直观、实用的鉴定图谱。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种利用RAPD快速区分枣品种的方法，包 括如下步骤：

(1)针对枣的基因序列设计RAPD随机引物，通过筛选得到以下5个随机引物：

Y22：5’-GTTTCGCTCCC-3’，

Y33：5’-CTGCTGGGACA-3’，

Y42：5’-CTGCTGGGACT-3’，

Y46：5’-CTGCTGGGACG-3’，

Y59：5’-GGACCCAACCG-3’；

(2)提取未知枣品种的DNA，稀释至30～50ng/μl；

(3)利用随机引物对未知枣品种的DNA进行PCR扩增，统计凝胶电泳后的谱带， 区分出具有唯一特异性谱带的品种，并构建被区分品种的图谱关系。

所述步骤(1)中的5个随机引物通过连续两次梯度PCR选择条带一致的温度作为 退火温度，所述随机引物Y22的退火温度为43.6℃，所述随机引物Y33的退火温度为 39.3℃，所述随机引物Y42的退火温度为42.1℃，所述随机引物Y46的退火温度为 45.1℃，所述随机引物Y59的退火温度为45.1℃。通过确定相应引物的最佳退火温度， 可以有效提高RAPD扩增的稳定性和结果的多样性。

RAPD中的引物设计非常关键，一般RAPD的引物为9～10个碱基，理论上，引物 越短，模板序列两端与引物互补的位点数量越多，扩增的PCR多态性丰富；但是，引 物较短，也会引起模板互补配对稳定性低的问题。本发明涉及的引物针对植物品种鉴定 的特点，采用11个碱基。在引物筛选过程中，选择扩增性强、稳定性高、多态性好的 随机引物，满足用于分析基因组多态性的引物要求。

所述步骤(2)中，提取枣品种DNA采用CTAB法，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测， 利用核酸检测仪检测DNA溶液浓度和纯度，并将浓度稀释至30～50ng/μl保存。作为作 为本发明的优选方案，所述DNA溶液浓度为30ng/μl。

所述步骤(3)中构建被区分品种的图谱关系包括如下步骤：

(a)将某一随机引物扩增未知枣品种PCR；

(b)根据电泳后不同谱带的有无进行分类，区分、筛选出具有唯一特异性谱带的 品种；

(c)对各类别具有相同谱带的品种，依次采用其余随机引物中的任意一个进行扩 增，重复步骤(b)，直到所有品种被区分、筛选出来。

所述构建图谱关系通过人工绘制植物品种鉴定图来实现。通过树形图表示各个品种 区分的过程及相应品种，通过标记引物名称和谱带的有无表示品种的鉴定方法和判断依 据。本发明与现有技术不同的是未采用“0-1”矩阵构建指纹图谱并进行聚类分析，通 过对比谱带进行筛选，建立直观的鉴定图谱。

所述步骤(3)中的PCR扩增为30μl的反应体系，包括10×PCR Buffer 3μl，2.5mmol/L dNTPs 2.4μl，25mmol/LMgCl² 1.8μl，1.25UTaq酶，随机引物10pmol/μl 1.2μl，模板DNA 40～50ng。

所述步骤(3)中PCR扩增反应95℃预变性3min，94℃变性30s，复性1min，72℃ 延伸2min，42个循环，72℃延伸10min。

有益效果：本发明的一种利用RAPD快速区分枣品种的方法操作方便，快速准确， 节省引物，5次PCR就能够将24个枣品种在分子水平上区分开，并在一定程度上体现 了利用11个碱基引物进行RAPD分子标记在植物品种鉴定的实用性的，所得的品种鉴 定图比聚类树更具直观性，即根据品种鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物， 该方法可以实现枣苗木的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。

附图说明

图1是11个随机引物鉴别区分24个枣品种的图谱关系示意图；

图2是利用引物Y46扩增24个枣品种DNA的RAPD扩增产物电泳图，横列是特 异谱带，纵列数字与表1对应，M：DNA marker；

图3是用引物Y46验证区分1、19、22三个品种的扩增产物电泳图，横列是特异谱 带，纵列数字与表1对应；M：DNA marker；

图4是用引物Y33验证区分5、7、13三个品种的扩增产物电泳图，横列是特异谱 带，纵列数字与表1对应；M：DNA marker；

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

一、枣品种材料的选用

选取公知公用枣品种24个，依次进行编号，具体如表1所示。

表1  24个枣品种及对应编号

二、引物筛选、DNA的提取、PCR反应

针对枣的基因序列设计出30个RAPD随机引物，筛选出5个碱基组成的具有稳定 性和多态性的随机引物，同时注重退火温度的选择，通过连续两次梯度PCR选择条带 一致的温度作为退火温度。筛选出来的引物扩增的DNA指纹清晰，稳定性和多态性好， 这5个随机引物及相应的最佳退火温度如下所示：

Y22：5’-GTTTCGCTCCC-3’    43.6℃

Y33：5’-CTGCTGGGACA-3’    39.3℃

Y42：5’-CTGCTGGGACT-3’    42.1℃

Y46：5’-CTGCTGGGACG-3’    45.1℃

Y59：5’-GGACCCAACCG-3’    45.1℃

然后将以上述24个品种的枣苗木幼叶为材料，采用改进的CTAB法提取DNA。其 中，通过加入酚和抗氧化剂(β-巯基乙醇)来有效去除蛋白质和酚类物质，制备的DNA 无凝胶状物质、蛋白质和酚类物质，适于PCR扩增。将提取的枣基因组DNA，经0.8％ 琼脂糖凝胶电泳检测，利用Eppendorf公司生产的Bio-Photometer核酸检测仪检测DNA 溶液浓度与纯度，并将浓度稀释至30～50ng/μl(以30ng/μl为最优)，保存，用于PCR 扩增。

PCR扩增反应采用30μl的PCR反应体系，其中模板DNA 40～50ng，随机引物 10pmol/μl 1.2μl，10×PCR Buffer 3μl，MgCl² 1.8μl，2.5mmol/L dNTPs 2.4μl，1.25U Taq 酶。在Eppendorf PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃预变性3min，94℃ 变性30s，复性1min，72℃延伸2min，42个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存。 PCR扩增产物在质量比1.3％琼脂糖凝胶中电泳30～60min，0.5mg·L^-1溴化乙锭染色紫 外投射仪上观察拍照。

三、DNA指纹分析和品种鉴定

利用上述得到的随机引物对未知枣品种的DNA进行PCR扩增，统计凝胶电泳后的 谱带，区分出具有唯一特异性谱带的品种，并构建被区分品种的图谱关系。构建图谱关 系时，用某一随机引物扩增未知枣品种PCR；根据电泳后不同谱带的有无进行分类，区 分、筛选出具有唯一特异性谱带的品种；对各类别具有相同谱带的品种，依次采用其余 随机引物中的任意一个进行扩增，重复步骤(b)，直到所有品种被区分、筛选出来。最 后通过人工绘制植物品种鉴定图，充分、直观地反映出11个随机引物鉴别区分28个枣 品种的图谱关系，如图1所示。

1.首先用引物Y46进行扩增，扩增结果如图2所示，通过280bp和900bp两条特 异性谱带的有无，将24个枣品种区分为3组(A、B、C)，有特异性谱带的用(+)表 示，无特异性谱带的用(-)表示，“·”表示产生了唯一特异性谱带，说明该品种被筛选 出来，如表2所示：

表2  引物Y46区分24个人品种分为3组

其中，A组280bp(+)和900bp(-)，只有一个品种‘金丝3号’具有，即具有唯 一特异性谱带，因此‘金丝3号’被区分开来；

B组280bp(+)，包括编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、17、18、20共18个品种；

C组280bp(-)，包括编号为16、19、21、23、24共5个品种；

上述引物Y46对三组的分组也表明该引物能够鉴定出处在不同组中的任意两个品 种。

2.进一步利用Y22同时扩增以上B组、C组的所有品种(如表3所示)

B组通过Y22扩增的300bp、900bp、1500bp三条多态性谱带的有无将18个品种分 成六个子组：

编号为2、7、12和13号品种根据300bp(+)、900bp(+)和1500bp(+)被分为 B1子组；编号为11、14和15品种根据300bp(-)和900bp(-)被分为B子组；编号 为1、3、5、9和10号品种根据300bp(+)、900bp(-)被分为C子组；编号为4、8、 17和20号品种根据300bp(-)和900bp(-)被分为D子组；编号6的品种300bp(+)、 900bp(+)和1500bp(-)，以及编号18的品种300bp(-)、900bp(+)和1500bp(-)， 通过三条特唯一异性谱带被单独区分鉴定出来。

C组在Y22扩增后，根据特征性谱带300bp(+)和900bp(-)将19号品种区分出 来；根据600bp(-)和900bp(-)将16和24号品种分成一个子组C2；根据300bp(-) 和900bp(-)将21号品种鉴定出来；根据600bp(+)和900bp(+)将23号品种鉴定 出来。

以上，通过Y22扩增可将编号6、18、19、21、23的品种区别出来。

表3  引物Y22和引物Y33依次区分B、C两组

3.再进一步利用引物Y33同时扩增以上五个未区别开来的子组B1、B2、B3、B4、 C2(如表3所示)

B1子组中，根据1200bp(+)12号品种‘六月鲜’被区分出来；根据900bp(+) 和1200bp(+)2号品种‘葫芦长虹’被区分出来；根据900bp(-)和1200bp(-)7号 和23号两个品种分为一个小组，随后在引物Y42扩增下，800bp(+)为7号品种‘中杨 木枣’，800bp(-)为13号品种‘大白铃J’。

B2子组中的三个品种，同样根据900bp和1200bp两条特异性谱带的有无鉴定出来： 根据900bp(+)和1200bp(+)15号品种‘板枣’鉴定出来；根据900bp(-)和1200bp (+)将11号品种‘成武冬枣’鉴定出来；根据1200bp(-)将14号品种‘冬枣’鉴定 出来(如表4所示)。

B3子组中的五个品种，根据350bp、900bp和1200bp三条特异性谱带的有无鉴定 出来：根据1200bp(+)将10号品种‘义乌大枣’鉴定出来；根据900bp(+)和1200bp (-)将5号品种‘孔麻脆’鉴定出来；根据350bp(+)、900bp(-)和1200bp(-)将 3号品种‘三色变枣’鉴定出来；根据350bp(-)、900bp(-)和1200bp(-)将1号和 9号品种分为一个小组，再由引物Y59扩增，根据350bp的有无区分开来，350bp(+) 为9号品种‘龙枣’，350bp(-)为1号品种‘大马牙’(如表4所示)。

B4子组中的四个品种，根据900bp和1200bp的两条特异性谱带的有无鉴定出来： 根据1200bp(+)将20号品种‘宣城圆枣’鉴定出来；根据900bp(-)和1200bp(-) 将17号品种‘圆铃2号’鉴定出来；根据900bp(+)和1200bp(-)将4号和8号分 为一组，再由引物Y42扩增，根据800bp的有无区分开来，800bp(+)为4号品种‘长 鸡心’，800bp(-)为8号品种‘广洋大枣’(如表4所示)。

另外，16和24号品种经引物Y33扩增后，根据特异性谱带1200bp(+)将24号品 种‘茶壶枣’鉴定出来，根据1200bp(-)将16号品种‘山东梨枣’鉴定出来。

表4  引物Y59和引物Y42区分B1、B3、B4

采用以上方法，通过5个随机引物，可完全鉴定、区分出24个枣品种，绘制的植 物品种鉴定图比现有通过聚类分析绘制的聚类树更具有直观性。解决了DNA指纹只能 适用于对少数几个品种的区分以及常用的计算机分析法所获得聚类结果无法用于品种 鉴别的实际情况。利用方法中的11个引物可以实现枣苗木的早期鉴定，对生产各栽培 品种及苗圃的苗木纯度分析以及品种资源筛选具有重要帮助。

为了进一步验证本发明对枣品种快速区分的实用性和准确性，同时用于证明本发明 得到的植物品种鉴定图的实用价值，以区分1号‘大马牙’、19号‘圆铃1号’和22号‘金 丝3号’三个品种为例，由植物品种鉴定图(图1所示)可以看出用引物Y46通过一次 PCR的结果就可以进行区分上述3个品种，利用引物Y46对上述3个品种的DNA进行 PCR扩增，经凝胶电泳后得到具体情况如图3所示，‘大马牙’有280bp大小的谱带，而 ‘圆铃1号’在280bp处没有谱带；又根据‘金丝3号’在900bp处有谱带，将上述3中枣 品种区分开来。

再以区分‘孔麻脆’、‘中杨木枣’两个品种为例，由植物品种鉴定图(图1所示)可 以看出，用引物Y33即可区分两个品种，是由于‘孔麻脆’在900bp处有谱带。通过采用 引物Y33对这两个品种的枣DNA进行PCR扩增，并凝胶电泳，如图4所示，可以看出 这与植物品种鉴定图表示的信息是一致的。同时，植物品种鉴定图中可以看出7号品种 ‘中杨木枣’和13号品种‘大白铃’用引物Y33是无法区分的，图4中也证明了这一点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京农业大学

 <120>  一种利用RAPD快速区分枣品种的方法

 <130>  NJAU110902

 <160>  5    

 <170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  11

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 <220>

<223>  Y22

 <400>  1

gtttcgctcc c                                                          11

  

<210>  2

<211>  11

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 <220>

<223>  Y33

 <400>  2

ctgctgggac a                                                          11

  

<210>  3

<211>  11

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 <220>

<223>  Y42

 <400>  3

ctgctgggac t                                                          11

  

<210>  4

<211>  11

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 <220>

<223>  Y46

 <400>  4

ctgctgggac g                                                          11

  

<210>  5

<211>  11

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 <220>

<223>  Y59

 <400>  5

ggacccaacc g                                                          11