一种改进CTAB法提取杏鲍菇中的DNA

摘要

一种改进CTAB法提取杏鲍菇中的DNA。是在加入Tris-酚、氯仿、异戊醇的混合溶液的同时加入25-35%的无水乙醇，所提出的DNA其OD260/OD280值都处于1.9－2.0之间。说明乙醇的加入有助于蛋白质的去除。这是因为乙醇与水互溶，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质在等电点沉淀下来，因此抽提时就可以很好地将蛋白质沉淀去除。用不同的五种方法种分别进行紫外检测结果，只有本发明的DNA条带最亮，总体基本无降解拖尾现象,在加样孔附近滞留的物质也很少；说明采用低浓度乙醇沉淀法可以很好地去除DNA中的多糖。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杏鲍菇DNA的提取方法。尤其是一种CTAB法提取杏鲍菇的DNA。

背景技术

目前在食用菌基因工程研究中，DNA的提取、分离和纯化是重要的技术之一。但是食药用真菌中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与核酸很相似，因此食用菌DNA的提取方法中其多糖类物质如何去除是一个棘手的问题；由于多糖可以抑制DNA 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、TaqDNA 聚合酶等多种分子生物学酶类的活性，因此污染了多糖的DNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。现有CTAB法提取植物基因组织中的DNA，均是在CTAB 缓冲液中加入PVP以去除少许多糖；在高浓度Na⁺或K⁺存在条件下，通过Tris-酚、氯仿抽提除去多糖。目前通常是通过计算OD₂₆₀/OD₂₈₀比值来评价DNA的纯度，若比值低于1.8则说明DNA样品中有蛋白污染；现有CTAB常规方法的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均低于1.8，说明仅通过PVP以去除少许多糖加上用Tris-酚:氯仿:异戊醇来抽提蛋白质仍会有相当多的多糖与DNA混杂在一起，目前还没有更有效的方法来解决DNA分离纯化时多糖污染的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的CTAB法提取杏鲍菇的DNA。以实现有效解决DNA分离纯化时多糖污染的问题。

本发明包括以下步骤：

（1）取杏鲍菇菌丝体0.3-0.7g离心10min，取沉淀，放入研钵中，加入研钵容积1/2左右的液氮研磨成细粉，置于10mL离心管中，加入55-70℃预热的CTAB提取缓冲液4mL，振荡混匀，放于恒温65℃的水浴锅中水浴保温0.5-1h，隔10～20min振荡混匀一次；取出离心10min；取上清液，转移到对应的试管中；

（2）在提取液中加入CTAB体积25-35%的无水乙醇；再加入4mLTris-酚、氯仿、异戊醇的混合溶液，所述混合溶液中的Tris-酚:氯仿:异戊醇=（22～28）:(21～26):(1～3)；离心分离10min；弃沉淀取上清液；

（3）在上清液中再加入氯仿、异戊醇的混合溶液重新抽提，所述混合溶液中氯仿:异戊醇=（24～28）:（1～5）；

（4）在上清液中加入0.3～0.5ml 3mol/L的乙酸钠， pH 为5.2；再加入3～5ml经-20℃预冷的异丙醇，充分混匀，在-20℃放置过夜；离心分离10min；弃上清液；取沉淀；

（5）用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下挥发乙醇，直至沉淀无醇味但仍保持湿润；加入100μl TE溶液溶解DNA；再加入1μl50mg/mlRNAse；在37℃水浴消化1h。

所述CTAB提取缓冲液包括100 mmol/LTris-HCl(pH 8.0),20 mmol/LEDTA(pH 8.0),1.4 mol/LNaCl，3%CTAB,2%PVP, 2.67%β-巯基乙醇。

本发明的优点：

本发明在加入Tris-酚、氯仿、异戊醇的混合溶液的同时加入25-35%的无水乙醇，所提出的DNA其 OD₂₆₀/OD₂₈₀值都处于1.9－2.0之间。说明乙醇的加入有助于蛋白质的去除。这是因为乙醇与水互溶，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质在等电点沉淀下来，因此抽提时就可以很好地将蛋白质沉淀去除。用不同的五种 方法分别进行紫外检测结果，只有本发明的DNA条带最亮，总体基本无降解拖尾现象, 在加样孔附近滞留的物质也很少；说明采用低浓度乙醇沉淀法可以很好地去除DNA中的多糖。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

（1）取杏鲍菇菌丝球0.5g，加入液氮（相当于研钵体积的1/2）研磨成细粉，置于10ml离心管中，加入65℃预热的3%CTAB提取缓冲液4ml（100 mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA(pH8.0),1.4mol/LNaCl,3%CTAB,2%PVP, 2.67%β-巯基乙醇），振荡混匀，放于恒温65℃的水浴锅中水浴保温1h，隔10～15min振荡混匀一次；取出离心10min；离心后取上清液；

（2）在上清液中加入相当于第一次所加CTAB量30%体积的无水乙醇；再加入4mLTris-酚、氯仿、异戊醇的混合溶液，混合溶液中的Tris-酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，离心10min；弃沉淀取上清液；

（3）在上清液中再加入4mL氯仿、异戊醇的混合溶液重新抽提，所述混合溶液中氯仿:异戊醇=24:1；离心10min，弃沉淀取上清液； 

（4）加入上清液1/10体积的3mol/L, pH 5.2的乙酸钠和等体积-20℃预冷的异丙醇，充分混匀，在-20 ℃ 放置过夜；离心分离10min；弃上清液；取沉淀，

（5）用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下挥发掉乙醇，直至沉淀无醇味但仍保持湿润；加入100μl TE溶液溶解DNA；再加入0.8-1.5μl 50mg/mlRNAse；在37℃水浴锅中消化0.5-1h。

将提取的DNA进行七个平行样的紫外检测；结果如表1所示

   0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA很完整。

实施例2：

取杏鲍菇菌丝球0.5g ，加入液氮（相当于研钵体积的1/2）研磨成细粉，置于10ml离心管中，加入65℃预热的3%CTAB提取缓冲液4ml（100 mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA(pH8.0),1.4mol/LNaCl,3%CTAB,2%PVP, 2.67%β-巯基乙醇），振荡混匀，放于恒温65℃的水浴锅中水浴保温1h，隔10～15min振荡混匀一次；取出离心10min；离心后取上清液；

在上清液中加入相当于第一次所加CTAB量25%体积的无水乙醇；再加入4mLTris-酚、氯仿、异戊醇的混合溶液，混合溶液中的Tris-酚:氯仿:异戊醇=26:23:2，离心10min；弃沉淀取上清液；

在上清液中再加入4mL氯仿、异戊醇的混合溶液重新抽提，所述混合溶液中氯仿:异戊醇=28:3；离心10min，弃沉淀取上清液； 

加入上清液1/10体积的3mol/L, pH 5.2的乙酸钠和等体积-20℃预冷的异丙醇，充分混匀，在-20 ℃ 放置过夜；离心分离10min；弃上清液；取沉淀，

用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下挥发掉乙醇，直至沉淀无醇味但仍保持湿润；加入100μl TE溶液溶解DNA；再加入0.8-1.5μl 50mg/mlRNAse；在37℃水浴锅中消化0.5-1h。