一种烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2及其重组表达载体和应用

摘要

本发明属于分子生物学领域，涉及一种烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2及其重组表达载体和应用。该基因来源于普通烟草，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的产物氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明还提供一种重组表达载体，包括本发明所述的基因NtTTG2。该基因在促进植物生长发育及种子饱满、种子数量方面有重要作用，是一种理想促生及增加产量的基因，可在导入植物获得促进生长和/或增加产量的品种中应用，优选导入烟草或小麦获得促进生长和/或增加产量的品种中应用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2及其重组表达载 体和应用。

背景技术

在植物体表面的表皮毛在不同种类的植物上表现出不同的形态特征。一般来说，表皮毛是 由表皮细胞分化出的毛状单细胞或者多细胞结构，这种结构可以作为植物最外层的天然屏障， 有着不可替代的保护功能，如可以减弱植物在紫外线、干旱、辐射和毒性物质等非生物胁迫下 所受到的伤害^[1]。另外，植物表皮毛在植物抗击虫害和抵御病原物侵染过程中也起着非常重要 的作用。

在植物中，表皮毛发育的控制是一个相当复杂的过程。有许多证据显示，表皮毛的起始和 发育是受正向调控因子和负向调控因子调控的。目前，对于拟南芥的表皮毛发育模型已经研究 的比较透彻，这也成为了研究植物细胞分化分子基础的最好的模型之一。

拟南芥的表皮毛是无腺体的单细胞表皮毛，一般有3个分支，在整个植株中均有分布。它 的发育是一个由时空控制的过程，已经分离到的表皮毛突变体70多个，可归以下几种类型：无 表皮毛型、表皮毛簇生型、表皮毛减少型、表皮毛扭曲型和玻璃状表皮毛型，涉及二十多个基 因的参与^[2]。为了阐释表皮毛发育起始的控制机制，克隆调控基因和研究这些调控基因的功能 是非常必要的。目前认为，在这些基因中，有三个最为重要，分别是编码myb的GL1，编码bHLH 的GL3和编码WD-40的TTG1，这三个基因表达的产物在矮牵牛中形成三元复合体，控制着花 青苷的生物合成^[3]。在拟南芥中，GL1(GLABROUS1)和TTG1(TRANSPARENTTESTA GLABRA1) 两个基因发生功能缺失的突变体，叶片的表皮毛完全消失。GL3(GLABROUS3)基因突变的突 变体数量和表皮毛的分支明显减少或消失。

表皮毛包括分泌型和非分泌型两种，是由表皮细胞层分化出来的单细胞或多细胞的结构。 分泌型表皮毛具有腺体，可以分泌多种化合物，如多糖、机酸、萜烯类或者盐等。拟南芥的表 皮毛是非分泌型的单细胞表皮毛，是表皮细胞分化成的三叉结构，一般认为起物理防卫的功能， 表皮毛密度的增加可以减少被天敌选择的几率^[4]。这种以表皮毛作为物理屏障的功能是一种 直接的抗虫机制，可以避免植食性昆虫的伤害。

另外，有些植物的表皮毛可以分泌化学物质来抵御外敌侵害，如分泌与防卫相关的酶类等 等。烟草(Nicotiana repanda)表皮毛中含有去甲基尼古丁，这种生物碱可以抗击植食性昆虫， 比尼古丁毒性更大。研究表明，去甲基尼古丁的产生是受茉莉酸甲酯或伤诱导的，而且被诱导 后积累非常迅速，在抗虫中具有重要作用。表皮毛的分泌物含有大量的对天敌具有毒性或防御 作用的物质，可以占到叶片干重的17％^[5]。Wagner等2004年实验证明，烟草表皮毛的分泌物在 抗击蚜虫伤害起着重要的作用。表皮毛的分泌物可以流到叶片的表皮细胞上，当蚜虫爬过时， 这些分泌物就会粘附于蚜虫身体上，从而被蚜虫带到植物的其他部位，启动其他部位的抗虫防 卫反应。

以往研究证明，拟南芥表皮毛有利于真菌孢子和菌丝的吸附，无毛突变体gl1增强了对真 菌侵染耐受能力。但进一步研究发现，表皮毛中可以高水平表达α-1，3-glucanase，具有这种特 性的表皮毛可以明显提高对真菌侵染的抗性。这种特性是不依赖于水杨酸或者茉莉酸防卫信号 通路，只依赖于表皮毛内表达的α-1，3-glucanase^[6]。

表皮毛在减轻植株对重金属的毒害也有重要作用。如拟南芥叶片表皮毛中可以积累十倍于 表皮细胞的有毒金属量，还检测到高水平的谷胱甘肽的生物合成，表皮毛这种充当毒性分子存 储库的功能可以降低植物中的养分值，从而防止植食性动物的袭击^[7]。

另外，植物的表皮毛具有较高的反射率，能够有效的反射大量的紫外线，减少紫外线直接 照射与表皮细胞上，减轻植物所受的UV-B辐射破坏。

总之，在植物的发育和防卫中，表皮毛起着非常重要的作用，而模式植物拟南芥表皮毛的 发育调控机制的解析也带动了许多其他植物如烟草表皮毛的相关研究。这些研究将能更好的阐 明表皮毛发育机制以及为抗病、高产基因工程育种提供优秀的基因资源。

参考文献：

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发明内容

本发明的目的是提供一种烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2。

本发明的另一个目的是提供一种含有NtTTG2基因的重组表达载体。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

一种含WD-40结构域的基因NtTTG2，该基因来源于普通烟草(Nicotiana tabacum)，核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的。

所述的含WD-40结构域的烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2编码的蛋白质，其氨基酸序 列如SEQ ID NO.2所示的。

一种重组表达载体，包括所述的烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2和植物表达载体。

所述的植物表达载体选自PBI121，PBI221或pCAMBIA1301中的一种。

所述的植物表达载体选自pCAMBIA1301。

所述的重组表达载体是通过将基因NtTTG2插入到载体pCAMBIA1301酶切位点Sac I/Kpn I间得到的载体pCAMBIA1301::NtTTG2。

所述的重组表达载体是通过将基因NtTTG2插入到载体pCAMBIA1301酶切位点Sac I/Kpn I间，并通过BamH I/Xba I酶切位点在NtTTG2后插入RFP基因得到的双元载体 pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP。

一种转化体，由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细 胞或农杆菌细胞。

所述的烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2在导入植物获得促进生长和/或增加产量的品种 中的应用，优选导入烟草或小麦获得促进生长和/或增加产量的品种中的应用。

所述的含烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2的重组表达载体在导入植物获得促进生长和/ 或增加产量的品种中的应用，优选导入烟草或小麦获得促进生长和/或增加产量的品种中的应 用。

有益效果

本发明提供了一种新的烟草表皮毛发育相关基因NtTTG2，该基因来源于普通烟草，含 WD-40结构域，具有促进植物生长发育及种子饱满、种子数量的功能。利用该基因构建的重 组表达载体，过量表达NtTTG2基因，将其转入农杆菌并进一步转化烟草，所获得的NtTTG2 过表达植株明显表现为促进生长及增加产量。

附图说明

图1pCAMBIA1301::NtTTG2_{3`UTR</sub>-intron-NtTTG2<sub>3`UTR}和pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP载体图 谱。

图2pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP载体酶切验证图，

A.pCAMBIA1301::NtTTG2载体酶切验证图。M为Marker，泳道1为载体酶切验证图，用Sac I和KpnI进行酶切；B.pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP载体酶切验证图。M为Marker，泳道1 为用Sac I和KpnI进行酶切，泳道2为用BamH I和Xba I进行酶切，泳道3为用Sac I和 Xba I进行酶切。

图3潮霉素抗性平板筛选，

A为非转基因烟草，B和C为转基因烟草种子。

图4pCAMBIA1301::NtTTG2-intron-NtTTG2转基因烟草基因表达检测，

A.Northern杂交检测NtTTG2基因表达量，其中TCNC为野生型，TTG2iNC1，2，3为不同转 基因株系；B.实时荧光定量PCR检测NtTTG2基因表达量，其中TCNC为野生型，TTG2iNC1， 2，3为不同转基因株系。

图5pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP转基因烟草基因表达检测，

A.Northern杂交检测NtTTG2基因表达量，其中TCNC为野生型，TOTNC1，2，3为不同转 基因株系；B.实时荧光定量PCR检测NtTTG2基因表达量，其中TCNC为野生型，TOTNC 1， 2，3分别为不同转基因株系。

图6pCAMBIA1301::NtTTG2_{3`UTR</sub>-intron-NtTTG2<sub>3`UTR}(沉默植株)生长产量表型， A.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)烟草在花盆中生长45天和115天表型；B.野 生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)烟草在种植10、20、30、40和50天后生长高度测 定；C.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)烟草在种植10、20、30、40和50天后鲜 重测定。

图7pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP(过表达植株)生长表型， A.野生型(TCNC)和过表达植株(TOTNC1，2，3)在生长45天后表型；B.野生型(TCNC) 和过表达植株(TOTNC1，2，3)花及角果表型；C.野生型(TCNC)和沉默植株(TOTNC1， 2，3)烟草在种植10、20、30、40和50天后鲜重测定；D.野生型(TCNC)和沉默植株(TOTNC1， 2，3)烟草角果内种子数统计。

具体实施方式

实施例1.NtTTG2基因的克隆与序列结构分析

烟草(Nicotiana tabacum)品种NC89的种子直接播于装有营养土的直径为15cm的花盆 中，温室(23-27℃、10h光照/14h黑暗)培养，40日龄植株用于RNA的提取。

总RNA提取：以普通烟草为材料，总RNA的抽提采用Trizol试剂(Invitrogen，USA)按 照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

反转录生成第一链：取2μg RNA作模板，根据Promega公司M-MLV反转录酶配套试剂 使用说明，分别加入下游引物0.5μg，定容至15μL，70℃变性5min，立即在冰上放置5min。 然后分别加入M-MLV 5×buffer 5μL，dNTP(25mM)5μl，rRNasin Ribonuclease Inhibitor 25U， M-MLV反转录酶200U，DEPC水补足25rtL。42℃温育1h，95℃5min灭活反转录酶。经 过优化后，取适量的反转录产物用于随后的PCR。

以cDNA第一链作为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增NtTTG2基因：

PCR扩增引物序列：

上游引物：SEQ ID NO.3(5’-ACACACATAATTTCCCTTCCATTTCC-3’)

下游引物：SEQ ID NO.4(5’-AGAGACCATATAAACACAGTGCCCT-3’)，

25μL反应体系为：10×Ex taq buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，Mg²⁺1.5μL，上、下游引物各 1μL，Ex taq 0.2μL，模板1μL，ddH₂0 15.8μL。反应程序如下为95℃5min，95℃50sec， 58℃50sec，72℃1min，72℃10min。PCR产物NtTTG2基因经纯化回收后，连接到pMD^TM19-T Simple Vector载体(Takara，Japan)上得到pMD^TM 19-T Simple::NtTTG2质粒，转化大肠杆菌 感受态细胞DH5α，送上海invitrogen公司测序，序列如SEQ ID NO.1。

实施例2.双元载体pCAMBIA1301::NtTTG2_{3`UTR</sub>-intron-NtTTG2<sub>3`UTR}的构建

根据NtTTG2基因3`不翻译区序列(3`UTR)设计引物，扩增其编码区部分片段337bp，用 于NtTTG2基因沉默载体的构建。

上游引物：SEQ ID NO.5(5′-TGTAGCGGAGTTGGAAAGGCATCAGG-3′)

下游引物：SEQ ID NO.6(5’-TCCCACCGCTGAGCAAAAGACATAC-3’)，

以pMD^TM 19-T Simple::NtTTG2质粒为模板，利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行PCR 扩增长度为337bp的部分NtTTG2_3`UTR基因序列，条件如下：95℃预变性5min；95℃变性 45sec、58℃复性30sec、72℃延伸30sec，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用1 ％的琼脂糖胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)对电 泳条带进行回收。

将通过PCR方法获得的337bp部分NtTTG2_{3`UTR</sub>基因序列，用T4连接酶连接至pUCm-T 载体上得到pUCm-T::NtTTG2<sub>3`UTR}载体，转化至大肠杆菌DH5α。涂LB(含Amp 100μg/mL)平 板，37℃培养16-20h后挑取若干克隆提取质粒，BamH I和Pst I双酶切验证后送公司测序。 测序验证正确后，用Pst I/BamH I和Pst I/Xho I两种不同的双酶切方式分别切 pUCm-T::NtTTG2_{3`UTR</sub>载体，酶切得到两端具有不同酶切位点的两种NtTTG2<sub>3`UTR}基因片段 NtTTG2_{3`UTR</sub>(Pst I/BamH I)和NtTTG2<sub>3`UTR}(Pst I/Xho I)，以进行下一步操作。

利用存在于pBSSK-in载体(Invitrogen，上海)中的内含子构建发夹结构，该内含子大约 600bp，来自于Phaseolus vulgaris nitrite reductase(NIR)基因(来源于棉花)，利用该内含子两 侧的多克隆位点将已获得的NtTTG2_{3`UTR</sub>基因片段反向重复地连在内含子两侧。具体步骤如下： 将NtTTG2<sub>3`UTR}(Pst I/BamH I)连入用BamH I与Pst I双酶切的pBSSK-in；该产物再用Nsi I 与Xho I(或Sal I)双酶切，然后将NtTTG2_3`UTR(Pst I和Xho I)连接其上(Pst I和Nsi I是同 尾酶，可发生连接，但连接后无法切开)，即构成RNAi载体。

最后用Sac I/Kpn I将整个RNAi片段切下，得到NtTTG2_{3`UTR</sub>-intron-NtTTG2<sub>3`UTR}(Sac I/Kpn I)，连入穿梭载体pCAMBIA1301的组成型表达启动子35S之后的Sac I和Kpn I 酶切位点之间，构成转化单元pCAMBIA1301::NtTTG2_{3`UTR</sub>-intron-NtTTG2<sub>3`UTR}(图1)。将 pCAMBIA1301::NtTTG2_{3`UTR</sub>-intron-NtTTG2<sub>3`UTR}转入到农杆菌EHA105(Invitrogen，上海) 中，为转基因奠定基础。

实施例3.双元载体pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP的构建

提取烟草总RNA，利用RT-PCR反转录合成cDNA。采用：上游引物：SEQ ID NO.7 (5’-GAGCTCATGGAAAATTCAAGTCAAGAAT-3’)，下游引物：SEQ ID NO.8 (5’-GGTACCTACTTTAAGCAGTTGCAACTTGT-3’)，以烟草cDNA为模板，扩增NtTTG2，在 NtTTG2两端引入Sac I/Kpn I酶切位点，将扩增得到的NtTTG2基因连接到pMD^TM 19-T Simple Vector载体(Takara，Japan)上转入大肠杆菌DH5α中，测序正确后，用Sac I/Kpn I对连接有 NtTTG2基因的pMD^TM 19-T Simple Vector载体进行双酶切，得到测序正确的NtTTG2片段，然后 将载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)也用Sac I/Kpn I酶切，将NtTTG2片段与 pCAMBIA1301线性载体连接，NtTTG2被插入pCAMBIA1301载体中花椰菜花叶病毒35S启动子 下游得到pCAMBIA1301::NtTTG2载体。同样原理，用BamH I/Xba I将pBI121(Invitrogen， 上海)上的RFP(红色荧光蛋白)切下，插入到用同样的酶切pCAMBIA1301::NtTTG2载体下 游的BamH I/Xba I酶切位点间，得到双元载体pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP，并进行酶切验证， 结果见图2。将pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP转入到农杆菌EHA105(Invitrogen，上海)中，为 转基因奠定基础。

实施例4.叶盘法转化烟草及其抗性筛选

具体步骤简述如下：

1农杆菌培养

1)分别从平板上挑取转染pCAMBIA1301::NtTTG2_{3`UTR</sub>-intron-NtTTG2<sub>3`UTR}载体(NtTTG2基 因沉默载体)的农杆菌EHA105单菌落以及含有pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP载体(NtTTG2 基因过表达载体)的农杆菌EHA105单菌落，分别接种到3mL YEB液体培养基中(Str 25 μg/mL、Rif50μg/mL、Kan 80μg/mL)于恒温摇床上27℃，180rpm摇培过夜至OD 600为 0.6-0.8。

2)摇培过夜的菌液按1∶100的比例，转入新配置的含上述抗生素的YEB培养基中，在与上 述相同的条件下培养6h左右，OD600为0.2-0.5时即可用于转化。

2侵染：于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具潮霉素(Hm)抗性的烟草 无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm×0.5cm的小块，放入菌液中，浸泡 适当时间(一般5-10min)。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

<注>：同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照，以下步骤同。

3共培养：将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基上，用封口膜 封好培养皿，28℃黑暗中培养2-4d。

4选择培养：将黑暗中共培养2-4d的烟草叶片转移到带抗性的分化培养基(MS+1μg/mL 6- 苄氨基嘌呤+50μg/mL潮霉素+500μg/mL羧苄青霉素)中，用封口膜封好培养皿，在光照为 2,000-10,000lux、25-28℃、16/8h光照/光暗条件下选择培养，结果见图3。

5生根培养：约2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到生根培养基 (1/2MS+200μg/L IAA+50μg/mL潮霉素+500μg/mL羧苄青霉素)上进行生根培养，5-10d后 长出不定根。根长好后，移入盆钵中培养。

待烟草种子成熟后进行单株收种(T1代，具有RR，Rr，rr型)，T1代种子继续在Hm抗 性平板上筛选，根据孟德尔遗传第一定律统计分析，将筛选获得T2代纯合品系，分别得到转 入pCAMBIA1301::NtTTG23`UTR-intron-NtTTG23`UTR的NtTTG2基因沉默植株纯合品系以 及转入pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP的NtTTG2基因过表达植株纯合品系。

实施例5转基因烟草中NtTTG2基因表达检测

1.Northern杂交，方法参考Wu et al.2007：Wu X，Wu T，Long J，Yin Q，Zhang Y，Chen L， Liu R，Gao T and Dong H(2007).Productivity and biochemical properties of green tea in response  to full-length and functional fragments of HpaG Xooc，a harpin protein from the bacterial rice leaf  streak pathogen Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola.J.Biosci.32：1119-1131.)：

1.1RNA甲醛凝胶变性电泳

分别提取并纯化pCAMBIA1301::NtTTG2-intron-NtTTG2转基因烟草以及 pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP转基因烟草的RNA。去纯化的RNA样品进行甲醛变性电泳。首 先用0.1mol/L NaOH浸泡电泳槽及梳子5min，然后用0.1％DEPC水仔细冲洗；在灭菌 eppendorf管中建立变性反应；然后，55℃水浴60min，冰水中放置10min，离心；加入2μl 10×甲醛凝胶加样缓冲液并将eppendorf管重新放置于冰上；制备100mL含有2.2mol/L甲醛 的1.5％琼脂糖凝胶。加1.5g琼脂糖到72mL灭菌水中，加热溶解琼脂糖，在冷却至55℃的 溶液中同时加入10mL 10×MOPS电泳缓冲液和18mL去离子甲醛，并在通风橱内灌制凝胶 (0.5％的凝胶可以用来分离0.5-8Kb的RNA，若要分离更大的RNA，则使用1.0％-1.2％的琼 脂糖凝胶)；将琼脂糖/甲醛凝胶装入水平电泳槽中，加入足够1×MOPS电泳缓冲液覆盖凝胶 约1mm，预电泳5min(5V/cm)；凝胶浸入1×MOPS电泳缓冲液中，4-5V/cm电压下进行 电泳，直到溴酚蓝移出约8cm(电泳过程中，由于电泳缓冲液的pH值会发生变化，导致在较 高电压下，条带会模糊不清。电泳过程中可以使用蠕动泵将两极缓冲液循环，每电泳1h换一 次缓冲液。)；电泳结束后将胶块置于凝胶成相系统中，观察RNA的完整性，记录18S、28S 条带离加样孔的距离，并在DEPC水中冲洗。

一般一个泳道最多可以分析20μg的RNA。

相关试剂

(1)10×甲醛凝胶电泳加样缓冲液

50％甘油(稀释于DEPC处理无RNase水中)

10mmol/L EDTA(pH 8.0)

0.25％(w/v)溴酚蓝

0.25％(w/v)二甲苯晴蓝乙酸

(2)10×MOPS电泳缓冲液

0.2mol/L MOPS(pH 7.0)

20mmol/L乙酸钠

10mmol/L EDTA(pH 8.0)

将41.8g的MOPS溶解于700mL灭菌的DEPC处理的无RNase水中，用2mol/L的NaOH 调整pH值至7.0，加20mL DEPC处理的1mol/L的乙酸钠和20mL DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，用DEPC处理的无RNase水将溶液体积调到1L，室温下避光保存。

1.2变性RNA在膜上转移及固定

凝胶取出后，用DEPC水冲洗一下；纸包裹的平台置于盛有6×SSC的大培养皿中，使 SSC液面略低于平台；将凝胶翻转背面朝上置于平台上，赶尽凝胶和滤纸之间的气泡，并在凝 胶的周围边缘放几条塑料薄膜，防止液流短路；尼龙膜在水中浸泡10min，取出后在6×SSC 中浸泡5min；将尼龙膜小心置于凝胶上方，胶面尽量多加SSC溶液，以避免在膜与胶之间产 生气泡(20×SSC：在800mL水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10MNaOH 调pH值至7.0，加水定容至1L)；在尼龙膜的上方放置预先用2×SSC湿润的滤纸数张，注 意使纸的边缘于尼龙膜及凝胶对齐，赶尽气泡；在滤纸的上方放置5-8cm高的纸巾，纸巾上 平放一块玻璃板并压上500g左右的重物；上述转印进行12-24h。每当纸巾湿润后，更换新的 干燥纸巾；转印结束后，取下滤纸，在尼龙膜上做标记；小心的揭下尼龙膜，在2×SSC溶液 中洗掉膜表面的凝胶；取出尼龙膜，滴干水，室温干燥30min后，置于80℃固定2h。

1.3探针的标记

取0.5-3.0μg目的基因做模板，稀释到15μl，于水浴中煮沸变性10min，迅速置于冰上； 在冰浴上向管内加入：2μl hexanucleotide mix，2μl dNTP混合物(含DIG)1μl Klenow酶， 混合均匀；于37℃温育8-16h后，加入0.5mol/L EDTA 2μl(pH8.0)终止反应；加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷的无水乙醇(-20℃)，混匀。在-70℃放置30min，10000rpm离 心15min；用冰冷的70％乙醇洗涤沉淀后在室温干燥，最后加入50μl TE溶解沉淀。

1.4预杂交和杂交

将固定好的尼龙膜置于杂交管中，加入预杂交液，于65℃预杂交6-8h；将探针DNA于 水浴中煮沸10min，迅速置于冰上冷却5min，倒入杂交液中混匀；倒出预杂交液，加入已混 匀探针的杂交液，赶尽气泡，封口；于65℃下杂交12h左右。

1.5洗膜和显影

准备洗液，Church wash 1#：40mmol/L Na₂HPO₄，5％SDS，1mmol/L EDTA，0.5％BSA； Church wash 2#：40mmol/L Na₂HPO₄，1％SDS，1mmol/L EDTA；将杂交管内的杂交液弃去， 将杂交膜放在Church wash 1#中，65℃、洗10min；在Church wash 2#中，65℃，洗膜两次， 每次10min；将一张X光片贴于塑料薄膜包裹的膜上，放置在放射自显影盒中，室温曝光， 根据需要调整曝光时间。pCAMBIA1301::NtTTG2-intron-NtTTG2转基因烟草的Northern杂交 结果见图4A，pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP转基因烟草的Northern杂交结果见图5A。

2.qRT-PCR(Wu et al.，2010：Wu，T.，Guo，A.，Zhao，Y.，Wang，M.，Wang，Y.，Zhao，D.，Li，X.，Ren， H.，Dong，H.，2010.Ectopic expression of the rice lumazine synthase gene contributes to defense  responses in transgenic tobacco.Phytopathology.100，573-581.)：

分别提取并纯化pCAMBIA1301::NtTTG2-intron-NtTTG2转基因烟草以及 pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP转基因烟草的RNA，并转录合成cDNA。

Q-RT-PCR在ABI PRISM 7500实时荧光定量PCR仪上进行操作，一次平行试验设3次重 复。PCR反应体系如下：cDNA 10ng，上、下游引物各0.2μM，1×SYBRPremixEx Taq(Takara， Japan)和1×Rox Reference Dye II，最后用无菌水补足至20μl。两步法进行PCR循环：95℃1 min，40个循环(95℃5s，60℃30s)。Q-RT-PCR检测pCAMBIA1301::NtTTG2-intron-NtTTG2 转基因烟草以及pCAMBIA1301::NtTTG2-RFP转基因烟草中NtTTG2基因的表达结果分别见图 4B和图5B。

实施例6.NtTTG2基因对烟草促生作用及提高产量。

将实施例4获得的NtTTG2沉默烟草和NtTTG2过表达烟草以及野生型烟草、在同样的条 件下(23-27℃、10h光照/14h黑暗)种植在温室内，于生长期10天，45天，115天和收获 后分别进行生长性状观察及种子数统计。

NtTTG2过表达植株明显表现为促进生长及增加产量，表现在根长、株高、生物量以及种 子数上。例如在生长到40天时，过表达株系TOTNC1，2，3鲜重分别为15.2g，13.8g及7.6 g，而野生型对照只有5.2g；在种子数方面，野生型为1258粒，而3个过表达株系分别为1855 粒，1736粒及1496粒。另外，NtTTG2沉默烟草植株表现为明显抑制的植物的生长和产量。 例如在株高方面，生长40天时，野生型植株的平均株高为0.58cm，而沉默株系的平均株高为 0.17cm；在鲜重方面，野生型株系平均鲜重为5.6g，而沉默株系的平均鲜重为3.3g。这些研 究结果证实了NtTTG2对烟草的促生作用及提高产量的效果(图7)。

本发明实施例所涉及引物由上海Invitrogen公司合成。